專利名稱：用于不良事件的預(yù)后的降鈣素原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域是臨床診斷學(xué)。具體地說，本發(fā)明涉及對象體液樣本中降鈣素原 (PCT)水平的測定。
背景技術(shù)：
降鈣素原(PCT)被認為是生物標志物，其反映了局部和全身性細菌感染即敗血癥的存在和嚴重度(Assicot 等，Lancet 1993 ;341 :515-8 ;Muller 等，Crit Care Med 2000 ；28 :977-83 ；Harbarth 等，Am J Respir Crit Care Med 2001 ；164 :396-402 ；Becker 等，Crit Care Med 2008 ;36 :941-52 ;Becker 等，J Clin Endocrinol Metab 2004:89: 1512-25 ;Nobre 等，Am J Respir Crit Care Med 2008 177 :498-505 ;Christ_Crain 等， Lancet 2004 ；363 :600-7 ；Stolz 等，Chest 2007 ；131 :9_19 ；Christ-Crain 等 Am J Respir Crit Care Med 2006 ； 174 :84-93 ;Briel 等，Arch Intern Med 2008 ； 168 :2000-7 ；討論 (discussion)7-8)。在細菌感染期間，血漿PCT濃度典型為高于0.25ng/mL。最近，通過使用高度敏感的分析技術(shù)，已發(fā)現(xiàn)在幾種非感染性疾病中PCT濃度可升至正常范圍的上限濃度范圍或超出，但是低于已知與需要抗菌治療的細菌感染相關(guān)的濃度。此外，已發(fā)現(xiàn)這些PCT濃度與這些患者的不利的預(yù)后相關(guān)。這些疾病包括冠狀動脈疾病和急性冠狀動脈綜合征。僅有兩份出版物描述了健康個體中的定量 PCT 濃度(Morgenthaler 等，Clin Chem2002，48 :788-790 ；Morgenthaler 等， Clin Lab 2002，48 :263-270)。然而，還不知道健康個體中相對升高的PCT濃度是否可以與潛在的未來不良事件的發(fā)生聯(lián)系起來。對初診時(at presentation)表觀健康的個體預(yù)測未來不良事件的可能性是重要的，因為對風(fēng)險的早期識別是幫助防止不良事件的發(fā)展的起始措施的先決條件。因此本發(fā)明的目標是在表觀健康(無癥狀)的群體中的PCT水平與不良事件的預(yù)后之間建立關(guān)聯(lián)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于意外地發(fā)現(xiàn)，以統(tǒng)計學(xué)相關(guān)的方式，與將不會患不良事件的無癥狀對象樣本中的PCT水平相比，后來患了不良事件的無癥狀對象樣本中的PCT水平增高。本發(fā)明涉及無癥狀對象經(jīng)歷不良事件的預(yù)后的體外方法。所述方法包含首先，測定對象樣本中降鈣素原(PCT)或其片段的水平。其次，將降鈣素原或其片段的水平與對象患不良事件的風(fēng)險之間建立聯(lián)系。
具體實施例方式本發(fā)明涉及確定表觀健康的對象患不良事件的風(fēng)險或確定表觀健康的對象是否存在未來患不良事件的增加的風(fēng)險的方法。優(yōu)選地，可以預(yù)測在約6個月至10年的時期內(nèi)不良事件發(fā)生的風(fēng)險。所述方法包含下列步驟第一，提供對象的樣本。第二，測定樣本中降鈣素原(PCT)或其片段的水平。第三，基于所述PCT水平來確定對象患不良事件的風(fēng)險或基于所述PCT水平來確定是否對象具有患不良事件的增加的風(fēng)險。術(shù)語“風(fēng)險”是指對象未來患某種不良事件的可能性。當在本文中使用時術(shù)語“對象”是指活著的人或非人的生物體。在優(yōu)選實施方案中，對象是人類。此外，優(yōu)選在從對象獲取所述對象的樣本時，該對象不存在(有癥狀的) 細菌感染。這確保了在對象中PCT水平不會升高到超過正常范圍。因此，優(yōu)選在實施本發(fā)明的方法之前先測試對象是否存在細菌感染。所述“表觀健康的”對象優(yōu)選也沒有任何非感染性疾病，即所述對象沒有顯示出將可以診斷為非感染性疾病的任何癥狀。術(shù)語“非感染性疾病”是指疾病如高血壓、骨科疾病如骨質(zhì)疏松癥、以及神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病(Alzheimer's disease)。已知由于出生后創(chuàng)傷，所以新生兒的PCT濃度是升高的。因此，新生兒被排除在本權(quán)利要求書之外。