專利名稱：一種蝮蛇生物活性酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化學(xué)制藥技術(shù)，具體地說，涉及一種蝮蛇生物活性酶的制 備方法。
技術(shù)背景蛇毒是毒蛇從毒腺中分泌出來的一種液體，主要成份是毒性蛋白質(zhì)，約占干重的90%至95%，其中，酶類和毒素約含二十多種。此外，還含有一些小分 子肽、氨基酸、碳水化合物、脂類、核苷、生物胺類及金屬離子等。蛇毒有液 體黃金之稱，具有很好的醫(yī)用價值，可制備特效藥抗蛇毒血清，還可制備鎮(zhèn)痛 劑和止血劑，效果勝于嗎啡、度冷丁，無成癮性。蛇毒還可治療癱瘓、小兒麻 痹癥等。近年來蛇毒又被用以治療癌癥，因為蛇毒由34種蛋白質(zhì)構(gòu)成的化合 物，其中有一種很重要且數(shù)量較多的毒素叫溶細(xì)胞素。它是一種專門破壞細(xì)胞 和細(xì)胞膜的毒素。現(xiàn)在臨床上應(yīng)用的蛇毒精制成分有兩種， 一是自巴西蛇毒分離的一種促凝 血成分名叫reptilase，用于防止內(nèi)出血，另一種是自馬來西亞蛇毒分離所得的 成分名叫arvin，用于防止血栓病的形成。隨著人們對蛇毒的研究，蛇毒在臨床 醫(yī)學(xué)的應(yīng)用也會更多。中國專利公開號為CN1673363A的專利申請文件公開了 一種蝮蛇活肝酶及其制備工藝，通過該專利方法得到生物活性物質(zhì)具有治療肝 病的用途，但是該專利申請中的制備工藝方法很難實現(xiàn)。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種蝮蛇生物活性酶的制備方法。通過 該方法制備的蝮蛇生物活性酶能夠用于治療肝纖維化疾病。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所提供的技術(shù)方案是蝮蛇生物活性酶的 制備方法，包括以下步驟(l)取蝮蛇毒干粉，用該蛇毒干粉1 5倍重量份的pH7.1 8.0的0.005 0.01mol/L緩沖液溶解，經(jīng)8000 10000轉(zhuǎn)高速離心30 60分鐘，取上清液用 陰離子交換層析柱分離，先用含0.01 0.05mol/L氯化鈉的pH7.1 8.0的0.005 0.01mol/L緩沖液洗脫，再用含0.1 0.5mol/L氯化鈉的pH7.1 8.0的 0.005 0.01mol/L緩沖液洗脫，收集洗脫液，在280nrn的波長下對洗脫液進(jìn)行 紫外分光光度計檢測，得到波長280nm吸收圖譜，收集各吸收峰的洗脫液中能 水解苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽(BAEE)的部分，將收集液透析除鹽，凍干 成粉；
(2) 將步驟(1)中獲得的凍干粉，用0.01 0.05mol/L碳酸氫鈉洗脫液 溶解，經(jīng)8000 10000轉(zhuǎn)高速離心30 60分鐘，取上清液用凝膠柱分離，然 后用0.01 0.05mol/L碳酸氫鈉洗脫液洗脫，收集洗脫液，在280nm的波長下 對洗脫液進(jìn)行紫外分光光度計檢測，得到波長280nm吸收圖譜，收集各吸收峰 的洗脫液中能水解苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽(BAEE)的部分，將收集液透 析除鹽，凍干成粉；
(3) 將步驟(2)中獲得的凍干粉，用pH5.0 6.0的0.01 0.03mol/L醋 酸鈉緩沖液溶解，經(jīng)8000 10000轉(zhuǎn)高速離心30 60分鐘，取上清液用羧甲 基-瓊脂糖凝膠Cl-6B陽離子交換柱分離，用氯化鈉直線梯度方式洗脫，該氯化 鈉溶液的濃度從Omol/L線性遞增至lmol/L，收集洗脫液，在280nm的波長下 對洗脫液進(jìn)行紫外分光光度計檢測，得到波長280nm吸收圖譜，收集活性吸收 峰的洗脫液，透析除鹽，凍干。
