專利名稱：：一種胸腺五肽口服微球制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種藥物制劑及其制備方法，特別涉及一種胸腺五肽口服微球制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
：胸腺五肽(thymopentin，TP_5)由精氨酸、賴氨酸、天門冬氨酸、纈氨酸、酪氨酸五種氨基酸組成，化學(xué)名稱為N-[N-[Na-[Na-L-精氨酰-L-賴氨酸]-L-a-天門冬氨酰]-L-纈氨酰]-L-酪氨酸，是胸腺分泌物中的一種胸腺生成素II的有效部分。胸腺五肽是一種細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)藥物，具有誘導(dǎo)T細(xì)胞分化、促進(jìn)T淋巴細(xì)胞亞群發(fā)育成熟并活化的功能；胸腺五肽具有增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力，增強(qiáng)紅細(xì)胞免疫功能，提高自然殺傷細(xì)胞(NK)活性，提高白介素-2(IL-2)的生成水平及受體表達(dá)水平，促進(jìn)外周血單核細(xì)胞Y-干擾素的產(chǎn)生，增強(qiáng)血清中超氧化物歧化酶(S0D)的活性等作用。臨床上胸腺五肽主要用于治療慢性肝炎、各種原發(fā)性或繼發(fā)性T細(xì)胞缺陷疾病、嚴(yán)重感染、耐藥性結(jié)核、自身免疫功能紊亂性疾病、各種細(xì)胞免疫功能低下的疾病以及惡性腫瘤的輔助治療等。胸腺五肽是一個(gè)小分子多肽，在體內(nèi)半衰期極短(約為30s)。因?yàn)樾叵傥咫牡姆€(wěn)定性較差，在胃腸道中易受胃酸和各種消化道酶的作用而被降解失活；同時(shí)，由于胸腺五肽水溶性較強(qiáng)，脂溶性差，加之人體腸道表面緊密聯(lián)結(jié)所構(gòu)成的生物膜屏障極大的阻礙了胸腺五肽從胃腸道的吸收，使其口服生物利用度極低。目前，胸腺五肽主要的臨床給藥途徑為靜脈或皮下注射，給藥間隔多為每日或隔日1次，對于需要長期治療的患者，頻繁的注射會帶來諸多痛苦和不便，患者依從性較差。眾所周知，口服給藥是最容易為患者所接受的一種給藥方式，因此，研制一種新型的胸腺五肽口服給藥制劑以提高其口服生物利用度是十分必要的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供供該制劑的制備方法。本發(fā)明目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)本發(fā)明口服微球制劑的原料組成為種胸腺五肽口服微球制劑，本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提胸腺五肽明膠丙交脂-乙交脂共聚物二氯甲烷聚乙烯醇-124抑肽酶甘膽酸鈉0.10.8重量份0.11.5重量份2-20重量份1842體積份520重量份0.010.2重j0.12重量份份本發(fā)明口服微球制劑的原料組成優(yōu)選為胸腺五肽明膠丙交脂-乙交脂共聚物二氯甲烷聚乙烯醇-124抑肽酶甘膽酸鈉0.5重量份0.4重量份9重量份30體積份10重量份0.05重量份0.2重量份。本發(fā)明口服微球制劑的原料組成優(yōu)選為胸腺五肽明膠丙交脂-乙交脂共聚物二氯甲烷聚乙烯醇-124抑肽酶甘膽酸鈉0.4重量份0.2重量份4重量份20體積份t份l:份份。0.15重j1.5重量本發(fā)明口服微球制劑的原料組成優(yōu)選為液，作為水相W工；將丙交脂-乙交脂共聚物溶解在二氯甲烷中，制成濃度為20%-40%的丙交脂_乙交脂共聚物二氯甲烷溶液，作為油相0;在35t:用勻漿機(jī)650015000rpm高速震蕩乳化15分鐘，將油水兩相混合均勻制成W乂O相，將聚乙烯醇-124溶解于450750體積份注射用水中，制成濃度為1%_3%的聚乙烯醇-124水溶液，作為水相W^在35t:用勻漿機(jī)650015000rpm高速震蕩乳化38分鐘，與前W乂O相進(jìn)行乳化包和，得到相，在253(TC下溫和攪拌，揮發(fā)二氯甲烷1015小時(shí)，或在28"下減壓揮發(fā)二氯甲烷15小時(shí)，離心，收集微球；用注射用水洗滌15次，每次1525體積份，加入5%甘露醇水溶液1525體積份重新分散，在-35-45°CT，經(jīng)冷凍干燥1218小時(shí)后，分裝，即得胸腺五肽口服微球制劑；加入常規(guī)輔料，采用常規(guī)方法制成片劑、膠囊劑。本發(fā)明制劑的制備方法優(yōu)選為胸腺五肽明膠丙交脂-乙交脂共聚物二氯甲烷聚乙烯醇-124抑肽酶甘膽酸鈉〖份〖份〖份0.7重j1.3重j16重j40體積份21重量份0.03重量份0.5重量份。