根據(jù)本發(fā)明的定義，新生兒的年齡優(yōu)選在1天至10天之間，更優(yōu)選為一天至3天。還已知在手術(shù)后的患者中PCT濃度是升高的，例如在器官移植如心臟移植、肺移植、肝移植、腎移植、 心臟手術(shù)后。因此，對于在手術(shù)后、例如在器官移植如心臟移植、肺移植、肝移植、腎移植、心臟手術(shù)后的患者，如果所述手術(shù)是在最近七天內(nèi)進行的，則被排除在健康人群之外；優(yōu)選如果所述手術(shù)是在最近十四天內(nèi)進行的話，則術(shù)后患者被除外。在另一外實施方案中，在最近兩個月內(nèi)經(jīng)歷過手術(shù)的術(shù)后患者被除外。優(yōu)選地，在最近14天、優(yōu)選7天內(nèi)經(jīng)歷了創(chuàng)傷的創(chuàng)傷后患者和人被除外。當在本文中使用時，術(shù)語“樣本”是指出于對目標對象如患者進行診斷、預(yù)后、或評估的意圖而獲取的體液樣本。優(yōu)選的測試樣本包括血液、血清、血漿、腦脊液、尿、唾液、痰、 以及胸腔積液。此外，本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員將了解，在分餾或純化程序后，例如將全血分離為血清或血漿成分后，一些測試樣本將會更易于分析。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述樣本選自血液樣本、血清樣本、血漿樣本、 腦脊液樣本、唾液樣本、以及尿樣本、或上述樣本中任何一種的提取物。優(yōu)選地，所述樣本為血液樣本、最優(yōu)選為血清樣本或血漿樣本。在本發(fā)明中，術(shù)語“預(yù)后”表示預(yù)測對象(例如患者)的醫(yī)療狀況將如何進展。這可包括對所述對象發(fā)生不良事件的可能性的評估?！安涣际录被虿涣己蠊欢x為危害個體健康的事件或后果。所述不良事件不限于，但可選自心臟事件、心血管事件、腦血管事件、癌癥、糖尿病、以及所有原因所致的死亡。 不良事件包括感染、嚴重感染、敗血癥樣全身性感染、以及敗血癥。不良事件不是由急性外因所致的不良事件和/或外因所致的創(chuàng)傷引起的事件。外因所致的創(chuàng)傷包括可由事故如車禍引起的那些。因此外因所致的創(chuàng)傷被排除在不良事件類群之外。心臟事件被定義為任何下列事件的總和急性心肌梗塞(ICD-編碼410)、急性和亞急性缺血性心臟病(ICD-編碼411)、以及下列手術(shù)冠狀動脈旁路移植術(shù)或經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)。腦血管事件被定義為任何下列事件的總和大腦前動脈(ICD-編碼43 或腦動脈 (I⑶-編碼434)的閉塞或狹窄。心血管性死亡被定義為由心臟或腦血管事件所致的死亡。總心血管事件被定義為心臟事件、腦血管事件、以及心血管性死亡的總和。如在本文中提到的，在蛋白質(zhì)或肽的情形中，術(shù)語“片段”是指可自較大的蛋白質(zhì)或肽衍生的較小的蛋白質(zhì)或肽，因此其包含了所述較大蛋白質(zhì)或肽的部分序列。所述片段通過對較大的蛋白質(zhì)或肽的一個或多個肽鍵的皂化而從其衍生。在本發(fā)明的情形中，降鈣素原優(yōu)選涉及跨越氨基酸殘基1-116、2_116、或3-116的肽或其片段。因此，降鈣素原片段的長度應(yīng)為至少12或15個氨基酸、優(yōu)選50個氨基酸以上、更優(yōu)選100或110個氨基酸以上。PCT可包含翻譯后修飾如糖基化、liposidation、或衍生化。PCT本身是降鈣素和鈣抑肽(katacalcin)的前體。PCT 1-116的氨基酸序列在SEQ ID NO. 1中給出。在本發(fā)明的情形中，術(shù)語“水平”涉及取自對象的樣本中的PCT (或片段/前體)的濃度(優(yōu)選以重量/體積；w/v來表示)。本文中對PCT或片段或其前體或片段的水平的測定(或測量或檢測)使用如下文中所說明的檢測方法和/或診斷學(xué)分析來進行。如本文中所提到的，“分析”或“診斷學(xué)分析”可以是在診斷學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用的任何類型。這樣的分析可以基于待檢測的分析物與具有一定程度親和力的一種或多種捕獲探針的結(jié)合。就捕獲分子與靶分子或目標分子之間的相互作用來說，親和常數(shù)優(yōu)選大于IO8MA在本發(fā)明的情形下，“捕獲分子”是可用于結(jié)合來自樣本的靶分子或目標分子、即分析物(即在本發(fā)明的情形中為心血管肽)的分子。因此捕獲分子必須要在空間上并且根據(jù)表面特征如表面電荷、疏水性、親水性、Lewis供體和/或受體的存在與否來進行適當造型，以特異性地與靶分子或目標分子結(jié)合。