專利名稱：降鈣素原(pct)在患原發(fā)性非傳染疾病的患者的風險分級和預后中的應用的制作方法
降鈣素原(PCT)在患原發(fā)性非傳染疾病的患者的風險分級
和預后中的應用 本發(fā)明的主題是患原發(fā)性非傳染疾病的患者的體外診斷、預后和風險分級，由此 患者體液樣品中降鈣素原(PCT)的水平，指示患者患其他疾病或醫(yī)學病癥的風險。

背景技術：
降鈣素原(PCT)已經(jīng)成為用于膿毒癥診斷的已確立的生物標志物PCT反映了細 菌感染的嚴重性，并且尤其用于監(jiān)測膿毒癥、嚴重膿毒癥或膿毒性休克中感染的進展。膿毒 癥、嚴重膿毒癥或膿毒性休克中PCT的濃度典型情況下高于lng/mL。有可能使用PCT來度 量與感染相關的全身性炎性反應的活性，控制療法的成功，以及估測預后(AssicotM等，患 膿毒癥和感染的患者的高血清降牽丐素原濃度(High ser卿rocalcitonin concentrations in patients with sepsis and infection) ， Lancetl993， 341 :515-8 ;Clec' h C等，在 患膿毒性休克的患者中降鈣素原的診斷值和預后值(Diagnostic and prognostic value of procalcitonin inpatients with septic shock), Crit Care Med 2004,32:1166-9; Lee YJ等，在全身性炎性反應綜合癥(SIRS)中降鈣素原(PCT)水平、動脈酮體比(AKBR)、 APACHE III分值和多器官機能障礙分值(MODS)的預測性比較(Predictive comparisons of procalcitonin (PCT) level, arterialketone body ratio (AKBR) ， APACHE III score and multiple organdysfunction score(MODS)in systemic inflammatory response syndrome (SIRS)) ， Yonsei Med J 2004， 45， 29-37 ;Meisner M.，膿毒癥的生物標志物 可以臨床使用嗎7 (Biomarkers of sepsis-clinically useful 7 ) ， Curr 0pin Crit Care 2005， 11，473-480 ;Wunder C等，IL_6、 IL-10和PCT血槳濃度用于嚴重膿毒癥中結(jié) 果的預測可靠嗎？與APACHE III禾口 SAPS II的比較(Are IL_6， IL-10 and PCT plasma concentrations reliablefor outcome prediction in severe sepsis A comparison with APACHE IIIand SAPS 11)， Inflamm Res 2004， 53， 158-163)?；寄摱景Y的患者中 PCT水平的增加與死亡率相關(0berhoffer M等，在患膿毒癥的患者中通過傳統(tǒng)和新的炎 癥標志物進行結(jié)果予頁領lj (Outcome prediction by traditional and new biomarkers of inflammation in patients with sepsis) ，Clin ChemLab Med 1999 ;37 :363-368)。
越來越多的研究討論了 PCT在非膿毒性傳染病例如肺炎、細菌性腦膜炎和瘧疾 中的可能作用(Bugden SA等，降鈣素原在持續(xù)性腦膜炎球菌流行期間在發(fā)熱年青成人的 急診部管理中的可會g作用(Th印otential role of procalcitonin in the emergency department managementof febrile young adults during a sustained meningococcal 印idemic) ，Emerg Med Australas 2004， 16， 114-119 ;Chiwakata CB等，降f丐素原在患惡性 瘧原蟲瘧疾的患者中作為疾病嚴重性和死亡風險的參數(shù)(Procalcitonin as a parameter of disease severity and risk of mortality inpatients with Plasmodium falciparum malaria), J Infect Dis 2001， 183， 1161-1164 ;Schwarz S等，細菌性和非細菌性腦膜炎 中的血清降牽丐素原水平(Serum procalcitonin levels in bacterial and abacterial meningitis) ，Crit Care Med 2000，28，1828-1832)。 