專利名稱：治療認(rèn)知功能障礙的靶位的制作方法
本申請是以下申請的分案申請申請日2003年11月24日；申請?zhí)?00380109146.X(PCT/US2003/038191)；發(fā)明名稱同上。
1.對相關(guān)申請的交叉引用
本申請要求享有于2002年11月22日提交的美國申請序列號60/413,152的權(quán)益，其全文并入作為參考。
2.政府支持
本發(fā)明在政府支持下完成，獲得國家衰老研究所的基金第PO1AG09973號。政府擁有本發(fā)明的某些權(quán)利。
3.
背景技術(shù)：
由于對認(rèn)知功能障礙的認(rèn)識日漸增加，開發(fā)出靈敏的方法以檢測功能障礙并治療功能障礙的需求也日漸增加。存在許多病情，如癡呆(如，雷維小體癡呆、血管癡呆、阿耳茨海默氏癥以及與HIV相關(guān)的癡呆)、亨廷頓氏舞蹈病、帕金森氏癥、精神分裂癥、抑郁癥、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、輕度認(rèn)知功能障礙(MCI)以及與年齡有關(guān)的認(rèn)知衰退(ARCD)，靈敏地檢測出認(rèn)知功能障礙能使有這些病情的患者受益。
認(rèn)知功能障礙(如，雷維小體癡呆、血管癡呆、阿耳茨海默氏癥與HIV相關(guān)的癡呆、亨廷頓氏舞蹈病、帕金森氏癥、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、MCI和ARCD)涉及的大量病況的主要危險因素是衰老?；加羞@些病況的個體具有在整個病程中嚴(yán)重程度增加的認(rèn)知癥狀。在未患有這些病癥的情況下，衰老本身對于認(rèn)知的影響對于定義疾病和正常衰老的界線是至關(guān)重要的。同時，衰老對于認(rèn)知的影響可以與神經(jīng)退行性疾病、確定性易獲病性的病程、疾病的進(jìn)展速率或其他特性相互影響。
開發(fā)認(rèn)知功能障礙的檢測方法和療法的重要手段包括使用實驗室動物。以動物模型描述的認(rèn)知功能障礙可能擴(kuò)展到人的認(rèn)知功能障礙上。在與年齡相關(guān)的認(rèn)知功能障礙的上下文范圍中，以遠(yuǎn)系繁殖的年老的Long-Evans鼠(Charles River Laboratories；Gallagher M，等，Behav.Neurosci.107618-626；1993)的廣泛行為特征可鑒定自然發(fā)生的認(rèn)知功能障礙的形式。該認(rèn)知老化模型使用了在其一生中保持無病原狀態(tài)的動物。在所有衰老的鼠上進(jìn)行的生理機(jī)能和尸體解剖的測試被用于排除患有會干擾衰老疾病或病癥研究的病況的動物。該模型的重要特點是其反映出了老年人認(rèn)知衰退的變化現(xiàn)象。另外，該模型中的老年鼠的認(rèn)知衰退的個體差異可用行為評估的方式來觀察，該評估對中顳葉中相聯(lián)結(jié)構(gòu)的功能靈敏，該系統(tǒng)對人的表述性記憶至關(guān)重要。
該模型的另一個重要特點是其指導(dǎo)理解了造成與年齡相關(guān)的認(rèn)知功能障礙的基因多樣性。該對與年齡相關(guān)的認(rèn)知功能障礙的遺傳影響不可能是單基因的，即由單個基因中的缺失或突變造成的。單基因病很少見而且一般影響年輕人。因為它們的嚴(yán)重性，單基因病經(jīng)常造成不能達(dá)到平均期望壽命。在人中，大量常見且嚴(yán)重的病情影響成年人群，隨著實足年齡的增加而增加了頻率和嚴(yán)重程度，而且這不能夠歸因于單個基因(比如可參見，Hegele RA.Trends Endocrinol Metab.2003 8371-377；Shih DQ，等Curr Diab Rep.2002 2125-134；Barlassina C，等J Am Soc Nephrol.2002 Suppl 3S155-S164)。不斷增加的證據(jù)表明成熟期發(fā)病或與衰老相關(guān)的病情的遺傳組成反應(yīng)出了比由單基因病造成的絕對缺陷或極大功能增進(jìn)更微妙的多基因表達(dá)的改變。確定這些與年齡相關(guān)的病情的分子基礎(chǔ)的挑戰(zhàn)就是要鑒定基因的多樣性并確認(rèn)特定基因組中表達(dá)的相對小的改變是否真與遠(yuǎn)系繁殖的諸如人群的群體中的病情相關(guān)或?qū)е逻@些病情。所以，利用哺乳動物遠(yuǎn)系繁殖老化模型可幫助分析海馬中的多基因表達(dá)水平間的關(guān)系和在遠(yuǎn)系繁殖的年輕或老年個體中的學(xué)習(xí)能力。
