專利名稱：三唑大環(huán)系統(tǒng)的制作方法
交叉參考
本申請要求2007年2月23日提交的美國臨時申請第60/903,073號的優(yōu)先權(quán)，本文引入該申請作為參考。
背景技術(shù)：
肽在藥物應(yīng)用中變得日益重要。未修飾的肽由于構(gòu)象的柔性，經(jīng)常具有較差的代謝穩(wěn)定性、較差的細胞滲透性和發(fā)生混雜的結(jié)合。為了改善這些性質(zhì)，研究人員已通過包括二硫鍵形成、酰胺鍵形成和碳-碳鍵形成的多種方法產(chǎn)生了環(huán)肽和擬肽(peptidomimetic)(Jackson等人(1991)，J.Am.Chem.Soc.1139391-9392；Phelan等人(1997)，J.Am.Chem.Soc.119455-460；Taylor(2002)，Biopolymers 6649-75；Brunel等人(2005)，Chem.Commun.(20)2552-2554；Hiroshige等人(1995)，J.Am.Chem.Soc.11711590-11591；Blackwell等人(1998)，Angew.Chem.Int.Ed.373281-3284；Schafmeister等人(2000)，J.Am.Chem.Soc.1225891-5892)。這些方法的局限性包括較差的代謝穩(wěn)定性(二硫鍵和酰胺鍵)、較差的細胞滲透性(二硫鍵和酰胺鍵)和潛在毒性金屬的使用(對于碳-碳鍵的形成)。因此，非常需要改進方法以產(chǎn)生具有增強的構(gòu)象剛性、代謝穩(wěn)定性和細胞滲透性的肽和擬肽。本發(fā)明滿足了本領(lǐng)域中的這些和其它的需要。
發(fā)明概述 本文提供了式(I)的擬肽大環(huán)化合物

(式I) 其中 A、C、D和E各自獨立地是天然或非天然的氨基酸； B是天然或非天然的氨基酸、氨基酸類似物、

-[NH-L3-CO-]、[-NH-L3-SO2-]或[-NH-L3-]； R1和R2獨立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素取代的； R3是氫、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x被R5取代； L是式

的形成大環(huán)的連接體(macrocycle-forminglinker)； L1、L2和L3獨立地是亞烷基、亞烯基(alkenylene)、亞炔基(alkynylene)、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞環(huán)芳基(cycloarylene)、亞雜環(huán)芳基(heterocycloarylene)或[-R4-K-R4-]n，各任選被R5取代； 各個R4是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞芳基(arylene)或亞雜芳基(heteroarylene)； 各個K是O、S、SO、SO2、CO、CO2或CONR3； 各個R5獨立地是鹵素、烷基、-OR6、-N(R6)2、-SR6、-SOR6、-SO2R6、-CO2R6、熒光部分、放射性同位素或治療劑； 各個R6獨立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、熒光部分、放射性同位素或治療劑； R7是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x被R5取代，或作為與D殘基所形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分； R8是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x被R5取代，或作為與E殘基所形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分； v是1-1000的整數(shù)； w是1-1000的整數(shù)； x是0-10的整數(shù)； y是0-10的整數(shù)； z是0-10的整數(shù)；且 n是1-5的整數(shù)。
在某些實施方式中，L是

或

在其它的實施方式中，L是

或

在進一步的實施方式中，R1和R2中的至少一個是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素取代的。在相關(guān)的實施方式中，R1和R2獨立地是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素取代的。例如，R1和R2中的至少一個是未取代的或被鹵素取代的烷基。在某些實施方式中，R1和R2都獨立地是未取代或被鹵素取代的烷基。在其它的實施方式中，R1和R2中的至少一個是甲基。在再其它的實施方式中，R1和R2兩個都是甲基。
在某些實施方式中，D和E中的至少一個是被高分子量的脂質(zhì)或烴取代的天然或非天然的氨基酸。在其它的實施方式中，D和E中的至少一個連接于另外的形成大環(huán)的連接體上。在再其它的實施方式中，擬肽大環(huán)化合物的二級結(jié)構(gòu)比相應(yīng)的非大環(huán)多肽的相應(yīng)的二級結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。在某些實施方式中，擬肽大環(huán)化合物包含α-螺旋。例如，α-螺旋包含1-5圈(turn)。在其它的實施方式中，該α-螺旋比相應(yīng)的非大環(huán)多肽的α-螺旋更穩(wěn)定。例如，形成大環(huán)的連接體可以跨越α-螺旋的1-5圈，如α-螺旋的大約1、2、3、4或5圈。例如，形成大環(huán)的連接體的長度可以是α-螺旋的每圈大約5

-大約9

在某些實施方式中，形成大環(huán)的連接體跨越α-螺旋的大約1圈。在這樣的實施方式中，形成大環(huán)的連接體的長度近似等于大約6個-大約14個碳-碳鍵的長度，或可以等于大約8個-大約12個碳-碳鍵的長度。在相關(guān)的實施方式中，大環(huán)化合物可以包含大約18-26個原子的環(huán)。
在其它的實施方式中，形成大環(huán)的連接體跨越大約α-螺旋的2圈。在某些實施方式中，形成大環(huán)的連接體的長度可以近似等于大約8個-大約16個碳-碳鍵的長度，或大約10個-大約13個碳-碳鍵的長度。在相關(guān)的實施方式中，大環(huán)化合物可以包含大約29-大約37個原子的環(huán)。
在某些實施方式中，可用于本發(fā)明的擬肽大環(huán)化合物的合成的氨基酸是式IIa或式IIb的化合物
其中， R1和R2獨立地是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素取代的； Q和T各獨立地選自亞烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞芳基、亞雜芳基、和[-R4-K-R4-]n，其各是未取代的或被R5取代； K是O、S、SO、SO2、CO、CO2或CONR3； R3是氫、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x被R5取代； R4是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞芳基或亞雜芳基； 各R5獨立地是鹵素、烷基、-OR6、-N(R6)2、-SR6、-SOR6、-SO2R6、-CO2R6、熒光部分、放射性同位素或治療劑； 各個R6獨立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、熒光部分、放射性同位素或治療劑； R7和R8獨立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基烷基或雜環(huán)烷基； R10和R11獨立地是-H或任何適于肽合成的保護基； g和h各獨立地是0-5的整數(shù)，其中，g+h大于1；且 n是1-5的整數(shù)。
在某些實施方式中，化合物是式IIa的化合物，且R1是未取代的或被鹵素取代的烷基。在其它的實施方式中，化合物是式IIb的化合物，且R2是未取代的或被鹵素取代的烷基。在更其它的實施方式中，化合物是式IIa的化合物，且R1是未取代的烷基。例如，R1可以是甲基。在更加其它的實施方式中，化合物是式IIb的化合物，且R2是未取代的烷基。例如，R2可以是甲基。在本發(fā)明的化合物的某些實施方式中，R9和R10中的至少一個是適于肽合成的保護基。另一方面，本發(fā)明進一步提供了包含本發(fā)明的化合物或本文所述的用于制備本發(fā)明的擬肽大環(huán)化合物的其它氨基酸類似物以及大環(huán)化試劑的試劑盒。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供了一種試劑盒，該試劑盒包含 a)至少一種選自式IIa的化合物和式IIb的化合物的化合物
其中， R1和R2獨立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素取代的； Q和T各獨立地選自亞烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞芳基、亞雜芳基和[-R4-K-R4-]n，其各是未取代的或被R5取代； K是O、S、SO、SO2、CO、CO2或CONR3； R3是氫、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x被R5取代； R4是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞芳基或亞雜芳基； 各R5獨立地是鹵素、烷基、-OR6、-N(R6)2、-SR6、-SOR6、-SO2R6、-CO2R6、熒光部分、放射性同位素或治療劑； 各個R6獨立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、熒光部分、放射性同位素或治療劑； R7和R8獨立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基烷基或雜環(huán)烷基； R10和R11獨立地是-H或任何適于肽合成的保護基； g和h各獨立地是0-5的整數(shù)； n是1-5的整數(shù)；和 b)大環(huán)化試劑。
在某些實施方式中，試劑盒包括式IIa的化合物，且R1是未取代的或被鹵素取代的烷基。在相關(guān)的實施方式中，R1是未取代的烷基。例如，R1可以是甲基。在其它的實施方式中，試劑盒包括式IIb的化合物，且R2是未取代的或被鹵素取代的烷基。在相關(guān)的實施方式中，R2是未取代的烷基。例如，R2可以是甲基。
在某些實施方式中，試劑盒包括至少一種式IIa的化合物和至少一種式IIb的化合物。本發(fā)明的試劑盒也可以包括式IIa或式IIb的化合物，其中，R9和R10中的至少一個是適于肽合成的保護基。在本發(fā)明的試劑盒的特定的實施方式中，大環(huán)化試劑是Cu試劑。在本發(fā)明的試劑盒的更其它的實施方式中，大環(huán)化試劑是Ru試劑。
本發(fā)明也提供了一種合成擬肽大環(huán)化合物的方法，該方法包括將式III或式IV的擬肽前體與大環(huán)化試劑接觸的步驟

(式III)

(式IV) 其中，v、w、x、y、z、A、B、C、D、E、R1、R2、R7、R8、L1和L2如上文所定義；當(dāng)大環(huán)化試劑是Cu試劑時，R12是-H，或當(dāng)大環(huán)化試劑是Ru試劑時，R12是-H或烷基；而且，進一步，其中所述接觸步驟導(dǎo)致在式III或式IV中的炔部分和疊氮(azide)部分之間形成共價連接。例如，當(dāng)大環(huán)化試劑是Ru試劑時，R12可以是甲基。
在本發(fā)明的的方法的某些實施方式中，R1和R2中的至少一個是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素取代的。在相關(guān)的實施方式中，R1和R2獨立地是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素取代的。
例如，R1和R2中的至少一個可以是未取代的或被鹵素取代的烷基。在另一種實施例中，R1和R2兩個獨立地是未取代的或被鹵素取代的烷基。在某些實施方式中，R1和R2中的至少一個是甲基。在其它的實施方式中，R1和R2是甲基。大環(huán)化試劑可以是Cu試劑。或者，大環(huán)化試劑可以是Ru試劑。
在某些實施方式中，在接觸步驟之前純化擬肽前體。在其它的實施方式中，在接觸步驟之后純化擬肽大環(huán)化合物。在更其它的實施方式中，擬肽大環(huán)化合物在接觸步驟之后再折疊。本方法可以在溶液中進行，或者，本方法可以在固體載體上進行。
本文也預(yù)想，在結(jié)合擬肽前體或擬肽大環(huán)化合物的目標大分子的存在下，在有利于所述結(jié)合的條件下進行本發(fā)明的方法。在某些實施方式中，在優(yōu)先結(jié)合擬肽前體或擬肽大環(huán)化合物的目標大分子的存在下，在有利于所述結(jié)合的條件下進行本發(fā)明的方法。本方法也可以應(yīng)用于合成擬肽大環(huán)化合物的文庫。
本發(fā)明的方法產(chǎn)生的擬肽大環(huán)化合物可以在水性溶液中包含α-螺旋。例如，擬肽大環(huán)化合物在水溶液中比相應(yīng)的非大環(huán)多肽顯示增加的α-螺旋結(jié)構(gòu)。在某些實施方式中，相比于相應(yīng)的非大環(huán)多肽，擬肽大環(huán)化合物顯示提高的熱穩(wěn)定性。在其它的實施方式中，相比于相應(yīng)的非大環(huán)多肽，擬肽大環(huán)化合物顯示提高的生物學(xué)活性。在更加其它的實施方式中，相比于相應(yīng)的非大環(huán)多肽，擬肽大環(huán)化合物顯示增強的對蛋白水解降解作用的抗性。在更其它的實施方式中，相比于相應(yīng)的非大環(huán)多肽，擬肽大環(huán)化合物顯示提高的滲透活細胞的能力。
在某些實施方式中，式III或式IV的擬肽前體的炔部分是選自以下的氨基酸的側(cè)鏈L-炔丙基甘氨酸(propargylglycine)、D-炔丙基甘氨酸、(S)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸(pentynoic acid)、(R)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-5-己炔酸(hexynoic acid)、(R)-2-氨基-2-甲基-5-己炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸(heptynoic acid)、(R)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-7-辛炔酸(octynoicacid)、(R)-2-氨基-2-甲基-7-辛炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-8-壬炔酸(nonynoic acid)、(R)-2-氨基-2-甲基-8-壬炔酸，且式III或式IV的擬肽前體的疊氮部分是選自以下的氨基酸的側(cè)鏈ε-疊氮基-L-賴氨酸、ε-疊氮基-D-賴氨酸、ε-疊氮基-α-甲基-L-賴氨酸、ε-疊氮基-α-甲基-D-賴氨酸、δ-疊氮基-α-甲基-L-鳥氨酸和δ-疊氮基-α-甲基-D-鳥氨酸。
在某些實施方式中，x+y+z為3，且A、B和C獨立地是天然或非天然的氨基酸。在其它的實施方式中，x+y+z為6，且A、B和C獨立地是天然或非天然的氨基酸。
在某些實施方式中，大環(huán)化試劑是Cu試劑，且接觸步驟在選自質(zhì)子溶劑、水性溶劑、有機溶劑及其混合物的溶劑中進行。例如，溶劑可以選自H2O、THF/H2O、tBuOH/H2O、DMF、DIPEA、CH3CN、CH2Cl2、ClCH2CH2Cl或其混合物。在其它的實施方式中，大環(huán)化試劑是Ru試劑，且接觸步驟在有機溶劑中進行。例如，溶劑可以是DMF、THF、CH3CN、CH2Cl2或ClCH2CH2Cl。溶劑可以是有利于螺旋形成的溶劑。
在某些實施方式中，本發(fā)明的方法產(chǎn)生的擬肽大環(huán)化合物具有式(I)

(式I) 其中，v、w、x、y、z、A、B、C、D、E、R1、R2、R7、R8和L如上文所定義。
參考文獻的引入 本文引入本說明書提及的所有出版物、專利和專利申請作為參考，仿佛本文分別且單獨地引入每一個完整的文獻作為參考。
發(fā)明詳述 定義 如本文所用，術(shù)語“大環(huán)化合物”指具有包含由至少9個共價鍵合的原子形成的環(huán)(ring或cycle)的化學(xué)結(jié)構(gòu)的分子。
如本文所用，術(shù)語“擬肽大環(huán)化合物”指包含通過多個肽鍵連接的多個氨基酸殘基和至少一個形成大環(huán)的連接體的化合物，所述連接體在一個天然存在的氨基酸殘基或非天然存在的氨基酸殘基或氨基酸類似物殘基的α碳與另一個天然存在的氨基酸殘基或非天然存在的氨基酸殘基或氨基酸類似物殘基的α碳之間形成大環(huán)。擬肽大環(huán)化合物任選地包括在一個或多個氨基酸殘基和/或氨基酸類似物殘基之間的一個或多個非肽鍵，且除了形成大環(huán)化合物的任意殘基外，還任選地包括一個或多個非天然存在的氨基酸殘基或氨基酸類似物殘基。
如本文所用，術(shù)語“穩(wěn)定性”指通過圓二色光譜、NMR或另一種生物物理測量法測定的本發(fā)明的擬肽大環(huán)化合物在溶液中特定二級結(jié)構(gòu)的維持，或?qū)w外或體內(nèi)蛋白水解降解作用的抗性。本發(fā)明所設(shè)想的二級結(jié)構(gòu)的非限制性的例子是α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和β-折疊片(pleated sheets)。
如本文所用，術(shù)語“螺旋穩(wěn)定性”指通過圓二色光譜測定的本發(fā)明的擬肽大環(huán)化合物對α-螺旋結(jié)構(gòu)的維持。例如，在某些實施方式中，本發(fā)明的擬肽大環(huán)化合物相比于相應(yīng)的非大環(huán)多肽，如通過圓二色光譜測定的在α-螺旋度方面顯示至少1.25、1.5、1.75或2倍的增加。
術(shù)語“α-氨基酸”或簡稱為“氨基酸”指含有結(jié)合到被稱為α-碳的碳上的氨基和羧基的分子。合適的氨基酸包括但不限于天然存在的氨基酸的D-和L-異構(gòu)體以及通過有機合成或其它代謝途徑制備的非天然存在的氨基酸。除非上下文特別地指出，本文所用的術(shù)語氨基酸包括氨基酸類似物。
術(shù)語“天然存在的氨基酸”指自然界合成的肽中通常發(fā)現(xiàn)的20種氨基酸中的任一種，已知單字母縮寫為A、R、N、C、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V。
術(shù)語“氨基酸類似物”指其結(jié)構(gòu)上類似于氨基酸，且在擬肽大環(huán)化合物的形成中可代替氨基酸的分子。除了在氨基和羧基之間包括一個或多個額外的亞甲基(例如，α-氨基β-羧酸)或氨基或羧基被類似的反應(yīng)基團取代(例如，用仲胺或叔胺取代伯胺，或用酯取代羧基)以外，氨基酸類似物包括，但不限于在結(jié)構(gòu)上與如本文所定義的氨基酸相同的化合物。
“非必需”氨基酸殘基是可從多肽的野生型序列(例如，BH3結(jié)構(gòu)域或p53MDM2結(jié)合結(jié)構(gòu)域)發(fā)生改變而不消除或?qū)嵸|(zhì)上改變其基本的生物學(xué)活性或生物化學(xué)活性(例如，受體結(jié)合或活化)的殘基?！氨匦琛卑被釟埢牵?dāng)從多肽的野生型序列發(fā)生改變時導(dǎo)致消除或?qū)嵸|(zhì)上消除多肽的基本的生物學(xué)活性或生物化學(xué)活性的殘基。
“保守氨基酸取代”是其中氨基酸殘基被具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基替換的取代?，F(xiàn)有技術(shù)已定義了具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基的族。這些族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如，K、R、H)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如，D、E)、具有不帶電的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，G、N、Q、S、T、Y、C)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，A、V、L、I、P、F、M、W)、具有β分支的側(cè)鏈的氨基酸(例如，T、V、I)和具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸(例如，Y、F、W、H)。因此，例如，BH3多肽中的預(yù)測的非必需氨基酸殘基優(yōu)選被來自同一側(cè)鏈族的另一種氨基酸殘基所取代。
如本文中與大環(huán)化合物或形成大環(huán)的連接體結(jié)合使用的術(shù)語“元”是指形成或可以形成大環(huán)的原子，并排除取代基或側(cè)鏈原子。以此類推，環(huán)癸烷、1，2-二氟-癸烷和1，3-二甲基-環(huán)癸烷都被認為是十元大環(huán)化合物，因為氫或氟取代基或甲基側(cè)鏈沒有參與形成大環(huán)。
當(dāng)用作分子結(jié)構(gòu)的部分時，符號