本發(fā)明口服微球制劑的制備方法包括如下步驟將胸腺五肽、明膠、抑肽酶、甘膽酸鈉溶解在18體積份注射用水中，制成水溶胸腺五肽、明膠、抑肽酶、甘膽酸鈉溶解在4體積份注射用水中，制成水溶液，作為水相W工；將丙交脂-乙交脂共聚物溶解在二氯甲烷中，制成濃度為40%的丙交脂-乙交脂共聚物二氯甲烷溶液，作為油相0;在4t:用勻漿機(jī)13000rpm高速震蕩乳化3分鐘，將油水兩相混合均勻制成W乂O相，將聚乙烯醇-124溶解于600體積份注射用水中，制成濃度為2%的聚乙烯醇-124水溶液，作為水相W2;在4t:用勻槳機(jī)13000rpm高速震蕩乳化5分鐘，與前W/0相進(jìn)行乳化包和，得到W乂0/^相，在28t:下溫和攪拌，揮發(fā)二氯甲烷13小時(shí)，或在5t:下減壓揮發(fā)二氯甲烷3小時(shí)，離心，收集微球，用注射用水洗滌3次，每次20體積份，加入5%甘露醇水溶液20體積份重新分散，在-4(TC下，經(jīng)冷凍干燥5小時(shí)后，分裝，即得胸腺五肽口服微球制劑；加入常規(guī)輔料，采用常規(guī)方法制成片劑、膠囊劑。本發(fā)明制劑的制備方法優(yōu)選為將胸腺五肽、明膠、抑肽酶、甘膽酸鈉溶解在5體積份注射用水中，制成水溶液，作為水相W工；將丙交脂-乙交脂共聚物溶解在二氯甲烷中，制成濃度為30%的丙交脂_乙交脂共聚物二氯甲烷溶液，作為油相0;在4t:用勻漿機(jī)10000rpm高速震蕩乳化3分鐘，將油水兩相混合均勻制成W乂O相，將聚乙烯醇-124溶解于500體積份注射用水中，制成濃度為2%的聚乙烯醇-124水溶液，作為水相W2;在4t:用勻槳機(jī)10000rpm高速震蕩乳化5分鐘，與前W/0相進(jìn)行乳化包和，得到W乂0/^相，在2『C下溫和攪拌，揮發(fā)二氯甲烷12小時(shí)，離心，收集微球，用注射用水洗滌3次，每次20體積份，加入5%甘露醇水溶液20體積份重新分散，在_401:下，經(jīng)冷凍干燥15小時(shí)后，分裝，即得胸腺五肽口服微球制劑；加入常規(guī)輔料，采用常規(guī)方法制成片劑、膠囊劑。本發(fā)明制劑制備方法還可以優(yōu)選為將胸腺五肽、明膠、抑肽酶、甘膽酸鈉溶解在2體積份注射用水中，制成水溶液，作為水相W工；將丙交脂-乙交脂共聚物溶解在二氯甲烷中，制成濃度為20%的丙交脂-乙交脂共聚物二氯甲烷溶液，作為油相0;在3t:用勻漿機(jī)7000rpm高速震蕩乳化2分鐘，將油水兩相混合均勻制成W乂O相，將聚乙烯醇-124溶解于480體積份注射用水中，制成濃度為1%的聚乙烯醇-124水溶液，作為水相W2;在3t:用勻漿機(jī)14000rpm高速震蕩乳化4分鐘，與前W/0相進(jìn)行乳化包和，得到W乂0/W2相，在26t:下溫和攪拌，揮發(fā)二氯甲烷11小時(shí)，離心，收集微球，用注射用水洗滌2次，每次18體積份，加入5%甘露醇水溶液18體積份重新分散，在-3『C下，經(jīng)冷凍干燥14小時(shí)后，分裝，即得胸腺五肽口服微球制劑；加入常規(guī)輔料，采用常規(guī)方法制成片劑、膠囊劑。本發(fā)明制劑制備方法還可以優(yōu)選為將胸腺五肽、明膠、抑肽酶、甘膽酸鈉溶解在7體積份注射用水中，制成水溶液，作為水相W工；將丙交脂-乙交脂共聚物溶解在二氯甲烷中，制成濃度為40%的丙交脂_乙交脂共聚物二氯甲烷溶液，作為油相0;在5t:用勻漿機(jī)14000rpm高速震蕩乳化4分鐘，將油水兩相混合均勻制成W乂O相，將聚乙烯醇-124溶解于700體積份注射用水中，制成濃度為3%的聚乙烯醇-124水溶液，作為水相W2;在5t:用勻漿機(jī)7000rpm高速震蕩乳化7分鐘，與前W/0相進(jìn)行乳化包和，得到W乂0/^相，攪拌均勻，在5t:下減壓揮發(fā)二氯甲烷3小時(shí)，離心，收集微球，用注射用水洗滌4次，每次22體積份，加入5%甘露醇水溶液22體積份重新分散，在_42°CT，經(jīng)冷凍干燥16小時(shí)后，分裝，即得胸腺五肽口服微球制劑；加入常規(guī)輔料，采用常規(guī)方法制成片劑、膠囊劑。其中，上述抑肽酶可以用胰蛋白酶抑制劑替代，用量為0.050.5重量份，優(yōu)選0.08重量份、0.4重量份或0.06重量份；甘膽酸鈉可以用去氧膽酸鈉或癸酸鈉代替，用量為0.12重量份，優(yōu)選0.1重量份、1.5重量份或0.5重量份。上述發(fā)明及其制備方法中所述的重量份和體積份的關(guān)系是g/mL。本發(fā)明制劑最佳載藥量為1%20%;微球的平均粒度在150微米之間。本發(fā)明制劑有效的提高了胸腺五肽的口服生物利用度，在不降低臨床療效的同時(shí)，使口服給藥成為胸腺五肽可選擇的臨床給藥途徑之一。圖1:胸腺五肽HPLC測定線性關(guān)系考察；圖2:胸腺五肽HPLC色譜圖3:胸腺五肽微球粒度分布圖。下面實(shí)驗(yàn)和實(shí)施例用于進(jìn)一步說明但不限于本發(fā)明。