因此，所述結(jié)合可以例如通過如下相互作用進行調(diào)節(jié)捕獲分子與靶分子或目標分子之間的離子、范德華(van-der-Waals)、π - ji、σ - ji、 疏水鍵或氫鍵的相互作用、或上述相互作用中兩種或更多種的組合。在本發(fā)明的情形中，捕獲分子可例如選自核酸分子、碳水化合物分子、RNA分子、蛋白質(zhì)、抗體、肽、或糖蛋白。優(yōu)選地，捕獲分子是對靶或目標分子具有充分親和力的抗體，包括其片段；且包括重組抗體或重組抗體片段、以及所述抗體的化學(xué)和/或生化修飾的衍生物或來源于其長度為至少12個氨基酸的變異鏈的片段。優(yōu)選的檢測方法包含各種形式的免疫分析如放射免疫分析(RIA)、化學(xué)發(fā)光和熒光免疫分析、酶聯(lián)免疫分析(ELISA)、液相芯片基珠陣列(Luminex-based bead arrays)、蛋白質(zhì)微陣列分析、以及快速測試形式如免疫層析試紙條測試。PCT水平的測定優(yōu)選使用(多克隆或優(yōu)選單克隆)抗體來進行，特別是與PCT的鈣抑肽部分或降鈣素部分特異性結(jié)合的抗體。所述分析可以是同質(zhì)性或異質(zhì)性分析、競爭性和非競爭性分析。在特別優(yōu)選的實施方案中，所述分析的形式是夾心式分析(sandwich assay)，其是非競爭性免疫分析，其中將待檢測和/或量化的分子與第一抗體以及第二抗體結(jié)合。所述第一抗體可以與固相如珠子、孔或其它容器的表面、芯片或試紙條結(jié)合，且第二抗體是使用例如染料、放射性同位素、或反應(yīng)性或催化活性部分標記的抗體。然后通過適當?shù)姆椒▉頊y量與分析物結(jié)合的標記抗體的量。與“夾心式分析”相關(guān)的一般構(gòu)成和程序是已確立的，且是專業(yè)人員所了解的。(《免疫分析手冊》(The Immunoassay Handbook), David Wild 編輯，Elsevier LTD, Oxford ；第三版· (2005 年 5 月)，ISBN-13 :978-0080445267 ；Hultschig C 等，Curr OpinChem Biol. 2006 年 2 月；10(1) :4-10. PMID 16376134)，通過參考被納入本文)。在特別優(yōu)選的實施方案中，所述分析包含兩種捕獲分子，優(yōu)選二者都作為液體反應(yīng)混合物中的分散體存在的抗體，其中將第一標記組分連接到第一捕獲分子上，其中所述第一標記組分是基于熒光-或化學(xué)發(fā)光-猝滅或放大的標記系統(tǒng)的一部分，并將所述標記系統(tǒng)的第二標記組分連接到第二捕獲分子上，使得在兩種捕獲分子都與分析物結(jié)合后產(chǎn)生了可測量的信號，其允許檢測含有樣本的溶液中所形成的夾心式復(fù)合物。還更優(yōu)選地，所述標記系統(tǒng)包含與熒光染料或化學(xué)發(fā)光染料、尤其是菁類染料組合的稀土穴狀化合物或稀土螯合物。在本發(fā)明的情形中，基于熒光的分析包含染料的使用，所述染料可例如選自 FAM(5-或6-羧基熒光素)、VIC、NED、熒光素、異硫氰酸熒光素(FITC)、IRD-700/800、菁染料如 CY3、CY5、CY3. 5、CY5. 5、CY7、咕噸、6-羧基-2，，4，，7，，4，7-六氯熒光素(HEX)、ΤΕΤ、 6-羧基_4，，5，- 二氯-2，，7，，二甲氧基熒光素(J0E)、N，N，N，，N，-四甲基-6-羧基若丹明(TAMRA)、6-羧基-X-若丹明(ROX)、5-羥基若丹明_6G (R6G5)、6-羧基若丹明_6G (RG6)、 若丹明、若丹明綠、若丹明紅、若丹明110、BODIPY染料如BODIPY TMR、俄勒岡綠、香豆素如傘形酮、苯甲亞胺如Hoechst 33258 ；菲啶如德克薩斯紅、亞基馬黃、Alexa Fluor、PET、溴化乙錠、吖啶染料、咔唑染料、吩惡嗪染料、嚇啉染料、多次甲基染料等。在本發(fā)明的情形中， 基于化學(xué)發(fā)光的分析包含染料的使用，其基于在如下文獻中描述的化學(xué)發(fā)光材料的物理原理Kirk-Othmer,《化工技術(shù)百禾斗全書》(Encyclopedia of chemical technology),第 4 版，執(zhí)行編輯:J. I. Kroschwitz ；編輯Μ· Howe-Grant, John Wiley & Sons，1993，第 15 卷， p. 518-562，通過參考被納入本文，其中包括551-562頁上的引述。優(yōu)選的化學(xué)發(fā)光染料是吖啶酯。在本發(fā)明的方法中，可以應(yīng)用幾種方法來確定表觀健康的對象患不良事件的風(fēng)險增加。所述方法可包括將對象的PCT水平與可比較人群中PCT的預(yù)定值進行比較。這可以是單個臨界值(cut-off value)，例如人群的中位值、或平均值、或第75、第90、第95、或第 99百分位數(shù)。