用Morris水迷宮(MWM)進(jìn)行的行為評估中，在迷宮周圍的空間提示結(jié)構(gòu)的指導(dǎo)下，鼠學(xué)習(xí)并記下了逃跑平臺的位置。在探測試驗中，利用測定動物搜索逃跑平臺位置的空間偏好來測試進(jìn)行認(rèn)知的基礎(chǔ)。在研究群體中的老年鼠能毫無困難地游到可見的平臺上，但當(dāng)隱藏平臺時需要利用空間信息了，就可檢測年齡決定的功能障礙了。正如許多公開報道的那樣，遠(yuǎn)系繁殖的Long-Evans品種中的老年鼠的個體表現(xiàn)變化極大，那些鼠中的一部分表現(xiàn)得和年輕成體一樣，但大約40-50％的落后于年輕個體表現(xiàn)的范圍(Gallagher等Behav.Neurosci.107618-626，1993)。年老鼠中的這種可變性反映出可靠的個體差異。所以，在年老群體中，一些動物認(rèn)知功能有障礙了并被稱為年老功能障礙的(AI)。其他動物認(rèn)知功能沒有障礙，或年老功能無障礙的(AU)。
最初表征的幾周后利用MWM在新空間環(huán)境中進(jìn)行的再次評估中，AI動物一如既往的有障礙，而AU動物能再次熟練表現(xiàn)(Colombo等Proc.Natl.Acad.Sci.9414195-14199，1997)。在對AI和AU鼠認(rèn)知能力的MWM評估中的差異甚至在間隔3個月以上時仍是可靠的(Gallagher和Burwell，Neurobiol.Aging 10691-708，1989)。另外，MWM中的AI和AU特征能區(qū)分在其他行為任務(wù)中同樣年齡個體的表現(xiàn)，所述行為任務(wù)需要同樣的認(rèn)知功能，如Barnes圓形迷宮(Gallagher和Burwell Neurobiol.Aging 10691-708，1989)和放射狀臂形迷宮(RAM)。這種嚙齒動物年老群體中自然產(chǎn)生的功能障礙顯示認(rèn)知老化是不可避免的或嚴(yán)格與實足年齡相聯(lián)系，而且重要的是，它提供了機(jī)會用以比較造成衰退或持久記憶的大腦變化的軌跡。利用該模型的其他背景研究顯示認(rèn)知功能障礙的發(fā)生并不依賴于包括神經(jīng)元缺失或相關(guān)回路的廣泛退化的神經(jīng)退行(Rapp和Gallagher Proc.Natl.Acad.Sci.939926-9930，1996)。所以，該模型可能是比要測定神經(jīng)元缺失影響的準(zhǔn)備工作更靈敏的認(rèn)知老化測試方法。
除了可靠性之外，該模型所用的認(rèn)知評估已經(jīng)證明能對相關(guān)大腦系統(tǒng)的老化影響靈敏。在AU和AI鼠的神經(jīng)回路中顯示有顯著的生物學(xué)差異產(chǎn)生了，該回路對MWM中評估的認(rèn)知功能至關(guān)重要。例如，相對于AU并年輕的鼠，AI鼠中的海馬神經(jīng)元對某些化學(xué)遞質(zhì)具有減弱的應(yīng)答，如乙酰膽堿和谷氨酸(Nicolle等J.Neurosci.199604-9610，1999)。在谷氨酸受體亞型的解剖分布研究中，利用該模型可揭示出減少了紅藻氨酸鹽(kainate)結(jié)合在海馬的CA3區(qū)域，該區(qū)域僅限于年老無障礙的鼠中并與年輕和年老障礙的鼠有區(qū)別(Nicolle等Neuroscience 74741-756，1996)。存在有越來越多對認(rèn)知功能障礙生物和遺傳基礎(chǔ)理解的需求。
