專利名稱：：噴霧流行性感冒疫苗組合物及其制備方法噴霧流行性感冒疫苗組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
-本發(fā)明涉及一種噴霧流行性感冒疫苗組合物的制備方法，屬于生物藥物制劑領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：流行性感冒簡稱流感(influenza)，主要是由甲(A)、乙(B)二型流感病毒分別引起的急性呼吸道傳染疾病。甲型流感病毒常以流行形式出現(xiàn)，引起世界性流感大流行，乙型流感病毒常常引起流感局部爆發(fā)，不引起世界性流感大流行。目前臨床上仍缺乏有效的藥物對流感患者進行治療，流感病毒疫苗是防止流感疾病發(fā)生和流行最有效的一種手段。流感病毒屬正粘病毒科(Orthomyxovindae)、流感病毒屬。典型的流感病毒顆粒為球型，直徑80120nm。流感病毒基因組是分多節(jié)段的單鏈、負鏈的RNA基因組，由相對分子質(zhì)量不等的8個節(jié)段組成，丙型7個。易發(fā)生基因重配。其中甲型流感病毒抗原經(jīng)常發(fā)生變異。其毒粒表面有血凝素(HA)蛋白、神經(jīng)氨酸酶(NA)和M2三種結(jié)構(gòu)蛋白，血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)這兩種蛋白的變化是流感病毒抗原發(fā)生抗原漂移的主要原因。如果抗原HA和NA中氨基酸序列出現(xiàn)一系列的點突變，使NA和HA抗原決定簇發(fā)生某些改變，可引起中、小型流行，稱抗原漂移；如果抗原變異幅度較大，形成一個新的亞型，稱抗原轉(zhuǎn)變，常常引起較大的流行，甚至引起世界流感大流行。核蛋白(NP)是可溶性蛋白，其抗原性穩(wěn)定。膜蛋白(MP)是毒粒的主要蛋白，也是特異性抗原，它們是流感病毒分型的主要依據(jù)，但它們的抗體不能中和流感病毒，所以沒有保護作用。由于流感病毒經(jīng)常發(fā)生變異，因此人的一生中要經(jīng)歷多次不同型、亞型和變種的病毒反復感染。流感病毒的變異產(chǎn)生了新的流行毒株，所以疫苗的毒株也必須改變，來應(yīng)對新的流行毒株。為此，WHO的專家委員會每年二月推薦在北半球的冬天(ll月下年4月)流感流行的病毒毒株，每年九月推薦在南半球的下一個冬天(5月10月)流感流行的病毒毒株。目前流感疫苗包括三個主要亞型A(H1N1)，A(H3N2)和B型。1937年雞胚培養(yǎng)流感病毒獲得成功，使大量生產(chǎn)流感疫苗成為可能。流感全病毒滅活疫苗于1941年在美國首次被批準使用，并證實有效。1945年在美國被廣泛使用，這種收獲的雞胚尿囊液經(jīng)紅細胞吸附和釋放有限的純化疫苗，屬早期粗制疫苗，接種人體后局部和全身的不良反應(yīng)都很強。上世紀60年代末，超速離心機和層析色譜技術(shù)的應(yīng)用，大大提高了病毒純化質(zhì)量，制成了全病毒滅活疫苗。它包含病毒所有蛋白、脂質(zhì)和核酸。該疫苗的制作方法是將911日受精雞胚尿囊腔接種流感病毒，培養(yǎng)、收獲、純化和滅活而得。此類疫苗免疫效果好，但兒童使用時出現(xiàn)了不良反應(yīng)。其主要原因之一是由于毒粒本身的細胞毒性造成的。1968年在美國首次被批準使用裂解純化流感疫苗。流感裂解疫苗含有血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)表面抗原和其他抗原。先提純病毒，后加入裂解劑，如乙醚、3-N-丁基磷酸鹽(tri-N-butylphosphate)、聚山梨酸酯80(polysorbate80)、脫氧膽酸鈉(deoxycholatesodium)、三硝基甲苯(Tritonx-100)等裂解劑。去除病毒的脂質(zhì)后制得，病毒的胞膜己被破壞，從而得到具有高度免疫原性的病毒蛋白混合物。雖然能夠獲得高度免疫原性的病毒蛋白混合物，但始終是注射劑型，注射接種免疫副反應(yīng)較重，不利于大范圍尤其是兒童、老人和體弱者接種，而鼻腔噴霧接種具有良好的耐受性，較低的副反應(yīng)，可以用于兒童、成人和老年人，而且使用方便，可以自行接種，可以大面積人群中應(yīng)用，是目前流感疫苗改進的方向。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種噴霧流行性感冒疫苗組合物及其制備方法。本發(fā)明提供一種流行性感冒疫苗組合物，該疫苗是噴霧劑型，所述的組合物含有流感病毒抗原以及藥物可接受的載體。所述載體選自干擾素、離子交換樹脂、人血白蛋白或磷酸鹽緩沖液。所述的干擾素是IFN-a、IFN-e或IFN-Y;離子交換樹脂是聚苯乙烯磺酸鈉，所述的磷酸鹽緩沖液是pH是7.0的磷酸鹽緩沖液。所述的流感病毒抗原為全病毒抗原、裂解病毒抗原或亞單位抗原。