實(shí)驗(yàn)例l胸腺五肽口服微球制備工藝正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)研究1、試劑聚乙烯醇(polyvinylalcohol，PVA_124，CH2CH0H)北京化學(xué)試劑公司(日本進(jìn)口分裝)批號20060613;甘露醇(Mannito1，CH2(OH)(CH0H)4CH20H)天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司，批號20060124;丙交脂-乙交脂共聚物(PLGA，Mr=10000，LA:GA=75:25)撫順天元生物材料有限公司，批號050512，；胸腺五肽(Thymopentin,TP_5)四川凱捷生物醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，批號20071115;水為純凈水，其它試劑均為市售分析純。2、儀器IKA-T25基本型均質(zhì)機(jī)，IKAWorksGuangZhou廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司；IKA—RHbasic2MagneticStirrer力口熱磁力攬摔器，IKA⑩WorksGuangZhou廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司；GL-21C高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；LGJ0.5冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；Mastersizer2000激光粒度分布測定儀，英國Malvern公司；JSM-35CF掃描電子顯微鏡(日本電子公司)；精密電子天平(德國SartoriusBT25S，BS224S);Waters高效液相色譜儀(2996PhotodiodeArrayDetector;2695S印arationsModule,Empower色譜工作站，美國Waters公司)；。18蛋白分析專用柱(200X4.6mmmm，5ym，大連依利特公司)。3、實(shí)驗(yàn)方法(1)胸腺五肽口服微球的制備將胸腺五肽、明膠、抑肽酶或胰蛋白酶抑制劑、甘膽酸鈉溶解在3mL注射用水中，制成水溶液，作為水相W工；將丙交脂-乙交脂共聚物溶解在15mL二氯甲烷中，作為油相0;在35t:用高速均質(zhì)機(jī)高速震蕩乳化，將油水兩相混合均勻制成W乂O相，將聚乙烯醇-124溶解于600mL注射用水中，制成水溶液，作為水相W2;在35。C用高速均質(zhì)機(jī)高速震蕩乳化，與前W/0相進(jìn)行乳化包和，得到W/0/W2相，在253(TC下溫和攪拌(<100rpm)揮發(fā)二氯甲烷12小時(shí)，離心，收集微球，用注射用水洗滌3次，每次20mL，加入1%甘露醇水溶液20mL重新分散，在_401:下，經(jīng)冷凍干燥15小時(shí)后，分裝，即得胸腺五肽口服微球。通過對微球得率、粒度分布影響較大的丙交脂_乙交脂共聚物(PLGA)濃度(0相)、聚乙烯醇濃度(W2相)、乳化攪拌速度等因素進(jìn)行研究。設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)，以確定影響微球得率、粒度分布各因素的主次作用。正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，見表1。表l因素水平表L9(34)PLGA濃度％_聚乙烯醇濃度％_乳化攪拌速度rpm(A)(B)(C)1201650023029500340313000(2)色譜條件色譜柱依利特C18蛋白分析專用色譜柱(200mmX4.6mm，5ym);柱溫30。C;檢測波長:275nm;流動(dòng)相0.05mol/L磷酸緩沖液(PH7.O)-甲醇(90:10);流速1.0mL'min—1;進(jìn)樣量:20iiL。(3)對照品溶液及供試品溶液的制備取胸腺五肽標(biāo)準(zhǔn)品，精密稱定，加流動(dòng)相溶解并稀釋定容，配制成濃度為0.5mgmL—1的溶液，搖勻，作為對照品溶液。另精密稱取胸腺五肽口服微球樣品50mg，置10ml容量瓶中，以含20%乙腈的流動(dòng)相溶解微球，并加流動(dòng)相至刻度，搖勻，定容，作為供試品溶液。(4)線性關(guān)系考察取胸腺五肽標(biāo)準(zhǔn)品，分別用流動(dòng)相配成不同濃度的胸腺五肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按上述色譜條件分別取20iiL注入色譜儀，進(jìn)行分析，每個(gè)濃度平行測定3次，記錄色譜峰面積。以胸腺五肽濃度(C)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)作線性回歸分析，得回歸方程A二2Xl(fC-8491.1，r=0.998。結(jié)果表明，胸腺五肽在質(zhì)量濃度0.013450.1345mg*mL—1內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。結(jié)果見表2，圖1。