上述步驟(1)中所述的緩沖液為Tris-HCl緩沖液或磷酸鹽緩沖液；所述 的陰離子交換層析柱為二乙氨乙基交聯(lián)葡聚糖A-50型或二乙氨乙基交聯(lián)葡聚 糖A-25型；
上述步驟(2)中所述的凝膠柱為葡聚糖凝膠G-75型或葡聚糖凝膠G-100
型；
所述制備方法中透析除鹽的條件為透析袋孔徑為8000 10000道爾頓，將 收集液裝入透析袋，放入收集液20 50倍體積的蒸餾水，攪拌透析，4 8小 時換一次蒸餾水，透析18 32小時。
本發(fā)明的蝮蛇生物活性酶的制備方法，工藝穩(wěn)定，質(zhì)量可控，在每個分離 純化步驟中均有收集活性組分的檢測指標(biāo)，保證了產(chǎn)品的質(zhì)量與活性。其中制 備方法步驟(1)和(2)中通過檢測各吸收峰的洗脫液是否能夠水解BAEE來 確定合并收集液的范圍。試驗中可以采用本領(lǐng)域公知的BAEE檢測方法進(jìn)行，本發(fā)明提供一種BAEE的檢測方法，具體如下所述稱取BAEE27.4mg溶解于100ml pH8.0的0.05mol/L的Tris-HCl水溶液中。 取上述配制的BAEE底物溶液2.9ml于lcm光程的石英比色皿中，加O.lml待 測收集液，立即混勻，于波長253nm處讀數(shù)，觀察5分鐘內(nèi)數(shù)值的變化。計算活力單位……--------......-=x usp/ml5x0.003x0.1A2: 5分鐘時的光吸收值；A1: O時間的光吸收值； 5 : 5分鐘；USp:表示活力單位；0. 003:光吸收值增加0.003即為l個usp單位。將具有酶活力的收集液部分，即能夠水解BAEE的收集液合并，得到本發(fā) 明制備方法中步驟(1)和(2)所述樣品，然后進(jìn)一步分離純化。而本發(fā)明通 過羧甲基-瓊脂糖凝膠Cl-6B (Cm-sepharoseCl-6B)陽離子交換柱的分離純化， 在280nm的波長下對洗脫液進(jìn)行紫外分光光度計檢測，得到多個蛋白吸收峰， 收集吸收峰中第n、 III、 IV號活性吸收峰的洗脫液，透析除鹽，凍干，即為蝮 蛇生物活性酶，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定分子量為2.5 3.5萬，其能 夠用于治療肝纖維化疾病。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明的蝮蛇生物活性酶去除了蝮蛇毒中所含的大量 有毒物質(zhì)，經(jīng)小白鼠皮下注射蝮蛇生物活性酶試驗，IO小時后解剖，皮下無出 血現(xiàn)象。而經(jīng)小白鼠脊椎注射蝮蛇生物活性酶試驗，表明無神經(jīng)毒性。并且具 有很高的生物活性，從而達(dá)到了用藥即安全、療效又高的目的。具有較強(qiáng)的治 療肝纖維化疾病的療效。為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明蝮蛇生物活性酶的治療效果，采用本發(fā)明實施 例2制得到的蝮蛇生物活性酶進(jìn)行以下藥效學(xué)實驗，對本發(fā)明作進(jìn)一步闡 述，但本發(fā)明并不限于下列實驗中包含的內(nèi)容。試驗例h蝮蛇生物活性酶對健康的纖維化的大鼠肝臟的影響試驗方法1、 注射蝮蛇生物活性酶后體內(nèi)纖維蛋白原水平雄性健康Wistar大鼠，體重300g，靜脈注射該蝮蛇生物活性酶的量分別為0.25， 0.5， 1.5， 2.5IU/kg，每日一次，連續(xù)7天。最后一次給藥后4小時， 麻醉，穿刺心臟取血做纖維蛋白原測定。EDTA-血樣轉(zhuǎn)入血細(xì)胞比容毛細(xì)管中， 將兩端封閉，離心5分鐘，放入56"C水浴中3分鐘，然后再離心3分鐘。纖維 蛋白原呈淡黃色膜于管的頂部。