本發(fā)明優(yōu)選的配方組成如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>其余由PBS磷酸鹽緩沖液補足到100%(體積百分比)流感病毒抗原配成2.15mg/ml(l份)(純化)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>或其中所述聚苯乙烯磺酸鈉粒徑為2040Wn。本發(fā)明的制備方法包括以下步驟(1)獲取細胞(2)細胞制備(3)接種病毒(4)收獲病毒液(5)病毒液的滅活(6)澄清過濾、濃縮(7)純化(8)裂解再純化(9)過濾去除Tritonx-100(10)配制本發(fā)明使用的細胞為腎細胞，包括地鼠腎細胞和Vero細胞，優(yōu)選Vero細胞，首先建立Vero細胞工作庫，并對細胞庫進行全面檢定，合格后方可作為細胞庫。在制備流感疫苗之前，需先進行細胞的復蘇、培養(yǎng)和擴增，以達到生產(chǎn)批量的需要。各種用于制備疫苗的哺乳動物細胞均為附著依賴性細胞，細胞在一定的載體上生長，本工藝中細胞的培養(yǎng)方式為轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，細胞分種率根據(jù)生產(chǎn)批量的需要確定，當細胞長成致密單層后，即可接種流感病毒，各個型別分別接種，甲型46小時左右開始收獲，乙型70小時左右開始收獲，收獲的病毒液血凝效價可達1:256。收獲的病毒液用甲醛溶液滅活得到單型病毒收獲液。收獲液經(jīng)合并后為單價病毒合并液。單價病毒合并液體需要進行濃縮提純制備成疫苗制品，本工藝中選用工藝采用GE公司切向流過濾系統(tǒng)對病毒收獲液進行澄清，病毒濃縮應(yīng)用750KD分子量超濾柱超濾濃縮，使純化的病毒純度更高，提高了疫苗的有效性和降低了副反應(yīng)發(fā)生，S印harose6FF柱層析對流感濃縮液進行純化，裂解純化采用Tritonx-100對純化流感病毒進行裂解，去除Tritonx-100采用分子量為10000的過濾器，進行過濾去除裂解劑，經(jīng)過四步的澄清、濃縮、純化、裂解純化，疫苗總蛋白含量減少了約99%以上。本發(fā)明采用GE公司切向流過濾系統(tǒng)對病毒收獲液進行澄清，替代了常規(guī)離心法。優(yōu)點操作簡單，單位時間處理量是離心法的23倍，可達到澄清除菌雙重效果。由于收獲后立即除菌，可最大程度減少熱源質(zhì)。病毒濃縮應(yīng)用750KD分子量超濾柱，替代了目前國內(nèi)普遍使用的100KD和300KD超濾膜包。超濾同一批病毒收獲液工期可縮短12倍，并且得到的濃縮液去除了大部分雜蛋白，為純化提供了前期保證，延長了純化用凝膠壽命。使純化的病毒純度更高，提高了疫苗的有效性和降低了副反應(yīng)發(fā)生。我們用柱層析純化法代替梯度密度離心法純化法，更適合工業(yè)化大生產(chǎn)。采用Tritonx-100對純化流感病毒進行裂解，裂解效果要優(yōu)于去氧膽酸鈉。通過超濾法去除裂解劑，比以往梯度密度離心法去除裂解劑的方法具有操作簡單、成本降低、節(jié)約能源、質(zhì)量超過國內(nèi)同類產(chǎn)品等優(yōu)點。本工藝中配制噴霧流感疫苗通過加入聚苯乙烯磺酸鈉和流感抗原配制噴霧流感疫苗。另一種方法是干擾素、流感抗原、人血白蛋白、PBS磷酸鹽緩沖液后配制成噴霧流感疫苗。兩種的配制方法中各組分不同濃度是經(jīng)多次研究的最佳組合，是經(jīng)過篩選得到的，可以產(chǎn)生最佳的免疫效果。以下通過對比試驗證明本發(fā)明的效果免疫小鼠用本工藝制備的噴霧流感疫苗實施例1和實施例2滴鼻8只雌性成年BALB/c小鼠(68周)鼻孔，每孔50微升，陽性對照組肌肉注射100微升8只雌性成年BALB/c小鼠(68周)。實施例1和實施例2每只小鼠等量鼻腔免疫二次，間隔14天，對照組肌肉注射只免疫一次。陰性對照組采用PBS磷酸鹽緩沖液。取樣方法于眼眶采血、離心、分離血清，同組血清混合一起，4'C備用。HI法測定抗體效價在血凝板中，用25ri生理鹽水倍比稀釋待檢血清，加入等量的四個血凝單位的病毒，輕輕搖勻后置室溫60min，加入25l41ie/。的紅細胞懸液，再搖勻置室溫3060min后觀察結(jié)果。結(jié)果_不同毒株疫苗的抗體效價_ZT^HI抗體效價經(jīng)紅細胞凝集抑制試驗(HI)法檢測抗體，兩種配方的噴霧流感疫苗抗原性與陽性對照疫苗相似。制品對動物保護性研究將用實施例1和實施例2疫苗分別滴鼻免疫ll13g小白鼠，免疫21天后鼻腔攻擊甲1、甲3和乙型流感病毒，每個鼻孔感染10—'10—e病毒0.05ml。然后每天觀察，感染24小時內(nèi)死亡的為非特異性死亡，不于統(tǒng)計。觀察14天，同時設(shè)立對照，不接種疫苗，21天后直接攻毒。用Reed和Muench公式計算LD50,測定保護指數(shù)。