專利名稱：他克林短鏈二聚體在制備治療神經(jīng)退行性疾病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化合物新的醫(yī)藥用途，尤其涉及他克林短鏈二聚體在制備治療 神經(jīng)退4亍性疾病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
神經(jīng)退行性疾病包括老年癡呆癥(Alzheimer's disease, AD)，帕金森病 (Parkinson's disease, PD)和中風(fēng)(Stroke)等是當(dāng)今嚴(yán)重危害數(shù)以百萬計(jì)老年人的 生活質(zhì)量和壽命的重大疾病。隨著社會(huì)老齡化的來臨，問題變得越來越嚴(yán)重。 不幸的是目前對(duì)大多數(shù)神經(jīng)退行性疾病尚無有效的預(yù)防治療藥物。盡管神經(jīng)退 行性疾病的病理機(jī)制千差萬別，但是它們具有一個(gè)共同的特征功能性神經(jīng)元 進(jìn)行性丟失。程序性細(xì)胞死亡(即凋亡)在功能性神經(jīng)元進(jìn)行性丟失過程中發(fā) 揮重要作用。神經(jīng)元凋亡在一定時(shí)間內(nèi)是可逆的，因此，阻止神經(jīng)元凋亡的神 經(jīng)保護(hù)劑能夠有效控制神經(jīng)退行性疾病的病程。
他克林(tacrine )是第一個(gè)獲美國食品及藥物管理局批準(zhǔn)用于治療老年癡呆 癥的膽堿酯酶抑制劑，其結(jié)構(gòu)式如圖l所示，它對(duì)老年癡呆癥的療效肯定，但 因其有較強(qiáng)的肝毒性，尤其會(huì)引起轉(zhuǎn)氨酶水平升高，已近乎被臨床淘汰。根據(jù) 我們的研究，他克林的同二聚體可以通過降低劑量而減弱其毒性。另外，單純 膽堿酯酶抑制劑只能改善輕度癡呆而不能延緩神經(jīng)元退行性病變。越來越多的 研究表明二聚已有的藥物是一類行之有效地獲取高效、低毒、多靶點(diǎn)藥物的 手段。計(jì)算機(jī)模擬藥物對(duì)接系統(tǒng)可以幫助設(shè)計(jì)新型同源或異源二聚體。因此， 我們通過二聚化來獲得一些針對(duì)包括膽堿酯酶，N-曱基-D-天門冬氨酸 (N-methyl-D-aspartic acid, NMDA )受體和一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase, NOS)等多靶點(diǎn)的新型藥物。應(yīng)用自動(dòng)化的計(jì)算機(jī)對(duì)接系統(tǒng)，基于對(duì)膽堿酯酶 的雙位點(diǎn)作用原理，我們?cè)O(shè)計(jì)合成了一系列的二聚體型膽堿酯酶抑制劑，他克林二聚體具有針對(duì)乙酰膽石威酯酶(Acetylcholinesterase, AChE )更高的選擇性， 這一創(chuàng)新結(jié)果已申請(qǐng)美國專利(US005783584A )。
基于N-甲基-D-天門冬氨酸受體研發(fā)"病理啟動(dòng)性"神經(jīng)保護(hù)劑策略
雖然神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生及其發(fā)展的分子機(jī)制尚不明了 ，亦缺乏有效的 預(yù)防治療藥物，但是越來越多的證據(jù)表明谷氨酸受體，尤其是N-曱基-D-天門 冬氨酸型谷氨酸受體的過度激活在神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮重要作用。由于能量 代謝障礙，突觸釋放的谷氨酸無法得到及時(shí)有效清除，甚至引起異常的釋放， 加之能量障礙導(dǎo)致離子穩(wěn)態(tài)破壞，神經(jīng)元出現(xiàn)持續(xù)的去極化，神經(jīng)元的去極化 削弱了鎂離子(Mg2+)對(duì)N-甲基-D-天門冬氨酸受體的電壓依賴性抑制作用， 導(dǎo)致N-甲基-D-天門冬氨酸受體的過度激活。這種過度激活引起Ca"的大量?jī)?nèi) 流和細(xì)胞內(nèi)自由基的生成(包括一氧化氮和活性氧)，從而介導(dǎo)神經(jīng)元死亡。 過去很長(zhǎng)一段時(shí)間N-曱基-D-天門冬氨酸受體一直被視為神經(jīng)保護(hù)劑開發(fā)的藥 物靶標(biāo)，然而眾多N-曱基-D-天門冬氨酸受體的拮抗劑在臨床實(shí)驗(yàn)中被淘汰， 其臨床應(yīng)用受到極大限制。這主要是因?yàn)楣劝彼崾羌?xì)胞生命活動(dòng)中的重要生物 調(diào)節(jié)分子，N-曱基-D-天門冬氨酸受體作為神經(jīng)系統(tǒng)一個(gè)重要的谷氨酸神經(jīng)遞 質(zhì)受體也介導(dǎo)神經(jīng)元的生存、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、興奮性突觸傳遞和突觸可塑性 等重要生理功能。N-曱基-D-天門冬氨酸受體拮抗劑千擾了這些正常生理功能 必將引起一些嚴(yán)重的副作用，因此臨床耐受性好的，安全有效的N-曱基-D-天 門冬氨酸受體阻斷劑是人們尋找的焦點(diǎn)。