體外研究顯示，PCT在單核細胞黏附和遷移過程中發(fā)揮了重要作用，并且對可誘導的一氧化氮合酶(iN0S)的基因表達具有影響(Linscheid P等，黏附的單核細胞和巨 噬細胞活化的脂肪細胞的降鈣素原和降鈣素基因相關肽的表達和分泌(E鄧ression and secretion ofprocalcitonin and calcitonin gene—related peptide by adherent monocytesand by macrophage-activated adipocytes), Crit Care Med 2004,32， 1715-1721 ;Wiedema皿FJ等，人類單核細胞對降f丐素原作出響應而遷移(Migration of human monocytes in response to procalcitonin)， Crit CareMed，2002，30，1112-1117 ; Hoffmann G等，降鈣素原在血管平滑肌細胞中擴大可誘導的一氧化氮合酶基因的表達和 一氧化氮的產(chǎn)生(Procalcitonin amplifies inducible nitric oxide synthase gene expressionand nitric oxide production in vascular smooth muscle cells), Crit CareMed， 2002， 30， 2091-2095)。 PCT已經(jīng)被用于指導抗生素療法(Chri st-Crain M等，降鈣素原指導的治療 對下呼吸道感染中抗生素的使用和結(jié)果的影響隨機分組的單盲干預試驗(Effect of procalcitonin—guided treatment on antibiotic useand outcome in lower respiratory tract infections :cluster—randomised， single—blinded intervention trial) ， Lancet. 2004 Feb 21,363(9409) :600-7)。在急診部出現(xiàn)的具有下呼吸道感染癥 狀的患者中測量了 PCT，只有PCT濃度> 0. 25ng/mL或> 0. 5ng/mL的患者使用抗生素進行 治療。顯然，這種方式產(chǎn)生了不能與對照組區(qū)分的臨床結(jié)果，在對照組中也有許多PCT濃度 < 0. 25ng/mL的患者接受了抗生素。值得注意的是，在該研究中，患相關共病例如心力衰竭 的患者被排除在外。因此，到目前為止，還不清楚除了感染之外，原發(fā)性疾病的存在是否將 影響對低于O. 25ng/mL的PCT濃度的解釋。相關的原發(fā)疾病可能額外增加免疫系統(tǒng)的負擔， 在這種情況下與不存在相關原發(fā)疾病的情況下相比，感染的生物標志物例如PCT可能在不 同的、即更低的濃度范圍內(nèi)就能指示感染。 在健康個體中，PCT濃度遠低于O. 25ng/mL:已經(jīng)測定的中值濃度是0. 014ng/ mL(Morgenthaler NG等，用于檢測降f丐素原的靈敏的免疫發(fā)光計量分析方法(Sensitive immunoluminometric assay for thedetection of procalcitonin)， Clin Chem. 2002 May,48(5) :788-90)。 在WO 2008/040328 A2中描述了用于診斷伴有心力衰竭的氣道和肺部感染或炎性
疾病的方法，其中在患者中測定了生物標志物降鈣素原。
發(fā)明簡述 本發(fā)明是基于一個令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即在患原發(fā)性非傳染疾病的患者的樣品中， 以高的頻率檢測到了略微升高的降鈣素原(PCT)水平(濃度)，并且它是診斷相關的。引 人注目的是，本發(fā)明人從總共4997個患原發(fā)性非傳染疾病的患者的樣品中，鑒定到了大量 樣品分別具有高于0. 03ng/mL(26. 0% )和0. 05ng/mL(14. 7% )的血清水平。略微升高的 PCT水平涉及范圍為大約0. 02到0. 25ng/mL，優(yōu)選在大約0. 02到0. Ing/mL之間的PCT水 平。略微升高的PCT水平的出現(xiàn)，可以指示患非感染性原發(fā)疾病的患者獲得臨床尚未證實 的和/或尚無癥狀的其他疾病或醫(yī)學病癥的風險。這種其他疾病或醫(yī)學病癥可能與局部感 染相關，或局部感染可能促進、加速或增加了患或獲得其他疾病或醫(yī)學病癥的風險。本發(fā)明 提供了用于對患者獲得非感染性原發(fā)疾病之外其他疾病或醫(yī)學病癥的風險進行預后的方 法。這也允許對這些患者的治療進行適應性調(diào)整，例如如果沒有檢測到升高的PCT水平，患者就不是必需接受附加的抗生素療法。必須指出，到目前為止，患非感染性原發(fā)疾病的患者在診斷過程中常規(guī)不篩查它們的PCT水平。本發(fā)明教導了，患非感染性原發(fā)疾病的患者應該對他們的PCT水平進行測定，以便允許對患其他疾病或醫(yī)學病癥的風險進行預后，并最終允許對療法進行適應性調(diào)整。 因此，本發(fā)明提供了用于對患非感染性原發(fā)疾病的患者進行預后的體外方法，方法包括在從所述患者獲得的樣品中，測定降鈣素原或其長度為至少12個氨基酸、優(yōu)選長度超過50個氨基酸、更優(yōu)選長度超過110個氨基酸的片段的水平；以及將所述降鈣素原或其片段的水平，與患者患其他還沒有被證明和/或還沒有癥狀的疾病或醫(yī)學病癥的風險相關聯(lián)。