指單鍵或者反式或順式雙鍵。
術(shù)語“氨基酸側(cè)鏈”指連接到氨基酸中的α-碳上的部分。例如，丙氨酸的氨基酸側(cè)鏈是甲基，苯丙氨酸的氨基酸側(cè)鏈是苯甲基，半胱氨酸的氨基酸側(cè)鏈是硫甲基，天冬氨酸的氨基酸側(cè)鏈是羧甲基，酪氨酸的氨基酸側(cè)鏈是4-羥基苯甲基，等等。也包括其它非天然存在的氨基酸側(cè)鏈，例如，那些自然發(fā)生的(例如，氨基酸代謝物)或合成制備的(例如，α，α二取代的氨基酸)的氨基酸側(cè)鏈。
術(shù)語“多肽”包括通過共價鍵(例如，酰胺鍵)連接的兩個或多個天然或非天然存在的氨基酸。本文所述的多肽包括全長蛋白質(zhì)(例如，完全加工的蛋白質(zhì))以及較短的氨基酸序列(例如，天然存在的蛋白質(zhì)的片段或合成的多肽片段)。
如本文所用，術(shù)語“大環(huán)化試劑”指任何通過介導(dǎo)炔和疊氮化物之間的反應(yīng)用于制備本發(fā)明的擬肽大環(huán)化合物的試劑。這樣的試劑包括，但不限于Cu試劑，如提供反應(yīng)性的Cu(I)物質(zhì)的試劑，如CuBr、CuI或CuOTf；以及Cu(II)鹽，如Cu(CO2CH3)2、CuSO4和CuCl2，其可以通過加入如抗壞血酸、抗壞血酸鈉的還原劑原位轉(zhuǎn)化為活性Cu(I)試劑。大環(huán)化試劑另外包括，例如，本領(lǐng)域內(nèi)已知的Ru試劑，如Cp*RuCl(PPh3)2、[Cp*RuCl]4或可以提供反應(yīng)性的Ru(II)物質(zhì)的其它Ru試劑。
術(shù)語“鹵代”或“鹵素”指氟、氯、溴或碘或其基團。
術(shù)語“烷基”指含有指定數(shù)目的碳原子的直鏈或支鏈烴鏈。例如，C1-C10表示該基團中具有1-10(包括端值)個碳原子。在沒有指定任何數(shù)值時，“烷基”是其中具有1-20(包括端值)個碳原子的鏈(直鏈或支鏈)。
術(shù)語“亞烷基”指二價烷基(即，-R-)。
術(shù)語“烯基”指作為具有一個或多個碳-碳雙鍵的直鏈或支鏈的烴鏈。烯基部分含有指定數(shù)目的碳原子。例如，C2-C10表示該基團中具有2-10(包括端值)個碳原子。術(shù)語“低級烯基”指C2-C6烯基鏈。在沒有指定任何數(shù)值時，“烯基”是其中具有2-20(包括端值)個碳原子的鏈(直鏈或支鏈)。
術(shù)語“炔基”指作為具有一個或多個碳-碳叁鍵的直鏈或支鏈的烴鏈。炔基部分含有指定數(shù)目的碳原子。例如，C2-C10表示該基團中具有2-10(包括端值)個碳原子。術(shù)語“低級炔基”指C2-C6炔基鏈。在沒有指定任何數(shù)值時，“炔基”是其中具有2-20(包括端值)個碳原子的鏈(直鏈或支鏈)。
術(shù)語“芳基”指6個碳的單環(huán)或10個碳的雙環(huán)芳香環(huán)系統(tǒng)，其中，各個環(huán)的0、1、2、3或4個原子被取代基取代。芳基的例子包括苯基、萘基等。術(shù)語“芳基烷基”或術(shù)語“芳烷基”指被芳基取代的烷基。術(shù)語“芳基烷氧基”指被芳基取代的烷氧基。
“芳基烷基”指如上定義的芳基，其中，如上定義的，芳基中的一個氫原子已被C1-C5烷基取代。芳基烷基的典型例子包括，但不限于2-甲基苯基、3-甲基苯基、4-甲基苯基、2-乙基苯基、3-乙基苯基、4-乙基苯基、2-丙基苯基、3-丙基苯基、4-丙基苯基、2-丁基苯基、3-丁基苯基、4-丁基苯基、2-戊基苯基、3-戊基苯基、4-戊基苯基、2-異丙基苯基、3-異丙基苯基、4-異丙基苯基、2-異丁基苯基、3-異丁基苯基、4-異丁基苯基、2-仲丁基苯基、3-仲丁基苯基、4-仲丁基苯基、2-叔丁基苯基、3-叔丁基苯基和4-叔丁基苯基。
“芳基酰氨基”指如上定義的芳基，其中，芳基中的一個氫原子已被一個或多個-C(O)NH2基團取代。芳基酰氨基的典型例子包括2-C(O)NH2-苯基、3-C(O)NH2-苯基、4-C(O)NH2-苯基、2-C(O)NH2-吡啶基、3-C(O)NH2-吡啶基和4-C(O)NH2-吡啶基， “烷基雜環(huán)”指如上定義的C1-C5烷基，其中，C1-C5烷基中的一個氫原子已被雜環(huán)取代。烷基雜環(huán)的典型例子包括，但不限于-CH2CH2-嗎啉、-CH2CH2-哌啶、-CH2CH2CH2-嗎啉和-CH2CH2CH2-咪唑。
“烷基酰氨基”指如上定義的C1-C5烷基，其中，C1-C5烷基中的一個氫原子已被-C(O)NH2基團取代。烷基酰氨基的典型例子包括，但不限于-CH2-C(O)NH2、-CH2CH2-C(O)NH2、-CH2CH2CH2C(O)NH2、-CH2CH2CH2CH2C(O)NH2、-CH2CH2CH2CH2CH2C(O)NH2、-CH2CH(C(O)NH2)CH3、-CH2CH(C(O)NH2)CH2CH3、-CH(C(O)NH2)CH2CH3和-C(CH3)2CH2C(O)NH2。
“鏈烷醇(alkanol)”指如上定義的C1-C5烷基，其中，C1-C5烷基中的一個氫原子已被羥基取代。鏈烷醇基團的典型例子包括，但不限于-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH2CH2CH2OH、-CH2CH2CH2CH2OH、-CH2CH2CH2CH2CH2OH、-CH2CH(OH)CH3、-CH2CH(OH)CH2CH3、-CH(OH)CH3和-C(CH3)2CH2OH。
“烷基羧基”指如上定義的C1-C5烷基，其中，C1-C5烷基中的一個氫原子已被-COOH基團取代。烷基羧基的典型例子包括，但不限于-CH2COOH、-CH2CH2COOH、-CH2CH2CH2COOH、-CH2CH2CH2CH2COOH、-CH2CH(COOH)CH3、-CH2CH2CH2CH2CH2COOH、-CH2CH(COOH)CH2CH3、-CH(COOH)CH2CH3和-C(CH3)2CH2COOH。
本文所用的術(shù)語“環(huán)烷基”包括具有3-12個碳、優(yōu)選3-8個碳、更優(yōu)選3-6個碳的飽和和部分不飽和的環(huán)烴基，其中，環(huán)烷基另外任選地被取代。一些環(huán)烷基包括，但不限于環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)戊烯基、環(huán)己基、環(huán)己烯基、環(huán)庚基和環(huán)辛基。
術(shù)語“雜芳基”指芳香族的5-8元單環(huán)、8-12元雙環(huán)或11-14元三環(huán)系統(tǒng)，其如果是單環(huán)，具有1-3個雜原子；如果是雙環(huán)，具有1-6個雜原子；或如果是三環(huán)，具有1-9個雜原子，所述雜原子選自O(shè)、N或S(例如，如果是單環(huán)、雙環(huán)或三環(huán)，分別有碳原子和1-3、1-6或1-9個O、N或S雜原子)，其中，各個環(huán)的0、1、2、3或4個原子被取代基取代。雜芳基的例子包括吡啶基、呋喃基(furyl或furanyl)、咪唑基、苯并咪唑基、嘧啶基、苯硫基或噻吩基、喹啉基(quinolinyl)、吲哚基、噻唑基等。
術(shù)語“雜芳基烷基”或術(shù)語“雜芳烷基”指被雜芳基取代的烷基。術(shù)語“雜芳基烷氧基”指被雜芳基取代的烷氧基。
術(shù)語“雜芳基烷基”或術(shù)語“雜芳烷基”指被雜芳基取代的烷基。術(shù)語“雜芳基烷氧基”指被雜芳基取代的烷氧基。
術(shù)語“雜環(huán)基”指非芳香族的5-8元單環(huán)、8-12元雙環(huán)或11-14元三環(huán)系統(tǒng)，其如果是單環(huán)，具有1-3個雜原子；如果是雙環(huán)，具有1-6個雜原子；或如果是三環(huán)，具有1-9個雜原子，所述雜原子選自O(shè)、N或S(例如，如果是單環(huán)、雙環(huán)或三環(huán)，分別有碳原子和1-3、1-6或1-9個O、N或S雜原子)，其中，各個環(huán)的0、1、2或3個原子被取代基取代。雜環(huán)基的例子包括哌嗪基(piperazinyl)、吡咯烷基、二噁烷基(dioxanyl)、嗎啉基(morpholinyl)、四氫呋喃基等。
術(shù)語“取代基”指在烷基、環(huán)烷基、芳基、雜環(huán)基或雜芳基上的任一個原子處“取代”的基團。合適的取代基包括，但不限于鹵素、羥基、巰基、氧代、硝基、鹵代烷基、烷基、烷芳基、芳基、芳烷基、烷氧基、硫代烷氧基、芳氧基、氨基、烷氧羰基、酰胺基、羧基、鏈烷磺酰基、烷基羰基和氰基。
在某些實施方式中，本發(fā)明的化合物包含一個或多個不對稱中心，因而作為外消旋體或外消旋混合物、單一的對映異構(gòu)體、單獨的非對映異構(gòu)體和非對映體混合物存在。除非另外清楚地指出，本發(fā)明包括這些化合物的所有這樣的異構(gòu)形式。在某些實施方式中，本發(fā)明的化合物也顯示為多種互變異構(gòu)形式，在這樣的例子中，本發(fā)明包括本文所述化合物的所有互變異構(gòu)形式(例如，如果環(huán)系統(tǒng)的烷基化導(dǎo)致多個位置烷基化，那么本發(fā)明包括所有這樣的反應(yīng)產(chǎn)物)。除非另外清楚地指出，本發(fā)明包括這樣的化合物的所有這樣的異構(gòu)形式。除非另外清楚地指出，本發(fā)明包括本文所述化合物的所有晶體形式。
如本文所用，術(shù)語“增加”或“減少”意味著分別導(dǎo)致統(tǒng)計上顯著的(即，p＜0.1)至少5％的增加或減少。
如本文所用，提及的變量數(shù)值范圍意味著表示，可以用等于該范圍內(nèi)的任何值的變量實施本發(fā)明。因此，對于本身離散的變量，變量等于該數(shù)值范圍內(nèi)的任何整數(shù)值，包括范圍的端點。類似地，對于本身連續(xù)的變量，變量等于該數(shù)值范圍內(nèi)的任何實值，包括范圍的端點。舉例來說，但不是限制，如果變量本身是離散的，描述為具有0-2之間的值的變量取0、1或2；而且如果變量本身是連續(xù)的，則取0.0、0.1、0.01、0.001的值或其它任何≥0且≤2的實值。
如本文所用，除非特別地指出，單詞“或”的使用是“和/或”的包含性的含義，而非“任一/或”的排它性的含義。
在下面的附圖
和描述中闡明了本發(fā)明的一種或多種特定實施方式的細節(jié)。從說明書、附圖和權(quán)利要求書可以顯而易見地看出本發(fā)明的其它特征、目標和優(yōu)勢。
本發(fā)明的擬肽大環(huán)化合物 本發(fā)明提供了式(I)的擬肽大環(huán)化合物

(式I) 其中 A、C、D和E各自獨立地是天然或非天然的氨基酸； B是天然或非天然的氨基酸、氨基酸類似物、

-[NH-L3-CO-]、[-NH-L3-SO2-]或[-NH-L3-]； R1和R2獨立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素取代的； R3是氫、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x被R5取代； L是式

的形成大環(huán)的連接體； L1、L2和L3獨立地是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞環(huán)芳基、亞雜環(huán)芳基或[-R4-K-R4-]n，各任選被R5取代； 各R4是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞芳基或亞雜芳基； 各個K是O、S、SO、SO2、CO、CO2或CONR3； 各R5獨立地是鹵素、烷基、-OR6、-N(R6)2、-SR6、-SOR6、-SO2R6、-CO2R6、熒光部分、放射性同位素或治療劑； 各個R6獨立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、熒光部分、放射性同位素或治療劑； R7是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x被R5取代，或作為與D殘基所形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分； R8是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x被R5取代，或作為與E殘基所形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分； v是1-1000的整數(shù)； w是1-1000的整數(shù)； x是0-10的整數(shù)； y是0-10的整數(shù)； z是0-10的整數(shù)；且 n是1-5的整數(shù)。
在本發(fā)明的某些實施方式中，x+y+z至少是3。在本發(fā)明的其它實施方式中，x+y+z是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。獨立地選擇各A、B、C、D或E在本發(fā)明的大環(huán)化合物或大環(huán)化合物前體中的存在。例如，由x是3的式[A]x代表的序列包括其中氨基酸不相同的實施方式，例如，Gln-Asp-Ala，以及其中氨基酸相同的實施方式，例如，Gln-Gln-Gln。這適用于指定范圍內(nèi)的x、y或z的任意值。
在某些實施方式中，本發(fā)明的擬肽大環(huán)化合物包含其是α-螺旋的二級結(jié)構(gòu)，且R8是-H，從而允許螺旋內(nèi)的氫鍵鍵合。
在其它實施方式中，選擇按照從第一Cα到第二Cα測量的形成大環(huán)的連接體L的長度以穩(wěn)定希望的二級肽結(jié)構(gòu)，如由擬肽大環(huán)化合物的殘基(包括但不是必定限于位于第一Cα和第二Cα之間的殘基)形成的α-螺旋。
在某些實施方式中，擬肽大環(huán)化合物包含至少一個α-螺旋基序。例如，式I的化合物中的A、B和/或C包括一個或多個α-螺旋。一般地說，α-螺旋包括3-4個氨基酸殘基/圈。在某些實施方式中，擬肽大環(huán)化合物的α-螺旋包括1-5圈，因而包括3-20個氨基酸殘基。在特定實施方式中，α-螺旋包括1圈、2圈、3圈、4圈或5圈。在某些實施方式中，形成大環(huán)的連接體使包括在擬肽大環(huán)化合物內(nèi)的α-螺旋基序穩(wěn)定。因此，在某些實施方式中，選擇從第一Cα到第二Cα的形成大環(huán)的連接體L的長度以提高α-螺旋的穩(wěn)定性。在某些實施方式中，形成大環(huán)的連接體跨越α-螺旋的1-5圈。在某些實施方式中，形成大環(huán)的連接體跨越α-螺旋的大約1圈、2圈、3圈、4圈或5圈。在某些實施方式中，形成大環(huán)的連接體的長度是α-螺旋的每圈大約5