表2胸腺五肽HPLC測定線性關(guān)系考察1234567胸腺五肽(mg/ml)0.013450.0201750.02690,040350.05380.08070.1345峰面積231733892048198.574580.598460.25150204.7279725.3(5)精密度考察取胸腺五肽標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)確稱定，加流動(dòng)相溶解并稀釋成濃度為0.03mg*mL的溶液，按上述色譜條件連續(xù)測定5次，根據(jù)色譜峰計(jì)算精密度，結(jié)果見表3，結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積RSDX二1.46%，表明方法精密度良好。表3胸腺五肽HPLC檢測精密度考察編號__^_^_^_^_峰面積51667.952058.9652238.850429.251008.7峰面積均值51480.71STD753.754RSD%L4641(6)加樣回收率試驗(yàn)精密稱取已知胸腺五肽含量的胸腺五肽口服微球50mg，精密加入胸腺五肽對照品lmg，照供試品溶液項(xiàng)下的制備方法制備，平行操作5份，依法測定，并計(jì)算回收率。結(jié)果表明，回收率分別為99.68%，101.36%，100.77%，99.01%，101.94%;平均回收率為100.55%，RSDX為1.20%，回收率符合方法學(xué)要求。(7)穩(wěn)定性試驗(yàn)取一份供試品溶液，在0，6，12，18，24h分別進(jìn)樣20yL，依法檢測，結(jié)果峰面積的RSDX為2.92%，表明供試品溶液中胸腺五肽在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。(8)胸腺五肽口服微球載藥量和包封率的測定取上述供試品溶液依法測定，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中胸腺五肽的含量，并按照下式計(jì)算微球的載藥量和包封率(結(jié)果見表4):微球載藥量=(微球中的胸腺五肽重量/微球重量)X100%包封率=(實(shí)際載藥量/理論載藥量)X100%。(9)HPLC法測定胸腺五肽對照品與口服微球的圖譜，結(jié)果見附圖2，結(jié)果表明在此色譜條件下胸腺五肽標(biāo)準(zhǔn)對照品與受試樣品中的胸腺五肽有相同的保留時(shí)間，而且樣品中的胸腺五肽分離度良好。(10)胸腺五肽口服微球的粒徑測定將所制備的胸腺五肽口服微球以水混懸后，超聲分散，用Mastersizer-2000型激光粒度分布測定儀測定微球的粒度分布，結(jié)果見表4，附圖3。表4胸腺五肽微球制備工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果胸腺五肽口服微球制備工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，采用綜合加權(quán)-直觀分析法由表2中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，因素A對微球的包封率影響最大，其次為因素C，因素B影響最??；PLGA濃度增加，包封率也隨之增高；因?yàn)榘饴试酱笤胶?，同時(shí)考慮到微球平均粒徑越小越容易被機(jī)體吸收，故最佳微球制備工藝為A3B2C3，即PLGA濃度為40X，PVA濃度為2%，乳化攪拌速度為13000rpm時(shí)所制備的微球包封率較高，此為最佳工藝。實(shí)驗(yàn)例2胸腺五肽口服微球制備工藝的重現(xiàn)行與穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)研究1、實(shí)驗(yàn)材料同實(shí)驗(yàn)例1。2、實(shí)驗(yàn)方法按照實(shí)驗(yàn)例1中胸腺五肽口服微球制備工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出的最優(yōu)生產(chǎn)工藝條件，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，并同時(shí)按照實(shí)驗(yàn)例1中相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法考察所制備微球的包封率、載藥量、粒度分布等指標(biāo)，以評價(jià)胸腺五肽口服微球微球制備工藝的重現(xiàn)性。3、實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，見表5。