4.發(fā)明簡述 在一個方面，本發(fā)明描述了一種鑒別與諸如哺乳動物的個體所預(yù)期行為相關(guān)的基因的方法，其包括提供一個具有預(yù)期行為的測試個體的群體，提供一個缺少預(yù)期行為的對照個體的群體，各自分離并合并來自測試和對照群體的神經(jīng)組織如海馬的表達(dá)的RNA，在每個對照和測試RNA合并庫中測定大量基因的表達(dá)水平并從大量基因中選出一個基因，所述基因的表達(dá)水平在哺乳動物的測試群體和對照群體間有差異。選擇的基因是與預(yù)期行為相關(guān)的候選基因?？赏ㄟ^任何合適的方式來檢測大量基因的表達(dá)水平，如微陣列分析、原位雜交組化、定量PCR、SAGE分析、Northern印跡分析或點印跡分析，或通過合適的方法來測量蛋白質(zhì)水平，包括Western印跡、蛋白質(zhì)槽印跡或蛋白質(zhì)陣列。大量基因可包括涉及谷氨酸轉(zhuǎn)運的基因，如EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4和EAAT5，不同于谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4和EAAT5的基因或涉及神經(jīng)元間突觸間隙和/或突觸外空間中谷氨酸分解代謝的基因，如天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶。優(yōu)選地，從大量基因中選出的基因顯示出增加的表達(dá)水平?？蛇x地，選出的基因顯示出減少的表達(dá)水平。
在另一方面，本發(fā)明描述了一種鑒別與個體預(yù)期認(rèn)知功能相關(guān)的基因的方法，其包括提供一個具有預(yù)期認(rèn)知功能的哺乳動物測試群體，提供一個缺少預(yù)期認(rèn)知功能的哺乳動物對照群體，各自分離并合并來自測試和對照群體的神經(jīng)組織如海馬的表達(dá)的RNA，在每個對照和測試RNA合并庫中測定大量基因的表達(dá)水平并從大量基因中選出一個基因，所述基因的表達(dá)水平在哺乳動物的測試群體和對照群體間有差異。選擇的基因是與預(yù)期認(rèn)知功能相關(guān)的候選基因?？赏ㄟ^任何合適的方式來檢測大量基因的表達(dá)水平，如微陣列分析、原位雜交組化、定量PCR、SAGE分析、Northern印跡分析或點印跡分析，或通過合適的方法來測量蛋白質(zhì)水平，包括Western印跡、蛋白質(zhì)槽印跡或蛋白質(zhì)陣列。大量基因可包括涉及谷氨酸轉(zhuǎn)運的基因，如EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4和EAAT5，不同于谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4和EAAT5的基因或涉及神經(jīng)元間突觸間隙和/或突觸外空間中谷氨酸分解代謝的基因，如天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶。優(yōu)選地，從大量基因中選出的基因顯示出增加的表達(dá)水平?？蛇x地，選出的基因顯示出減少的表達(dá)水平。
本發(fā)明的另一個方面涉及一種篩選用于促進(jìn)認(rèn)知功能的化合物的方法，其包括向諸如哺乳動物的個體給藥測試化合物，在給藥所述測試化合物后測定所述個體的諸如海馬的神經(jīng)組織中的基因的表達(dá)水平，將所述基因的所述表達(dá)水平與個體神經(jīng)組織參考表達(dá)水平進(jìn)行比較，其中該個體沒有給藥所述測試化合物，并測定所述基因的表達(dá)水平是否與相應(yīng)參考表達(dá)水平有差異，其中所述差異顯示測試化合物為促進(jìn)認(rèn)知功能的候選治療劑。測試化合物可以是小分子，如但不限于式I，II或III所示的那些分子。其他方法可以包括將所述基因的表達(dá)水平與個體神經(jīng)組織參考表達(dá)水平進(jìn)行比較，其中向該個體給藥了頭孢曲松。可通過任何合適的方式來檢測基因的表達(dá)水平，如微陣列分析、原位雜交組化、定量PCR、SAGE分析、Northern印跡分析或點印跡分析，或通過合適的方法來測量蛋白質(zhì)水平，包括Western印跡、蛋白質(zhì)槽印跡或蛋白質(zhì)陣列。基因可以是涉及谷氨酸轉(zhuǎn)運的，如EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4和EAAT5，或可以是涉及神經(jīng)元間突觸間隙和/或突觸外空間中谷氨酸分解代謝的，如天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶。優(yōu)選地，從大量基因中選出的基因顯示出增加的表達(dá)水平?？蛇x地，選出的基因顯示出減少的表達(dá)水平。