-9

或α-螺旋的每圈大約6

-8

在形成大環(huán)的連接體跨越α-螺旋的大約1圈時，長度等于大約5個-13個碳-碳鍵、大約7個-11個碳-碳鍵或大約9個碳-碳鍵。在形成大環(huán)的連接體跨越α-螺旋的大約2圈時，長度等于大約8個-16個碳-碳鍵、大約10個-14個碳-碳鍵或大約12個碳-碳鍵。在形成大環(huán)的連接體跨越α-螺旋的大約3圈時，長度等于大約14個-22個碳-碳鍵、大約16個-20個碳-碳鍵或大約18個碳-碳鍵。在形成大環(huán)的連接體跨越α-螺旋的大約4圈時，長度等于大約20個-28個碳-碳鍵、大約22個-26個碳-碳鍵或大約24個碳-碳鍵。在形成大環(huán)的連接體跨越α-螺旋的大約5圈時，長度等于大約26個-34個碳-碳鍵、大約28個-32個碳-碳鍵或大約30個碳-碳鍵。在形成大環(huán)的連接體跨越α-螺旋的大約1圈時，連接包含大約4個-12個原子、大約6個-10個原子或大約8個原子。在形成大環(huán)的連接體跨越α-螺旋的大約2圈時，連接包含大約7個-15個原子、大約9個-13個原子或大約11個原子。在形成大環(huán)的連接體跨越α-螺旋的大約3圈時，連接包含大約13個-21個原子、大約15個-19個原子或大約17個原子。在形成大環(huán)的連接體跨越α-螺旋的大約4圈時，連接包含大約19個-27個原子、大約21個-25個原子或大約23個原子。在形成大環(huán)的連接體跨越α-螺旋的大約5圈時，連接包含大約25個-33個原子、大約27個-31個原子或大約29個原子。在形成大環(huán)的連接體跨越α-螺旋的大約1圈時，產(chǎn)生的大環(huán)形成包含大約17元-25元、大約19元-23元或大約21元的環(huán)。在形成大環(huán)的連接體跨越α-螺旋的大約2圈時，產(chǎn)生的大環(huán)形成包含大約29元-37元、大約31元-35元或大約33元的環(huán)。在形成大環(huán)的連接體跨越α-螺旋的大約3圈時，產(chǎn)生的大環(huán)形成包含大約44元-52元、大約46元-50元或大約48元的環(huán)。在大環(huán)形成連接體跨越α-螺旋的大約4圈時，產(chǎn)生的大環(huán)形成包含大約59元-67元、大約61元-65元或大約63元的環(huán)。在大環(huán)形成連接體跨越α-螺旋的大約5圈時，產(chǎn)生的大環(huán)形成包含大約74元-82元、大約76元-80元或大約78元的環(huán)。
形成大環(huán)的連接體L的示例性的實施方式如下所示

在其它實施方式中，為了促進細胞攝取，進一步修飾D和/或E。在某些實施方式中，脂質(zhì)化(lipidating)或PEG化(PEGylating)擬肽大環(huán)化合物促進細胞攝取、提高生物利用度、增加血液循環(huán)、改變藥物代謝動力學(xué)、降低免疫原性和/或降低需要的給藥頻率。
在一種實施方式中，當(dāng)與相應(yīng)的非大環(huán)多肽比較時，擬肽大環(huán)化合物顯示改善的生物學(xué)性質(zhì)，如提高的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、提高的對靶標的親和力、提高的對蛋白水解降解作用的抗性和/或提高的細胞滲透性。在另一種實施方式中，當(dāng)與相應(yīng)的非大環(huán)多肽比較時，擬肽大環(huán)化合物在水溶液中包含一個或多個α-螺旋，和/或顯示提高的α-螺旋度。在某些實施方式中，形成大環(huán)的連接體提高了擬肽大環(huán)化合物的細胞滲透性。不希望受限于理論，假設(shè)相對于相應(yīng)的非大環(huán)多肽，形成大環(huán)的連接體可以提高擬肽大環(huán)化合物的總體疏水性。
具有已知的一級氨基酸序列的任何蛋白質(zhì)或多肽(其包含據(jù)信賦予生物活性的二級結(jié)構(gòu))是本發(fā)明的主題。例如，可以分析該多肽的序列，并且可以在適當(dāng)?shù)奈恢萌〈景l(fā)明的包含疊氮和包含炔的氨基酸類似物。通過查明生物活性需要二級結(jié)構(gòu)的哪一個(哪些)分子表面，以及因此本發(fā)明的形成大環(huán)的連接體可以跨過另外的哪一個(哪些)表面形成大環(huán)化合物而不會在空間上阻礙生物活性所需的表面，來確定所述適當(dāng)?shù)奈恢谩Ｊ褂萌缦路椒ㄟM行這樣的確定如二級結(jié)構(gòu)和天然的結(jié)合配體之間的復(fù)合物的X-射線結(jié)晶學(xué)分析，以顯現(xiàn)對于活性關(guān)鍵的殘基(和表面)；通過二級結(jié)構(gòu)中的殘基的順序誘變，以在功能上確認對于活性關(guān)鍵的殘基(和表面)；或通過其它方法。通過這樣的確定，用本發(fā)明的氨基酸類似物和形成大環(huán)的連接體取代合適的氨基酸。例如，對于α-螺旋的二級結(jié)構(gòu)，生物學(xué)活性可能需要螺旋的一個表面(例如，沿螺旋的軸縱向地和圍繞螺旋的軸大約45-135°徑向地延伸的分子表面)在體內(nèi)或體外與另一個生物分子接觸。在這種情況下，形成大環(huán)的連接體設(shè)計為連接螺旋的2個α-碳，同時在活性不直接需要的該表面的一部分中沿螺旋表面縱向地延伸。
在本發(fā)明的某些實施方式中，肽序列源自蛋白質(zhì)的BCL-2家族。BCL-2家族被定義為存在最多4個被命名為BH1、BH2、BH3和BH4的保守的BCL-2同源性(BH)結(jié)構(gòu)域，所有這些結(jié)構(gòu)域均包括α-螺旋片段(Chittenden等人(1995)，EMBO 145589；Wang等人(1996)，Genes Dev.102859)?？沟蛲龅鞍踪|(zhì)(如BCL-2和BCL-XL)在所有BH結(jié)構(gòu)域中表現(xiàn)出序列保守性。促凋亡蛋白質(zhì)被分為“多結(jié)構(gòu)域”家族成員(例如，BAK、BAX)，其在BH1、BH2和BH3結(jié)構(gòu)域中具有同源性；和“僅BH3結(jié)構(gòu)域”家族成員(例如，BID、BAD、BIM、BIK、NOXA、PUMA)，其只在BH3兩親性α-螺旋片段中包含序列同源性。BCL-2家族成員具有形成同型二聚體和雜二聚體的能力，表明促凋亡蛋白質(zhì)與抗凋亡蛋白質(zhì)水平之間的競爭性結(jié)合和比率決定了對于死亡刺激的易感性?？沟蛲龅鞍踪|(zhì)的功能是保護細胞免于促凋亡過量，即，過度的程序性細胞死亡。另外的“安全”措施包括調(diào)節(jié)促凋亡蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和保持它們作為無活性的構(gòu)象異構(gòu)體，這需要蛋白水解活化、脫磷酸化作用或配體誘導(dǎo)的構(gòu)象變化以激活促死亡功能。在某些細胞類型中，在質(zhì)膜處接收到的死亡信號經(jīng)線粒體途徑引發(fā)細胞凋亡。線粒體通過螯合細胞色素c(活化胱天蛋白酶(caspase)9的胞質(zhì)復(fù)合物的關(guān)鍵成分)起到細胞死亡的控制者(gatekeeper)的作用，從而導(dǎo)致致死性的下游蛋白溶解事件。多結(jié)構(gòu)域蛋白(如BCL-2/BCL-XL和BAK/BAX)在線粒體膜處發(fā)揮護衛(wèi)者和執(zhí)行者(guardian and executioner)的對抗性作用，其活性進一步受上游的BCL-2家族的僅BH3成員的調(diào)節(jié)。例如，BID是促凋亡蛋白質(zhì)的僅BH3結(jié)構(gòu)域家族中的成員，并將在質(zhì)膜處接收到的死亡信號傳遞給線粒體膜處的效應(yīng)促凋亡蛋白質(zhì)。BID具有與促凋亡蛋白質(zhì)和抗凋亡蛋白質(zhì)相互作用的能力，并且在由胱天蛋白酶8活化時，引發(fā)細胞色素c釋放和線粒體凋亡。缺失和誘變研究確定，促凋亡家族成員的兩親性α-螺旋BH3片段可以作為死亡域發(fā)揮功能，并因此可以代表與多結(jié)構(gòu)域凋亡蛋白質(zhì)相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基序。結(jié)構(gòu)研究已證明BH3螺旋可以通過插入由BH1、2和3結(jié)構(gòu)域的界面形成的疏水性溝而與抗凋亡蛋白質(zhì)相互作用?；罨腂ID可以被抗凋亡蛋白質(zhì)(例如，BCL-2和BCL-XL)結(jié)合并螯合，并可以引發(fā)促凋亡蛋白質(zhì)BAX和BAK的活化，導(dǎo)致細胞色素c釋放和線粒體凋亡程序。BAD也是僅BH3結(jié)構(gòu)域促凋亡家族成員，其表達觸發(fā)BAX/BAK的活化。但是，與BID相反，BAD顯示優(yōu)先結(jié)合抗凋亡家族成員BCL-2和BCL-XL。BAD BH3結(jié)構(gòu)域顯示與BCL-2結(jié)合的高親和力，而BAD BH3肽不能在體外激活細胞色素c從線粒體的釋放，表明BAD不是BAX/BAK的直接活化劑。過度表達BCL-2的線粒體對BID誘導(dǎo)的細胞色素c釋放有抗性，但與BAD共同處理可以恢復(fù)BID敏感性。BAD對線粒體凋亡的誘導(dǎo)似乎是由于(1)BAX/BAK活化劑，如BID和BID樣蛋白質(zhì)，從BCL-2/BCL-XL結(jié)合袋(binding pocket)中移除；或者(2)BAD選擇性占據(jù)了BCL-2/BCL-XL結(jié)合袋，從而阻止了BID樣蛋白質(zhì)被抗凋亡蛋白質(zhì)螯合。因此，已經(jīng)出現(xiàn)兩種類型的僅BH3結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)直接活化線粒體凋亡的BID樣蛋白質(zhì)，和具有通過占據(jù)多結(jié)構(gòu)域抗凋亡蛋白質(zhì)的結(jié)合袋而使線粒體對BID樣促凋亡劑敏感的能力的BAD樣蛋白質(zhì)。已經(jīng)公開了適合本文公開的方法的BCL-2家族成員蛋白質(zhì)的各種α-螺旋結(jié)構(gòu)域(Walensky等人(2004)，Science 3051466；和Walensky等人，美國專利公開第2005/0250680號，本文引入其完整內(nèi)容作為參考)。
在其它實施方式中，肽序列源自結(jié)合癌基因蛋白MDM2的腫瘤抑制性p53蛋白。MDM2結(jié)合位點位于形成α-螺旋的p53腫瘤抑制劑區(qū)域內(nèi)。在美國專利7,083,983中(本文引入其完整內(nèi)容作為參考)，Lane等人公開了負責(zé)結(jié)合MDM2的p53區(qū)域大致由成熟人p53蛋白的氨基酸13-31(PLSQETFSDLWKLLPENNV)代表。由Lane公開的其它修飾的序列也包括在本發(fā)明中。而且，Shair等人(1997)，Chem.&Biol.4791已經(jīng)討論了p53和MDM2的相互作用，本文引入其完整內(nèi)容作為參考；而且在報道的全部癌癥病例中，實際上有一半已確認了p53基因中的突變。當(dāng)對細胞施加應(yīng)激時，據(jù)信p53協(xié)調(diào)導(dǎo)致細胞周期停止和DNA修復(fù)的反應(yīng)或程序性細胞死亡的反應(yīng)。像直接改變p53蛋白的功能的p53基因中的突變一樣，可以通過MDM2中的變化改變p53。已經(jīng)表明MDM2蛋白結(jié)合p53，并通過與p53的反式激活域結(jié)合破壞轉(zhuǎn)錄激活。例如，源自p53的反式激活域的11氨基酸肽形成插入MDM2裂隙內(nèi)的2.5圈的兩親性α-螺旋。因此，在某些實施方式中，由本發(fā)明的方法產(chǎn)生的新的α-螺旋結(jié)構(gòu)經(jīng)人工改造，產(chǎn)生緊密結(jié)合螺旋受體并破壞天然的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)。然后使用高通量技術(shù)篩選這些結(jié)構(gòu)，以鑒定最佳的小分子肽。破壞MDM2相互作用的新結(jié)構(gòu)可用于許多應(yīng)用，包括但不限于，軟組織肉瘤(其在野生型p53的存在下過度表達MDM2)的控制。在某些實施方式中，這些癌癥然后被截斷MDM2的小分子阻止，因而防止了p53的抑制。此外，在某些實施方式中，MDM2-p53相互作用的小分子干擾劑作為治療輔劑用來幫助控制和調(diào)節(jié)常規(guī)化療中p53依賴性細胞凋亡反應(yīng)的程度。
下面給出了用于本發(fā)明的合適的肽序列的非限制性的示例性列表 表1

表1列出了人類序列，其靶向于BH3結(jié)合位點，并與癌癥、自身免疫疾病、代謝疾病和其它人類疾病有關(guān)。
表2
表2列出了人類序列，其靶向于BH3結(jié)合位點，并與癌癥、自身免疫疾病、代謝疾病和其它人類疾病有關(guān)。
表3

表3列出了人類序列，其靶向于MDM2/X的p53結(jié)合位點，并與癌癥有關(guān)。
表4
表4列出了序列，其靶向于人類G蛋白偶聯(lián)受體，并與多種人類疾病有關(guān)(Tyndall等人(2005)，Chem.Rev.105793-826)。
本發(fā)明的擬肽大環(huán)化合物的制備方法 本文公開了合成本發(fā)明的擬肽大環(huán)化合物的方法。在某些實施方式中，這些擬肽大環(huán)化合物的合成包括多步驟的過程，其特征在于合成含有疊氮部分和炔部分的擬肽前體；接著將擬肽前體與大環(huán)化試劑接觸以產(chǎn)生三唑連接的擬肽大環(huán)化合物。例如，大環(huán)化合物或大環(huán)化合物前體可以通過溶液相或固相方法合成，且可以包含天然存在的和非天然存在的氨基酸。參見，例如，Hunt，Chemistry andBiochemistry of the Amino Acids中的″The Non-Protein Amino Acids″，由G.C.Barrett編著，Chapman and Hall，1985。
在某些實施方式中，疊氮連接殘基的α-碳，且炔連接在另一個殘基的α-碳上。在某些實施方式中，疊氮部分是氨基酸L-賴氨酸、D-賴氨酸、α-甲基-L-賴氨酸、α-甲基-D-賴氨酸、L-鳥氨酸、D-鳥氨酸、α-甲基-L-鳥氨酸或α-甲基-D-鳥氨酸的疊氮基類似物。在另一種實施方式中，炔部分是L-炔丙基甘氨酸。在更其它的實施方式中，炔部分是選自以下的氨基酸L-炔丙基甘氨酸、D-炔丙基甘氨酸、(S)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-5-己炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-5-己炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-7-辛炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-7-辛炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-8-壬炔酸和(R)-2-氨基-2-甲基-8-壬炔酸。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供了一種合成擬肽大環(huán)化合物的方法，該方法包括將式III或式IV的擬肽前體與大環(huán)化試劑接觸的步驟