圖1顯示了患者樣品中降鈣素原水平范圍的頻率的直方圖。它們是由各種不同專業(yè)的醫(yī)生連續(xù)不斷地送往私立實驗室進行各種不同類型的分析、但是不包括PCT分析的4997份未選擇的樣品。 圖2顯示了高于0. 05ng/mL的PCT水平相對于提供了相應樣品的咨詢專業(yè)醫(yī)生的
醫(yī)學領域的分布情況。標出了所有組中的中值。
發(fā)明詳述 本發(fā)明涉及用于對患非感染性原發(fā)疾病的患者進行預后的體外方法，方法包括在從所述患者獲得的樣品中，測定降鈣素原或其長度為至少12個氨基酸、優(yōu)選長度超過50個氨基酸、更優(yōu)選長度超過IIO個氨基酸的片段的水平；以及將所述降鈣素原或其片段的水平，與患者患其他還沒有被證明和/或還沒有癥狀的疾病或醫(yī)學病癥的風險相關聯(lián)。
在本發(fā)明的意義上，除非另有陳述，"患者"被理解為是所有人或動物，無論它們是否表現(xiàn)出病理性變化。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的患者是人類。 優(yōu)選情況下，在本發(fā)明的上下文中，患者患非感染性的原發(fā)疾病，在所述患者的血清或血漿樣品中降鈣素原或其長度為至少12個氨基酸的片段的水平低于0. 25ng/mL。
在本發(fā)明中，術語"預后"是指預測對象(例如患者)的醫(yī)學病癥將如何發(fā)展。這可以包括估計所述對象恢復的機會或不利結(jié)果的機會。 在本文中，在蛋白或肽的情況下提到的術語"片段"，是指可以源自于較大蛋白或肽的較小蛋白或肽，因此包含了較大蛋白或肽的部分序列。所述片段可以從較大蛋白或肽通過皂化其一個或多個肽鍵而衍生得到。 降鈣素原是包含116個氨基酸的肽。也存在其較小的變體例如PCT3-116等。因此，降鈣素原片段的長度是至少12個氨基酸，優(yōu)選超過50個氨基酸，更優(yōu)選超過110個氨基酸。 在本文中，優(yōu)選情況下，患其他疾病或醫(yī)學病癥的所述風險與現(xiàn)有的細菌感染、特別是局部感染相關。局部感染可以促進、加速和/或增加在患非感染性原發(fā)疾病的患者中患或獲得其他疾病或醫(yī)學病癥的風險。 在體外方法的特別優(yōu)選的實施方案中，所述降鈣素原或其片段的水平指示患者中的細菌性感染。 進一步優(yōu)選情況下，所述感染是局部感染。
本文的局部感染涉及所有比膿毒癥嚴重性低的感染。膿毒癥被定義為與"全身性炎性反應綜合癥"("SIRS")相關的感染(Levy匪等，2001年SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS國際膿毒癥定義大會(2001SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International S印sisDefinitionsConference) ，Crit Care Med. 2003 Apr,31(4) :1250-6)。
局部感染可以是例如口腔中、牙齒處或牙根的感染，傷口感染，呼吸道感染或痔瘡等。本文的所述局部感染可以通過施用抗生素進行治療。局部感染的治療導致患者患其他疾病或醫(yī)學病癥的風險降低。因此，在體外方法的優(yōu)選實施方案中，所述細菌感染可以用抗生素治療。在這種情況下，優(yōu)選地，當患者用抗生素治療時，患其他疾病或醫(yī)學病癥的風險被降低。 本發(fā)明的體外方法的關聯(lián)步驟優(yōu)選包含將所述降鈣素原或其片段的水平與閾值水平進行比較，由此，當所述降鈣素原或其片段的水平超過所述閾值水平時，所述患者對所述風險易感。 所述閾值水平優(yōu)選在0. 02到0. 25ng/mL之間，更優(yōu)選在0. 02到0. Ing/mL之間，更優(yōu)選為大約0. 05(+/-0. 01)ng/mL，最優(yōu)選為大約0. 03 (+/-0. 01)ng/mL。這些閾值水平的定義來自于在隨附的圖1的直方圖和實施例1中顯示的PCT水平范圍的頻率分布分析。
在具體的實施方案中，所述原發(fā)疾病不是動脈粥樣硬化。在另一個實施方案中，所述原發(fā)疾病不是心力衰竭。在本發(fā)明的某些實施方案中，所述原發(fā)疾病不是急性冠脈綜合癥。此外，在具體實施方案中，優(yōu)選所述原發(fā)疾病不是冠脈病(coronary disease)。在具體實施方案中，其他疾病或醫(yī)學病癥不選自急性冠脈綜合癥、心力衰竭或心肌梗塞。