或者，可以使用范圍，例如當被測試的群體被相等或不相等地分為組(例如低、中、或高風(fēng)險組)或分為四分位數(shù)時，最低的四分位數(shù)為具有最低風(fēng)險的個體且最高的四分位數(shù)為具有最高風(fēng)險的個體。所述預(yù)定值可以在挑選的特定群體中根據(jù)某些因素如性別、年齡、遺傳特征、習(xí)慣、種族等而變化。優(yōu)選地，通過使用下列備選方案來進行風(fēng)險測定-將測定的PCT或PCT片段水平與來自表觀健康的對象群體的全體預(yù)定樣本中的 PCT或其片段水平的中位值進行比較，或-將測定的PCT或PCT片段水平與來自表觀健康的對象群體的全體預(yù)定樣本中的 PCT或其片段水平的分位數(shù)進行比較，或-基于Cox比例風(fēng)險分析或風(fēng)險指數(shù)計算如凈重新分類指數(shù)(NRI)或綜合鑒別指數(shù)(IDI)來進行計算。在其它實施方案中，比數(shù)比(odds ratio)或風(fēng)險比用作預(yù)測風(fēng)險或診斷疾病的檢驗?zāi)芰Φ亩攘?。就比?shù)比來說，值1表明“患病”和“對照”組的對象中陽性結(jié)果的可能性相等 ’大于1的值表明患病組更可能是陽性結(jié)果；而小于1的值表明對照組更可能是陽性結(jié)果。在某些優(yōu)選實施方案中，優(yōu)選挑選標志物和/或標志物組來顯示如下的比數(shù)比至少約1. 5以上或約0. 75以下、更優(yōu)選至少約2以上或約0. 5以下、還更優(yōu)選至少約3以上或約0. 33以下、更加優(yōu)選至少約4以上或約0. 25以下、更加優(yōu)選至少約5以上或約0. 2以下、以及最優(yōu)選至少約10以上或約0. 1以下。在這里的情形中術(shù)語“約”是指給定測量結(jié)果的+/_5%。就風(fēng)險比來說，值1表明終點(例如死亡)的相對風(fēng)險在“患病”和“對照”組中是相等的；大于1的值表明在患病組中風(fēng)險更大；而小于1的值表明在對照組中風(fēng)險更大。 在某些優(yōu)選實施方案中，優(yōu)選挑選標志物和/或標志物組來顯示如下的風(fēng)險比至少約1.1 以上或約0. 91以下、更優(yōu)選至少約1. 25以上或約0. 8以下、還更優(yōu)選至少約1. 5以上或約 0. 67以下、更加優(yōu)選至少約2以上或約0. 5以下、以及最優(yōu)選至少約2. 5以上或約0. 4以下。在這種情形中，術(shù)語“約”是指給出的測量結(jié)果的+/_5%。如可在表6中看出的，本發(fā)明人能夠建立表明對象未來將患某種不良事件的PCT 水平的臨界值。通常，當血清樣本中的PCT水平為至少0. 015ng/ml血清、優(yōu)選至少0. 02ng/ ml時可以確定對象具有患不良事件的風(fēng)險。具體地說，當血清樣本中所述PCT水平為至少0.0155ng/ml血清時，可確定對象具有患心臟事件或心血管事件的增加的風(fēng)險。當血清樣本中測定的PCT水平為至少 0. 0215ng/ml時，可確定對象具有患腦血管事件或由于心血管原因的死亡的增加的風(fēng)險。當血清樣本中的PCT水平為至少0.0155ng/ml時，可確定對象具有死于癌癥的增加的風(fēng)險。 當血清樣本中的PCT水平為至少0. 0155ng/ml時，可確定對象具有死于癌癥的增加的風(fēng)險。 當血清樣本中的所述PCT水平為至少0. 0205ng/ml時，可確定對象具有死亡的增加的風(fēng)險， 且當血清樣本中的PCT水平為至少0. 0185ng/ml時，可確定對象具有患糖尿病的風(fēng)險。優(yōu)選在本發(fā)明的方法中要測定至少一種其它參數(shù)并用其來確定患不良事件的風(fēng)險或增加的風(fēng)險。這樣的其它參數(shù)可以是臨床參數(shù)、實驗室(即生化的)參數(shù)和/或遺傳學(xué)參數(shù)。用于將對象分層為不同組(類別)的合適的閾值水平可以例如如下來進行根據(jù)患者的PCT水平將參比患者群分類為某種分位數(shù)如三分位數(shù)、四分位數(shù)、五分位數(shù)、或甚至根據(jù)合適的百分位數(shù)。對于高于或低于某個百分位數(shù)的各個分位數(shù)或組來說，可以計算出風(fēng)險比來比較例如不良后果的風(fēng)險，所述不良后果即“不利的效果”或增加的風(fēng)險，例如就存活率而言。在這樣的情景下，高于1的風(fēng)險比(HR)表明患者具有較高的不良后果的風(fēng)險。低于1的HR表明較低的風(fēng)險。大約1(例如+/-0.1)的HR表明該具體患者組沒有升高的風(fēng)險。通過將某種分位數(shù)的患者之間的HR彼此比較并與總患者群的HR進行比較，可能會鑒別出具有升高的水平和增強的風(fēng)險的那些分位數(shù)的患者，并由此根據(jù)本發(fā)明對對象分層。