(式III)

(式IV) 其中，v、w、x、y、z、A、B、C、D、E、R1、R2、R7、R8、L1和L2如上文所定義；當(dāng)大環(huán)化試劑是Cu試劑時，R12是-H，或當(dāng)大環(huán)化試劑是Ru試劑時，R12是-H或烷基；而且進一步，其中，所述接觸步驟導(dǎo)致在式III或式IV中的炔部分和疊氮部分之間形成共價連接。例如，當(dāng)大環(huán)化試劑是Ru試劑時，R12可以是甲基。
在本發(fā)明的的方法的某些實施方式中，R1和R2中的至少一個是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素取代的。在相關(guān)的實施方式中，R1和R2獨立地是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素取代的。
例如，R1和R2中的至少一個可以是未取代的或被鹵素取代的烷基。在另一種實施例中，R1和R2兩個獨立地是未取代的或被鹵素取代的烷基。在某些實施方式中，R1和R2中的至少一個是甲基。在其它的實施方式中，R1和R2是甲基。大環(huán)化試劑可以是Cu試劑或Ru試劑。
在某些實施方式中，在接觸步驟之前純化擬肽前體。在其它的實施方式中，在接觸步驟之后純化擬肽大環(huán)化合物。在更其它的實施方式中，擬肽大環(huán)化合物在接觸步驟之后再折疊。本方法可以在溶液中進行，或者，可選擇地，本方法可以在固體載體上進行。
本文也預(yù)想，在結(jié)合擬肽前體或擬肽大環(huán)化合物的目標大分子的存在下，在有利于所述結(jié)合的條件下進行本發(fā)明的方法。在某些實施方式中，在優(yōu)先結(jié)合擬肽前體或擬肽大環(huán)化合物的目標大分子的存在下，在有利于所述結(jié)合的條件下進行本發(fā)明的方法。本方法也應(yīng)用于合成擬肽大環(huán)化合物的文庫。
本發(fā)明的方法產(chǎn)生的擬肽大環(huán)化合物在水溶液中可以包含α-螺旋。例如，擬肽大環(huán)化合物在水溶液中比相應(yīng)的非大環(huán)多肽顯示增加的α-螺旋結(jié)構(gòu)。在某些實施方式中，相比于相應(yīng)的非大環(huán)多肽，擬肽大環(huán)化合物顯示提高的熱穩(wěn)定性。在其它的實施方式中，相比于相應(yīng)的非大環(huán)多肽，擬肽大環(huán)化合物顯示提高的生物學(xué)活性。在更加其它的實施方式中，相比于相應(yīng)的非大環(huán)多肽，擬肽大環(huán)化合物顯示增強的對蛋白水解降解作用的抗性。在更其它的實施方式中，相比于相應(yīng)的非大環(huán)多肽，擬肽大環(huán)化合物顯示提高的滲透活細胞的能力。
在某些實施方式中，式III或式IV的擬肽前體的炔部分是選自以下的氨基酸的側(cè)鏈L-炔丙基甘氨酸、D-炔丙基甘氨酸、(S)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-5-己炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-5-己炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-7-辛炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-7-辛炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-8-壬炔酸和(R)-2-氨基-2-甲基-8-壬炔酸。在其它的實施方式中，式III或式IV的擬肽前體的疊氮部分是選自以下的氨基酸的側(cè)鏈ε-疊氮基-L-賴氨酸、ε-疊氮基-D-賴氨酸、ε-疊氮基-α-甲基-L-賴氨酸、ε-疊氮基-α-甲基-D-賴氨酸、δ-疊氮基-α-甲基-L-鳥氨酸和δ-疊氮基-α-甲基-D-鳥氨酸。
在某些實施方式中，x+y+z為3，且A、B和C獨立地是天然或非天然的氨基酸。在其它的實施方式中，x+y+z為6，且A、B和C獨立地是天然或非天然的氨基酸。
在某些實施方式中，接觸步驟在選自質(zhì)子溶劑、水性溶劑、有機溶劑及其混合物的溶劑中進行。例如，溶劑可以選自H2O、THF/H2O、tBuOH/H2O、DMF、DIPEA、CH3CN或CH2Cl2、ClCH2CH2Cl或其混合物。溶劑可以是有利于螺旋形成的溶劑。
在某些實施方式中，通過進行本發(fā)明的方法產(chǎn)生的擬肽大環(huán)化合物具有式(I)