在一個實施方案中，所述其他疾病或醫(yī)學病癥不是感染，特別是不是氣管和肺部感染。 在本發(fā)明的體外方法的另一個實施方案中，所述原發(fā)疾病選自但不限于癌癥、糖尿病、慢性胃腸疾病、慢性腎病、高血壓、整形外科疾病包括骨質(zhì)疏松癥，以及神經(jīng)退行性疾病包括阿茨海默氏病。 此外，在另一個實施方案中，所述其他疾病或醫(yī)學病癥選自心臟病，選自但不限于動脈粥樣硬化、急性冠脈綜合癥和心力衰竭。 本文的原發(fā)疾病涉及已經(jīng)被證實和/或已經(jīng)表現(xiàn)出癥狀的疾病。其他疾病或醫(yī)學病癥涉及還沒有被證實和/或尚無癥狀的疾病。 來自患者的樣品可以例如選自血液樣品、血清樣品、血漿樣品和尿液樣品或任何上述樣品的提取物。 在本發(fā)明的具體實施方案中，體外方法還包括將所述降鈣素原或其片段的水平與一種或多種其他預后生物標志物的水平數(shù)學組合，由此所述降鈣素原或其片段的水平與所述其他預后生物標志物的水平的組合，增加了所述降鈣素原或其片段的水平或所述相關標志物的水平對所述患其他疾病或醫(yī)學病癥的風險的預測值。 在本發(fā)明的上下文中，"算法"或"數(shù)學算法"是指使用數(shù)學或統(tǒng)計學方法或模型，用于比較某些測量值與參比群體的值，以便對所述測量值進行分級。這可以是例如在預定樣品的集合中某些實體的水平的中值，這意味著在給定數(shù)量的樣品中將所述實體的測量水平與所述實體的水平的數(shù)學中值進行比較。對用于確定中值的樣品的數(shù)量沒有具體限制，但是應該足以確保中值的統(tǒng)計學顯著性。用于確定中值的樣品數(shù)量甚至可以隨著時間過程而增加，結(jié)果加入了來自臨床樣品的其他測量值，以便增加中值的統(tǒng)計學顯著性。優(yōu)選情況下，樣品數(shù)量的選擇使得中值的統(tǒng)計學顯著性得到確保。因此，所述中值被用作參比值，由此可以根據(jù)高于或低于中值的相對水平以及測量值偏離所述中值的程度，將上述實體的測量水平與某些生理狀態(tài)、例如患者出現(xiàn)不利結(jié)果的傾向性進行統(tǒng)計學關聯(lián)。除了中值之外，可以與上面的描述類似地使用其他統(tǒng)計方法，例如分位數(shù)(例如分位數(shù)或百分位數(shù))測定或數(shù)學模型，優(yōu)選為Cox回歸，以便獲得上述的參比值和/或確定測量值對于從其獲得樣品的給定對象的生理狀態(tài)的顯著性。所述數(shù)學或統(tǒng)計學方法或模型對于本領域技術人員來說是公知的，它在醫(yī)藥應用的情況下的使用也是已經(jīng)接受的。 術語"生物標志物(生物學標志物)"涉及可測量和可定量的生物學參數(shù)(例如特定酶濃度，特定激素濃度，特定基因表型在群體中的分布，生物學物質(zhì)的存在)，可以用作健康和生理學相關評估，例如疾病風險、精神錯亂、環(huán)境暴露及其影響、疾病診斷、代謝過程、物質(zhì)濫用、妊娠、細胞系建立(development)、流行病學研究等的指標。此外，生物標志物被定義為客觀測量和評估的特征，作為正常生物學過程、病理過程或?qū)χ委熜愿深A的藥理學響應的指示。生物標志物可以在生物樣品(例如血液、尿液或組織測試物)上測量，它可以是從人獲得的記錄(血壓、ECG或Holter心電圖)，或者它可以是成像測試(超聲心電圖或CT掃描)(Vasan等，2006， Circulation113 :2335-2362)。 生物標志物可以指示各種不同健康或疾病特征，包括暴露于環(huán)境因素的水平或類型，遺傳易感性，對暴露的遺傳響應，亞臨床或臨床疾病的生物標志物，或?qū)Ο煼憫闹笜?。因此，可以簡單化地將生物標志物想成是疾病性?風險因子或風險標志物)、疾病狀態(tài)(臨床前或臨床)或疾病速度(進展)的指示物。因此，生物標志物可以被分類成前因生物標志物(鑒定發(fā)生疾病的風險)，篩選生物標志物(篩選亞臨床疾病)，診斷生物標志物(識別明顯疾病)，分級生物標志物(為疾病嚴重性分類)或預后生物標志物(預測將來的疾病過程，包括復發(fā)和對療法的反應，以及監(jiān)測療法的效能)。生物標志物也可以用作替代終點。替代終點是在臨床試驗中用作結(jié)果代替所需真正結(jié)果的測量，以評估療法的安全性和有效性的終點。其中的原理是替代終點的變化緊密跟從所需結(jié)果的變化。替代終點的優(yōu)點在于它們與需要大型臨床試驗才能評估的終點例如發(fā)病和死亡相比，可以在較短的時間框架內(nèi)使用較低的成本而收集到。替代終點的其他價值包括與更遙遠的臨床事件相比，它們更接近于目標暴露/干預，可以更容易地進行因果關聯(lián)。替代終點的一個重要缺點是如果目標臨床結(jié)果受到大量因素(除了替代終點之外)的影響，剩余的混雜性可能降低替代終點的有效性。已經(jīng)表明，如果替代終點能夠解釋暴露或干預對目標結(jié)果的影響的至少50%，其正確性就較高。例如，生物標志物可以是蛋白、肽或核酸分子。