診斷和/或預(yù)后測試的靈敏度和特異性不僅取決于所述測試的分析“質(zhì)量”，它們還取決于是什么構(gòu)成了異常結(jié)果的定義。實際上，接受者操作特性曲線(R0C曲線)典型地通過將變量值對其在“正?！?即表觀健康的)和“患病”群體(即患有細菌感染的患者) 中的相對頻率進行作圖來計算。對于任何特定的標志物來說，有和沒有疾病的對象的標志物水平的分布將可能會重疊。在這樣的情況下，測試不會以100%的精確度來絕對地區(qū)分正常與患病或者具有增強風(fēng)險的患者與沒有增強風(fēng)險的患者，且重疊的區(qū)域表明在那里測試不能區(qū)分正常與患病；風(fēng)險增強與風(fēng)險沒有增強。挑選一個閾值，高于其(或低于其，取決于標志物如何隨著疾病而改變)則認為測試是異常的，且低于其則認為測試是正常的。ROC 曲線下面積是對得到的測量結(jié)果將可以正確鑒別病況的可能性的度量。甚至當測試結(jié)果不一定會給出精確數(shù)值時也可以使用ROC曲線。只要人們可以對結(jié)果進行分等，則人們就可以創(chuàng)建ROC曲線。例如，“患病”樣本的測試結(jié)果可以根據(jù)程度(例如1 =低、2 =正常、以及3=高)來分等。這種分等可以與“正?！比后w中的結(jié)果以及創(chuàng)建的ROC曲線相關(guān)聯(lián)。這些方法在本技術(shù)領(lǐng)域中是公知的(Hanley等1982. Radiology 143 :29-36)。優(yōu)選地，挑選一個閾值以提供大于約0. 5、更優(yōu)選大于約0. 7、還更優(yōu)選大于約0. 8、更加優(yōu)選大于約0. 85、 以及最優(yōu)選大于約0. 9的ROC曲線面積。在這種情形中，術(shù)語“約”是指給出的測量結(jié)果的 +/-5%。ROC曲線的橫軸代表(1-特異性)，其隨著假陽性率而增加。所述曲線的縱軸代表靈敏度，其隨著真陽性率而增加。因此，對于所挑選的特定臨界值來說，可以測定(ι-特異性)的值，并可獲得相應(yīng)的靈敏度。ROC曲線下面積是對所測得的標志物水平將可以正確鑒別疾病或病況的可能性的度量。因此，ROC曲線下面積可用于確定所述測試的有效性。比數(shù)比是對效果大小的度量，其描述了兩個二元數(shù)據(jù)值之間的聯(lián)系或非獨立性的強度(例如事件在測試陰性組中發(fā)生的幾率與其在測試陽性組中發(fā)生的幾率的比率)。陽性預(yù)測值(PPV)，或準確率，是具有陽性測試結(jié)果的患者被正確診斷和/或預(yù)測的比例。它反映了陽性測試可反映出被測試的潛在病況的可能性。陰性預(yù)測值(NPV)是具有陰性測試結(jié)果的患者被正確診斷和/或預(yù)測的比例。總精確度是被所述測試正確分類的所有患者的百分比。具體地說，所述至少一種臨床參數(shù)可以選自性別(即男性或女性)、年齡、收縮血壓、收縮血壓、舒張血壓、體重指數(shù)、腰圍、腰-臀比、以及吸煙習(xí)慣。特別是，因為PCT水平在男性和女性之間存在顯著不同(參見例如表幻，所以對象的性別是在實施本發(fā)明的方法時需要被考慮的參數(shù)。所述至少一種實驗室參數(shù)可以選自空腹血液或血漿葡萄糖濃度；甘油三酸酯；膽固醇濃度；HDL膽固醇濃度及其亞級分(subfraction) ；LDL膽固醇濃度及其亞級分；胱抑素 C ；胰島素；CRP ；包括 ANP、proANP、NT-proANP、MR-proANP、BNP, proBNP、NT-proBNP 的A和B型利鈉肽及其前體和所述前體的片段；GDF15 ；ST2 ；降鈣素原及其片段；腎上腺髓質(zhì)素前體及其包括ADM、PAMP, MR-proADM、CT-proADM的片段；內(nèi)皮素前體_1及其包括 CT-proET-l、NT-proET-l、大內(nèi)皮素-1和內(nèi)皮素_1的片段。所述至少一種遺傳學(xué)參數(shù)優(yōu)選地選自單核苷酸多態(tài)性(SNPs)、以及突變。如上文和本文中所述，本發(fā)明的方法提供了關(guān)于對象患不良事件的可能增加的風(fēng)險的信息。基于這一信息，可以采取預(yù)防性措施以避免所述不良事件發(fā)生在對象身上。所述預(yù)防性措施可以是，例如服用適當?shù)乃幬?、遵循飲食限制、鍛煉、獲得醫(yī)務(wù)監(jiān)督等。在另一方面，本發(fā)明涉及使用上文和本文中所述的方法來確定表觀健康的對象患不良事件的增加的風(fēng)險。此外，本發(fā)明涉及使用含有針對PCT或其片段或其前體或片段的一種或多種抗體的試劑盒，用于進行無癥狀的對象經(jīng)歷不良事件的預(yù)后，即用于實施如本文中所述的方法。實施例