(式I) 其中，v、w、x、y、z、A、B、C、D、E、R1、R2、R7、R8和L如上文所定義。
可以替換可替代的但等效的保護基團、離去基團或試劑，且特定的合成步驟可以按照可替代的順序或次序進行以產(chǎn)生需要的化合物。在合成本文所述的化合物中有用的合成化學(xué)轉(zhuǎn)化和保護基團方法(保護和去保護)包括，例如，那些例如在Larock，ComprehensiveOrganic Transformations，VCH Publishers(1989)；Greene和Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第2版，John Wiley and Sons(1991)；Fieser和Fieser，F(xiàn)ieser and Fieser′s Reagents for OrganicSynthesis，John Wiley and Sons(1994)；和Paquette編著，Encyclopediaof Reagents for Organic Synthesis，John Wiley and Sons(1995)及其后續(xù)的版本中所述的方法。
例如，通過如Fields等人，Synthetic PeptidesA User′s Guide中的第3章，Grant，W.H.編著，F(xiàn)reeman&Co.，New York，N.Y.，1992，第77頁中所述的化學(xué)合成方法制備本發(fā)明的擬肽大環(huán)化合物。因此，例如，使用自動化Merrifield固相合成技術(shù)，使用側(cè)鏈保護的氨基酸通過tBoc或Fmoc化學(xué)基團保護胺，在例如自動肽合成儀(例如，Applied Biosystems(Foster City，CA)，430A、431或433型)上合成肽。
一種產(chǎn)生本文所述的擬肽前體和擬肽大環(huán)化合物的方法使用固相肽合成(SPPS)。C-末端氨基酸經(jīng)與連接體分子的酸不穩(wěn)定鍵連接在交聯(lián)的聚苯乙烯樹脂上。這種樹脂不溶于用于合成的溶劑，使得洗去過量試劑和副產(chǎn)物相對簡單和快速。用在酸中穩(wěn)定、但可用堿去除的Fmoc基團保護N-末端。如必需的話，用堿穩(wěn)定的、酸不穩(wěn)定的基團保護側(cè)鏈官能團。
例如，使用天然的化學(xué)連接，通過連結(jié)單個的合成肽產(chǎn)生較長的擬肽前體?；蛘?，通過眾所周知的重組DNA和蛋白質(zhì)表達技術(shù)生物合成較長的合成肽。眾所周知的標準手冊中提供了這些技術(shù)的詳細方案。為了構(gòu)建編碼本發(fā)明的擬肽前體的基因，逆向翻譯氨基酸序列以獲得編碼氨基酸序列的核酸序列，優(yōu)選使用對于在其中表達該基因的有機體是最佳的密碼子。接下來，如果必須的話，典型地通過合成編碼肽的寡核苷酸和任何調(diào)節(jié)元件制備合成基因。將合成基因插入合適的克隆載體，并轉(zhuǎn)染到宿主細胞中。然后在適于選擇的表達系統(tǒng)和宿主的合適條件下表達該肽。通過標準方法純化并鑒定該肽。
例如，以高通量組合方式，例如使用高通量多通道組合合成儀(例如，來自AAPPTEC，Inc.，Louisville，KY的Apex 396型多通道肽合成儀)，制備擬肽前體。
單獨提供了下面的合成方案以說明本發(fā)明，但并非意在限制本文所述的本發(fā)明的范圍。為了簡化圖形，示例性的方案顯示了疊氮基氨基酸類似物ε-疊氮基-α-甲基-L-賴氨酸和ε-疊氮基-α-甲基-D-賴氨酸，及炔氨基酸類似物L(fēng)-炔丙基甘氨酸、(S)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸和(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸。因此，在下面的合成方案中，各個R1、R2、R7和R8是-H；各個L1是-(CH2)4-；且各個L2是-(CH2)-。但是，如以上整個發(fā)明詳述部分所指出的，可以采用許多其它氨基酸類似物，其中，R1、R2、R7、R8、L1和L2可以獨立地選自本文公開的各種結(jié)構(gòu)。
合成方案1
合成方案1描述了本發(fā)明的幾種化合物的制備。如Belokon等人(1998)，Tetrahedron Asymm.94249-4252所述制備由手性輔劑(S)-2-[N-(N’-芐基脯氨?；?氨基]苯甲酮(BPB)得來的席夫堿(Schiffbases)和氨基酸(如甘氨酸或丙氨酸)的Ni(II)復(fù)合物。產(chǎn)生的復(fù)合物隨后與包含疊氮部分或炔部分的烷基化試劑反應(yīng)以產(chǎn)生本發(fā)明的光學(xué)異構(gòu)性富集的(enantiomerically enriched)化合物。如需要，可以保護產(chǎn)生的化合物用于肽合成。
合成方案2
在如合成方案2所示的用于合成擬肽大環(huán)化合物的通用方法中，擬肽前體包含疊氮部分和炔部分，且通過使用可商購的氨基酸N-α-Fmoc-L-炔丙基甘氨酸及氨基酸(S)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸、(S)-2-氨基-6-庚炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸、N-甲基-ε-疊氮基-L-賴氨酸和N-甲基-ε-疊氮基-D-賴氨酸的N-α-Fmoc保護的形式的溶液相或固相肽合成法(SPPS)來合成。然后通過標準條件(例如，如95％TFA的強酸)將擬肽前體去保護并從固相樹脂上切下。擬肽前體作為粗制混合物進行反應(yīng)，或者在有機溶液或水性溶液中在與大環(huán)化試劑(如Cu(I))反應(yīng)前進行純化(Rostovtsev等人(2002)，Angew.Chem.Int.Ed.412596-2599；Tornoe等人(2002)，J.Org.Chem.673057-3064；Deiters等人(2003)，J.Am.Chem.Soc.12511782-11783；Punna等人(2005)，Angew.Chem.Int.Ed.442215-2220)。在一種實施方式中，在有利于α-螺旋形成的條件下進行三唑形成反應(yīng)。在一種實施方式中，在選自H2O、THF、CH3CN、DMF、DIPEA、tBuOH或其混合物的溶劑中進行大環(huán)化步驟。在另一種實施方式中，在DMF中進行大環(huán)化步驟。在某些實施方式中，在緩沖的水性溶劑或部分水性溶劑中進行大環(huán)化步驟。
合成方案3
在如合成方案3所示的用于合成擬肽大環(huán)化合物的通用方法中，擬肽前體包含疊氮部分和炔部分，且使用可商購的氨基酸N-α-Fmoc-L-炔丙基甘氨酸及氨基酸(S)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸、(S)-2-氨基-6-庚炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸、N-甲基-ε-疊氮基-L-賴氨酸和N-甲基-ε-疊氮基-D-賴氨酸的N-α-Fmoc保護的形式通過固相肽合成法(SPPS)來合成。擬肽前體作為粗制混合物與樹脂上的大環(huán)化試劑(如Cu(I))反應(yīng)(Rostovtsev等人(2002)，Angew.Chem.Int.Ed.412596-2599；Tornoe等人(2002)，J.Org.Chem.673057-3064；Deiters等人(2003)，J.Am.Chem.Soc.12511782-11783；Punna等人(2005)，Angew.Chem.Int.Ed.442215-2220)。然后通過標準條件(例如，如95％TFA的強酸)將合成的含三唑的擬肽大環(huán)化合物去保護并從固相樹脂上切下。在某些實施方式中，在選自CH2Cl2、ClCH2CH2Cl、DMF、THF、NMP、DIPEA、2，6-二甲基吡啶、吡啶、DMSO、H2O或其混合物的溶劑中進行大環(huán)化步驟。在某些實施方式中，在緩沖的水性溶劑或部分水性溶劑中進行大環(huán)化步驟。
合成方案4
在如合成方案4所示的用于合成擬肽大環(huán)化合物的通用方法中，擬肽前體包含疊氮部分和炔部分，且使用可商購的氨基酸N-α-Fmoc-L-炔丙基甘氨酸及氨基酸(S)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸、(S)-2-氨基-6-庚炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸、N-甲基-ε-疊氮基-L-賴氨酸和N-甲基-ε-疊氮基-D-賴氨酸的N-α-Fmoc保護的形式通過溶液相或固相肽合成法(SPPS)來合成。然后通過標準條件(例如，如95％TFA的強酸)將擬肽前體去保護并從固相樹脂上切下。擬肽前體作為粗制混合物進行反應(yīng)，或者在與大環(huán)化試劑如Cu(II)(例如Cp*RuCl(PPh3)2或[Cp*RuCl]4)反應(yīng)前進行純化(Rasmussen等人(2007)，Org.Lett.95337-5339；Zhang等人(2005)，J.Am.Chem.Soc.12715998-15999)。在某些實施方式中，在選自DMF、CH3CN和THF的溶劑中進行大環(huán)化步驟。
合成方案5
在如合成方案5所示的用于合成擬肽大環(huán)化合物的通用方法中，擬肽前體包含疊氮部分和炔部分，且使用可商購的氨基酸N-α-Fmoc-L-炔丙基甘氨酸及氨基酸(S)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸、(S)-2-氨基-6-庚炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸、N-甲基-ε-疊氮基-L-賴氨酸和N-甲基-ε-疊氮基-D-賴氨酸的N-α-Fmoc保護的形式通過固相肽合成法(SPPS)來合成。擬肽前體作為粗制混合物與在樹脂上的大環(huán)化試劑(如Cu(II)試劑)反應(yīng)。例如，該試劑可以是Cp*RuCl(PPh3)2或[Cp*RuCl]4(Rasmussen等人(2007)，Org.Lett.95337-5339；Zhang等人(2005)，J.Am.Chem.Soc.12715998-15999)。在某些實施方式中，在選自CH2Cl2、ClCH2CH2Cl、CH3CN、DMF和THF的溶劑中進行大環(huán)化步驟。
表5顯示幾種示例性的擬肽大環(huán)化合物。對于這些大環(huán)化合物，對應(yīng)的非大環(huán)多肽是BID BH3多肽序列片段DIIRNIARHLAQVGDSMDRSI?！癗le”代表正亮氨酸并取代甲硫氨酸殘基?？梢韵氲礁鶕?jù)表1-表4所公開的多肽序列使用類似的連接體合成擬肽大環(huán)化合物。
表5
表5顯示本發(fā)明的示例性的擬肽大環(huán)化合物?！癗le”代表正亮氨酸。
氨基酸類似物 本發(fā)明包括非天然存在的氨基酸和氨基酸類似物在合成本文所述的擬肽大環(huán)化合物中的應(yīng)用。任何適合于用來合成穩(wěn)定的含三唑擬肽大環(huán)化合物的合成方法的氨基酸或氨基酸類似物都可以用于本發(fā)明中。例如，預(yù)計L-炔丙基甘氨酸是本發(fā)明中有用的氨基酸。但是，其它含有不同氨基酸側(cè)鏈的含炔的氨基酸也可用于本發(fā)明。例如，L-炔丙基甘氨酸在氨基酸的α-碳和氨基酸側(cè)鏈的炔之間含有一個亞甲基單元。本發(fā)明也包括使用在α-碳和炔之間具有多個亞甲基單元的氨基酸。同樣，本發(fā)明也包括作為本發(fā)明的有用氨基酸的氨基酸L-賴氨酸、D-賴氨酸、α-甲基-L-賴氨酸和α-甲基-D-賴氨酸的疊氮類似物。但是，其它含有不同的氨基酸側(cè)鏈的末端疊氮基氨基酸也可以用于本發(fā)明。例如，L-賴氨酸的疊氮類似物在氨基酸的α-碳和氨基酸側(cè)鏈的末端疊氮基之間含有4個亞甲基單元。本發(fā)明也包括使用在氨基酸的α-碳和末端疊氮基之間具有少于或多于4個亞甲基單元的氨基酸。表6顯示一些可用于制備本發(fā)明的擬肽大環(huán)化合物的氨基酸。
表6
表6顯示用于制備本發(fā)明的擬肽大環(huán)化合物的示例性的氨基酸。
在某些實施方式中，氨基酸和氨基酸類似物是D-構(gòu)型。在其它的實施方式中，它們是L-構(gòu)型。在某些實施方式中，擬肽中包含的某些氨基酸和氨基酸類似物是D-構(gòu)型，而某些氨基酸和氨基酸類似物是L-構(gòu)型。在某些實施方式中，氨基酸類似物是α，α-二取代的，如α-甲基-L-炔丙基甘氨酸、α-甲基-D-炔丙基甘氨酸、ε-疊氮基-α-甲基-L-賴氨酸和ε-疊氮基-α-甲基-D-賴氨酸。在某些實施方式中，氨基酸類似物是N-烷基化的，例如，N-甲基-L-炔丙基甘氨酸、N-甲基-D-炔丙基甘氨酸、N-甲基-ε-疊氮基-L-賴氨酸和N-甲基-ε-疊氮基-D-賴氨酸。
在某些實施方式中，使用保護基團(包括但不限于-Fmoc和-Boc)保護氨基酸的-NH部分。在其它實施方式中，在合成擬肽大環(huán)化合物之前不保護氨基酸。
在某些實施方式中，用于本發(fā)明的擬肽大環(huán)化合物的合成的氨基酸是式IIa或式IIb的化合物
其中， R1和R2獨立地是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素取代的； Q和T各獨立地選自亞烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞芳基、亞雜芳基和[-R4-K-R4-]n，其各是未取代的或被R5取代； K是O、S、SO、SO2、CO、CO2或CONR3； R3是氫、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x被R5取代； R4是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞芳基或亞雜芳基； 各R5獨立地是鹵素、烷基、-OR6、-N(R6)2、-SR6、-SOR6、-SO2R6、-CO2R6、熒光部分、放射性同位素或治療劑； 各R6獨立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、熒光部分、放射性同位素或治療劑； R7和R8獨立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基烷基或雜環(huán)烷基； R10和R11獨立地是-H或任何適于肽合成的保護基； g和h各獨立地是0-5的整數(shù)，其中，g+h大于1；且 n是1-5的整數(shù)。
在某些實施方式中，化合物是式IIa的化合物，且R1是未取代的或被鹵素取代的烷基。在其它的實施方式中，化合物是式IIb的化合物，且R2是未取代的或被鹵素取代的烷基。在更其它的實施方式中，化合物是式IIa的化合物，且R1是未取代的烷基。例如，R1可以是甲基。在更加其它的實施方式中，化合物是式IIb的化合物，且R2是未取代的烷基。例如，R2可以是甲基。
在本發(fā)明的化合物的某些實施方式中，R9和R10中的至少一個是適于肽合成的保護基。
試劑盒 另一方面，本發(fā)明進一步提供了包含本發(fā)明的化合物或用于制備本發(fā)明的擬肽大環(huán)化合物的其它氨基酸類似物及本文所述的大環(huán)化試劑的試劑盒。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供了一種試劑盒，該試劑盒包含 a)至少一種選自式IIa的化合物和式IIb的化合物的化合物