優(yōu)選情況下，所述預后生物標志物之一是從所述患者獲得的樣品中的proBNP或其片段。更優(yōu)選情況下，所述proBNP片段是NT pro-BNP或BNP。 在具體的實施方案中，體外方法還包括測定從所述患者獲得的樣品中一種或多種其他預后生物標志物的水平，以及將所述降鈣素原或其片段的水平和所述一種或多種其他預后生物標志物的水平二者都與所述對風險的易感性相關聯(lián)，由此所述降鈣素原或其片段的水平與所述一種或多種其他預后生物標志物的水平的組合，增加了所述降鈣素原或其片段的水平對所述風險的預測值。 其他預后生物標志物可以例如選自肌鈣蛋白、髓過氧化物酶、CRP、新蝶呤、GDF-15、 ST2、抑半胱氨酸蛋白酶肽-C(cystatin-C)，以及下列肽的成熟肽、激素原(前體)
和相關的激素原片段的形式利尿鈉肽，腎上腺髓質(zhì)素，內(nèi)皮素，血管加壓素。 優(yōu)選情況下，所述降鈣素原或其片段的水平和所述一種或多種其他預后生物標志
物的水平之間的關聯(lián)性，使用數(shù)學算法來進行。 在另一方面，本發(fā)明涉及檢測下限低于大約0. 05ng/mL，優(yōu)選低于大約0. 04ng/ mL，更優(yōu)選低于大約0. 03ng/mL，最優(yōu)選低于大約0. 02ng/mL 的超靈敏降鈣素原測定方法 在確定患非感染性原發(fā)疾病的患者患還沒有被證實和/或尚無癥狀的其他疾病或醫(yī)學病 癥的風險中的應用。 在超靈敏降鈣素原測定方法的應用的優(yōu)選實施方案中，在來自所述患者的樣品 中，測量降鈣素原或其長度為至少12個氨基酸的片段或降鈣素原和/或其片段的混合物的 水平。在一個實施方案中，只測定了一個片段的水平。在另一個實施方案中，測定降鈣素原 和/或其片段的混合物的水平。 本文中提到的"測定方法"或"診斷測定方法"可以是在診斷學領域中使用的任何 類型的測定方法，包括但不限于基于酶反應、發(fā)光、熒光或放射化學物質(zhì)的測定方法。優(yōu)選 的檢測方法包括快速檢驗(現(xiàn)場檢驗)、放射免疫分析、化學發(fā)光和熒光免疫分析、免疫印 跡分析、酶聯(lián)免疫分析(ELISA)、基于Luminex的珠子陣列和蛋白微陣列分析。測定方法的 類型還可以是基于微孔板的、基于芯片的、基于珠子的，其中生物標志物可以結(jié)合到表面上 或在溶液中。測定方法可以是均質(zhì)或異質(zhì)測定方法，夾心測定方法，競爭性和非競爭性測定 方法。在特別優(yōu)選的實施方案中，測定方法采用夾心測定方法，這是一種非競爭性免疫分 析，其中待檢測和/或定量的分子與第一抗體和第二抗體結(jié)合。第一抗體可以結(jié)合到固相 上，例如珠子、孔或其他容器的表面、片或條，第二抗體是用例如染料、放射性同位素或反應 性或催化活性基團標記的抗體。然后通過適當?shù)姆椒y量位點上被標記抗體的量。"夾心 測定方法"所涉及的通用成分和步驟是已被接受的，并為專業(yè)技術人員所知(《免疫分析方 法手冊》(The Immunoassay Handbook), David Wild主編，Elsevier LTD， Oxford ;第三片反 (2005年5月)，ISBN-13 :978-0080445267 ;Hultschig C等，Curr 0pin Chem Biol. 2006 Feb, 10(1) :4-10. PMID :16376134，在此引為參考)。 在特別優(yōu)選的實施方案中，測定方法包含兩種捕獲分子(捕獲探針)，優(yōu)選都為分 散在液體反應混合物中的抗體，其中第一種標記成分與第一捕獲分子結(jié)合，其中所述第一 種標記成分是基于熒光或化學發(fā)光_淬滅或擴增的標記系統(tǒng)的一部分，所述標記系統(tǒng)的第 二種標記成分與第二捕獲分子結(jié)合，以便在兩種捕獲分子與待檢測的被分析物結(jié)合后，產(chǎn) 生可測量的信號，允許在含有樣品的溶液中檢測形成的夾心復合物。 在本發(fā)明的情況下，捕獲探針可以選自核酸分子特別是適體(即tamer)，碳水化合 物分子，PNA分子，蛋白，肽特別是環(huán)狀肽，或糖蛋白。 在更優(yōu)選情況下，所述標記系統(tǒng)含有稀土穴狀化合物或稀土螯合物與熒光染料或 化學發(fā)光染料、特別是花青素類型的染料的組合。 在本發(fā)明的情況下，基于熒光的測定方法包含使用染料，染料可以例如選自 FAM(5-或6-羧基熒光素)，VIC， NED，熒光素，熒光素異硫氰酸酯(FITC) ， IRD_700/800，花青 素染料例如CY3、CY5、CY3. 5、CY5. 5、Cy7，貼噸(Xanthen)，6-羧基-2' ，4' ，7' ，4，7_六氯 熒光素(HEX)，TET，6-羧基-4' ，5' -二氯_2' ，7' _ 二甲氧基熒光素(JOE) ， N， N， N'，