表5胸腺五肽口服微球制備工藝的重現(xiàn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>由表5中實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，所重復(fù)制備的三批次胸腺五肽口服微球的包封率、載藥量和粒度分布較為均勻，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD%)較小，說明制備工藝有較好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)例3胸腺五肽口服微球制劑體外釋放度的實(shí)驗(yàn)研究1、試劑和儀器胸腺五肽口服微球(自制)；梅特勒-科利多AB265-S電子分析天平；SWB-2000恒溫水浴搖床(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；Waters高效液相色譜儀(2996PhotodiodeArrayDetector;2695SeparationsModule,Empower色譜工作站，美國Waters公司)；C18蛋白分析專用柱(200X4.6mmmm，5ym，大連依利特公司)；水為純凈水，其它試劑均為市售分析純。2、實(shí)驗(yàn)方法取胸腺五肽口服微球制劑100mg，精密稱定，置15ml具塞試管中，加入釋放介質(zhì)(pH7.0的磷酸緩沖液，內(nèi)含0.01X苯扎氯胺)10ml/管，置于37t:(士rC)恒溫水浴搖床中，在1小時(shí)、2小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)時(shí)分別用注射器取出2.5ml，用0.45ii濾膜過濾，初濾液0.2ml加回原試管，精密稱取續(xù)濾液2g(±0.02g)置于進(jìn)樣瓶中，余液和濾膜加回原試管并即時(shí)補(bǔ)充2ml溶劑，按1.2項(xiàng)下HPLC法測定胸腺五肽含量；按下式計(jì)算釋放度。測得濃度(mg/ml)X10ml+2前次取出2g溶液中所含樣品量(mg)釋放度％=-微球取樣量(mg)x胸腺五肽載藥量y。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果胸腺五肽口服微球制劑體外釋放度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6:表6胸腺五肽口服微球制劑體外釋放度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)不同時(shí)間點(diǎn)胸腺五肽累積釋放度<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>由表6可以看出胸腺五肽口服微球的體外釋放存在明顯的兩相，前2h處于藥物的快速釋放期，胸腺五肽在此階段的累積釋放量達(dá)到(37.90±1.10)%，存在一定的突釋，此后進(jìn)入藥物的緩慢釋放期，24h后胸腺五肽的累積釋放量為(61.76±2.63)%。實(shí)驗(yàn)例4胸腺五肽口服微球的初步藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察l實(shí)驗(yàn)材料1.1藥品與試劑胸腺五肽(Thymopentin，TP_5，四川凱捷生物醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，批號20071115);口服胸腺五肽微球(本室自制，批號20080630);注射用環(huán)磷酰胺(CTX，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號08050321);肝素抗凝的真空采血管(山東成武縣醫(yī)用制品廠，批號20070720);FITCanti-mouseCD3，PEanti-mouseCD4，PE/Cy5.5anti-mouseCD8a，RBCLysisBuffer(BiolegendLtd，美國)；PBS緩沖鹽(北京博奧森公司，批號080527)。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠，雌雄兼用，體重20±2g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.3實(shí)驗(yàn)儀器FACSCalibur流式細(xì)胞儀，美國BectonDickinson公司。2實(shí)驗(yàn)方法2.1分組與給藥將小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半；即①空白對照組；②模型對照組③胸腺五肽皮下注射組④胸腺五肽口服組⑤胸腺五肽微球口服組。各組動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后，除正常對照組外，其余各組于實(shí)驗(yàn)前3d腹腔注射CTX40mgkg—1d—、使其產(chǎn)生免疫抑制反應(yīng)，正常對照組注射等體積生理鹽水。按體質(zhì)量換算表中的折算比計(jì)算每只小鼠應(yīng)給予的給藥劑量，從第1個(gè)實(shí)驗(yàn)日至第7個(gè)實(shí)驗(yàn)日，按下表分組連續(xù)給藥7日，每日給藥l次，第8d結(jié)束實(shí)驗(yàn)。