最近丄^tow等人提出了一個(gè)開發(fā)臨床耐受性好的，安全有效的神經(jīng)保護(hù)劑 的全新策略，這個(gè)策略的精髓在于這些藥物選擇性地作用于病理性啟動(dòng)的靶 標(biāo)，而不干擾正常的生理功能，被稱這一類化合物為PAT (Pathologically-activated therapy,病理性啟動(dòng)型治療)藥物。對(duì)于N-曱基-D-天門冬氨酸受體而言，病 理性啟動(dòng)型藥物主要包括一類反竟?fàn)幮缘?，具有快速?dòng)力學(xué)特征的N-曱基-D-天門冬氨酉臾受體的通道阻斷劑 (uncompetitive antagonist with fast-off rate, UFO)，這一類藥物有望達(dá)到上述效果。另外，其它一些老年癡呆癥的發(fā)病機(jī) 制假說也都直接或間接與谷氨酸誘導(dǎo)的興奮性毒性有關(guān)，這些假說包括淀粉樣蛋白毒性學(xué)說，膽堿能學(xué)說、tau蛋白病理學(xué)說、自由基損傷學(xué)說。因此，具 有快速動(dòng)力學(xué)和病理性啟動(dòng)特征的N-曱基-D-天門冬氨酸受體拮抗劑有望在神
經(jīng)退行性疾病的治療中取得突破性的進(jìn)展。
基于神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的靶標(biāo)研發(fā)"一藥多靶"神經(jīng)保護(hù)劑策略
近幾年，輕度年齡相關(guān)性疾病患者雖然得到了一定程度的藥物治療，但是 這些治療措施無力延緩患者的神經(jīng)元退行性變化，而且這些"一藥一靶位" (one-drug-one-target)的藥物的治療效果是非常有限的。這主要是因?yàn)樯窠?jīng)退 4亍性疾病都是一些多病因，多病理機(jī)制的疾病，他們需要多耙位元的干預(yù)措施 來針對(duì)多方面的病因病理。這種多靶標(biāo)的藥物策略已經(jīng)在傳統(tǒng)醫(yī)藥(中國和其 它國家)中存在幾千年了，例如目前用雞尾酒療法來控制艾滋病的擴(kuò)散。雖然 耳關(guān)合應(yīng)用多個(gè)針對(duì)不同耙位的藥物可以達(dá)到這種效果，但是具有多靶位的藥物 顯然可以避免多個(gè)單藥物聯(lián)合應(yīng)用所涉及到的生物利用度，藥代動(dòng)力學(xué)方面的 差異所造成的問題。"一藥多靶位"(one-drug-multiple-target)藥物在臨床的治 療學(xué)上更具有明顯優(yōu)勢(shì)，例如(l)療效更好，同時(shí)作用于多個(gè)靶位對(duì)抗疾 病的發(fā)生發(fā)展；(2)克服藥物聯(lián)用的缺陷，盡管多個(gè)藥物聯(lián)用或許可以產(chǎn)生 類似藥效，但不同藥物的生物利用度、藥物代謝動(dòng)力學(xué)等特性不盡相同，使得 實(shí)現(xiàn)聯(lián)用的目標(biāo)比較困難；(3)極大提高患者的順應(yīng)性，癡呆病人對(duì)醫(yī)囑的 順應(yīng)性是疾病治療中的關(guān)鍵問題之一，用藥單一顯然便利使用。越來越多的證 據(jù)顯示被美國食品及藥物管理局批準(zhǔn)的針對(duì)單靶標(biāo)治療老年癡呆癥的四個(gè)膽 堿酯酶抑制劑和N-甲基-D-天門冬氨酸受體的拮抗劑美金剛(memantine )或多 或少也具有"一藥雙靶，，或"一藥多耙，，的特性。因此，能同時(shí)針對(duì)包括(3-淀粉樣 蛋白、N-曱基-D-天門冬氨酸受體、tau蛋白、膽堿酯酶、金屬離子和活性氧等 多個(gè)輩巴點(diǎn)的單個(gè)藥物逐漸受到人們的重視。
而基于上述有關(guān)神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的靶標(biāo)研發(fā)"一藥多靶"神經(jīng)保護(hù)劑、 并應(yīng)用于制備治療神經(jīng)退行性疾病，包括老年癡呆癥(Alzheimer，s disease, AD)， 帕金森病(Parkinson's disease, PD)和中風(fēng)(Stroke)，尚未見有才艮道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供他克林短鏈二聚體的新的醫(yī)藥用途，即
他克林短鏈二聚體在制備治療神經(jīng)退行性疾病藥物中的應(yīng)用；特別是在制備治
療老年癡呆癥(Alzheimer,s disease, AD)、巾白金森病(Parkinson's disease, PD)和中
風(fēng)(Stroke)疾病藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述他克林短鏈二聚體類化合物為具有下述結(jié)構(gòu)的化合物及其可 藥用的鹽
其中，、 Rz是H或(d-C4)的烷基，n = 2， 3, 4。
特別優(yōu)選的例子為，所述他克林短鏈二聚體類化合物的結(jié)構(gòu)如下:
其中，n=2, 3, 4。
他克林(tacrine):化學(xué)名為四氫氨基丫啶，是弱堿性化合物，商品名為
Cognex 。他克林短《連二聚體包括雙(2 )他克林[bis(2)-tacrine ]、雙(3)
他克林[bis(3)-tacrine ]和雙(4)他克林[bis(4)-tacrine ]等三個(gè)弱堿性化合
物，與鹽酸成鹽后為白色粉末。
本發(fā)明所述神經(jīng)退行性疾病包括老年癡呆癥、中風(fēng)和帕金森氏病。 本發(fā)明所涉及的他克林短鏈二聚體類化合物及其可藥用的鹽可以作為原