測量管內(nèi)的血漿和纖維蛋白原的長度，纖維蛋 白原的濃度的計算公式纖維蛋白原的管內(nèi)長度(mm) /血漿管內(nèi)長度(mm) xl00mg/dl上式中mm:毫米； mg/dl:毫克每分升2、注射蝮蛇生物活性酶的體內(nèi)抗凝效應(yīng)用蝮蛇生物活性酶在大鼠體內(nèi)做抑制血栓素(TXB2)產(chǎn)生的測定。Wistar 大鼠(體重310士15g)，靜脈注射蝮蛇生物活性酶的劑量為O.l， 0.25， 0.5， 1.5， 2.5IU/kg。 2小時后，麻醉，心臟穿刺采血以測定TXB2。用未抗凝的血，在試 管中37。C下保溫60分鐘，1500轉(zhuǎn)/分，4。C下離心60分鐘取出上清液，冰凍保 存于-20。C備用。TXB2用商品抗血清(PerkinElmer)做放射免疫測定。所得的 TXB2值相當(dāng)于在血液凝固過程中凝血酶刺激血小板生成的TXB2。 3、對膽汁流動的影響將大鼠分成4組(l)健康大鼠，不注射CCU， (2)健康大鼠注射蝮蛇生 物活性酶，(3)注射CCU大鼠，(4)注射CCU大鼠和注射蝮蛇生物活性酶(注 射CCU致肝損傷后，注射蝮蛇生物活性酶)。蝮蛇生物活性酶經(jīng)大鼠尾靜脈注 射于健康的和注射過CCU的大鼠，每日一次，劑量為1.5IU/kg，持續(xù)3周。4、體內(nèi)膽汁中的3H-牛磺膽酸鹽的回收將大鼠分成4組(1)健康大鼠，不注射CCU， (2)健康大鼠注射蝮蛇生 物活性酶，(3)注射CCU大鼠，(4)注射CCU大鼠和注射蝮蛇生物活性酶(注 射CCU致肝損傷后，注射蝮蛇生物活性酶)。將大鼠饑餓18-24小時，只供應(yīng) 水。靜脈注射麻醉藥氯胺酮(90mg/ml)和甲芐噻嗪(xylazine) (10mg/ml)麻醉， 剖腹，將聚乙烯導(dǎo)管插入膽管，從股靜脈注入造影劑(50ul生理鹽水中含 3士10dpm3H-?；撬猁})，連續(xù)收集膽汁，每隔10分鐘換一次接收管。從每個 接收管中取出100ul做閃爍計數(shù)測定。從注射的劑量，產(chǎn)生的膽汁量，膽汁樣 品中的3H-?；悄懰猁}的放射性計算3H-?；悄懰猁}的回收率。試驗結(jié)果正常大鼠注射蝮蛇生物活性酶后，其體內(nèi)的纖維蛋白原水平下降。下降的幅度與劑量相關(guān)。隨劑量增加而降低(從9.65+2.65mg/dl ， 0.1IU/kg至 2.30+0.30mg/dl， 2.5/kg)。其纖溶活性有利于治療動物的肝纖維化/肝硬化(圖 1)。正常大鼠注射蝮蛇生物活性酶后，其血漿中的血栓素水平下降，隨劑量增 加而降低(從4.11±52pg/0.1ml， 0.1/kg至2.30±0.30mg/dl， 2.5IU/kg)。意味著 有抗凝作用。(圖2)。肝的反射性細(xì)胞的活化被認(rèn)為為肝纖維化的主要原因。肝損傷與治愈是個 復(fù)合體，包括多種因素；細(xì)胞外基質(zhì)，發(fā)出細(xì)胞激動素，和特異的細(xì)胞成分。 肝損傷后的診斷圖像顯示膽汁流動發(fā)生變化。圖3所示注射蝮蛇生物活性酶對 大鼠的膽汁產(chǎn)量的影響。(如圖3所示健康大鼠的膽汁產(chǎn)量，p<0.05;注射 CC14和蝮蛇生物活性酶的大鼠的膽汁產(chǎn)量p < 0.01;注射CC14大鼠的膽汁產(chǎn)量， p< 0.001;健康大鼠與注射CCl4大鼠的膽汁產(chǎn)量對比p〈0.01;注射CCU和蝮 蛇生物活性酶的大鼠與注射CCl4大鼠的膽汁產(chǎn)量對比，p < 0.05;而注射CC14 和蝮蛇生物活性酶的大鼠的膽汁產(chǎn)量與健康大鼠的膽汁產(chǎn)量對比，沒有明顯差 異)。僅注射蝮蛇生物活性酶組的膽汁產(chǎn)量最高，而僅注射ccu的大鼠的膽汁 產(chǎn)量最低。膽鹽的吸收和分泌，如?；悄懰猁}，作為肝功能的重要指標(biāo)以其回收作為 肝功能的最好標(biāo)志。圖4所示注射蝮蛇生物活性酶對大鼠的?；悄懰猁}的回收 率的影響。各組進(jìn)行比較，僅注射蝮蛇生物活性酶大鼠的牛磺膽酸鹽回收率最 高，而僅注射CCU大鼠的牛磺膽酸鹽的回收率最低。總的來說，所有這些纖溶，抗凝，膽汁流動與改善肝的微循環(huán)，氧合作用， 膽汁循環(huán)有關(guān)?？梢哉J(rèn)為該蝮蛇生物活性酶可作為治療肝纖維化和肝硬化的有 效藥物。