各組小鼠自由進(jìn)食、飲水。實(shí)驗(yàn)分組、給藥方式及檢測結(jié)果見表7。表7試驗(yàn)分組與給藥方式<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>*與模型對照組相比較，P<0.052.2末次給藥結(jié)束后，小鼠稱重，小鼠眼眶取血2mL，以肝素抗凝的真空采血管收集，混勻，備用。手術(shù)摘取小鼠胸腺、脾臟，計(jì)算臟器指數(shù)。2.3流式細(xì)胞法測定T淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+2.3.1吸取肝素抗凝的全血樣品100iiL，加入三色熒光標(biāo)記抗體(CD3、CD4、CD8抗體)10iiL，漩渦振蕩使充分混勻，室溫避光孵育30min;2.3.2加入紅細(xì)胞溶解液2mL溶血5min后，1200r/min離心10min，棄去上清液；2.3.3將沉淀中加入PBS緩沖液2mL，混勻后，1200r/min離心5min，棄去上清液；重復(fù)上述操作用2次，總計(jì)用PBS緩沖液洗滌3次；2.3.4將用PBS緩沖液洗滌后的細(xì)胞沉淀加lmLPBS緩沖液稀釋并混勻，然后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果小鼠T淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果見表7。由表7可見小鼠注射環(huán)磷酰胺后T細(xì)胞亞群中CD4/CD8比值明顯升高，胸腺五肽皮下注射組和胸腺五肽微球口服組CD4/CD8比值明顯降低，與模型對照組有顯著性差異(P<0.05);胸腺五肽口服組與模型對照組無顯著差異(P>0.05)。下述實(shí)施例均能實(shí)現(xiàn)上述實(shí)驗(yàn)例的效果。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:胸腺五肽口服微球胸腺五肽0.5kg明膠0.4kg丙交脂-乙交脂共聚物9kg二氯甲烷30L聚乙烯醇-12410kg抑肽酶0.05kg甘膽酸鈉0.2kg;將胸腺五肽、明膠、抑肽酶、甘膽酸鈉溶解在5L注射用水中，制成水溶液，作為水相W工；將丙交脂_乙交脂共聚物溶解在301二氯甲烷中，制成濃度為30%的丙交脂_乙交脂共聚物二氯甲烷溶液，作為油相0;在4t:用勻漿機(jī)10000rpm高速震蕩乳化3分鐘，將油水兩相混合均勻制成W乂O相，將10kg聚乙烯醇-124溶解于500L注射用水中，制成濃度為2%的聚乙烯醇-124水溶液，作為水相W2;在4t:用勻漿機(jī)10000rpm高速震蕩乳化5分鐘，與前W/0相進(jìn)行乳化包和，得到相，在28t:下溫和攪拌，揮發(fā)二氯甲烷12小時(shí)，離心，收集微球，用注射用水洗滌3次，每次20L，加入5%甘露醇水溶液20L重新分散，在-40°C下，經(jīng)冷凍干燥15小時(shí)后，分裝，即得胸腺五肽口服微球；胸腺五肽口服微球最佳載藥量為1%20%;微球的平均粒度在1--50微米之間。實(shí)施例2:胸腺五肽口服微球片劑胸腺五肽0.4kg明膠0.2kg丙交脂-乙交脂共聚物4kg二氯甲烷20L聚乙烯醇-1245kg抑肽酶0.15kg甘膽酸鈉1.5kg;將胸腺五肽、明膠、抑肽酶、甘膽酸鈉溶解在2L注射用水中，制成水溶液，作為水相W工；將丙交脂_乙交脂共聚物溶解在20L二氯甲烷中，制成濃度為20%的丙交脂-乙交脂共聚物二氯甲烷溶液，作為油相0;在3t:用勻漿機(jī)7000rpm高速震蕩乳化2分鐘，將油水兩相混合均勻制成W乂O相，將聚乙烯醇-124溶解于480L注射用水中，制成濃度為1%的聚乙烯醇-124水溶液，在3t:用勻漿機(jī)14000rpm高速震蕩乳化4分鐘，與前W/0相進(jìn)行乳化包和，得到W/0/W2相，在26t:下溫和攪拌，揮發(fā)二氯甲烷11小時(shí)，離心，收集微球，用注射用水洗滌2次，每次18L，加入5%甘露醇水溶液18L重新分散，在_381:下，經(jīng)冷凍干燥14小時(shí)后，分裝，即得胸腺五肽口服微球；胸腺五肽口服微球最佳載藥量為1%20%;微球的平均粒度在150微米之間；加入常規(guī)輔料，采用常規(guī)方法制成片劑。實(shí)施例3:胸腺五肽口服微球膠囊劑胸腺五肽0.7kg明膠1.3kg丙交脂-乙交脂共聚物16kg二氯甲烷40L聚乙烯醇-12421kg抑肽酶0.03kg甘膽酸鈉0.5kg;將胸腺五肽、明膠、抑肽酶、甘膽酸鈉溶解在7L注射用水中，制成水溶液，作為水相W工；將丙交脂_乙交脂共聚物溶解在40L二氯甲烷中，制成濃度為40%的丙交脂-乙交脂共聚物二氯甲烷溶液，作為油相0;在5t:用勻漿機(jī)14000rpm高速震蕩乳化4分鐘，將油水兩相混合均勻制成W乂O相，將聚乙烯醇-124溶解于700L注射用水中，制成濃度為3%的聚乙烯醇-124水溶液，作為水相W2;在5t:用勻漿機(jī)7000rpm高速震蕩乳化7分鐘，與前w/o相進(jìn)行乳化包禾p，得到相，在5t:下減壓揮發(fā)二氯甲烷3小時(shí)，離心，收集微球，用注射用水洗滌4次，每次22L，加入5%甘露醇水溶液22L重新分散，在_42°CT，經(jīng)冷凍干燥16小時(shí)后，分裝，即得胸腺五肽口服微球制劑；胸腺五肽口服微球最佳載藥量為1%20%;微球的平均粒度在150微米之間；加入常規(guī)輔料，采用常規(guī)方法制成膠囊劑。