將小白鼠分成4組，每批90只，對照組15只，雌雄各半。滴鼻免疫小白鼠，每只免疫50微升疫苗，觀察21天。攻擊流感病毒甲l、甲3和乙型，取1(Tl(T病毒稀釋度，每個稀釋度鼻腔感染5只小白鼠，小白鼠每個鼻孔感染流感病毒0.05ml,感染24小時內(nèi)死亡的為非特異性死亡，觀察14天，解剖取氣管，研磨直接做血凝試驗。用Reed和Muench公式計算LD50，測定保護指數(shù)。試驗結(jié)果表明疫苗對小白鼠具有保護作用，保護指數(shù)均在100以上。結(jié)果如<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>下噴霧流感疫苗對小白鼠保護情況<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>按照本工藝制備的噴霧流感疫苗滴鼻免疫小白鼠后，能夠有效的使機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，對病毒的侵害具有保護作用。按照本工藝進行制備噴霧流感疫苗，配方獨特，不用注射，無刺激性，質(zhì)量容易控制，產(chǎn)品穩(wěn)定，并且有好的耐受性，低的副反應(yīng)，可以用于兒童、成人和老年人，而且使用方便，可以自行接種，可以大面積人群中應(yīng)用。具體實施例方式實施例1、按照本工藝中的制備方法進行流感抗原制備，也可從市場上購買得到，取流感抗原后進行配制。取聚苯乙烯磺酸鈉，聚苯乙烯磺酸鈉是由國家食品藥品監(jiān)督管理局批準的藥品，配成水溶液，使其含量為0.5g/ml，取流感抗原配成水溶液，使其含量為2.15mg/ml，按照8:1進行進行混合，攪拌1小時制成混合水性懸濁液。將該懸濁液以每次0.6ml的量在人體鼻腔內(nèi)噴霧給藥。實施例2:應(yīng)用本工藝的制備方法制備流感抗原，也可從市場上購買得到，取制備好的流感抗原配制成600ml，加入干擾素1045單位幾、人血白蛋白25ml、其余為PBS磷酸鹽緩沖液混合后制成1000ml噴霧流感疫苗。權(quán)利要求1、一種噴霧流行性感冒疫苗組合物，其特征在于所述的組合物含有流感病毒抗原以及藥物可接受的載體。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其特征在于，所述載體選自干擾素、離子交換樹脂、人血白蛋白或磷酸鹽緩沖液。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗組合物，其特征在于，所述的干擾素是IFN-a、IFN-e或IFN-y;離子交換樹脂是聚苯乙烯磺酸鈉，所述的磷酸鹽緩沖液是pH是7.0的磷酸鹽緩沖液。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其特征在于，所述的流感病毒抗原為全病毒抗原、裂解病毒抗原或亞單位抗原。5、根據(jù)權(quán)利要求1-4任何一項所述的疫苗組合物，其特征在于，所述組合物配方為<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的疫苗組合物，其特征在于，所述聚苯乙烯磺酸鈉粒徑為2040Mm。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:(1)獲取細胞(2)細胞制備；(3)接種病毒(4)收獲病毒液(5)病毒液的滅活(6)澄清過濾、濃縮(7)純化(8)裂解再純化(9)配制。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，病毒液的滅活所用滅活劑為甲醛溶液或其他的滅活劑，純化方法為S印harose6FF或其他的純化方法，裂解劑為Tritonx-100或其他的裂解劑。9、根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述配制是將流感病毒抗原和藥物可接受的載體混合。10、根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，操作步驟如下取0.5g/ml聚苯乙烯磺酸鈉，聚苯乙烯磺酸鈉由國家食品藥品監(jiān)督管理局批準的藥品，取流感抗原2.15mg/ml，按照8:1進行進行混合，攪拌1小時制成混合水性懸濁液;或取制備好的流感抗原600ml加入干擾素10"單位/L、人血白蛋白25ml、其余為磷酸鹽緩沖液混合后制成1000ml噴霧流感疫苗。全文摘要本發(fā)明涉及一種噴霧流行性感冒疫苗組合物的制備方法，所述的組合物含有流感病毒抗原以及藥物可接受的載體，所述載體選自干擾素、離子交換樹脂、人血白蛋白或磷酸鹽緩沖液。文檔編號A61P31/00GK101274097SQ20081009805公開日2008年10月1日申請日期2008年5月23日優(yōu)先權(quán)日2008年5月23日發(fā)明者棟崔申請人:棟崔