料，添加藥學(xué)上可接受的輔料制成口服制劑或注射劑，比如，可加入適當(dāng)?shù)馁x
形劑制成片劑，也可以用其藥用鹽配制成7jC針劑或者凍干粉針劑。
6本發(fā)明以目前最新最權(quán)威的神經(jīng)退行性疾病的病理機(jī)制理論知識(shí)為基礎(chǔ)， 借鑒研發(fā)治療神經(jīng)退行性疾病藥物成功的經(jīng)驗(yàn)和失敗的教訓(xùn)，針對(duì)疾病的多病 因和病理過程的多環(huán)節(jié)為治療靶標(biāo)，多學(xué)科結(jié)合研制"單分子多耙位"具有病理 啟動(dòng)性特征的抗神經(jīng)退行性疾病的新型神經(jīng)保護(hù)性藥物。
本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能同時(shí)擁有"病理啟動(dòng)性"和"一藥多
靶"特點(diǎn)的新型二聚體藥物。為神經(jīng)退行性疾病的治療開拓新思路和新方法； 為神經(jīng)退行性疾病治療提供一類全新藥物。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的
他克林短鏈二聚體在制備治療神經(jīng)退行性疾病藥物中的應(yīng)用；特別是在制 備治療老年癡呆癥(Alzheimer，s disease, AD)、巾白金森病(Parkinson's disease, PD) 和中風(fēng)(Stroke)疾病藥物中的應(yīng)用。
神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)生及其發(fā)展的分子機(jī)制尚不明了 ，亦缺乏有效的 預(yù)防治療藥物，故現(xiàn)在的治療方法仍然以對(duì)癥為主。由于這些治療方法并沒有 從根本上消除神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的病因，因此不能阻止病程進(jìn)展，疾病仍然 會(huì)進(jìn)行性惡化。隨著人們對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病認(rèn)識(shí)的深入和對(duì)高素質(zhì)生活要 求的提高，對(duì)抗神經(jīng)元凋亡的藥物的需求大幅度增加?？沟蛲龅乃幬飳?duì)于保護(hù) 神經(jīng)元，防止神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)展和惡化，改善患者癥狀和提高生活質(zhì) 量，減輕社會(huì)負(fù)擔(dān)都具有重要意義。隨著世界及我國人口老齡化進(jìn)程加快，神 經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的患病群體越來越大。神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病已成社會(huì)和家庭 的沉重負(fù)擔(dān)，它不僅是一個(gè)重大的醫(yī)學(xué)問題，而且是一個(gè)社會(huì)問題。衰老不該 再是人類無奈的等待，關(guān)注神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，豈容片刻遲緩！日益增多的 研究結(jié)果表明"單分子多靶位"的病理啟動(dòng)性藥物是治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病 最有希望的發(fā)展方向，其理論和實(shí)踐也將有助進(jìn)一步理解神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病 的發(fā)病才幾理。因此，開發(fā)多靶標(biāo)治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病新藥具有迫切的醫(yī)療 需求，以及巨大的科學(xué)、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。
本發(fā)明為他克林短鏈二聚體在醫(yī)學(xué)上治療老年癡呆癥、中風(fēng)和帕金森氏病 方面提供了療效確切、副作用較低的用藥選擇。


圖1是本發(fā)明涉及的現(xiàn)有技術(shù)中他克林的結(jié)構(gòu)式。
圖2是本發(fā)明涉及的他克林短鏈二聚體類化合物的結(jié)構(gòu)式。
圖3是本發(fā)明其中一個(gè)實(shí)施例的他克林短鏈二聚體結(jié)構(gòu)式。
圖4顯示的是電腦分子對(duì)接的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的模式圖5顯示的是第二張電腦分子對(duì)接的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的模式示意圖6是75 的谷氨酸神經(jīng)毒性及保護(hù)的四唑藍(lán)(MTT )比色法的結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖，
圖7是不同濃度的谷氨酸神經(jīng)毒性及保護(hù)的四唑藍(lán)(MTT)比色法的結(jié)果統(tǒng)計(jì) 圖8是暫時(shí)性局部腦缺血(MCAO)腦片的氯化三苯四氮唑(TTC)染色結(jié)果； 圖9是上述圖8染色結(jié)果的統(tǒng)計(jì)圖-單腦片； 圖IO是圖8染色結(jié)果的統(tǒng)計(jì)圖-總?cè)毖獏^(qū)；