實(shí)施例4:胸腺五肽口服微球胸腺五肽0.5kg明膠0.4kg丙交脂-乙交脂共聚物9kg二氯甲烷30L聚乙烯醇-12410kg抑肽酶0.05kg甘膽酸鈉0.2kg;將胸腺五肽、明膠、抑肽酶、甘膽酸鈉溶解在4L注射用水中，制成水溶液，作為水相W工；將丙交脂_乙交脂共聚物溶解在30L二氯甲烷中，制成濃度為40%的丙交脂-乙交脂共聚物二氯甲烷溶液，作為油相0;在4t:用勻漿機(jī)13000rpm高速震蕩乳化3分鐘，將油水兩相混合均勻制成W乂O相，將聚乙烯醇-124溶解于600L注射用水中，制成濃度為2%的聚乙烯醇-124水溶液，作為水相W2;在4t:用勻漿機(jī)13000rpm高速震蕩乳化5分鐘，與前W/0相進(jìn)行乳化包和，得到W乂0/^相，在28t:下溫和攪拌，揮發(fā)二氯甲烷13小時(shí)，或在5°C下減壓揮發(fā)二氯甲烷3小時(shí)，離心，收集微球，用注射用水洗滌3次，每次20L，加入5%甘露醇水溶液20L重新分散，在_401:下，經(jīng)冷凍干燥5小時(shí)后，分裝，即得胸腺五肽口服微球制劑；加入常規(guī)輔料，采用常規(guī)方法制成片劑、膠囊劑。權(quán)利要求一種胸腺五肽口服微球制劑，其特征在于該微球制劑的原料組成為胸腺五肽0.1～0.8重量份明膠0.1～1.5重量份丙交脂-乙交脂共聚物2-20重量份二氯甲烷18～42體積份聚乙烯醇-1245～20重量份抑肽酶0.01～0.2重量份甘膽酸鈉0.1～2重量份。2.如權(quán)利要求l所述的口服微球制劑，其特征在于該微球制劑的原料組成為胸腺五肽o.5重量份明膠o.4重量份丙交脂-乙交脂共聚物9重量份二氯甲烷30體積份聚乙烯醇-12410重量份抑肽酶o.05重量份甘膽酸鈉o.2重量份。3.如權(quán)利要求l所述的口服微球制劑，其特征在于該微球制劑的原料組成為胸腺五肽o.4重量份明膠o.2重量份丙交脂-乙交脂共聚物4重量份二氯甲烷20體積份聚乙烯醇-1245重量份抑肽酶o.15重量份甘膽酸鈉1.5重量份。4.如權(quán)利要求l所述的口服微球制劑，其特征在于該微球制劑的原料組成為胸腺五肽o.7重量份明膠1.3重量份丙交脂-乙交脂共聚物16重量份二氯甲烷40體積份聚乙烯醇-12421重量份抑肽酶o.03重量份甘膽酸鈉o.5重量份。5.如權(quán)利要求1-4任-所述的口服微球制劑的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟將胸腺五肽、明膠、抑肽酶、甘膽酸鈉溶解在l-8體積份注射用水中，制成水溶液，作為水相w、；將丙交脂-乙交脂共聚物溶解在二氯甲烷中，制成濃度為20％-，40％0的丙交脂-乙交脂共聚物二氯甲烷溶液，作為油相o；在3—5℃用勻漿機(jī)6500~15000J.pm高i速震蕩乳化l-5分鐘，將油水兩相混合均勻制成W,..／’O相，將聚乙烯醇-124溶解‘450-.T50體積份注射用水中，制成濃度為。tO-3％o的聚乙烯醇-[247長溶液，作為水相w，；在3-5t:用勻漿機(jī)650015000rpm高速震蕩乳化38分鐘，與前W乂O相進(jìn)行乳化包和，得到相，在253(TC下溫和攪拌，揮發(fā)二氯甲烷1015小時(shí)，或在28"下減壓揮發(fā)二氯甲烷15小時(shí)，離心，收集微球，用注射用水洗滌15次，每次1525體積份，加入5%甘露醇水溶液1525體積份重新分散，在-35-45°CT，經(jīng)冷凍干燥1218小時(shí)后，分裝，即得胸腺五肽口服微球制劑；加入常規(guī)輔料，采用常規(guī)方法制成片劑、膠囊劑。6.如權(quán)利要求5所述的口服微球制劑的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟將胸腺五肽、明膠、抑肽酶、甘膽酸鈉溶解在4體積份注射用水中，制成水溶液，作為水相W工；將丙交脂-乙交脂共聚物溶解在二氯甲烷中，制成濃度為40%的丙交脂-乙交脂共聚物二氯甲烷溶液，作為油相0;在4t:用勻漿機(jī)13000rpm高速震蕩乳化3分鐘，將油水兩相混合均勻制成W乂O相，將聚乙烯醇-124溶解于600體積份注射用水中，制成濃度為2%的聚乙烯醇-124水溶液，作為水相W2;在4t:用勻漿機(jī)13000rpm高速震蕩乳化5分鐘，與前W乂O相進(jìn)行乳化包和，得到W乂0/W2相，在28t:下溫和攪拌，揮發(fā)二氯甲烷13小時(shí)，或在5t:下減壓揮發(fā)二氯甲烷3小時(shí)，離心，收集微球，用注射用水洗滌3次，每次20體積份，加入5%甘露醇水溶液20體積份重新分散，在-40°CT，經(jīng)冷凍干燥5小時(shí)后，分裝，即得胸腺五肽口服微球制劑；加入常規(guī)輔料，采用常規(guī)方法制成片劑、膠囊劑。