本發(fā)明的另一個方面涉及一種篩選用于促進(jìn)認(rèn)知功能的化合物的方法，其包括向諸如哺乳動物的個體給藥測試化合物，在給藥所述測試化合物后測定所述個體的諸如海馬的神經(jīng)組織中的谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達(dá)水平，將所述基因的所述表達(dá)水平與個體神經(jīng)組織參考表達(dá)水平進(jìn)行比較，其中該個體沒有給藥所述測試化合物，并測定所述基因的表達(dá)水平是否與相應(yīng)參考表達(dá)水平有差異，其中所述差異顯示測試化合物為促進(jìn)認(rèn)知功能的候選治療劑。測試化合物可以是小分子，如但不限于式I，II或III所示的那些分子。可通過任何合適的方式來檢測基因的表達(dá)水平，如微陣列分析、原位雜交組化、定量PCR、SAGE分析、Northern印跡分析或點印跡分析，或通過合適的方法來測量蛋白質(zhì)水平，包括Western印跡、蛋白質(zhì)槽印跡或蛋白質(zhì)陣列。優(yōu)選地，從大量基因中選出的基因顯示出增加的表達(dá)水平。可選地，選出的基因顯示出減少的表達(dá)水平。
一種篩選用于促進(jìn)諸如哺乳動物的個體的認(rèn)知功能的化合物的方法，包括如下步驟將測試化合物與表達(dá)圖4所列基因的細(xì)胞接觸，如，谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白基因EAAT1、2、3、4或5，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶或垂體腺苷酸環(huán)化酶活化因子多肽(PACAP)，并測定所述基因的表達(dá)水平是否由于所述細(xì)胞接觸所述測試化合物而改變，如果存在所述改變則顯示所述化合物有能力促進(jìn)諸如哺乳動物的個體所需的認(rèn)知功能?；衔锟梢允切》肿?，如式I，II或III所示的那些分子。細(xì)胞可以來源于神經(jīng)組織，如培養(yǎng)的神經(jīng)元、培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)或初級神經(jīng)元培養(yǎng)基；或可以是永生化的細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞系、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系或星形細(xì)胞細(xì)胞系。優(yōu)選地，從大量基因中選出的基因顯示出增加的表達(dá)水平?？蛇x地，選出的基因顯示出減少的表達(dá)水平。
本發(fā)明上述每一個方面中所用的測試化合物可以是小分子，如任何第三代頭孢菌素(頭孢磺吡芐、頭孢氨噻、頭孢唑肟、頭孢曲松、頭孢哌酮、拉氧頭孢和頭孢他啶)、丙戊酸或MS-153。另外，測試化合物可以活化基因表達(dá)，包括選自EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4和EAAT5的谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白，或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因?？蛇x地，測試化合物可以是基因表達(dá)的抑制劑。