圖11表明他克林短鏈二聚體bis(3)-tacrine具有高效的體內(nèi)神經(jīng)保護(hù)作用。
圖12是NMDA誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)的海馬細(xì)胞的電流圖(B3T 0.3|iM 、 畫DA30jiM );
圖13是NMDA誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)的海馬細(xì)胞的電流圖14是受體配體竟?fàn)幮越Y(jié)合實(shí)驗(yàn)圖；表明短鏈二聚體bis(3)-tacrine在MK-801 位點(diǎn)阻斷NMDA受體。
圖15是高頻刺激誘導(dǎo)的海馬長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)圖；表明短鏈二聚體bis(3)-tacrine不 影響NMDA受體介導(dǎo)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP,生理性)效應(yīng)。
另外，在本發(fā)明說明書中，B3T是他克林短鏈二聚體bis(3)-tacrine的簡(jiǎn)稱。
具體實(shí)施例方式
下面通過結(jié)合附圖和實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明
8一、 本發(fā)明借助于分子對(duì)接技術(shù)設(shè)計(jì)和合成新型二聚體
我們?cè)谝焉暾?qǐng)的美國專利(US005783584A)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用ICM-Pro 3.4-8a 程序(Molsoft)研究蛋白質(zhì)-配體相互作用從而指導(dǎo)新型具有快速動(dòng)力學(xué)特征 反竟?fàn)幮缘腘-曱基-D-天門冬氨酸受體拮抗劑的合成。通過這種方法，我們根 據(jù)受體蛋白的結(jié)構(gòu)特征和藥物分子的結(jié)構(gòu)以及他們相互作用的特點(diǎn)研究藥物 的功能，從而篩選出具有開發(fā)前途的化合物。根據(jù)分子對(duì)接的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們 發(fā)現(xiàn)短鏈二聚體雙(3 )他克林對(duì)N-曱基-D-天門冬氨酸受體的結(jié)合力較MK-801 弱，如圖4及圖5所示，具體來說，圖4:ICM-Pro 3.4-8a程序(Molsoft )演示 雙(3 )他克林與N-甲基-D-天門冬氨酸受體的NR1和NR2B異二聚體的分子 對(duì)接結(jié)果；圖5演示:他克林短鏈二聚體與N-曱基-D-天門冬氨酸受體細(xì)胞外前 庭區(qū)的相互作用受體胞外區(qū)的M3和Ml殘基對(duì)二聚體的結(jié)合力影響較小， 也就是說，它們對(duì)二聚物與N-曱基-D-天門冬氨酸受體結(jié)合并不十分關(guān)鍵，表 明二聚體[如雙(3 )他克林]對(duì)N-曱基-D-天門冬氨酸受體的結(jié)合能力較MK-801 弱。
另外，雙(3)他克林與一氧化氮合酶的分子對(duì)接模擬分析表明其可以結(jié) 合于神經(jīng)型一氧化氮合酶或誘導(dǎo)型一氧化氮合酶活性區(qū)的精氨酸殘基。這些結(jié) 果表明他克林短鏈二聚體是一 個(gè)潛在多靶點(diǎn)的病理啟動(dòng)型藥物。
二、 他克林短鏈二聚體是"病理啟動(dòng)性"和"一藥多靶"融合型神經(jīng)保護(hù)劑
膽堿酯酶，谷氨酸和一氧化氮是細(xì)胞生命活動(dòng)中的重要生物調(diào)節(jié)分子，然 而，他們?cè)诶夏臧V呆癥的發(fā)病機(jī)理中也發(fā)揮重要的作用，比如過度表達(dá)的膽堿 酯酶及濃度異常升高的谷氨酸和一氧化氮能介導(dǎo)細(xì)胞毒性作用。因此抑制過度 激活的N-甲基-D-天門冬氨酸受體和 一 氧化氮合酶而不影響谷氨酸和 一 氧化氮 的正常生理功能就顯得尤為重要。我們期望新型二聚體可以通過中度親和力與 相應(yīng)的靶點(diǎn)作用，成為很有前景的病理啟動(dòng)型藥物。為了證實(shí)這一點(diǎn)，我們?cè)?不同的生理和病理?xiàng)l件下檢測(cè)這些二聚體對(duì)相應(yīng)靶點(diǎn)的作用。同時(shí)，大量的證 據(jù)顯示一藥多耙點(diǎn)的藥物具有優(yōu)于單個(gè)靼點(diǎn)藥物的特性，而且這樣的藥物很難通過有意設(shè)計(jì)而獲得，但可以通過多方篩選得到。利用分子對(duì)接模擬，我們可 以研究藥物和膽堿酯酶或N-曱基-D-天門冬氨酸受體的作用，從而設(shè)計(jì)合成一些 具有開發(fā)前景的病理啟動(dòng)型二聚體。首先，我們發(fā)現(xiàn)他克林短鏈二聚體具有高