7.如權(quán)利要求5所述的口服微球制劑的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟將胸腺五肽、明膠、抑肽酶、甘膽酸鈉溶解在5體積份注射用水中，制成水溶液，作為水相W工；將丙交脂_乙交脂共聚物溶解在二氯甲烷中，制成濃度為30%的丙交脂-乙交脂共聚物二氯甲烷溶液，作為油相0;在4t:用勻漿機(jī)10000rpm高速震蕩乳化3分鐘，將油水兩相混合均勻制成W乂0相，將聚乙烯醇-124溶解于500體積份注射用水中，制成濃度為2%的聚乙烯醇-124水溶液，作為水相W2;在4t:用勻漿機(jī)10000rpm高速震蕩乳化5分鐘，與前W/0相進(jìn)行乳化包和，得到W乂0/^相，在28t:下溫和攪拌，揮發(fā)二氯甲烷12小時(shí)，離心，收集微球，用注射用水洗滌3次，每次20體積份，加入5%甘露醇水溶液20體積份重新分散，在-4(TC下，經(jīng)冷凍干燥15小時(shí)后，分裝，即得胸腺五肽口服微球制劑；加入常規(guī)輔料，采用常規(guī)方法制成片劑、膠囊劑。8.如權(quán)利要求5所述的口服微球制劑的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟將胸腺五肽、明膠、抑肽酶、甘膽酸鈉溶解在2體積份注射用水中，制成水溶液，作為水相W工；將丙交脂-乙交脂共聚物溶解在二氯甲烷中，制成濃度為20%的丙交脂-乙交脂共聚物二氯甲烷溶液，作為油相0;在3t:用勻漿機(jī)7000rpm高速震蕩乳化2分鐘，將油水兩相混合均勻制成W乂O相，將聚乙烯醇-124溶解于480體積份注射用水中，制成濃度為1%的聚乙烯醇-124水溶液，作為水相W2;在3t:用勻漿機(jī)14000rpm高速震蕩乳化4分鐘，與前W/0相進(jìn)行乳化包和，得到W乂0/W2相，在26t:下溫和攪拌，揮發(fā)二氯甲烷11小時(shí)，離心，收集微球，用注射用水洗滌2次，每次18體積份，加入5%甘露醇水溶液18體積份重新分散，在-3『C下，經(jīng)冷凍干燥14小時(shí)后，分裝，即得胸腺五肽口服微球制劑；加入常規(guī)輔料，采用常規(guī)方法制成片劑、膠囊劑。9.如權(quán)利要求5所述的口服微球制劑的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟將胸腺五肽、明膠、抑肽酶、甘膽酸鈉溶解在7體積份注射用水中，制成水溶液，作為水相W工；將丙交脂-乙交脂共聚物溶解在二氯甲烷中，制成濃度為40%的丙交脂-乙交脂共聚物二氯甲烷溶液，作為油相0;在5t:用勻漿機(jī)14000rpm高速震蕩乳化4分鐘，將油水兩相混合均勻制成W乂0相，將聚乙烯醇-124溶解于700體積份注射用水中，制成濃度為3%的聚乙烯醇-124水溶液，作為水相W2;在5t:用勻漿機(jī)7000rpm高速震蕩乳化7分鐘，與前W/0相進(jìn)行乳化包和，得到W乂0/^相，攪拌均勻，在5t:下減壓揮發(fā)二氯甲烷3小時(shí)，離心，收集微球，用注射用水洗滌4次，每次22體積份，加入5%甘露醇水溶液22體積份重新分散，在-42t:下，經(jīng)冷凍干燥16小時(shí)后，分裝，即得胸腺五肽口服微球制劑；加入常規(guī)輔料，采用常規(guī)方法制成片劑、膠囊劑。10.如權(quán)利要求l-4任一所述的口服微球制劑，其特征在于其中抑肽酶用胰蛋白酶抑制劑替代，用量為0.050.5重量份；甘膽酸鈉用去氧膽酸鈉或癸酸鈉代替，用量為0.12重量份。11.如權(quán)利要求l-4任一所述的口服微球制劑，其特征在于其中抑肽酶用胰蛋白酶抑制劑替代，用量為0.08重量份、0.4重量份或0.06重量份；甘膽酸鈉用去氧膽酸鈉或癸酸鈉代替，用量為0.1重量份、1.5重量份或0.5重量份。12.如權(quán)利要求5-9任一所述的口服微球制劑的制備方法，其特征在于其中抑肽酶用胰蛋白酶抑制劑替代，用量為0.050.5重量份；甘膽酸鈉用去氧膽酸鈉或癸酸鈉代替，用量為0.12重量份。13.如權(quán)利要求5-9任一所述的口服微球制劑的制備方法，其特征在于其中抑肽酶用胰蛋白酶抑制劑替代，用量為0.08重量份、0.4重量份或0.06重量份；甘膽酸鈉用去氧膽酸鈉或癸酸鈉代替，用量為0.1重量份、1.5重量份或O.5重量份。全文摘要本發(fā)明公開一種胸腺五肽口服微球制劑及其制備方法。該口服微球制劑的原料組成為胸腺五肽、明膠、丙交脂-乙交脂共聚物、二氯甲烷、聚乙烯醇-124、抑肽酶或胰蛋白酶抑制劑、甘膽酸鈉或去氧膽酸鈉或癸酸鈉。本發(fā)明胸腺五肽口服微球制劑口服生物利用率高，在不降低臨床療效的同時(shí)可替代注射給藥，克服了頻繁的注射給患者帶來諸多痛苦和不便。文檔編號A61K9/16GK101721677SQ200810187988公開日2010年6月9日申請日期2008年12月31日優(yōu)先權(quán)日2008年10月10日發(fā)明者馮前進(jìn),周曉慶,王永輝,郭光明申請人:北京博恩特藥業(yè)有限公司