研究人群和設(shè)計研究人群來自于腎臟和血管終末期疾病的預(yù)防(PREVEND)研究。所述PREVEND 研究被設(shè)計用于在從荷蘭格羅寧根城(Groningen)的普通人群(年齡范圍在觀至75 歲)中抽取的大組群中前瞻性地調(diào)查蛋白尿的固有進程以及它與腎臟和心血管疾病的關(guān)系。研究設(shè)計、招募、以及程序的細節(jié)已公布在別處(Hillege等，Circulation 2002,106 1777-1782 ；Hillege 等，J Intern Med 2001,249 :519-526 ；Mahmoodi 等，JAMA 2009，301 1790-1797)。PREVEND研究被當?shù)蒯t(yī)學(xué)倫理委員會、格羅寧根大學(xué)醫(yī)學(xué)中心(University Medical Center Groningen)的批準，并符合了赫爾辛基宣言中概述的原則。所有參與者都給出了書面的知情同意書。測量參與者經(jīng)歷了兩次門診就診以評估人口統(tǒng)計的、人體測量的、以及心血管風(fēng)險的因素。他們在首次就診之前就完成了關(guān)于人口統(tǒng)計資料、心血管疾病(CVD)史、吸煙習(xí)慣、 CVD家族史、飲酒、以及藥物使用的調(diào)查問卷。對參與者進行了如下調(diào)查總膽固醇水平、 高密度脂蛋白(HDL)膽固醇、甘油三酸酯、測量血壓、血清肌酸酐、以及糖尿病。糖尿病根據(jù)美國糖尿病協(xié)會(American Diabentes Association)的準則被定義為空腹血漿葡萄糖 ^ 7. Ommol/1或使用了抗糖尿病藥物。此外，關(guān)于藥物使用的信息通過使用來自格羅寧根城所有社區(qū)藥房的藥房配藥數(shù)據(jù)來證實。在基線時，CVD通過如下來限定先前重大的心血管事件史(即心肌梗塞、腦血管意外)、冠狀動脈血管成形術(shù)和/或旁路手術(shù)史、踝/肱指數(shù)小于0. 9、或存在基于明尼蘇達分類(即1. 1和1. 2編碼)的QS波型?；加蠧VD的個人在初診時被排除在研究之外?；加刑悄虿〉膫€人在初診時被排除在研究之外?；加腥魏伟┌Y的個人被排除在研究之外。血清肌酸酐> 132 μ mol/L的個人被認為具有腎功能障礙并被排除在研究之外。對于研究合格的個人總數(shù)為η = 5313。因此，在這項研究中被調(diào)查的人群是有代表性的表觀未患病的人群，代表了普通的健康人群。在入選的時間點，對每位個人抽取血液樣本以制作實驗室量度(參見下文)。對被調(diào)查的人群進行十年的隨訪，并記錄各種終點的發(fā)生研究的終點是突發(fā)的心臟事件、突發(fā)的腦血管事件、心血管性死亡、總心血管事件、突發(fā)的糖尿病、癌癥死亡、以及總體死亡。心臟事件被定義為任何下列事件的總和急性心肌梗塞(ICD-編碼410)、急性和亞急性缺血性心臟病G11)、以及下列手術(shù)冠狀動脈旁路移植術(shù)或經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)。腦血管事件被定義為任何下列事件的總和大腦前動脈(43 或腦動脈034) 的閉塞或狹窄。心血管性死亡被定義為由心臟或腦血管事件所致的死亡?？傂难苁录欢x為心臟事件、腦血管事件、以及心血管性死亡的總和。糖尿病根據(jù)美國糖尿病協(xié)會的準則被限定為空腹血漿葡萄糖> 7. Ommol/1或使用了抗糖尿病藥物。癌癥死亡被定義為由癌癥所致的死亡?？傮w死亡被定義為任何原因的死亡。心血管發(fā)病的信息(住院)獲自PRISMANT，荷蘭出院診斷的國家登記信息。根據(jù) 《國際疾病分類》Qnternational Classfication of Disase)第9版以及干預(yù)的分類來對數(shù)據(jù)進行編碼。在有人已搬遷至未知的地點的情況下，則將該人從市政登記遷出的日期用作審查日期。死亡數(shù)據(jù)從市政登記員接收，且死亡原因通過將死亡證明的編號與荷蘭中央統(tǒng)計局(Dutch Central Bureau of Statistics)編碼的主要死因關(guān)聯(lián)起來而獲得的。
實驗室分析在基線時，血液樣本在禁食過夜后抽取。將血液樣本抽到含有EDTA的激冷的管中。立即將所述樣本在1500g和4°C下離心10分鐘，并將上清液以等分試樣儲存在-80°C 下供未來應(yīng)用。按照如下來測量PCT 使用可商購的用于PCT的超靈敏夾心式分析(BRAHMS PCT LIA 靈敏型)(Morgenthaler 等，Clin Chem 2002，48 :788-90)，其使用針對 PCT 的鈣抑肽部分的一種抗體作為固相、以及針對PCT的降鈣素部分的一種抗體作為標記抗體 (BRAHMS AG，Hennigsdorf，德國)。將各種濃度的重組PCT用作定標。使用100 μ 1的樣本量。統(tǒng)計學(xué)分析無論數(shù)據(jù)的分布是否是偏態(tài)的，都將連續(xù)變量的基線描述統(tǒng)計報告為平均值士標準偏差(SD)以及第25和第75百分位數(shù)的中位值。