效的體內(nèi)外神經(jīng)保護(hù)作用，如圖6、圖7和圖8、圖9、圖10、圖11所示；具 體來說，圖6表明大鼠小腦顆粒神經(jīng)元(cerebellar granule neurons, CGNs )用 不同濃度的雙(3 )他克林預(yù)處理兩個(gè)小時(shí)，然后暴露于75 (iM的谷氨酸，用四 唑藍(lán)(MTT)比色法于谷氨酸暴露的24小時(shí)檢測(cè)細(xì)胞存活率。檢測(cè)結(jié)果表明雙 (3)他克林濃度依賴性地對(duì)抗谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元毒性；圖7表明大鼠小腦 顆粒神經(jīng)元(CGNs )用3 |iM的雙(3 )他克林或3 的美金剛預(yù)處理兩個(gè)小 時(shí)，然后暴露于不同濃度的谷氨酸，用四唑藍(lán)(MTT)比色法于谷氨酸暴露的 24小時(shí)檢測(cè)細(xì)胞存活率；細(xì)胞的存活率表示為對(duì)照組(未處理組)的百分率(％ )。 檢測(cè)結(jié)果表明谷氨酸濃度越高雙(3)他克林的保護(hù)能力越強(qiáng)，明顯優(yōu)于美金 剛組。
其次，通過研究這些二聚體對(duì)膽堿酯酶和一氧化氮合酶的作用，我們發(fā)現(xiàn) 雙(3)他克林能夠中度抑制膽堿酯酶(IC5o: 0.25 |uM )和神經(jīng)元型一氧化氮 合酶(IC5。 43pM)。更有意思的是，膜片鉗和放射性配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 雙(3 )他克林能夠中度反竟?fàn)幮缘匾种芅-甲基-D-天門冬氨酸受體，如圖12、 圖13和圖14所示；同時(shí)，我們的結(jié)果顯示雙(3)他克林并不影響N-曱基-D-天門冬氨酸受體介導(dǎo)的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)現(xiàn)象，如圖15所示；表明該二聚體不會(huì)干 擾N-曱基-D-天門冬氨酸受體的正常生理功能，而且他對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元 死亡的保護(hù)作用隨著谷氨酸的濃度升高而增強(qiáng)，如圖7所示；表明他確實(shí)可以 對(duì)抗病理啟動(dòng)的N-曱基-D-天門冬氨酸受體。這些結(jié)果證明他克林短鏈二聚體 是一類具有病理啟動(dòng)型特性和多靶點(diǎn)的化合物。
他克林短鏈二聚體包括雙(2)他克林、雙(3)他克林和雙(4)他克 林等三個(gè)弱堿性化合物，與鹽酸成鹽后為白色粉末，其鹽酸鹽可溶于水(11.3 至13.7mg/ml)，性質(zhì)穩(wěn)定，粉末可室溫保存5年以上。根據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(有效劑量和藥代學(xué)特點(diǎn))，推算對(duì)治療老年癡呆癥
(Alzheimer，sdisease, AD)病人的劑量為5 mg/天，為方便使用，他克林短鏈二聚 體的鹽酸鹽與相應(yīng)的賦形劑可制成2.5和5mg的片劑，供口服用；推算對(duì)中風(fēng) (Stroke)劑量為10mg每次，為急救使用，他克林短鏈二聚體的鹽酸鹽可制成 5和10 mg的針劑，供靜脈或肌肉注射用。
根據(jù)已經(jīng)得到的資料表明在細(xì)胞水平，100 pM或以下濃度的他克林短 一隨二聚體對(duì)原代培養(yǎng)的神經(jīng)元無毒性作用。在動(dòng)物水平，20mg/kg或以下劑量 的他克林短鏈二聚體對(duì)鼠類無明顯的毒副作用。另外，現(xiàn)有研究資料證明二聚 他克林可以降低他克林原有的毒副作用。
他克林短鏈二聚體抗大腦中動(dòng)脈阻塞/再灌損傷分析(動(dòng)物實(shí)驗(yàn))。大腦中 動(dòng)脈阻塞/再灌的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立及他克林短鏈二聚體抗大鼠局灶性腦缺血 面積、腦水腫及行為功能障礙的分析按照實(shí)施例1進(jìn)行。
他克林短鏈二聚體抗谷氨酸誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)的神經(jīng)元凋亡(細(xì)胞實(shí)驗(yàn))。
谷氨酸過度激活N-甲基-D-天門冬氨酸受體介導(dǎo)興奮毒性在神經(jīng)退行性疾病的 病理進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。建立體外谷氨酸介導(dǎo)興奮毒性模型對(duì)研究神經(jīng)退行 性疾病的病理機(jī)制及篩選神經(jīng)保護(hù)性藥物有重要意義。谷氨酸介導(dǎo)興奮毒性模 型在原代培養(yǎng)的神經(jīng)元建立及他克林短鏈二聚體抗谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡 效應(yīng)及才幾制的分析按照實(shí)施例2進(jìn)行。
實(shí)施例1:
他克林短鏈二聚體對(duì)S D大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞缺血/再灌注損傷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 模型中局灶性腦缺血面積、腦水腫及行為功能障礙的保護(hù)性干預(yù)作用