9N'-四甲基_6-羧基羅丹明(TAMRA)，6-羧基-X-羅丹明(R0X) ， 5-羧基羅丹明-6G(R6G5)， 6_羧基羅丹明_6G (RG6)，羅丹明，羅丹明綠，羅丹明紅，羅丹明110， BODIPY染料例如BODIPY TMR，俄勒岡綠，香豆素例如傘形酮，苯甲酰亞胺例如Hoechst33258，菲啶例如德克薩斯紅， 雅吉瓦黃(Yakima Yellow), Alexa Fluor ， PET，溴化乙錠，吖啶染料，咔唑染料，吩噁嗪染 料，卩卜啉染料，Polymethin染料等。 在本發(fā)明的情況下，基于化學發(fā)光的測定方法包括使用在下述文獻中描述 的基于物理原理的化學發(fā)光材料的染料，該文獻為Kirk-0thmer的《化學技術百科全 書》(Encyclopedia of chemicaltechnology，第四片反，執(zhí)行編輯J. I. Kroschwitz，編輯 M. Howe-Grant， John Wiley & Sons, 1993， vol. 15， p. 518-562，在此引為參考，包括在 551-562頁中的引用文獻。優(yōu)選的化學發(fā)光染料是吖啶酯。 在本發(fā)明的情況下，術語"超靈敏降鈣素原測定方法"意味著用于檢測降鈣素原或 其片段和/或定量其水平的測定方法，具有低于大約0. 05ng/mL，優(yōu)選低于大約0. 04ng/mL， 更優(yōu)選低于大約0. 03ng/mL，最優(yōu)選低于大約0. 02ng/mL的檢測下限。
超靈敏降鈣素原測定方法是例如PCT靈敏性LIA(發(fā)光免疫分析)試劑盒 (B. R. A. H. M. S AG， Hennigsdorf， Germany,產(chǎn)品號109. 050)。在本發(fā)明的情況下，PCT水 平可以用例如上面描述的測定方法，優(yōu)選使用PCT靈敏性LIA(發(fā)光免疫分析)試劑盒 (B. R. A. H. M. S AG，Hennigsdorf,Germany,產(chǎn)品號109. 050)，按照實施例1中或按照實施例 2中描述的通用步驟進行測定。 優(yōu)選情況下，使用超靈敏降鈣素原測定方法，對在患原發(fā)性疾病的患者中發(fā)生其 他疾病或醫(yī)學病癥的風險進行分級。 超靈敏降鈣素原測定方法可用于控制所述其他疾病或醫(yī)學病癥的治療或預防。優(yōu) 選情況下，所述治療或預防包括向患者給藥抗生素。 超靈敏降鈣素原測定方法可以是例如是包含兩種針對降鈣素原不同部分的抗體 的夾心測定方法。 在超靈敏降鈣素原測定方法的應用的具體實施方案中，一種抗體針對降鈣素原的 降鈣素部分，另一種抗體是針對降鈣素原的下鈣素(katacalcin)部分的單克隆抗體。
在本發(fā)明的情況下，術語"降鈣素原的降鈣素部分"是指含有前降鈣素原的85-116 位氨基酸的多肽。在本發(fā)明的情況下，"降鈣素原的下鈣素部分"是指含有前降鈣素原的 121-141位氨基酸的多肽。上述氨基酸編號參照蛋白數(shù)據(jù)庫索引http:〃麗w. expasy. ch/ uniprot/P01258中列出的人類前降鈣素原的序列。還包含了在其他物種中類似起源的氨基 酸序列，以及與上述人類多肽具有優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、最優(yōu)選至少98%序列 同源性的多肽。 另一方面，本發(fā)明涉及在患原發(fā)性疾病的患者中，在局部感染的治療中用于預防 還沒有被證實的其他疾病或醫(yī)學病癥的抗生素，其中所述原發(fā)性疾病不是感染，并且其中 當在選自血液樣品、血清樣品和血漿樣品的患者樣品中，降鈣素原或其長度為至少12個氨 基酸的片段的水平在0. 02到0. 25ng/mL之間、優(yōu)選在0. 02到0. lng/mL之間時，給藥抗生 素。優(yōu)選情況下，當所述患者用抗生素進行治療時，患其他疾病或醫(yī)學病癥的風險降低。
另一方面，本發(fā)明涉及用于在患者中診斷細菌性感染的存在的體外方法，方法包 括在從所述患者獲得的樣品中測定降鈣素原或其長度為至少12個氨基酸的片段的水平
(i)在所述抗生素治療開始之前或治療開始后6小時內(nèi)測定至少一次，以及
(ii)在患者的抗生素治療開始后12小時到1周內(nèi)進行至少一次；