將類別變量顯示為數(shù)值和百分比。使用X2檢驗來測試類別變量的組間差異。如果變量根據(jù)Kolmogorov-Smirnov檢驗來說不是正態(tài)分布的話，則要通過使用Mudent's t檢驗或曼-懷氏秩檢驗(Marm-Whitney rank test)來比較連續(xù)數(shù)據(jù)。為了測試針對突發(fā)事件的PCT預(yù)測值，我們分別將Cox比例風(fēng)險模型與已記錄過的各種事件的發(fā)生相擬合，以作為因變量。因為偏態(tài)分布，所以要在Cox回歸分析中應(yīng)用PCT的對數(shù)變換(log》來計算每次PCT水平加倍的風(fēng)險比(HR)和95%置信區(qū)間(CIs)。來自雙側(cè)檢驗的0.05以下的P值被認為在統(tǒng)計上是顯著的。此外，通過將第五 PCT五分位數(shù)與第一 PCT五分位數(shù)相比來第二次計算風(fēng)險比。所有的統(tǒng)計學(xué)分析都通過社會科學(xué)統(tǒng)計軟件包 Statistical Package for Social Sciences)，第 16 版(SPSS he，芝加哥，伊利諾斯州，美國)和S-PLUS軟件(Insightful Corp.，西雅圖，華盛頓州，美國)來進行。結(jié)果研究人群的基線特性總結(jié)在表1中。表2顯示了基線PCT水平(全部)以及通過性別來分層的基線PCT水平Ing/ ml) ο使用所含PCT水平彡0. lng/ml的樣本以及所含PCT水平也高于0. lng/ml的樣本來進行分析。發(fā)現(xiàn)對于這兩種樣本來說PCT的預(yù)后值基本上相同。對于整個研究組(P < 0. 001)以及對于PCT水平彡0. lng/ml (P < 0. 001)的受試者來說，PCT水平在男性和女性之間存在顯著不同(表2)。表3和4顯示了風(fēng)險比，其描述了如所示的，每次PCT濃度加倍，發(fā)生事件的風(fēng)險增加。例如，對于心血管性死亡來說，2. 23的風(fēng)險比表示PCT濃度為例如0. 030ng/ml的個體所具有的死于心血管并發(fā)癥的風(fēng)險較PCT濃度為0. 015ng/ml的個體高出2. 23倍。表3顯示了用于在整個研究組中通過PCT水平(分別為全部和彡0. lng/ml)來預(yù)測心血管事件以及癌癥、心血管性和總體死亡的風(fēng)險比(95% Cl)。表4顯示了通過由性別來分層的PCT水平(分別為全部和彡0. lng/ml)來預(yù)測心血管事件以及癌癥、心血管性和總體死亡的風(fēng)險比(95% Cl)。表5顯示了通過PCT水平在無癥狀人群中預(yù)測2型糖尿病的發(fā)生的風(fēng)險比(95% Cl)。表6顯示了臨界值和AUC ROC0從全部被調(diào)查的人群中，將> 0. lng/ml的PCT值排除在這一分析之外。對于每類事件來說，要計算接受者操作特性曲線下面積(AUC R0C)。 最佳臨界值被定義為靈敏度和特異性的最高數(shù)學(xué)乘積(mathematical product)，當測試所有可能的臨界值時，每類事件的所述最佳臨界值都可以得到。對于本技術(shù)領(lǐng)域中的專業(yè)人員來說，顯然其它臨界值也可被認為是“最佳的”，這取決于靈敏度、特異性、陽性預(yù)測值、或陰性預(yù)測值在特定應(yīng)用中是否重要。表7顯示了根據(jù)PCT五分位數(shù)的不良事件。從全部被調(diào)查的人群中，將> 0. Ing/ ml的PCT值排除在這一分析之外。將所述人群以PCT濃度五分位數(shù)區(qū)分開。顯示了對于各類事件來說每五分位數(shù)的病例數(shù)和比例(以百分比計)。通過與五分位數(shù)Ql比較，計算出每類事件發(fā)生的風(fēng)險比的Q2至Q5五分位數(shù)。事件類糖尿病分析與其它事件分開顯示，因為對于這類事件來說可以進行隨訪的人數(shù)要小于其它事件類型。甚至每五分位數(shù)的個體數(shù)也不完美，因為在那些劃分五分位數(shù)的PCT濃度上高頻率的個體值，他們一定會被歸屬于這一濃度的上一級或下一級的五分位數(shù)?？傊?，所述結(jié)果顯示了在無癥狀的受試者中，升高的PCT水平可作為預(yù)后值，用于預(yù)測受試者是否具有未來患不良事件的風(fēng)險。表 權(quán)利要求
1.一種方法，其用于確定表觀健康的對象，優(yōu)選為人，患不良事件的增加的風(fēng)險，所述方法包含-提供所述對象的樣本；-測定所述樣本中的降鈣素原(PCT)或其片段的水平；和-基于所述PCT水平來確定所述對象是否具有患不良事件的增加的風(fēng)險。