線栓法阻塞大腦中動(dòng)脈模型是急性局灶性腦缺血/再灌注損傷的經(jīng)典模型， 能較合理地模擬頸部、顱內(nèi)大血管手術(shù)等圍術(shù)期急性局灶性腦缺血再灌損傷的 病理生理過程。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇及分組^:康雄性SD大鼠，體重280-320 g。隨 機(jī)分成4組假手術(shù)組(S組，11=10只)、生理鹽水組(NS組，n二10只)、他 克林短鏈二聚體處理組[Tl(0.1mg/Kg)和T2(0.3mg/Kg)組，每組iFlO只]。大鼠局灶性腦缺血/再灌注模型的制備，參照Longa等方法建立大腦中動(dòng)脈阻塞模 型[Neuroscience Lett. 439(2008): 160-164]。 10%水合氯醛(350 mg/kg )腹腔注 射麻醉后，沿大鼠的頸正中線切開，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈， 結(jié)扎并剪斷頸外動(dòng)脈主千以備用。動(dòng)脈夾暫時(shí)阻斷頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)心端、頸總動(dòng)月永 近心端，于近分叉處的頸外動(dòng)脈插入涂有硅膠的漁線(直徑約0.28 mm)，隨 后松開頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)心端動(dòng)脈夾，插入至1.8 - 2.0 mm遇有輕微阻力時(shí)停止。120 min后將漁線拔出，恢復(fù)大腦中動(dòng)脈灌注。扎緊切口、松開動(dòng)脈夾并縫合皮趺。 假手術(shù)組大鼠手術(shù)操作相同，漁線僅置入約1.0cm。術(shù)前術(shù)中全程激光多普勒 血流儀監(jiān)控；術(shù)后大鼠維持體溫在37.0士0.50C。
他克林短鏈二聚體減少大腦中動(dòng)脈阻塞引起的腦缺血體積和腦水腫1、 2，
3, 5—氯化三苯基四氮唑(TTC)是脂溶性光^:感復(fù)合物，1894年首次合成用來 檢測(cè)種子的生存能力，1958年開始用來染色檢測(cè)哺乳動(dòng)物組織的缺血梗塞。它 是呼吸鏈中吡咬一核苷結(jié)構(gòu)酶系統(tǒng)的質(zhì)子受體，與正常組織中的脫氳酶反應(yīng)而 呈紅色，而缺血組織內(nèi)脫氫酶活性下降，不能反應(yīng)，故不會(huì)產(chǎn)生變化呈蒼白。 2、耳又腦可麻醉后直4妻取腦或經(jīng)生理鹽水灌注后取腦。因?yàn)槟X組織未用多聚 曱醛固定，所以較軟，取腦時(shí)更應(yīng)仔細(xì)，保持大腦的完整性。3、 -20度水箱中 速凍20分鐘左右，便于切片。4、切片 一般切成7片，用專門的腦槽；每隔 2mm切一片。第一刀在腦前極與^L交叉連線中點(diǎn)處；第二刀在^見交叉部位； 第三刀在漏斗柄部位；第四刀在漏斗柄與后葉尾極的之間。5、將切片置于TTC 中，常規(guī)濃度為2%,也有用1%或更低濃度的。6、用錫箔紙蓋住后，放入37c 溫箱15~30min，不時(shí)翻動(dòng)腦片，使均勻接觸到染色液。7、染色后效果蒼 白區(qū)為皮層下梗死。8、掃描用圖像分析軟件來計(jì)算梗死體積和腦水腫等。 蒼白區(qū)為缺血損傷區(qū)，按公式V= (Si + S2+…+ Sn) xo.5計(jì)算缺血損傷體 積(式中V為缺血損傷體積，Si- Sn為各切片橢圓面積，0.5為常數(shù))。結(jié)果顯 示他克林短鏈二聚體雙(3)他克林可顯著減少大腦中動(dòng)脈阻塞引起的腦缺血 體積和腦水腫(圖4)。
他克林短鏈二聚體緩解大腦中動(dòng)脈阻塞的行為功能障礙大鼠腦缺血/再灌
12注損傷后出現(xiàn)神經(jīng)功能缺失癥狀和行為學(xué)改變，進(jìn)食顯著減少，體重明顯減輕，
活動(dòng)減少，反應(yīng)遲鈍。參照Longa等分級(jí)法于再灌注相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行神經(jīng)癥狀 評(píng)分。0:無癥狀；1:提尾時(shí)損傷對(duì)側(cè)前肢不能伸直；2:行走時(shí)向損傷對(duì)側(cè) 旋轉(zhuǎn)；3: 4亍走時(shí)向損傷對(duì)側(cè)傾倒；4:無自發(fā)活動(dòng)或死亡。腦缺血再灌注22 小時(shí)后，各組大鼠神經(jīng)癥狀缺失的評(píng)分假手術(shù)組(S組)，n=10只)為0土0.31; 生理鹽水組(NS組，n=10只)為2.3 ± 0.43;他克林短鏈二聚體處理組 [Tl(0.1mg/Kg),i^l0只]為1.6士0.31禾口 [T2(0.3mg/Kg, n=10只]為0.3士0.45。
實(shí)施例2:他克林短鏈二聚體抗谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡
小腦顆粒神經(jīng)元原代培養(yǎng)按本實(shí)驗(yàn)室發(fā)表文章方法進(jìn)行(JBC, 280(2005): 18179-88 )。取出生7 8天，體重約15 ~ 20 g的清潔級(jí)SD大鼠，無菌條件下 斷頭、開顱、取小腦，置于解剖液中去除腦膜和血管；吸去解剖液，將腦組織 置于切板上，然后用電動(dòng)切片機(jī)切成0.5 mm3大小的組織塊；將切碎的腦組織 置于解剖液中重懸后，1500 rpm離心3分鐘以去除雜質(zhì)；取沉淀，置于含有 0.25 mg/ml胰酶的解剖液中，置于37°C水浴15分鐘以消化細(xì)胞外結(jié)締組織， 每5分鐘搖勻以促消化均勻；加入含有胰酶抑制劑和DNA酶的解剖液，搖勻 后1500 rpm離心3分鐘以中止消化和除去細(xì)胞破碎釋放的DNA;加入5 ml解 剖液重懸沉淀，并分裝于兩個(gè)15 ml離心管中，每管用吸管吹打20次以將聚 集成團(tuán)的細(xì)胞吹散成單個(gè)細(xì)胞，然后每管加解剖液混勻并靜置，15分鐘后，組 織碎片和未被吹散的細(xì)胞團(tuán)沉淀，上清即為單個(gè)細(xì)胞懸液；靜置后取含有單個(gè) 細(xì)胞的上清，1500rpm離心3分鐘，沉淀即為細(xì)胞；用10ml完全培養(yǎng)基重懸 細(xì)胞沉淀，稀釋計(jì)數(shù)后，按1.5 - 1.8xl0Vml的密度^t妄種于經(jīng)多聚賴氨酸包被的 培養(yǎng)板中，置于5% C02及37 。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種后24小時(shí)加入12 pmol/L 阿糖胞苷以抑制膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，培養(yǎng)第5天加入5 mmol/L葡萄糖以 補(bǔ)充細(xì)胞代謝所需能量。7天后，神經(jīng)元分化成熟。此法培養(yǎng)的小腦顆粒神經(jīng) 元純度大于95 o/。。培養(yǎng)的第8日，以雙(3 )他克林，濃度在0.1到30 )iM]預(yù) 處理小腦顆粒神經(jīng)元兩個(gè)小時(shí)，然后分別與75 jiM谷氨酸共孵育24小時(shí)，或 以雙(3)他克林(3 pM)預(yù)處理小腦顆粒神經(jīng)元兩個(gè)小時(shí)，然后分別與谷氨
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酸(25到500 pM )共孵育24小時(shí)。用四唑藍(lán)比色法方法檢查細(xì)胞的生存率。 結(jié)果表明雙(3 )他克林劑量依賴性地阻止谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡，如圖6 所示。更重要地是雙(3)他克林對(duì)濃度越高的谷氨酸顯現(xiàn)更強(qiáng)的保護(hù)效應(yīng)， 如圖7所示。
下面對(duì)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果的主要圖形作進(jìn)一步解釋
如圖4、圖5所示，分子對(duì)接的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明二聚體雙(3)他克林對(duì)N-曱基-D-天門冬氨酸受體的結(jié)合力較MK-801 弱。
具體來說，圖4:ICM-Pro 3.4-8a程序(Molsoft )演示雙(3 )他克林與N陽 曱基-D-天門冬氨酸受體的NR1和NR2B異二聚體的分子對(duì)接結(jié)果；圖5演示 他克林短鏈二聚體與N-曱基-D-天門冬氨酸受體細(xì)胞外前庭區(qū)的相互作用受 體胞外區(qū)的M3和M1殘基對(duì)二聚體的結(jié)合力影響較小，也就是說，它們對(duì)二 聚物與N-曱基-D-天門冬氨酸受體結(jié)合并不十分關(guān)鍵，表明二聚體[如雙(3) 他克林]對(duì)N-曱基-D-天門冬氨酸受體的結(jié)合能力較MK-801弱。
圖6、圖7.短鏈二聚體的雙(3)他克林具有高效的體外神經(jīng)保護(hù)作用。
具體來說，圖6表明大鼠小腦顆粒神經(jīng)元(cerebellar granule neurons, CGNs ) 用不同濃度的雙(3)他克林預(yù)處理兩個(gè)小時(shí)，然后暴露于75iiM的谷氨酸，用 四哇藍(lán)(MTT)比色法于谷氨酸暴露的24小時(shí)檢測(cè)細(xì)胞存活率。檢測(cè)結(jié)果表明 雙(3)他克林濃度依賴性地對(duì)抗谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元毒性；圖7表明大鼠小 腦顆粒神經(jīng)元(CGNs )用3 )iM的雙(3 )他克林或3 |iM的美金剛預(yù)處理兩個(gè) 小時(shí)，然后暴露于不同濃度的谷氨酸，用四唑藍(lán)(MTT)比色法于谷氨酸暴露 的24小時(shí)檢測(cè)細(xì)胞存活率；細(xì)胞的存活率表示為對(duì)照組(未處理組)的百分率 (% )。檢測(cè)結(jié)果表明谷氨酸濃度越高雙(3)他克林的保護(hù)能力越強(qiáng)，明顯 優(yōu)于美金剛組。