以及將所述降鈣素原或其片段的水平與細菌性感染的存在相關聯(lián)，其中所述水平 每24小時降低至少20% ng/mL，指示在患者中存在細菌性感染。 優(yōu)選情況下，患者患非感染性原發(fā)疾病，并且在所述患者的血清或血漿樣品中降 鈣素原或其長度為至少12個氨基酸的片段的水平，低于0. 25ng/mL。 在本發(fā)明的情況下，術語"抗生素"是指具有抑制微生物生長或殺死微生物的能力 的化學物質(zhì)。不同抗生素可能具有各種不同的作用機制，例如通過與細菌核糖體亞基結(jié)合 從而抑制蛋白的生物合成，抑制細胞壁合成，例如通過抑制肽聚糖合成，與細菌細胞質(zhì)膜相 互作用從而例如改變其通透性，抑制細菌DNA旋轉(zhuǎn)酶或拓撲異構(gòu)酶IV酶從而抑制DNA復制 和轉(zhuǎn)錄，抑制葉酸鹽(或酯)合成，或通過與RNA聚合酶結(jié)合抑制轉(zhuǎn)錄。在本發(fā)明的情況下， 抗生素可以選自例如P-內(nèi)酰胺類、糖肽類、聚酮類、氨基糖苷類抗生素、多肽抗生素、氟喹 諾酮類(chinolones)和磺胺類。優(yōu)選情況下，術語是指P _內(nèi)酰胺化合物例如青霉素，頭 孢菌素類或碳青霉烯類；四環(huán)素類；大環(huán)內(nèi)酯類；氟喹諾酮類；磺胺類；氨基糖苷類；咪唑 類；肽類抗生素和林可酰胺類。更具體來說，術語涉及阿莫西林，氟氯西林，青霉素G，氨芐 青霉素，甲氧西林，噁西林，頭孢西丁，頭孢曲松，頭孢唑肟，亞胺培南，紅霉素，泰洛星，替米 考星，螺旋霉素，交沙霉素，阿奇霉素，克拉霉素，四環(huán)素，米諾環(huán)素，多西環(huán)素，賴甲環(huán)素，氟 諾沙星，依諾沙星，氧氟沙星，復方磺胺甲噁唑(co-trimoxazole)，環(huán)丙沙星，三甲氧芐啶， 慶大霉素，阿米卡星，甲硝唑，枯草桿菌肽，克林霉素或林可霉素。最優(yōu)選情況下，術語涉及 氨芐西林，頭孢噻肟，紅霉素，四環(huán)素，環(huán)丙沙星，復方磺胺甲噁唑，慶大霉素，甲硝唑，枯草 桿菌肽或克林霉素。
實施例 ^MMl^在患各種不同原發(fā)性疾病的患者的樣品中測定降鈣素原水平 使用B. R. A. H. M. S PCT靈敏性LIA(發(fā)光免疫分析)試劑盒(B. R. A. H. M. S AG，
Hennigsdorf， Germany,產(chǎn)品號109. 050)，分析了 4997份連續(xù)的臨床實驗室的患者血清樣 品，測定了降鈣素原(PCT)水平?；颊叩难逵蓙碜圆煌t(yī)學領域、例如腎病學、泌尿?qū)W、腫 瘤學、兒科學、內(nèi)科學、一般內(nèi)科等的不同咨詢專業(yè)醫(yī)生送到實驗室進行分析。分析測定按 照與試劑盒一起運輸?shù)氖謨赃M行，除了將樣品體積從50 L增加到100 ii L，以增加功能性 測定靈敏度(FAS)并可靠地測定較低濃度范圍內(nèi)(0. 05到0. 25ng/mL)的PCT濃度之外。
測定的PCT水平的頻率已經(jīng)作圖在直方圖中(參見隨附的圖1) 。 66. 7%的血清 樣品顯示出PCT水平高于O. 017ng/mL，26. 0%的血清樣品顯示出PCT濃度高于O. 03ng/mL， 14. 0%的血清樣品顯示出PCT水平高于0. 05ng/mL。 PCT濃度高于0. 05ng/mL的樣品(即 4997份樣品中的702份樣品)已經(jīng)按照相應樣品所源自的咨詢專業(yè)醫(yī)生的醫(yī)學領域進行了 分類。這種關聯(lián)性作圖于隨附的圖2中。大量患者盡管患非感染性原發(fā)疾病，但是具有分 別高于0. 03ng/mL和0. 05ng/mL的PCT水平，這是令人吃驚的發(fā)現(xiàn)。
^MMi^在患者樣品中測定降鈣素原水平的通用步驟 降f丐素原(PCT)可以按照描述進行測量(Morgenthaler NG等，Clin Chem， 2002 May， 48 (5) ，788-790)。針對PCT的降f丐素部分產(chǎn)生了綿羊抗體，針對PCT的下f丐素部分產(chǎn)
11生了小鼠單克隆抗體。將管用抗下鈣素抗體包被?？菇碘}素抗體用MACN吖啶酯(InVent GmbH， Hennigsdorf, Germany)標記，用作示蹤劑。重組PCT在正常馬血清中的稀釋液被用 作標準品。將100 y L樣品或標準品在包被的管中溫育30分鐘，加入200 ii L示蹤劑。在溫 育2小時后，將管用lml LIA清洗溶液(B. R. A. H. M. S AG)清洗4次，并結(jié)合。化學發(fā)光使 用LB952T照度計(Berthold， Germany)進行測量。
權利要求
用于患非感染性原發(fā)疾病的患者的預后的體外方法，該方法包括在從所述患者獲得的樣品中，測定降鈣素原或其長度為至少12個氨基酸的片段的水平；以及將所述降鈣素原或其片段的水平與患者患還沒有被證實和/或尚無癥狀的其他疾病或醫(yī)學病癥的風險相關聯(lián)。
2. 權利要求l的體外方法，其中所述降鈣素原或其片段的水平指示患者的細菌性感染。
3. 權利要求2的體外方法，其中所述感染是局部感染。
4. 權利要求2或3的體外方法，其中所述細菌感染能用抗生素治療。
5. 權利要求4的體外方法，其中當所述患者用抗生素進行治療時，患其他疾病或醫(yī)學 病癥的風險降低。
6. 權利要求1到5的方法，其中所述關聯(lián)步驟包括將所述降鈣素原或其片段的水平與 閾值水平進行比較，由此，當所述降鈣素原或其片段的水平超過所述閾值水平時，所述患者 對所述風險易感。