2.權(quán)利要求1的方法，其中PCT具有如SEQID NO. 1所示的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述PCT片段包含(含有)-至少12個氨基酸、優(yōu)選50個以上氨基酸、最優(yōu)選100個以上氨基酸，或-SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列中的第2至116或3至116位氨基酸。
4.權(quán)利要求1至3的方法，其中所述水平測定使用診斷學(xué)分析、優(yōu)選為免疫分析來進行。
5.權(quán)利要求1至4的方法，其中所述不良事件選自心臟事件、心血管事件、腦血管事件、心血管性死亡、糖尿病、癌癥死亡、以及死亡。
6.權(quán)利要求1至4的方法，其中所述風(fēng)險測定如下進行-將測定的PCT或PCT片段水平與來自表觀健康對象群體的全體預(yù)定樣本中的PCT或其片段水平的中位值進行比較，或-將測定的PCT或PCT片段水平與來自表觀健康對象群體的全體預(yù)定樣本中的PCT或其片段水平的分位數(shù)進行比較，或-基于Cox比例風(fēng)險分析或風(fēng)險指數(shù)計算如凈重新分類指數(shù)(NRI)或綜合鑒別指數(shù) (IDI)來進行計算。
7.1至6的方法，其中所述對象不存在有癥狀的感染。(PCT水平?jīng)]有升高到超過正常范圍)
8.權(quán)利要求1至7的方法，其中所述樣本是體液，尤其是血液、血清、血漿、腦脊液、尿液、唾液、痰、或胸腔積液。
9.權(quán)利要求1至8的方法，其中當血清或血漿樣本中的所述PCT水平為至少0.015ng/ ml、優(yōu)選至少0. 02ng/ml時，確定所述對象有患不良事件的風(fēng)險。
10.權(quán)利要求1至9的方法，其中當血清樣本中的所述PCT水平為至少0.0155ng/ml 時，確定所述對象有患心臟事件或心血管事件的增加的風(fēng)險。
11.權(quán)利要求1至10的方法，其中當血清樣本中的所述PCT水平為至少0.0215ng/ml 時，確定所述對象有患腦血管事件或由于心血管原因而死亡的增加的風(fēng)險。
12.權(quán)利要求1至11的方法，其中當血清樣本中的所述PCT水平為至少0.0155ng/ml 時，確定所述對象有死于癌癥的增加的風(fēng)險。
13.權(quán)利要求1至12的方法，其中當血清樣本中的所述PCT水平為至少0.0205ng/ml 時，確定所述對象有死亡的增加的風(fēng)險。
14.權(quán)利要求1至13的方法，其中當血清樣本中的所述PCT水平為至少0.0185ng/ml 時，確定所述對象有患糖尿病的增加的風(fēng)險。
15.權(quán)利要求1至14的方法，其還包含測定-選自如下的臨床參數(shù)性別、年齡、收縮血壓、收縮血壓、舒張血壓、體重指數(shù)、腰圍、 腰-臀比、以及吸煙習(xí)慣；或-選自如下的實驗室參數(shù)空腹血液或血漿葡萄糖濃度；甘油三酸酯；膽固醇濃度；和 HDL膽固醇濃度及其亞級分；LDL膽固醇濃度及其亞級分；胱抑素C ；胰島素；CRP ；包括ANP、 proANP、NT-proANP、MR-proANP、BNP、proBNP、NT-proBNP 的 A 和 B 型利鈉肽及其前體和所述前體的片段；⑶F15 ；ST2 ；降鈣素原及其片段；腎上腺髓質(zhì)素前體及其包括ADM、PAMP, MR-proADM、CT-proADM的片段；內(nèi)皮素前體_1及其包括CT-proET-1、NT-proET-1、大內(nèi)皮素-1，以及內(nèi)皮素-1的片段；或-選自如下的遺傳學(xué)參數(shù)單核苷酸多態(tài)性(SNP)，和突變，特別是與糖尿病遺傳性相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性和突變。
16.權(quán)利要求1至15的方法，其還包含采取至少一種預(yù)防性措施以避免所述對象發(fā)生所述不良事件。
17.權(quán)利要求1至16的方法在確定表觀健康的對象患不良事件的增加的風(fēng)險中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于在無癥狀的對象中對不良事件進行預(yù)后的體外方法，其包含測定所述對象的體液樣本中降鈣素原(PCT)或其具有至少12個氨基酸殘基的片段或前體或其片段的水平，并在所測得的水平與患不良事件的潛在風(fēng)險之間建立相關(guān)性。
文檔編號G01N33/68GK102472752SQ201080029105
公開日2012年5月23日 申請日期2010年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月28日
發(fā)明者S·J·L·巴克爾, 約阿希姆·斯特魯克 申請人:B.R.A.H.M.S 有限公司