其中， R1和R2獨立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素取代的； Q和T各獨立地選自亞烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞芳基、亞雜芳基和[-R4-K-R4-]n，其各是未取代的或被R5取代； K是O、S、SO、SO2、CO、CO2或CONR3； R3是氫、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x被R5取代； R4是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞芳基或亞雜芳基； 各R5獨立地是鹵素、烷基、-OR6、-N(R6)2、-SR6、-SOR6、-SO2R6、-CO2R6、熒光部分、放射性同位素或治療劑； 各R6獨立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、熒光部分、放射性同位素或治療劑； R7和R8獨立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基烷基或雜環(huán)烷基； R10和R11獨立地是-H或任何適于肽合成的保護基； g和h各獨立地是0-5的整數(shù)； n是1-5的整數(shù)；和 b)大環(huán)化試劑。
在某些實施方式中，試劑盒包括式IIa的化合物，且R1是未取代的或被鹵素取代的烷基。在相關(guān)的實施方式中，R1是未取代的烷基。例如，R1可以是甲基。在其它的實施方式中，試劑盒包括式IIb的化合物，且R2是未取代的或被鹵素取代的烷基。在相關(guān)的實施方式中，R2是未取代的烷基。例如，R2可以是甲基。
在某些實施方式中，試劑盒包括至少一種式IIa的化合物和至少一種式IIb的化合物。本發(fā)明的試劑盒也可以包括式IIa或式IIb的化合物，其中，R9和R10中的至少一個是適于肽合成的保護基。在本發(fā)明的試劑盒的特定的實施方式中，大環(huán)化試劑是Cu試劑或Ru試劑。在某些實施方式中，試劑盒包含多個式IIa和/或IIb的化合物。在某些實施方式中，試劑盒包含一個或多個容納一種或多種如本文所述的氨基酸類似物的容器。在其它實施方式中，試劑盒包含一個或多個容納一種或多種如本文所述的大環(huán)化試劑的容器。在更其它的實施方式中，試劑盒包含一個或多個容納一種或多種如本文所述的氨基酸類似物的容器，以及一個或多個容納一種或多種如本文所述的大環(huán)化試劑的容器。
例如，在某些實施方式中，試劑盒包含容納至少兩種如上所述的氨基酸類似物的容器，至少一種氨基酸類似物具有側(cè)鏈炔和至少一種氨基酸類似物具有側(cè)鏈末端疊氮部分，該氨基酸類似物任選地受到保護并適于本文所述的合成。在某些實施方式中，氨基酸類似物選自L-炔丙基甘氨酸、D-炔丙基甘氨酸、(S)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-5-己炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-5-己炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-7-辛炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-7-辛炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-8-壬炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-8-壬炔酸、ε-疊氮基-L-賴氨酸、ε-疊氮基-D-賴氨酸、ε-疊氮基-α-甲基-L-賴氨酸和ε-疊氮基-α-甲基-D-賴氨酸、δ-疊氮基-α-甲基-L-鳥氨酸和δ-疊氮基-α-甲基-D-鳥氨酸及用于液相或固相肽合成的所有適當(dāng)保護的形式。
在某些實施方式中，試劑盒包括容納結(jié)合到與本文所述的擬肽大環(huán)化合物合成相容的固體載體上的至少一種非天然存在的氨基酸或氨基酸類似物的容器。在某些實施方式中，試劑盒包含一個容納本發(fā)明的含有末端炔部分的氨基酸類似物的容器，結(jié)合容納本發(fā)明的含有末端疊氮部分的氨基酸類似物的容器，結(jié)合本發(fā)明的大環(huán)化試劑。
分析 例如，本發(fā)明的擬肽大環(huán)化合物的性質(zhì)通過使用下面所述的方法進行分析。在某些實施方式中，相對于相應(yīng)的非大環(huán)多肽，本發(fā)明的大環(huán)化合物具有增強的性質(zhì)。相應(yīng)的非大環(huán)多肽是，例如，擬肽大環(huán)化合物的前體，如轉(zhuǎn)化為所述大環(huán)化合物的式III或IV的化合物?；蛘撸鄳?yīng)的非大環(huán)多肽是具有與本發(fā)明的大環(huán)化合物重疊的實質(zhì)序列的多肽序列，如天然多肽序列。相應(yīng)于大環(huán)多肽的天然多肽的許多例子如表1、2、3和4所示。
一般地，相應(yīng)的非大環(huán)多肽也可以是標記的天然多肽或擬肽前體。例如，如果必需的話，在下面所述的一些分析試驗中使用這樣的標記，例如熒光標記或放射性標記。在這樣的分析試驗中，典型地通過類似的或功能上相當(dāng)?shù)姆椒擞洿蟓h(huán)化合物和相應(yīng)的非大環(huán)多肽。
測定α-螺旋度的分析 在溶液中，具有α-螺旋結(jié)構(gòu)域的多肽二級結(jié)構(gòu)在隨機卷曲結(jié)構(gòu)和α-螺旋結(jié)構(gòu)之間達到動態(tài)平衡，這經(jīng)常稱為“百分螺旋度”。因此，例如，未修飾的促凋亡BH3結(jié)構(gòu)域在溶液中主要是隨機卷曲，具有通常低于25％的α-螺旋含量。另一方面，具有優(yōu)化連接體的擬肽大環(huán)化合物具有例如高于相應(yīng)的非大環(huán)多肽至少2倍的α-螺旋度。在某些實施方式中，本發(fā)明的大環(huán)化合物具有高于50％的α-螺旋度。為了測定本發(fā)明的擬肽大環(huán)化合物(例如基于BH3結(jié)構(gòu)域的大環(huán)化合物)的螺旋度，將化合物溶于水性溶液(例如，pH 7的50mM磷酸鉀溶液或蒸餾水，達到25-50μM的濃度)中。使用標準測量參數(shù)(例如，溫度，20℃；波長，190-260nm；步距分辨率(step resolution)，0.5nm；速度，20nm/秒；累積，10；響應(yīng)，1秒；帶寬，1nm；路徑長度，0.1cm)在旋光分光計(例如，Jasco J-710)上獲得圓二色性(CD)光譜。通過將平均殘基橢圓率(例如，[Φ]222obs)除以模型螺旋十肽的報道值來計算各個肽的α-螺旋含量(Yang等人(1986)，Methods Enzymol.130208)。
測定熔解溫度(Tm)的分析 含有二級結(jié)構(gòu)(如α-螺旋)的本發(fā)明的擬肽大環(huán)化合物顯示例如比相應(yīng)的非大環(huán)多肽更高的熔解溫度。典型地，本發(fā)明的擬肽大環(huán)化合物顯示＞60℃的Tm，表明在水溶液中非常穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。為了分析大環(huán)形成對熔解溫度的效應(yīng)，將擬肽大環(huán)化合物或未修飾的肽溶于蒸餾水中(例如，到50μM的終濃度)，并且通過使用標準參數(shù)(例如，波長，222nm；步距分辨率，0.5nm；速度，20nm/秒；累積，10；響應(yīng)，1秒；帶寬，1nm；溫度上升速度，1℃/分鐘；路徑長度，0.1cm)在旋光分光計(例如，Jasco J-710)上測量橢圓率在一定溫度范圍(例如，4-95℃)內(nèi)的變化來測定Tm。
蛋白酶抗性分析 肽骨架的酰胺鍵對于蛋白酶的水解是敏感的，因而致使肽化合物在體內(nèi)易于快速降解。但是，肽螺旋的形成一般掩蔽酰胺骨架，從而可以保護其免于蛋白水解裂解。本發(fā)明的擬肽大環(huán)化合物可以進行體外胰蛋白酶的蛋白水解以評價與相應(yīng)的非大環(huán)多肽相比其降解速度的任何變化。例如，擬肽大環(huán)化合物和相應(yīng)的非大環(huán)多肽與胰蛋白酶瓊脂糖一起溫育，并在各個時間點通過離心終止反應(yīng)，隨后注入HPLC以根據(jù)280nm處的紫外吸收定量殘留的底物。簡單地說，擬肽大環(huán)化合物和擬肽前體(5mcg)與胰蛋白酶瓊脂糖(Pierce)(S/E～125)溫育0、10、20、90和180分鐘。通過臺式離心機高速離心終止反應(yīng)；通過基于HPLC的在280nm處的峰檢測對分離出的上清液中殘余的底物進行定量。蛋白水解反應(yīng)顯示出一級動力學(xué)，且速率常數(shù)k由ln[S]相對于時間的曲線圖確定(k＝-1X斜率)。
體外穩(wěn)定性分析 具有優(yōu)化連接體的擬肽大環(huán)化合物具有(例如)高于相應(yīng)的非大環(huán)多肽至少2倍的體外半衰期，且具有12小時或更長的體外半衰期。對于體外血清穩(wěn)定性研究，可以使用多種分析。例如，將擬肽大環(huán)化合物和相應(yīng)的非大環(huán)多肽(在特定實例中，相應(yīng)的天然多肽)(2mcg)與新鮮的小鼠、大鼠和/或人血清(2mL)在37℃下溫育0、1、2、4、8和24小時。為了測定完整化合物的水平，可以使用下面的步驟通過將100μl的血清轉(zhuǎn)移到2ml離心管中，接著加入10μL的50％甲酸和500μL乙腈，并在4±2℃下以14,000RPM離心10分鐘來提取樣品。然后將上清液轉(zhuǎn)移到新的2ml管中，并在N2＜10psi、37℃下在Turbovap上蒸發(fā)。在100μL的50∶50乙腈∶水中重構(gòu)樣品，并進行LC-MS/MS分析。
體外結(jié)合分析 為了評價擬肽大環(huán)化合物和擬肽前體與接受體蛋白質(zhì)的結(jié)合和親和力，使用例如熒光偏振分析(FPA)。FPA技術(shù)使用偏振光和熒光示蹤劑測量分子取向和分子流動性。當(dāng)用偏振光激發(fā)時，由于附著在具有高表觀分子量的分子(例如，與大蛋白質(zhì)結(jié)合的FITC標記的肽)上的熒光示蹤劑(例如，F(xiàn)ITC)相比于附著在較小分子上(例如，在溶液中游離的FITC標記的肽)的熒光示蹤劑具有較慢的旋轉(zhuǎn)速度，附著在具有高表觀分子量的分子上的熒光示蹤劑發(fā)射較高水平的偏振熒光。
例如，在室溫下，熒光標記的(fluoresceinated)擬肽大環(huán)化合物(25nM)與接受體蛋白質(zhì)(25-1000nM)在結(jié)合緩沖液(140mMNaCl、50mM Tris-HCL，pH 7.4)中溫育30分鐘。例如，用發(fā)光分光光度計(例如，Perkin-Elmer LS50B)通過熒光偏振測定結(jié)合活性。可以使用例如Graphpad Prism軟件(GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA)通過非線性回歸分析確定Kd值。在某些情況下，本發(fā)明的擬肽大環(huán)化合物顯示出與相應(yīng)的非大環(huán)多肽類似的或更低的Kd。
在該分析試驗中可以使用BH3-肽接受體蛋白質(zhì)(如BCL-2、BCL-XL、BAX或MCL1)。在該分析試驗中也可以使用p53肽的接受體蛋白質(zhì)(如MDM2或MDMX)。
鑒定肽-蛋白質(zhì)相互作用的拮抗劑的體外置換分析 為了評價拮抗肽(例如，BH3肽或p53肽)和接受體蛋白質(zhì)之間的相互作用的化合物的結(jié)合和親和力，例如，使用了利用來源于擬肽前體序列的熒光標記擬肽大環(huán)化合物的熒光偏振分析(FPA)。FPA技術(shù)使用偏振光和熒光示蹤劑測量分子取向和分子流動性。當(dāng)用偏振光激發(fā)時，由于附著在具有高表觀分子量的分子(例如，與大蛋白質(zhì)結(jié)合的FITC標記的肽)上的熒光示蹤劑(例如，F(xiàn)ITC)相比于附著在較小分子(例如，在溶液中游離的FITC標記的肽)上的熒光示蹤劑具有較慢的旋轉(zhuǎn)速度，附著在具有高表觀分子量的分子上的熒光示蹤劑發(fā)射較高水平的偏振熒光。拮抗熒光標記的擬肽大環(huán)化合物與接受體蛋白質(zhì)之間的相互作用的化合物在競爭性結(jié)合FPA實驗中檢測到。
例如，在室溫下，假定的拮抗劑化合物(1nM-1mM)和熒光標記的擬肽大環(huán)化合物(25nM)與接受體蛋白質(zhì)(50nM)一起在結(jié)合緩沖液(140mM NaCl、50mM Tris-HCL，pH 7.4)中溫育30分鐘。例如，用發(fā)光分光光度計(例如，Perkin-Elmer LS50B)通過偏振熒光測定拮抗劑的結(jié)合活性。使用例如Graphpad Prism軟件(GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA)通過非線性回歸分析確定Kd值。
可以在該分析試驗中作為假定的拮抗劑檢驗任一類型的分子，如有機小分子、肽、寡核苷酸或蛋白質(zhì)。在該分析試驗中可以使用BH3-肽的接受體蛋白質(zhì)(如BCL-2、BCL-XL、BAX或MCL1)。在該分析試驗中可以使用p53肽的接受體蛋白質(zhì)(如MDM2或MDMX)。
完整細胞中的結(jié)合分析 可以在完整細胞中通過免疫沉淀實驗測定肽或擬肽大環(huán)化合物與其天然接受體的結(jié)合。例如，完整的細胞與熒光標記的(FITC-標記的)化合物在不含血清的情況下溫育4小時，接著置換血清，并進一步溫育4-18小時。然后使細胞沉淀，并在4℃下、在裂解緩沖液(50mM Tris[pH 7.6]、150mM NaCl、1％CHAPS和蛋白酶抑制劑混合物)中溫育10分鐘。以14,000rpm離心提取物15分鐘，收集上清液，與10μl山羊抗-FITC抗體溫育2小時，在4℃旋轉(zhuǎn)接著進一步與蛋白A/G Sepharose(50μl的50％珠漿(bead slurry))在4℃溫育2小時?？焖匐x心之后，在含有增加的鹽濃度(例如，150、300、500mM)的裂解緩沖液中洗滌沉淀物。隨后在加入含有SDS的樣品緩沖液和煮沸之前，以150mM NaCl再平衡小珠。離心后，任選地使用4％-12％梯度Bis-Tris凝膠對上清液進行電泳，接著轉(zhuǎn)移到Immobilon-P膜上。封閉之后，任選地將印跡與檢測FITC的抗體一起溫育，也與一種或多種檢測與擬肽大環(huán)化合物結(jié)合的蛋白質(zhì)的抗體一起溫育，所述蛋白質(zhì)包括BCL2、MCL1、BCL-XL、A1、BAX、BAK、MDM2或MDMX。
細胞滲透性分析 相比于相應(yīng)的非大環(huán)多肽，擬肽大環(huán)化合物例如具有更好的細胞滲透性。在某些實施方式中，擬肽大環(huán)化合物比相應(yīng)的非大環(huán)多肽具有更好的細胞滲透性。具有優(yōu)化連接體的擬肽大環(huán)化合物具有例如高于相應(yīng)的非大環(huán)多肽至少2倍的細胞滲透性，并且，觀察到通常20％或更多的應(yīng)用的肽在4小時后已滲透入細胞。為了測定擬肽大環(huán)化合物和相應(yīng)的非大環(huán)多肽的細胞滲透性，在37℃下在不含血清的培養(yǎng)基中將完整的細胞與熒光標記的擬肽大環(huán)化合物或相應(yīng)的非大環(huán)多肽(10μM)溫育4小時，用培養(yǎng)基洗滌2次，并在37℃下與胰蛋白酶(0.25％)溫育10分鐘。再次洗滌細胞并將其再懸浮于PBS中。例如，通過使用FACSCalibur流式細胞儀或Cellomics’KineticScan