圖1:健康大鼠注射蝮蛇生物活性酶7天后體內(nèi)的纖維蛋白原水平。圖2:健康大鼠注射蝮蛇生物活性酶2小時后血栓素水平。圖3:注射蝮蛇生物活性酶對大鼠的膽汁產(chǎn)量的影響。圖4:注射蝮蛇生物活性酶對大鼠的?；悄懰猁}的回收率的影響。具體實施方案
為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本 發(fā)明的內(nèi)容不限于下面的實施例。 實施例l
(1) 取蝮蛇毒干粉20g，用該蛇毒干粉5倍重量份的pH7.1的0.005mol/L Tris-HCl緩沖液溶解，經(jīng)8000轉(zhuǎn)高速離心30分鐘，取上清液用二乙氨乙基交 聯(lián)葡聚糖A-50型陰離子交換層析柱(DEAE-sephadex A-50)分離，先用含 O.Olmol/L氯化鈉的pH7.1的0.005mol/LTris-HCl緩沖液洗脫，再用含O.lmol/L 氯化鈉的pH7.1的0.005mol/LTris-HCl緩沖液洗脫，收集洗脫液，在2S0nm的 波長下對洗脫液進(jìn)行紫外分光光度計檢測，得到波長280nm吸收圖譜，收集各 吸收峰的洗脫液中能水解BAEE的部分，將收集液透析除鹽，凍干成粉；
(2) 將步驟(1)中獲得的凍干粉，用O.Olmol/L碳酸氫鈉洗脫液溶解， 經(jīng)8000轉(zhuǎn)高速離心30分鐘，取上清液用葡聚糖凝膠G-75型(Sephadex G-75) 凝膠柱分離，然后用0.01mol/L碳酸氫鈉洗脫液洗脫，收集洗脫液，在280nm 的波長下對洗脫液進(jìn)行紫外分光光度計檢測，得到波長280nm吸收圖譜，收集 各吸收峰的洗脫液中能水解BAEE的部分，將收集液透析除鹽，凍干成粉；
(3) 將步驟(2)中獲得的凍干粉，用pH5.0的0.01mol/L醋酸鈉緩沖液 溶解，經(jīng)8000轉(zhuǎn)高速離心30分鐘，取上清液用羧甲基-瓊脂糖凝膠C1-6B
(Cm-sepharoseCl-6B)陽離子交換層析柱分離，用氯化鈉直線梯度方式洗脫， 該氯化鈉溶液的濃度從Omol/L線性遞增至lmol/L，收集洗脫液，在280nm的 波長下對洗脫液進(jìn)行紫外分光光度計檢測，得到波長280nm吸收圖譜，得到多 個蛋白吸收峰，收集吸收峰中第II、 III、 W號活性吸收峰的洗脫液，將收集液 透析除鹽，凍干，即得到蝮蛇生物活性酶。
上述制備方法中透析除鹽的條件為透析袋孔徑為8000 10000道爾頓，將 收集液裝入透析袋，放入收集液20倍的蒸餾水中攪拌透析，4小時換一次蒸餾 水，透析18小時。
經(jīng)過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蝮蛇生物活性酶的分子量為2.5 3.5 萬，經(jīng)活性測定，具有治療肝纖維化活性，熱原、毒性、過敏檢查，均符合規(guī) 定。實施例2(1 )取蝮蛇毒干粉20g，用該蛇毒干粉3倍重量份的pH8.0的O.Olmol/L磷 酸鹽緩沖液溶解，經(jīng)10000轉(zhuǎn)高速離心30分鐘，取上清液用二乙氨乙基交聯(lián) 葡聚糖A-25型陰離子交換層析柱(DEAE-sephadex A-25)分離，先用含 0.05mol/L氯化鈉的pHS.O的O.Olmol/L磷酸鹽緩沖液洗脫，再用含O.lmol/L 氯化鈉的pH8.0的O.Olmol/L磷酸鹽緩沖液洗脫，收集洗脫液，在280nm的波 長下對洗脫液進(jìn)行紫外分光光度計檢測，得到波長280nm吸收圖譜，收集各吸 收峰的洗脫液中能水解BAEE的部分，將收集液透析除鹽，凍干成粉；(2) 將步驟(1)中獲得的凍干粉，用0.05mol/L碳酸氫鈉洗脫液溶解， 經(jīng)10000轉(zhuǎn)高速離心30分鐘，取上清液用葡聚糖凝膠G-100型(Sephadex