圖8、圖9、圖10、圖11短鏈二聚體的雙(3)他克林具有高效的體內(nèi)神經(jīng) 保護(hù)作用。具體來"i兌，圖8演示暫時(shí)性局部腦缺血(middle cerebral artery occlusion, MCAO)腦片的氯化三苯四氮唑(TTC)染色結(jié)果左列是假手術(shù)組，中列是 溶劑對(duì)照組，右列是雙(3 )他克林(0.3 mg/kg)組，白色為中風(fēng)大鼠腦的缺血區(qū)， 圖中顯示藥物和生理鹽水在暫時(shí)性局部腦缺血后1 5分鐘處理中風(fēng)大鼠，24 小時(shí)評(píng)估缺血程度，與對(duì)照組對(duì)比，雙(3)他克林(0.3mg/kg)組的缺血區(qū)更小。 圖9演示在暫時(shí)性局部腦缺血后l 5分鐘處理中風(fēng)大鼠，2 4小時(shí)評(píng)估缺血 程度，生理鹽水組和雙(3 )他克林(0.3 mg/kg)組從前至后七塊腦的缺血體積的 統(tǒng)計(jì)結(jié)果。圖10:藥物[雙(3)他克林(0.1,0.3 mg/kg),美金剛(20mg/kg)] 和生理鹽水在暫時(shí)性局部腦缺血后1 5分鐘處理中風(fēng)大鼠，24小時(shí)評(píng)估缺血程 度，各組總?cè)毖獏^(qū)的缺血區(qū)體積統(tǒng)計(jì)結(jié)果，表明雙(3 )他克林組能夠顯著減 少缺血區(qū)。圖ll表明;藥物[雙(3)他克林(0.1,0.3mg/kg)，美金剛(20 mg/kg)] 和生理鹽水在暫時(shí)性局部腦缺血后1 5分鐘處理中風(fēng)大鼠，2 2小時(shí)評(píng)估中風(fēng) 大鼠的神經(jīng)行為功能，結(jié)果表明雙(3)他克林(0.3 mg/kg)比美金剛(20mg/kg) 更顯著改善暫時(shí)性局部腦缺血(MCAO )引起的行為障礙(* P<0.05， ** PO.01 與對(duì)照組比4交)。
圖12、圖13.短鏈二聚體的雙(3)他克林適度反竟?fàn)幮宰钄郚-曱基-D-天 門冬氨酸受體。
具體來說，圖12表明雙(3)他克林激動(dòng)劑(N-曱基-D-天門冬氨酸)依賴性 地阻斷N-曱基-D-天門冬氨酸受體。圖13表明雙(3)他克林電壓依賴性阻斷 N-曱基-D-天門冬氨酸受體，在細(xì)胞電壓從-70到+50mV之間時(shí)，電壓越低,雙 (3 )他克林阻斷N-曱基-D-天門冬氨酸受體的能力越強(qiáng)(即他克林適度反竟?fàn)幮?阻斷N-甲基-D-天門冬氨酸受體)。注:圖中電流的幅度是根據(jù)30 N-曱基-D-天門冬氨酸組(標(biāo)星號(hào)者)的電流標(biāo)準(zhǔn)化的結(jié)果。
圖14短鏈二聚體的雙(3 )他克林在MK-801位點(diǎn)阻斷N-甲基-D-天門冬氨
酸受體。
具體來說，圖14表明用小腦皮質(zhì)的膜蛋白與卩H]MK-801 (4nM)及逐漸增加濃度的雙(3 )他克林共同孵育30分鐘，檢測(cè)雙(3 )他克林對(duì)MK-801竟?fàn)?性與N-曱基-D-天門冬氨酸受體的結(jié)合能力。結(jié)果表明雙(3)他克林能竟?fàn)?性結(jié)合于N-曱基-D-天門冬氨酸受體的MK-801位點(diǎn)。雙(3 )他克林對(duì)MK-801 的竟?fàn)巺?shù)K,是利用公式IC5Q/(1 + [配體]/Ka)根據(jù)相應(yīng)的半數(shù)抑制量IC50, 而IC5o值是利用至少八個(gè)逐漸增加濃度的雙(3)他克林與卩H]MK-801 (4 nM) 的共同孵育30分鐘獲得(每個(gè)樣本重復(fù)三次)。
圖15短鏈二聚體的雙(3)他克林不影響N-曱基-D-天門冬氨酸受體介導(dǎo) 長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)。
大鼠海馬腦片制備和體外電生理技術(shù)4姿文獻(xiàn)[J Neuroscience 2004 , 24(13):3370-3378]進(jìn)行。圖15演示在海馬腦片，記錄200 Hz刺激后的對(duì)照 組和3pM雙(3 ) ^也克4木處理組的長(zhǎng)時(shí)禾呈增強(qiáng)(Long term potentiation, LTP, 生理性)效應(yīng)；60分鐘時(shí)，對(duì)照組和雙(3 )他克林組的LTP分別為149 士 8% 和152 ± 9%;結(jié)果表明雙(3 )他克林不影響200 Hz刺激后的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效 應(yīng)。
權(quán)利要求
1、他克林短鏈二聚體類化合物在制備治療神經(jīng)退行性疾病的藥物中的用途，所述他克林短鏈二聚體類化合物為具有下述結(jié)構(gòu)的化合物及其可藥用的鹽其中，R1、R2是H或(C1-C4)的烷基，n＝2，3，4。
2、按照權(quán)利要求1所述的用途，其特征是所述他克林短鏈二聚體類 化合物的結(jié)構(gòu)為<formula>formula see original document page 2</formula>其中，n=2， 3, 4。
3、按照權(quán)利要求1所述的用途，其特征是所述神經(jīng)退行性疾病包括 老年癡呆癥、中風(fēng)和帕金森氏病。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種他克林短鏈二聚體類化合物在制備治療神經(jīng)退行性疾病的藥物中的用途，具體地說，本發(fā)明涉及他克林短鏈二聚體在制備治療包括老年癡呆癥、中風(fēng)和帕金森氏病方面的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K31/4747GK101658522SQ20081014215
公開日2010年3月3日 申請(qǐng)日期2008年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月26日
發(fā)明者龐元平, 李文明, 羅加烈, 陳新滋, 韓怡凡 申請(qǐng)人:普爾藥物科技開發(fā)(深圳)有限公司