HCS讀數(shù)儀分析細胞熒光。
細胞效力分析 例如，在基于細胞的殺傷試驗中，使用多種致瘤和非致瘤的細胞系及源自人類或小鼠細胞群體的初級細胞測定特定擬肽大環(huán)化合物的效力。例如，在與擬肽大環(huán)化合物(0.5-50μM)一起溫育的24-96小時期間監(jiān)測細胞的存活力，以鑒定那些以EC50＜10μM殺死細胞的化合物。測定細胞存活力的幾種標準分析是可通過商業(yè)途徑得到的，并任選地用來評價擬肽大環(huán)化合物的效力。另外，測定膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)和胱天蛋白酶(caspase)活化的分析任選地用來評價擬肽大環(huán)化合物能否通過激活凋亡機制殺死細胞。
體內(nèi)穩(wěn)定性分析 為了研究擬肽大環(huán)化合物的體內(nèi)穩(wěn)定性，例如，向小鼠和/或大鼠通過IV、IP、PO或吸入途徑以0.1-50mg/kg的濃度施用化合物，并在注射后0′、5′、15′、30′、1小時、4小時、8小時和24小時抽取血樣。然后如上所述通過LC-MS/MS測定25μL新鮮血清中的完整化合物的水平。
動物模型中的體內(nèi)效力 為了確定本發(fā)明的擬肽大環(huán)化合物在體內(nèi)的抗癌活性，例如，化合物單獨施用(IP、IV、PO、通過吸入或鼻途徑)或與亞最佳劑量的相關(guān)化療藥物(例如，環(huán)磷酰胺、阿霉素、依托泊苷)聯(lián)合施用。在一個實施例中，在NOD-SCID小鼠遭受全身輻射3小時后，通過尾靜脈注入穩(wěn)定表達螢光素酶的5×106RS4；11細胞(從急性淋巴母細胞性白血病患者的骨髓建立)。如果不予處理，這種形式的白血病在這一模型中在3周內(nèi)是致命的。例如，通過對小鼠注射D-螢光素(60mg/kg)并對麻醉的動物成像(例如，Xenogen In VivoImaging System，Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA)，容易地監(jiān)測白血病。通過Living Image Software(Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA)，經(jīng)光子通量(photonic flux)(光子/秒)的積分(integration)定量全身生物發(fā)光。例如，單獨的或與亞最佳劑量的相關(guān)化療藥物聯(lián)合的擬肽大環(huán)化合物通過尾靜脈或IP途徑以0.1mg/kg-50mg/kg的劑量在7-21天的時間內(nèi)向白血病小鼠施用(注射之后10天/實驗的第1天，14-16的生物發(fā)光)。任選地，在整個實驗過程中，每隔一天對小鼠成像，并在實驗期間每天監(jiān)測其存活。在實驗結(jié)束時任選地對死亡的小鼠進行尸體檢查。另一種動物模型是將源自人類濾泡性淋巴瘤的細胞系穩(wěn)定表達螢光素酶的DoHH2植入到NOD-SCID小鼠中。這些體內(nèi)試驗任選地產(chǎn)生初步的藥代動力學(xué)、藥效學(xué)和毒理學(xué)數(shù)據(jù)。
臨床試驗 為了確定本發(fā)明的擬肽大環(huán)化合物對于治療人類的適用性，進行了臨床試驗。例如，選擇出診斷為癌癥并需要治療的患者并將他們分成治療組和一個或多個對照組，其中，對治療組施用本發(fā)明的擬肽大環(huán)化合物，而對照組接受安慰劑或已知的抗癌藥。這樣，可以通過對患者組就如生存率和生活質(zhì)量的因素進行比較，評價本發(fā)明的擬肽大環(huán)化合物的治療安全性和有效性。在這個實例中，相比于用安慰劑治療的患者對照組，用擬肽大環(huán)化合物治療的患者組顯示提高的長期生存率。
藥物組合物和給藥途徑 本發(fā)明的擬肽大環(huán)化合物也包括其藥學(xué)上可接受的衍生物或前藥?！八帉W(xué)上可接受的衍生物”指本發(fā)明的化合物的任何藥學(xué)上可接受的鹽、酯、酯的鹽、前藥或其它衍生物，其在向接受者施用后能夠提供(直接或間接地)本發(fā)明的化合物。尤其有利的藥學(xué)上可接受的衍生物是那些當(dāng)向哺乳動物施用時提高本發(fā)明的化合物的生物利用度的衍生物(例如，通過提高口服化合物進入血液的吸收)，或相對于母體化合物增加活性化合物向生物區(qū)室(例如，腦或淋巴系統(tǒng))的遞送的衍生物。一些藥學(xué)上可接受的衍生物包括增加水溶性或跨過胃腸粘膜的主動轉(zhuǎn)運的化學(xué)基團。
在某些實施方式中，通過共價或非共價地連接合適的官能團修飾本發(fā)明的擬肽大環(huán)化合物，以提高選擇性的生物學(xué)性質(zhì)。這樣的修飾包括那些提高進入特定生物區(qū)室(例如，血液、淋巴系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng))的生物學(xué)滲透性、提高口服利用度、增加溶解性以允許注射施用、改變代謝以及改變排泄率的修飾。
本發(fā)明的化合物的藥學(xué)上可接受的鹽包括那些由藥學(xué)上可接受的無機酸和無機堿以及無機堿和有機堿衍生的鹽。合適的酸式鹽的例子包括乙酸鹽、己二酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、甲酸鹽、延胡索酸鹽、乙醇酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、硝酸鹽、棕櫚酸鹽(palmoate)、磷酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、水楊酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、甲苯磺酸鹽和十一酸鹽(undecanoate)。由合適的堿衍生的鹽包括堿金屬鹽(例如，鈉鹽)、堿土金屬鹽(例如，鎂鹽)、銨鹽和N-(烷基)4+鹽。
為了由本發(fā)明的化合物制備藥物組合物，藥學(xué)上可接受的載體包括固體或液體載體。固態(tài)制劑包括粉劑、片劑、丸劑、膠囊、扁囊劑、栓劑和分散顆粒劑。固體載體可以是一種或多種物質(zhì)，其也可以作為稀釋劑、調(diào)味劑、粘合劑、防腐劑、片劑崩解劑或包封材料發(fā)揮作用。在科學(xué)文獻和專利文獻中詳細描述了配制和給藥的技術(shù)，參見，例如，最新版本的Remington′s Pharmaceutical Sciences，Maack Publishing Co，Easton PA。
在粉劑中，載體是細碎的固體，其與細碎的活性成分混合。在片劑中，活性成分與具有必要粘合性質(zhì)的載體按照適當(dāng)?shù)谋壤旌希褐瞥尚枰男螤詈痛笮　?br> 合適的固體賦形劑是碳水化合物或蛋白質(zhì)填料，包括但不限于糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；來自玉米、小麥、大米、馬鈴薯或其它植物的淀粉；纖維素，如甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素或羧甲基纖維素鈉；和樹膠，包括阿拉伯樹膠和黃蓍膠；以及蛋白質(zhì)，如明膠和膠原蛋白。如果需要的話，加入崩解劑或增溶劑，如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、海藻酸或其鹽，如海藻酸鈉。
液態(tài)制劑包括溶液、懸浮液和乳狀液，例如，水或水/丙二醇溶液。對于腸胃外注射，液體制劑可以在水性聚乙二醇溶液中配制。
藥物制劑優(yōu)選為單位劑型。在這樣的形式中，制劑再分為含有適量活性成分的單位劑量。單位劑型可以是包裝制劑，該包裝含有離散量的制劑，如包裝片劑、膠囊和小瓶或安瓿中的粉末。另外，單位劑型可以是膠囊、片劑、扁囊劑或錠劑本身，或者可以是適當(dāng)數(shù)目的這些包裝形式中的任一種。
當(dāng)本發(fā)明的組合物包含擬肽大環(huán)化合物和一種或多種另外的治療劑或預(yù)防劑的組合時，該化合物和另外的藥物應(yīng)該以通常在單一治療方案中施用的劑量的大約1-100％的劑量水平存在，更優(yōu)選大約5-95％的劑量水平。在某些實施方式中，另外的藥物作為多劑量方案的一部分與本發(fā)明的化合物分開施用。或者，這些藥物是單一劑型的部分，在單一組合物中與本發(fā)明的化合物混合。
使用方法 一方面，本發(fā)明提供了新的擬肽大環(huán)化合物，其可在競爭性結(jié)合試驗中用于確認可結(jié)合擬肽大環(huán)化合物模擬的蛋白質(zhì)或肽的天然配體的物質(zhì)。例如，在p53MDM2系統(tǒng)中，基于p53的標記的穩(wěn)定擬肽大環(huán)化合物與競爭結(jié)合MDM2的小分子一起在MDM2結(jié)合試驗中使用。競爭性結(jié)合研究允許快速體外評價并確定對于p53/MDM2系統(tǒng)特異性的藥物候選物。同樣地，在BH3/BCL-XL抗凋亡系統(tǒng)中，基于BH3的標記的擬肽大環(huán)化合物可以與競爭結(jié)合BCL-XL的小分子一起在BCL-XL結(jié)合試驗中使用。競爭結(jié)合研究允許快速體外評價并確定對于BH3/BCL-XL系統(tǒng)特異性的藥物候選物。本發(fā)明進一步提供了產(chǎn)生針對擬肽大環(huán)化合物的抗體的方法。在某些實施方式中，這些抗體特異性地結(jié)合擬肽大環(huán)化合物和衍生出擬肽大環(huán)化合物的p53或BH3擬肽前體。例如，這樣的抗體分別破壞p53/MDM2或BH3/BCL-XL系統(tǒng)。
在其它方面，本發(fā)明提供了處理處于患與異常(例如，不足或過量)BCL-2家族成員的表達或活性(例如，外來或內(nèi)在的凋亡途徑異常)有關(guān)的疾病的危險(或?qū)λ黾膊∶舾?中或患有所述疾病的受試者的預(yù)防方法和治療方法。據(jù)信，某些BCL-2型疾病至少部分上由一種或多種BCL-2家族成員的異常水平(例如，過度表達或不足表達)引起，或由一種或多種顯示異?；钚缘腂CL-2家族成員的存在引起。這樣，例如，BCL-2家族成員的水平和/或活性的降低，或BCL-2家族成員的水平和/或活性的提高，用來改善或減少疾病的不利癥狀。
另一方面，本發(fā)明提供了通過干擾腫瘤細胞中p53和MDM2之間的相互作用或結(jié)合來治療或預(yù)防過度增生性疾病的方法。這些方法包括向溫血動物(包括人類)或向含有野生型p53的腫瘤細胞施用有效量的本發(fā)明的化合物。在某些實施方式中，本發(fā)明的化合物的施用誘導(dǎo)細胞生長停止或凋亡。在其它或進一步的實施方式中，本發(fā)明用來治療疾病和/或包含升高的MDM2水平的腫瘤細胞。本文所用的升高的MDM2水平是指，通過ELISA和類似的試驗測定(Picksley等人(1994)，Oncogene 9，2523-2529)，MDM2水平高于在含有超過正?？截悢?shù)(2)的mdm2的細胞中發(fā)現(xiàn)的水平的MDM2水平，或高于每個細胞大約10,000個MDM2分子的水平。
如本文所用，術(shù)語“治療”定義為向患者應(yīng)用或施用治療劑，或者向從患者分離的組織或細胞系應(yīng)用或施用治療劑，所述患者患有疾病、疾病癥狀或具有患病傾向，目的是治愈、恢復(fù)、減輕、解除、改變、矯正、緩解、改善或影響疾病、疾病癥狀或患病傾向。
在某些實施方式中，本發(fā)明的擬肽大環(huán)化合物用來治療、預(yù)防和/或診斷癌癥和腫瘤疾病。如本文所用，術(shù)語“癌”、“過度增生性”和“腫瘤的”指具有自主生長能力的細胞，即，以快速增殖的細胞生長為特征的異常狀態(tài)或疾病。過度增生性和腫瘤疾病狀態(tài)可以分類為病理的，即，表現(xiàn)或構(gòu)成疾病狀態(tài)；或者可以分類為非病理的，即，偏離正常但與疾病狀態(tài)無關(guān)。該術(shù)語意味著包括所有類型的癌性生長或致癌過程、轉(zhuǎn)移性的組織或惡性轉(zhuǎn)化的細胞、組織或器官，不管組織病理類型或侵入的階段如何。轉(zhuǎn)移性腫瘤可以源自許多原發(fā)性腫瘤類型，包括但不限于乳腺、肺、肝、結(jié)腸和卵巢原發(fā)的腫瘤?！安±硇赃^度增生性”細胞出現(xiàn)于以惡性腫瘤生長為特征的疾病狀態(tài)中。非病理性過度增生性細胞的例子包括與創(chuàng)傷修復(fù)有關(guān)的細胞的增殖。細胞增生性和/或分化性疾病的例子包括癌癥，例如，癌、肉瘤或轉(zhuǎn)移性疾病。在某些實施方式中，擬肽大環(huán)化合物是用于控制乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肺癌、這些癌癥的轉(zhuǎn)移等的新的治療劑。
癌癥或腫瘤狀態(tài)的例子包括但不限于纖維肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、成骨性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、胃癌、食道癌、直腸癌、胰癌、卵巢癌、前列腺癌、子宮癌、頭頸癌、皮膚癌、腦癌、鱗狀細胞癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管原癌、腎細胞癌、肝細胞瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎性癌、維爾姆斯腫瘤、子宮頸癌、睪丸癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、黑素瘤、神經(jīng)母細胞瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、白血病、淋巴瘤或卡波西肉瘤。
增生性疾病的例子包括造血腫瘤性疾病。如本文所用，術(shù)語“造血腫瘤性疾病”包括涉及造血起源的(例如，源自骨髓、淋巴或紅細胞譜系的)增生性/腫瘤細胞或其前體細胞的疾病。優(yōu)選地，疾病起因于分化不良的急性白血病，例如，成紅細胞白血病和急性巨核母細胞性白血病。其它示例性的骨髓疾病包括但不限于急性前髓性(promyeloid)白血病(APML)、急性髓性白血病(AML)和慢性髓性白血病(CML)(綜述見于Vaickus(1991)，Crit Rev.Oncol./Hemotol.11267-97)；淋巴惡性腫瘤包括但不限于急性淋巴母細胞性白血病(ALL)，包括B-譜系A(chǔ)LL和T-譜系A(chǔ)LL、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、幼淋巴細胞性白血病(PLL)、毛細胞白血病(HLL)和瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥(WM)。其它形式的惡性淋巴瘤包括但不限于非何杰金氏淋巴瘤及其變體、外周T細胞淋巴瘤、成人T細胞性白血病/淋巴瘤(ATL)、皮膚T細胞性淋巴瘤(CTCL)、大顆粒狀淋巴細胞性白血病(LGF)、何杰金氏病和里德-斯特恩伯格病。
乳房的細胞增生性和/或分化性疾病的例子包括但不限于增生性乳房疾病，包括，例如，上皮細胞增生、硬化性腺病和小導(dǎo)管乳頭狀瘤；腫瘤，例如，如纖維腺瘤、葉狀腫瘤和肉瘤的基質(zhì)腫瘤，和如大導(dǎo)管乳頭狀瘤的上皮腫瘤；乳腺癌，包括原位(非侵襲性)癌(包括原位導(dǎo)管癌(包括佩吉特病)和小葉原位癌)和侵襲性(浸潤性)癌(包括但不限于，浸潤性導(dǎo)管癌、浸潤性小葉癌、髓樣癌、膠樣(粘液)癌、小管癌和浸潤性乳頭狀癌)；和混雜性的惡性腫瘤。男性乳房疾病包括但不限于男性乳房發(fā)育癥和癌。
肺的細胞增生性和/或分化性疾病的例子包括但不限于支氣管原癌，包括類腫瘤綜合征、細支氣管肺泡癌、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，例如，支氣管類癌、混雜性的腫瘤和轉(zhuǎn)移的腫瘤；胸膜病狀包括炎性胸腔積液、非炎性胸腔積液、氣胸和胸膜腫瘤(包括孤立性纖維性腫瘤(胸膜纖維瘤)和惡性間皮瘤)。
結(jié)腸的細胞增生性和/或分化性疾病的例子包括但不限于非腫瘤息肉、腺瘤、家族性綜合征(familial syndromes)、結(jié)腸直腸癌形成、結(jié)腸直腸癌和類癌腫瘤。
肝的細胞增生性和/或分化性疾病的例子包括但不限于結(jié)節(jié)性增生、腺瘤和惡性腫瘤，包括肝的原發(fā)癌和轉(zhuǎn)移性的腫瘤。
卵巢的細胞增生性和/或分化性疾病的例子包括但不限于卵巢腫瘤，例如，體腔上皮瘤、漿液瘤、粘液瘤、子宮內(nèi)膜樣瘤、透明細胞腺癌、囊腺纖維瘤、布倫納瘤、表面上皮性腫瘤；生殖細胞瘤，例如，成熟(良性)畸胎瘤、單胚層畸胎瘤、不成熟的惡性畸胎瘤、無性細胞瘤、內(nèi)胚竇瘤、絨膜癌；生殖索-間質(zhì)腫瘤(sex cord-stomaltumors)，例如，粒層-卵泡膜細胞瘤、泡膜細胞瘤(thecoma)、纖維瘤(fibromas)、男性母細胞瘤(androblastomas)、希爾細胞瘤(hillcell tumors)和性腺母細胞瘤；和如克魯肯貝格瘤的轉(zhuǎn)移瘤。
在其它或進一步的實施方式中，本文所述的擬肽大環(huán)化合物用來治療、預(yù)防或診斷特征在于過度活躍的細胞死亡或由于生理損傷造成的細胞死亡等為特征的狀態(tài)。以成熟前或不希望的細胞死亡或者不希望的或過度的細胞增殖為特征的狀態(tài)的一些例子包括但不限于細胞減少性/細胞減生性、無細胞性/發(fā)育不全性、或細胞過多性/增生性狀態(tài)。一些例子包括血液系統(tǒng)疾病，包括但不限于范科尼貧血、再生障礙性貧血、地中海貧血(thalaessemia)、先天性中性白細胞減少、脊髓發(fā)育不良。
在其它或進一步的實施方式中，發(fā)揮減少凋亡作用的本發(fā)明的擬肽大環(huán)化合物用來治療與不希望的細胞死亡水平相關(guān)的疾病。因此，在某些實施方式中，本發(fā)明的抗凋亡擬肽大環(huán)化合物用來治療如導(dǎo)致與病毒感染相關(guān)的細胞死亡的疾病的疾病，例如，與人免疫缺陷病毒(HIV)感染有關(guān)的感染。許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的特征為特定神經(jīng)元組的逐漸損失，因而在某些實施方式中，本發(fā)明的抗凋亡擬肽大環(huán)化合物用于治療這些疾病。這樣的疾病包括阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化(ALS)、色素性視網(wǎng)膜炎、脊髓性肌萎縮和各種形式的小腦變性。這些疾病中的細胞損失不誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，而且凋亡似乎是細胞死亡的機制。另外，許多血液系統(tǒng)疾病與血細胞的產(chǎn)生減少相關(guān)。這些疾病包括與慢性病相關(guān)的貧血、再生障礙性貧血、慢性中性白細胞減少和骨髓發(fā)育異常綜合征。血細胞產(chǎn)生障礙(如骨髓發(fā)育異常綜合征和某些形式的再生障礙性貧血)與骨髓內(nèi)的凋亡性細胞死亡增加相關(guān)。這些疾病可能起因于促進凋亡的基因的激活、基質(zhì)細胞或造血成活因子的獲得性缺陷或者毒素和免疫應(yīng)答介質(zhì)的直接效應(yīng)。兩種與細胞死亡相關(guān)的常見疾病是心肌梗塞和中風(fēng)。在這兩種疾病中，在血流急性損失的情況下產(chǎn)生的中心缺血區(qū)內(nèi)的細胞似乎由于壞死而快速死亡。但是，在中心缺血區(qū)之外，細胞死亡的時間延長，從形態(tài)學(xué)上看似乎通過凋亡死亡。在其它或進一步的實施方式中，本發(fā)明的抗凋亡擬肽大環(huán)化合物用來治療所有這樣的與不希望的細胞死亡相關(guān)的疾病。
用本文所述的擬肽大環(huán)化合物治療的免疫障礙的一些例子包括但不限于器官移植排斥、關(guān)節(jié)炎、狼瘡、IBD、局限性回腸炎、哮喘、多發(fā)性硬化、糖尿病等。
用本文所述的擬肽大環(huán)化合物治療的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一些例子包括但不限于阿爾茨海默病、唐氏綜合征、荷蘭型遺傳性腦出血淀粉樣變性病、反應(yīng)性淀粉樣變性病、伴有蕁麻疹和耳聾的家族性淀粉樣蛋白腎病、默-韋綜合征、特發(fā)性骨髓瘤；巨球蛋白血癥相關(guān)的骨髓瘤、家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病、家族性淀粉樣心肌病、孤立性心臟淀粉樣變性(Isolated Cardiac Amyloid)、全身性老年淀粉樣變性病、成年人發(fā)作的糖尿病、胰島素瘤、孤立性心房淀粉樣變性(Isolated Atrial Amyloid)、甲狀腺髓樣癌、家族性淀粉樣變性病、伴有淀粉樣變性的遺傳性腦出血、家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病變、癢病、克羅伊茨費爾特-雅各布病、格-施-沙綜合征、牛海綿狀腦炎、朊病毒介導(dǎo)的疾病和亨廷頓舞蹈病。
用本文所述的擬肽大環(huán)化合物治療的內(nèi)分泌疾病的一些例子包括但不限于糖尿病、甲狀腺機能減退、垂體機能減退、甲狀旁腺機能減退、性腺機能減退等。
用本文所述的擬肽大環(huán)化合物治療或預(yù)防的心血管疾病(例如炎性疾病)的例子包括但不限于動脈粥樣硬化、心肌梗塞、中風(fēng)、血栓形成、動脈瘤、心力衰竭、缺血性心臟病、心絞痛、心源性猝死、高血壓性心臟?。环枪跔钛芗膊?，例如，小動脈硬化、小血管病、腎病、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、高脂血癥、黃瘤病、哮喘、高血壓、肺氣腫和慢性肺??；或者與介入操作(“手術(shù)性血管創(chuàng)傷”)相關(guān)的心血管狀態(tài)，例如，血管成形術(shù)后再狹窄、設(shè)置旁路(shunt)、支架、合成或天然的切除移植物、留置導(dǎo)管、瓣膜或其它可植入裝置。優(yōu)選的心血管疾病包括動脈粥樣硬化、心肌梗塞、動脈瘤和中風(fēng)。
實施例 下面的部分提供了本發(fā)明的說明性的實施例。
實施例1.α，α二取代的氨基酸的制備 化合物1
根據(jù)Yao等人(2004)J.Org.Chem，691720-1722，通過兩步程序制備化合物1。向溶于二甲基甲酰胺(10ml)的1-碘-4-氯-丁烷(1ml，8.2mmol)中加入疊氮化鈉(0.53g，8.2mmol)，并在室溫下整夜攪拌進行反應(yīng)。然后用乙酸乙酯和水稀釋反應(yīng)物。用水(3次)洗滌有機層，經(jīng)硫酸鎂干燥，并真空濃縮以80％的產(chǎn)率產(chǎn)生1-疊氮基-4-氯-丁烷。用丙酮(38ml)稀釋疊氮化物，加入碘化鈉(1.98g，13.00mmol)，并整夜回流加熱以進行反應(yīng)。之后，用水稀釋反應(yīng)物，并用乙醚(3次)萃取產(chǎn)物。用碳酸氫鈉和鹽水洗滌合并的有機提取物。有機提取物經(jīng)硫酸鎂干燥，并真空濃縮。通過將其經(jīng)過中性氧化鋁的柱塞(plug)純化產(chǎn)物1。產(chǎn)率是89％。
化合物2
S-Ala-Ni-BPB 根據(jù)Belokon等人(1998)，Tetrahedron Asymm.94249-4252，通過三步程序制備化合物2。在40C下攪拌制備S-脯氨酸(100g，0.869mol)和KOH(172g，2.61mol)的異丙醇(600ml)溶液。溶液一變得澄清，就在同樣的溫度下加入芐基氯(156ml，1.34mol)。加入完成(3.5小時)后，在40C下整夜攪拌反應(yīng)物。用濃HCl(110ml)中和反應(yīng)物直至pH 5，然后向反應(yīng)混合物加入氯仿(400ml)，并整夜攪拌混合物。接著過濾混合物，并用CHCl洗滌沉淀物。合并CHCL3溶液并蒸發(fā)，用丙酮處理殘留物，過濾粗制產(chǎn)物的沉淀，并另外用丙酮洗滌。以75％的產(chǎn)率分離苯甲基脯氨酸產(chǎn)物。