G-100)凝膠柱分離，然后用0.05mol/L碳酸氫鈉洗脫液洗脫，收集洗脫液，在 2S0nm的波長下對洗脫液進(jìn)行紫外分光光度計檢測，得到波長280nm吸收圖 譜，收集各吸收峰的洗脫液中能水解BAEE的部分，將收集液透析除鹽，凍干 成粉；(3) 將步驟(2)中獲得的凍干粉，用pH6.0的0.03mol/L醋酸鈉緩沖液 溶解，經(jīng)10000轉(zhuǎn)高速離心30分鐘，取上清液用羧甲基-瓊脂糖凝膠C1-6B(Cm-sepharoseCl-6B)陽離子交換層析柱分離，用氯化鈉直線梯度方式洗脫， 該氯化鈉溶液的濃度從Omol/L線性遞增至lmol/L，收集洗脫液，在280nm的 波長下對洗脫液進(jìn)行紫外分光光度計檢測，得到波長280nm吸收圖譜，得到多 個蛋白吸收峰，收集吸收峰中第II、 III、 W號活性吸收峰的洗脫液，將收集液 透析除鹽，凍干，即得到蝮蛇生物活性酶。上述制備方法中透析除鹽的條件為透析袋孔徑為8000 10000道爾頓，將 收集液裝入透析袋，放入收集液50倍的蒸餾水中攪拌透析，8小時換一次蒸餾 水，透析24小時。經(jīng)過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蝮蛇生物活性酶的分子量為2.5 3.5 萬，經(jīng)活性測定，具有治療肝纖維化活性，熱原、毒性、過敏檢査，均符合規(guī) 定。實施例3(1)取蝮蛇毒干粉20g，用該蛇毒干粉1倍重量份的pH7.6的0.008mol/LTris-HCl緩沖液溶解，經(jīng)9000轉(zhuǎn)高速離心50分鐘，取上清液用二乙氨乙基交 聯(lián)葡聚糖A-50型陰離子交換層析柱(DEAE-sephadex A-50)分離，先用含 0.02mol/L氯化鈉的pH7.6的0.008mol/LTris-HCl緩沖液洗脫，再用含O.lmol/L 氯化鈉的pH7.6的0.008mol/LTris-HCl緩沖液洗脫，收集洗脫液，在280nm的 波長下對洗脫液進(jìn)行紫外分光光度計檢測，得到波長280nm吸收圖譜，收集各 吸收峰的洗脫液中能水解BAEE的部分，將收集液透析除鹽，凍干；
(2) 將步驟(1)中獲得的凍干粉，用0.03mol/L碳酸氫鈉洗脫液溶解， 經(jīng)9000轉(zhuǎn)高速離心50分鐘，取上清液用葡聚糖凝膠G-100型(Sephadex G-100) 凝膠柱分離，然后用0.03mol/L碳酸氫鈉洗脫液洗脫，收集洗脫液，在280nm 的波長下對洗脫液進(jìn)行紫外分光光度計檢測，得到波長280nm吸收圖譜，收集 各吸收峰的洗脫液中能水解BAEE的部分，將收集液透析除鹽，凍干；
(3) 將步驟(2)中獲得的凍干粉，用pH5.5的0.02mol/L醋酸鈉緩沖液 溶解，經(jīng)9000轉(zhuǎn)高速離心50分鐘，取上清液用羧甲基-瓊脂糖凝膠C1-6B
(Cm-sepharoseCl-6B)陽離子交換層析柱分離，用氯化鈉直線梯度方式洗脫， 該氯化鈉溶液的濃度從Omol/L線性遞增至lmol/L，收集洗脫液，在280nm的 波長下對洗脫液進(jìn)行紫外分光光度計檢測，得到波長280nm吸收圖譜，得到多 個蛋白吸收峰，收集吸收峰中第II、 III、 IV號活性吸收峰的洗脫液，將收集液 透析除鹽，凍干，即得到蝮蛇生物活性酶。
上述制備方法中透析除鹽的條件為透析袋孔徑為8000 10000道爾頓，將 收集液裝入透析袋，放入收集液30倍的蒸餾水中攪拌透析，6小時換一次蒸餾 水，透析32小時。
經(jīng)過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蝮蛇生物活性酶的分子量為2.5 3.5 萬，經(jīng)活性測定，具有治療肝纖維化活性，熱原、泰性、過敏檢查，均符合規(guī) 定。
權(quán)利要求