7. 權利要求1到6的方法，其中所述閾值水平在0. 02到0. 25ng/mL之間。
8. 前述權利要求任一項的體外方法，其中所述原發(fā)疾病選自但不限于癌癥、糖尿病、慢 性胃腸疾病、慢性腎病、高血壓、包括骨質(zhì)疏松癥的整形外科疾病，以及包括阿茨海默氏病 的神經(jīng)退行性疾病。
9. 前述權利要求任一項的體外方法，其中所述其他疾病或醫(yī)學病癥選自心臟疾病，所 述心臟疾病選自但不限于動脈粥樣硬化、急性冠脈綜合癥和心力衰竭。
10. 前述權利要求任一項的方法，其中所述樣品選自血液樣品、血清樣品、血漿樣品和 尿液樣品或任何上述樣品的提取物。
11. 前述權利要求任一項的方法，還包括將所述降鈣素原或其片段的水平與一種或多 種其他預后生物標志物的水平相關聯(lián)，由此所述降鈣素原或其片段的水平與所述其他預后 生物標志物的水平的組合，增加了所述降鈣素原或其片段的水平或所述相關標志物的水平 對所述風險的預測值。
12. 權利要求11的方法，其中所述預后生物標志物之一是從所述患者獲得的樣品中的 proBNP或其片段。
13. 權利要求11或12的方法，其中所述proBNP片段是NT proBNP或BNP。
14. 權利要求11到13任一項的方法，還包括測定從所述患者獲得的樣品中一種或多種 其他預后生物標志物的水平，以及將所述降鈣素原或其片段的水平和所述一種或多種其他 預后生物標志物的水平二者都與所述對風險的易感性相關聯(lián)，由此所述降鈣素原或其片段 的水平與所述一種或多種其他預后生物標志物的水平的組合，增加了所述降鈣素原或其片 段的水平對所述風險的預測值。
15. 權利要求11到14任一項的方法，其中其他預后生物標志物選自肌鈣蛋白、髓過氧 化物酶、CRP、新蝶呤、GDF-15、 ST2、抑半胱氨酸蛋白酶肽-C，以及下列肽的成熟肽、前體、激 素原和相關的激素原片段的形式利尿鈉肽，腎上腺髓質(zhì)素，內(nèi)皮素，血管加壓素。
16. 權利要求11到15任一項的方法，其中所述降鈣素原或其片段的水平和所述一種或 多種其他預后生物標志物的水平之間的關聯(lián)，使用數(shù)學算法來進行。
17. 檢測下限低于大約0. 05ng/mL的超靈敏降鈣素原測定方法在確定患有非感染性原發(fā)疾病的患者患還沒有被證實和/或尚無癥狀的其他疾病或醫(yī)學病癥的風險中的應用。
18. 權利要求17的超靈敏降鈣素原測定方法的應用，其中在來自所述患者的樣品中， 測定降鈣素原或其長度為至少12個氨基酸的片段或降鈣素原和/或其片段的混合物的水平。
19. 權利要求17或18的超靈敏降鈣素原測定方法的應用，用于對患原發(fā)性疾病的患者 患其他疾病或醫(yī)學病癥的風險進行分級。
20. 權利要求17到19的超靈敏降鈣素原測定方法的應用，用于控制所述其他疾病或醫(yī) 學病癥的治療或預防。
21. 權利要求20的超靈敏降鈣素原測定方法的應用，其中所述治療或預防包括向患者 給藥抗生素。
22. 權利要求17到21的超靈敏降鈣素原測定方法的應用，其中測定方法是包含兩種針 對降鈣素原不同部分的抗體的夾心測定方法。
23. 權利要求17到22的超靈敏降鈣素原測定方法的應用，其中一種抗體針對降鈣素原 的降鈣素部分，另一種抗體是針對降鈣素原的下鈣素部分的單克隆抗體。
24. 在患原發(fā)性疾病的患者的局部感染的治療中用于預防還沒有被證實的其他疾病或 醫(yī)學病癥的抗生素，其中所述原發(fā)性疾病不是感染，并且其中當在選自血液樣品、血清樣品 和血漿樣品的患者樣品中，降鈣素原或其長度為至少12個氨基酸的片段的水平在0. 02到 0. 25ng/mL之間時，給藥抗生素。
25. 權利要求24的抗生素，其中當所述患者用抗生素進行治療時，患其他疾病或醫(yī)學 病癥的風險降低。
26. 用于診斷患者的細菌性感染的存在的體外方法，該方法包括在從所述患者獲得 的樣品中測定降鈣素原或其長度為至少12個氨基酸的片段的水平(i) 在所述抗生素治療開始之前或治療開始后6小時內(nèi)進行至少一次，以及(ii) 在患者的抗生素治療開始后12小時到1周進行至少一次；以及將所述降鈣素原或其片段的水平與細菌性感染的存在相關聯(lián)，其中所述水平每24 小時降低至少20%，指示在患者中存在細菌性感染。
27. 權利要求26的體外方法，其中患者患非感染性原發(fā)疾病，并且其中在所述患者的 血清或血漿樣品中降鈣素原或其長度為至少12個氨基酸的片段的水平低于0. 25ng/mL。
全文摘要
本發(fā)明的主體是用于患原發(fā)性非傳染疾病的患者的體外診斷、預后和風險分級的分析方法和體外方法，其中患者體液樣品中降鈣素原(PCT)的水平指示了患者患其他疾病或醫(yī)學病癥的風險。
文檔編號A61P31/04GK101790687SQ200880101846
公開日2010年7月28日 申請日期2008年8月1日 優(yōu)先權日2007年8月3日
發(fā)明者安德烈亞斯·貝格曼, 約阿希姆·斯特魯克 申請人:B.R.A.H.M.S有限公司