在-20C到-30C下，在10分鐘的時間里，伴隨攪拌向苯甲基脯氨酸(41g，0.2mol)的二氯甲烷(200ml)溶液加入亞硫酰氯(18.34ml，0.25mol)。在-10C下持續(xù)攪拌，直至反應(yīng)混合物變得幾乎透明。然后，在-30C下，伴隨攪拌向反應(yīng)混合物加入2-氨基二苯甲酮(25g，0.125mol)的二氯甲烷(100ml)溶液。室溫下再持續(xù)攪拌10小時，并在0C下，伴隨攪拌向反應(yīng)混合物加入碳酸鈉(40g)的水(150ml)溶液。分離有機層，用二氯甲烷萃取水層幾遍，并合并有機溶液和蒸發(fā)。產(chǎn)物(苯甲基脯氨酸-氨基二苯甲酮加合物)從乙醇中結(jié)晶，并以85％的產(chǎn)率分離。
在氮氣中、40-50C下，將KOH(23.1g，0.35mol)的甲醇(75ml)溶液倒入攪拌的苯甲基脯氨酸-氨基二苯甲酮加合物(19.5g，0.05mol)和硝酸鎳六水合物(29.1g，0.1mol)、L-Ala(8.9g，0.1mol)在甲醇(175)中的混合物中。在55C-65C下，攪拌反應(yīng)混合物2小時，然后用乙酸(20ml)中和。用水(500ml)稀釋反應(yīng)體積。6小時后，過濾分離的結(jié)晶固體，并用水(2x)洗滌，產(chǎn)生純的化合物2(紅色固體，22g)。M+H obs.512.4，M+H calc.512.1。
化合物3
向化合物2(5.122g，10.0mmol)加入經(jīng)過凍融循環(huán)脫氣的二甲基甲酰胺(45mL)。用冰浴冷卻溶液至4C，并且一次(in one batch)加入粉末KOH(6.361g，100mmol)。除去冷浴，經(jīng)注射器加入溶于二甲基甲酰胺(4.0mL)的化合物1(3.375g，15mmol)。室溫下攪拌反應(yīng)物40分鐘。然后通過將其緩慢加到冷的5％乙酸水溶液(200mL)中終止反應(yīng)。通過過濾收集粗制產(chǎn)物，并用冷水洗滌3次。使用Biotage硅膠柱和作為洗脫劑的己烷-乙酸乙酯，通過快速色譜純化產(chǎn)物。獲得紅色固體化合物3(51％產(chǎn)率)，M+H calc.609.2，M+H obs.609.37。通過UV 254nm測定純度為98％。
化合物4
向5-氯戊炔(5g，47.8mmol)的丙酮(80mL)溶液加入碘化鈉(14.321g，95.54mmol)。整夜回流加熱進行反應(yīng)。之后，用水稀釋反應(yīng)物，并用乙醚(3次)萃取產(chǎn)物。用碳酸氫鈉和鹽水洗滌合并的有機提取物。有機提取物經(jīng)硫酸鎂干燥，并真空濃縮。通過將其經(jīng)過中性氧化鋁的柱塞純化產(chǎn)物4。產(chǎn)率是92％。
化合物5
向化合物2(2.561g，5.0mmol)加入經(jīng)過凍融循環(huán)脫氣的二甲基甲酰胺(23mL)。用冰浴冷卻溶液至4C，并且一次加入粉末KOH(3.181g，50mmol)。除去冷浴，經(jīng)注射器加入溶于二甲基甲酰胺(2.0mL)的化合物4(1.94g，10mmol)。室溫下攪拌反應(yīng)40分鐘。然后通過將其緩慢加到冷的5％乙酸水溶液(100mL)中終止反應(yīng)。通過過濾收集粗制產(chǎn)物，并用冷水洗滌3次。使用Biotage硅膠柱和作為洗脫劑的己烷-乙酸乙酯，通過快速色譜純化產(chǎn)物?；衔?是紅色固體，1.4g，48％的產(chǎn)率。M+H calc.578.19，M+H obs.578.69。通過UV 254nm測定純度為97％。
化合物6
在70C下，向1/1的3N HCl/MeOH溶液(12ml)逐滴加入化合物3(1g，1.65mmol)的甲醇(3ml)溶液。起始材料在5-10分鐘內(nèi)消失。然后真空濃縮反應(yīng)混合物，并用高真空泵除去殘留的溶劑。用以冰浴冷卻至0C的10％的Na2CO3水溶液(16ml)稀釋粗制的殘留物。加入溶于二噁烷(16ml)的Fmoc-OSu(0.84g，2.5mmol)，并伴隨攪拌使得反應(yīng)加熱到室溫過夜。之后，用乙酸乙酯和1N HCl稀釋反應(yīng)物。用1NHCl(3次)洗滌有機層。然后經(jīng)硫酸鎂干燥有機層，并真空濃縮。在使用Biotage硅膠柱和作為洗脫劑的乙酸乙酯/己烷和二氯甲烷/甲醇通過快速色譜純化之后，分離純的產(chǎn)物，產(chǎn)生對于兩個步驟的總產(chǎn)率為36％的粘性油。M+Na obs 431.89，M+H calc(409.18)。通過UV 254nm測定純度為98％。
化合物7
在70C下，向1/1的3N HCl/MeOH的溶液(18ml)逐滴加入化合物5(1.4g，2.4mmol)的甲醇(4ml)溶液。起始材料在5-10分鐘內(nèi)消失。然后真空濃縮反應(yīng)混合物，并用高真空泵除去殘留的溶劑。用以冰浴冷卻至0C的10％的Na2CO3水溶液(24ml)稀釋粗制的殘留物。加入溶于二噁烷(24ml)的Fmoc-OSu(0.98g，2.9mmol)，并伴隨攪拌使得反應(yīng)物加熱到室溫過夜。之后，用乙酸乙酯和1N HCl稀釋反應(yīng)物。用1N HCl(3次)洗滌有機層。然后經(jīng)硫酸鎂干燥有機層，并真空濃縮。在使用Biotage硅膠柱和乙酸乙酯/己烷和二氯甲烷/甲醇作為洗脫劑，通過快速色譜純化之后，分離純的產(chǎn)物(對于兩個步驟產(chǎn)率為30％)。獲得粘性油產(chǎn)物，其在靜置時固化。M+H calc.378.16，M+Na obs 400.85。
已經(jīng)描述了本發(fā)明的許多實施方式。盡管如此，應(yīng)當(dāng)理解，可以在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下進行各種修改。因此，其它實施方式在下面的權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.式(I)的擬肽大環(huán)化合物
其中
A、C、D和E各自獨立地是天然或非天然的氨基酸；
B是天然或非天然的氨基酸、氨基酸類似物、
-[NH-L3-CO-]、[-NH-L3-SO2-]或[-NH-L3-]；
R1和R2獨立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素取代的；
R3是氫、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x被R5取代；
L是式
的形成大環(huán)的連接體；
L1、L2和L3獨立地是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞環(huán)芳基、亞雜環(huán)芳基或[-R4-K-R4-]n，各基團任選被R5取代；
各個R4是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞芳基或亞雜芳基；
各個K是O、S、SO、SO2、CO、CO2或CONR3；
各個R5獨立地是鹵素、烷基、-OR6、-N(R6)2、-SR6、-SOR6、-SO2R6、-CO2R6、熒光部分、放射性同位素或治療劑；
各個R6獨立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、熒光部分、放射性同位素或治療劑；
R7是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x被R5取代，或作為與D殘基所形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分；
R8是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x被R5取代，或作為與E殘基所形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分；
v是1-1000的整數(shù)；
w是1-1000的整數(shù)；
x是0-10的整數(shù)；
y是0-10的整數(shù)；
z是0-10的整數(shù)；且
n是1-5的整數(shù)。
2.如權(quán)利要求1所述的擬肽大環(huán)化合物，其中，所述L是
3.如權(quán)利要求1所述的擬肽大環(huán)化合物，其中，所述L是
4.如權(quán)利要求1所述的擬肽大環(huán)化合物，其中，所述R1和R2中的至少一個是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素取代的。
5.如權(quán)利要求1所述的擬肽大環(huán)化合物，其中，所述R1和R2獨立地是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素取代的。
6.如權(quán)利要求1所述的擬肽大環(huán)化合物，其中，所述R1和R2中的至少一個是未取代的或被鹵素取代的烷基。
7.如權(quán)利要求1所述的擬肽大環(huán)化合物，其中，所述R1和R2獨立地是未取代的或被鹵素取代的烷基。
8.如權(quán)利要求1所述的擬肽大環(huán)化合物，其中，所述R1和R2中的至少一個是甲基。
9.如權(quán)利要求1所述的擬肽大環(huán)化合物，其中，所述R1和R2是甲基。
10.如權(quán)利要求1所述的擬肽大環(huán)化合物，其中，所述D和E中的至少一個是被高分子量的脂質(zhì)或烴取代的天然或非天然的氨基酸。
11.如權(quán)利要求1所述的擬肽大環(huán)化合物，其中，所述D和E中的至少一個連接于另外的形成大環(huán)的連接體上。
12.如權(quán)利要求1所述的擬肽大環(huán)化合物，其中，所述擬肽大環(huán)化合物的二級結(jié)構(gòu)比相應(yīng)的非大環(huán)多肽的相應(yīng)二級結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。
13.如權(quán)利要求1所述的擬肽大環(huán)化合物，其中，所述擬肽大環(huán)化合物包含α-螺旋。
14.如權(quán)利要求13所述的擬肽大環(huán)化合物，其中，所述α-螺旋包含1-5圈。
15.如權(quán)利要求13所述的擬肽大環(huán)化合物，其中，所述α-螺旋比相應(yīng)的非大環(huán)多肽的α-螺旋更穩(wěn)定。
16.如權(quán)利要求13所述的擬肽大環(huán)化合物，其中，所述形成大環(huán)的連接體跨越α-螺旋的1-5圈。
17.如權(quán)利要求13所述的擬肽大環(huán)化合物，其中，所述形成大環(huán)的連接體跨越α-螺旋的大約1、2、3、4或5圈。
18.如權(quán)利要求13所述的擬肽大環(huán)化合物，其中，所述形成大環(huán)的連接體的長度是α-螺旋的每圈大約
-大約
19.如權(quán)利要求13所述的擬肽大環(huán)化合物，其中，所述形成大環(huán)的連接體跨越α-螺旋的大約1圈。
20.如權(quán)利要求19所述的擬肽大環(huán)化合物，其中，所述形成大環(huán)的連接體的長度近似等于大約6個-大約14個碳-碳鍵的長度。
21.如權(quán)利要求19所述的擬肽大環(huán)化合物，其中，所述形成大環(huán)的連接體的長度近似等于大約8個-大約12個碳-碳鍵的長度。
22.如權(quán)利要求19所述的擬肽大環(huán)化合物，其中，所述大環(huán)化合物包含大約18-26個原子的環(huán)。
23.如權(quán)利要求13所述的擬肽大環(huán)化合物，其中，所述α-螺旋包含大約2圈。
24.如權(quán)利要求23所述的擬肽大環(huán)化合物，其中，所述形成大環(huán)的連接體的長度近似等于大約8個-大約16個碳-碳鍵的長度。
25.如權(quán)利要求23所述的擬肽大環(huán)化合物，其中，所述形成大環(huán)的連接體的長度近似等于大約10個-大約13個碳-碳鍵的長度。
26.如權(quán)利要求23所述的擬肽大環(huán)化合物，其中，所述大環(huán)化合物包含大約29-大約37個原子的環(huán)。
27.式IIa或式IIb的化合物
其中，
R1和R2獨立地是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素取代的；
Q和T各獨立地選自亞烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞芳基、亞雜芳基、和[-R4-K-R4-]n，其各是未取代的或被R5取代；
K是O、S、SO、SO2、CO、CO2或CONR3；
R3是氫、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x被R5取代；
R4是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞芳基或亞雜芳基；
各R5獨立地是鹵素、烷基、-OR6、-N(R6)2、-SR6、-SOR6、-SO2R6、-CO2R6、熒光部分、放射性同位素或治療劑；
各個R6獨立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、熒光部分、放射性同位素或治療劑；
R7和R8獨立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基烷基或雜環(huán)烷基；
R10和R11獨立地是-H或任何適于肽合成的保護基；
g和h各自獨立地是0-5的整數(shù)，其中，g+h大于1；且
n是1-5的整數(shù)。
28.如權(quán)利要求27所述的化合物，其中，所述化合物是式IIa的化合物，且R1是未取代的或被鹵素取代的烷基。
29.如權(quán)利要求27所述的化合物，其中，所述化合物是式IIb的化合物，且R2是未取代的或被鹵素取代的烷基。
30.如權(quán)利要求27所述的化合物，其中，所述化合物是式IIa的化合物，且R1是未取代的烷基。
31.如權(quán)利要求27所述的化合物，其中，所述化合物是式IIb的化合物，且R2是未取代的烷基。
32.如權(quán)利要求27所述的化合物，其中，所述化合物是式IIa的化合物，且R1甲基。
33.如權(quán)利要求27所述的化合物，其中，所述化合物是式IIb的化合物，且R2是甲基。
34.如權(quán)利要求27所述的化合物，其中，所述R9和R10中的至少一個是適于肽合成的保護基。
35.一種試劑盒，包含
a)至少一種選自式IIa的化合物和式IIb的化合物的化合物
其中，
R1和R2獨立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素取代的；
Q和T各自獨立地選自亞烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞芳基、亞雜芳基、和[-R4-K-R4-]n，其各自是未取代的或被R5取代；
K是O、S、SO、SO2、CO、CO2或CONR3；
R3是氫、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x被R5取代；
R4是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞芳基或亞雜芳基；
各R5獨立地是鹵素、烷基、-OR6、-N(R6)2、-SR6、-SOR6、-SO2R6、-CO2R6、熒光部分、放射性同位素或治療劑；
各個R6獨立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、熒光部分、放射性同位素或治療劑；
R7和R8獨立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基烷基或雜環(huán)烷基；
R10和R11獨立地是-H或任何適于肽合成的保護基；
g和h獨立地是0-5的整數(shù)；
n是1-5的整數(shù)；和
b)大環(huán)化試劑。
36.如權(quán)利要求35所述的試劑盒，其中，所述試劑盒包括式IIa的化合物，且R1是未取代的或被鹵素取代的烷基。
37.如權(quán)利要求35所述的試劑盒，其中，所述試劑盒包括式IIb的化合物，且R2是未取代的或被鹵素取代的烷基。
38.如權(quán)利要求35所述的試劑盒，其中，所述試劑盒包括式IIa的化合物，且R1是未取代的烷基。
39.如權(quán)利要求35所述的試劑盒，其中，所述試劑盒包括式IIb的化合物，且R2是未取代的烷基。
40.如權(quán)利要求35所述的試劑盒，其中，所述試劑盒包括式IIa的化合物，且R1是甲基。
41.如權(quán)利要求35所述的試劑盒，其中，所述試劑盒包括式IIb的化合物，且R2是甲基。
42.如權(quán)利要求35所述的試劑盒，其中，所述R9和R10中的至少一個是適于肽合成的保護基。
43.如權(quán)利要求35所述的試劑盒，其中，所述試劑盒包括至少一種式IIa的化合物和至少一種式IIb的化合物。
44.如權(quán)利要求35所述的試劑盒，其中，所述大環(huán)化試劑是Cu試劑。
45.如權(quán)利要求35所述的試劑盒，其中，所述大環(huán)化試劑是Ru試劑。
46.一種合成擬肽大環(huán)化合物的方法，該方法包括將式III或式IV的擬肽前體與大環(huán)化試劑接觸的步驟
其中，v、w、x、y、z、A、B、C、D、E、R1、R2、R7、R8、L1和L2如權(quán)利要求1所定義；
當(dāng)大環(huán)化試劑是Cu試劑時，R12是-H，和當(dāng)大環(huán)化試劑是Ru試劑時，R12是-H或烷基；且
所述接觸步驟導(dǎo)致在式III或式IV中的炔部分和疊氮部分之間形成共價連接。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其中，所述R1和R2中的至少一個是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素取代的。
48.如權(quán)利要求46所述的方法，其中，所述R1和R2獨立地是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素取代的。
49.如權(quán)利要求46所述的方法，其中，所述R1和R2中的至少一個是未取代的或被鹵素取代的烷基。
50.如權(quán)利要求46所述的方法，其中，所述R1和R2獨立地是未取代的或被鹵素取代的烷基。
51.如權(quán)利要求46所述的方法，其中，所述R1和R2中的至少一個是甲基。
52.如權(quán)利要求46所述的方法，其中，所述R1和R2是甲基。
53.如權(quán)利要求46所述的方法，其中，所述大環(huán)化試劑是Cu試劑。
54.如權(quán)利要求46所述的方法，其中，所述大環(huán)化試劑是Ru試劑。
55.如權(quán)利要求46所述的方法，其中，所述擬肽前體在接觸步驟之前純化。
56.如權(quán)利要求46所述的方法，其中，所述擬肽大環(huán)化合物在接觸步驟之后純化。
57.如權(quán)利要求46所述的方法，其中，所述擬肽大環(huán)化合物在接觸步驟之后再折疊。
58.如權(quán)利要求46所述的方法，其中，所述方法在溶液中進行。
59.如權(quán)利要求46所述的方法，其中，所述方法在固體載體上進行。
60.如權(quán)利要求46所述的方法，其中，所述方法在結(jié)合擬肽前體或擬肽大環(huán)化合物的目標大分子的存在下，在有利于所述結(jié)合的條件下進行。
61.如權(quán)利要求46所述的方法，其中，所述方法在優(yōu)先與擬肽前體或擬肽大環(huán)化合物結(jié)合的目標大分子的存在下，在有利于所述結(jié)合的條件下進行。
62.如權(quán)利要求46所述的方法，其中，所述方法應(yīng)用于合成擬肽大環(huán)化合物的文庫。
63.如權(quán)利要求46所述的方法，其中，所述擬肽大環(huán)化合物在水溶液中包含α-螺旋。
64.如權(quán)利要求63所述的方法，其中，所述擬肽大環(huán)化合物與相應(yīng)的非大環(huán)多肽相比在水溶液中顯示增加的α-螺旋結(jié)構(gòu)。
65.如權(quán)利要求46所述的方法，其中，相比于相應(yīng)的非大環(huán)多肽，所述擬肽大環(huán)化合物顯示提高的熱穩(wěn)定性。
66.如權(quán)利要求46所述的方法，其中，相比于相應(yīng)的非大環(huán)多肽，所述擬肽大環(huán)化合物顯示提高的生物學(xué)活性。
67.如權(quán)利要求46所述的方法，其中，相比于相應(yīng)的非大環(huán)多肽，所述擬肽大環(huán)化合物顯示增強的對蛋白水解降解作用的抗性。
68.如權(quán)利要求46所述的方法，其中，相比于相應(yīng)的非大環(huán)多肽，所述擬肽大環(huán)化合物顯示提高的滲透活細胞的能力。
69.如權(quán)利要求46所述的方法，其中，所述式III或式IV的擬肽前體的炔部分是選自以下氨基酸的側(cè)鏈L-炔丙基甘氨酸、D-炔丙基甘氨酸、(S)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-5-己炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-5-己炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-7-辛炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-7-辛炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-8-壬炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-8-壬炔酸，且式III或式IV的擬肽前體的疊氮部分是選自以下氨基酸的側(cè)鏈ε-疊氮基-L-賴氨酸、ε-疊氮基-D-賴氨酸、ε-疊氮基-α-甲基-L-賴氨酸、ε-疊氮基-α-甲基-D-賴氨酸、δ-疊氮基-α-甲基-L-鳥氨酸和δ-疊氮基-α-甲基-D-鳥氨酸。
70.如權(quán)利要求46所述的方法，其中，x+y+z為3，且A、B和C獨立地是天然或非天然的氨基酸。
71.如權(quán)利要求46所述的方法，其中，x+y+z為6，且A、B和C獨立地是天然或非天然的氨基酸。
72.如權(quán)利要求46所述的方法，其中，所述大環(huán)化試劑是Cu試劑，且接觸步驟在選自質(zhì)子溶劑、水性溶劑、有機溶劑及其混合物的溶劑中進行。
73.如權(quán)利要求72所述的方法，其中，所述溶劑是H2O、THF/H2O、tBuOH/H2O、DMF、DIPEA、CH3CN、CH2Cl2或ClCH2CH2Cl。
74.如權(quán)利要求46所述的方法，其中，所述大環(huán)化試劑是Ru試劑，且接觸步驟在有機溶劑中進行。
75.如權(quán)利要求74所述的方法，其中，所述溶劑是DMF、THF、CH3CN、CH2Cl2或ClCH2CH2Cl。
76.如權(quán)利要求72所述的方法，其中，所述溶劑是有利于螺旋形成的溶劑。
77.如權(quán)利要求46所述的方法，其中，所述擬肽大環(huán)化合物具有式(I)
其中，v、w、x、y、z、A、B、C、D、E、R1、R2、R7、R8和L如權(quán)利要求1所定義。
全文摘要
本發(fā)明提供了新的擬肽大環(huán)化合物及其制備方法和用途，以及氨基酸類似物和形成大環(huán)的連接體及用于其制備的試劑盒。
文檔編號A61K38/00GK101663044SQ200880009510
公開日2010年3月3日 申請日期2008年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月23日
發(fā)明者H·M·納什 申請人:愛勒讓治療公司