1、一種蝮蛇生物活性酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)取蝮蛇毒干粉，用該蛇毒干粉1～5倍重量份的pH7.1～8.0的0.005～0.01mol/L緩沖液溶解，經(jīng)8000～10000轉(zhuǎn)高速離心30～60分鐘，取上清液用陰離子交換層析柱分離，先用含0.01～0.05mol/L氯化鈉的pH7.1～8.0的0.005～0.01mol/L緩沖液洗脫，再用含0.1mol/L氯化鈉的pH7.1～8.0的0.005～0.01mol/L緩沖液洗脫，收集洗脫液，在280nm的波長下對洗脫液進(jìn)行紫外分光光度計檢測，得到波長280nm吸收圖譜，收集各吸收峰的洗脫液中能水解苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽的部分，將收集液透析除鹽，凍干成粉；(2)將步驟(1)中獲得的凍干粉，用0.01～0.05mol/L碳酸氫鈉洗脫液溶解，經(jīng)8000～10000轉(zhuǎn)高速離心30～60分鐘，取上清液用凝膠柱分離，然后用0.01～0.05mol/L碳酸氫鈉洗脫液洗脫，收集洗脫液，在280nm的波長下對洗脫液進(jìn)行紫外分光光度計檢測，得到波長280nm吸收圖譜，收集各吸收峰的洗脫液中能水解苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽的部分，將收集液透析除鹽，凍干成粉；(3)將步驟(2)中獲得的凍干粉，用pH5.0～6.0的0.01～0.03mol/L醋酸鈉緩沖液溶解，經(jīng)8000～10000轉(zhuǎn)高速離心30～60分鐘，取上清液用羧甲基-瓊脂糖凝膠Cl-6B陽離子交換柱分離，用氯化鈉直線梯度方式洗脫，該氯化鈉溶液的濃度從0mol/L線性遞增至1mol/L，收集洗脫液，在280nm的波長下對洗脫液進(jìn)行紫外分光光度計檢測，得到波長280nm吸收圖譜，收集活性吸收峰的洗脫液，透析除鹽，凍干成粉。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蝮蛇生物活性酶的制備方法，其特征在于步 驟(1)中所述的緩沖液為Tris-HCl緩沖液或磷酸鹽緩沖液。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蝮蛇生物活性酶的制備方法，其特征在于步 驟(1)中所述的陰離子交換層析柱為二乙氨乙基交聯(lián)葡聚糖A-50型或二乙氨 乙基交聯(lián)葡聚糖A-25型。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蝮蛇生物活性酶的制備方法，其特征在于步 驟(2)中所述的凝膠柱為葡聚糖凝膠G-75型或葡聚糖凝膠G-100型。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蝮蛇生物活性酶的制備方法，其特征在于所述制備方法中透析除鹽的條件為透析袋孔徑為8000 10000道爾頓，將收集液 裝入透析袋，放入收集液20 50倍體積的蒸餾水，攪拌透析，4 8小時換一 次蒸餾水，透析18 32小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蝮蛇生物活性酶的制備方法。該方法通過利用陰離子交換柱層析、凝膠過濾柱層析、陽離子交換柱層析等技術(shù)手段，從蝮蛇蛇毒中分離提取了具有治療肝纖維化疾病的生物活性酶。該方法工藝穩(wěn)定，制備的蝮蛇生物活性酶質(zhì)量易于控制，適于規(guī)?；a(chǎn)。
文檔編號A61K38/43GK101407792SQ200810182568
公開日2009年4月15日 申請日期2008年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月5日
發(fā)明者余冬林, 王旺新, 趙鳳和, 郭秀華 申請人:郭秀華