在另一方面，本發(fā)明描述了一種文庫，其包括大量編碼基因的cDNA序列，所述基因由于在哺乳動物中保持認(rèn)知功能而在哺乳動物神經(jīng)組織中差異表達(dá)。優(yōu)選地，文庫包括編碼基因的cDNA序列，所述基因由于用頭孢曲松、丙戊酸或MS-153對哺乳動物處理而在神經(jīng)組織中差異表達(dá)。文庫可以包括源于谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白基因的cDNA序列，如EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4和EAAT5，或源于天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的序列。文庫包含的cDNA至少有20％、50％或80％的序列源于谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白基因。
本發(fā)明的另一方面是一種包括微陣列芯片，其包括其上各個編址位置上附有cDNA序列的固相支持物，cDNA序列與上述cDNA文庫的成分相對應(yīng)，如那些在神經(jīng)組織中由于個體認(rèn)知功能的保持或由于用頭孢曲松或丙戊酸處理個體而造成差異表達(dá)的cDNA序列。微陣列芯片的成分包括選自EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4和EAAT5的谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶序列。
本發(fā)明也描述了一種藥物組合物，包括有效治療量的刺激化合物，所述化合物刺激圖4所列基因的神經(jīng)組織中的表達(dá)，所述基因是例如谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白基因EAAT1、2、3、4或5、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶或垂體腺苷酸環(huán)化酶活化因子多肽(PACAP)。藥物組合物還可以包含小分子。
在另一個方面，本發(fā)明描述了一種藥物組合物，包括有效治療量的式I、II或III化合物?？蛇x的，藥物組合物可包含除了頭孢曲松或丙戊酸的有效治療量的化合物，其由通過將化合物給藥給諸如哺乳動物的個體或細(xì)胞來篩選用于促進(jìn)認(rèn)知功能的化合物的方法來鑒定，并在暴露或不暴露于化合物的條件下，測定在那些個體或細(xì)胞間的差異化的基因表達(dá)。這些化合物是促進(jìn)認(rèn)知功能的候選化合物。
本發(fā)明的另一方面描述了一種在諸如人的哺乳動物中保持認(rèn)知功能或在諸如人的哺乳動物中治療認(rèn)知功能障礙的方法，該方法通過刺激涉及在神經(jīng)組織中谷氨酸運輸或谷氨酸分解代謝的神經(jīng)組織的基因表達(dá)來進(jìn)行。另外，在諸如人的哺乳動物中保持認(rèn)知功能需要包括給藥一種藥物組合物，其能刺激圖4所列基因的神經(jīng)組織表達(dá)，所述基因是例如谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白基因EAAT1、2、3、4或5，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶或垂體腺苷酸環(huán)化酶活化因子多肽(PACAP)。
本發(fā)明也描述了一種在諸如人的哺乳動物中保持認(rèn)知功能的方法，需要包括給藥一種藥物組合物，其為下式任意一種小分子I、II或III。對于在諸如人的哺乳動物中保持認(rèn)知功能的方法，需要包括給藥式I的化合物，則哺乳動物不出現(xiàn)作為抗生素治療適應(yīng)癥的傳染病的癥狀。
本發(fā)明也描述了在諸如人的哺乳動物中促進(jìn)認(rèn)知功能，需要包括向所述哺乳動物給藥一定量的藥物組合物，其刺激圖4所列基因的神經(jīng)組織的表達(dá)從而足以促進(jìn)以下認(rèn)知功能空間記憶的獲得，長期空間記憶或空間記憶恢復(fù)。本發(fā)明也描述了在年老的諸如人的哺乳動物中保持認(rèn)知功能或治療認(rèn)知功能障礙，并治療諸如人的哺乳動物中的有障礙的認(rèn)知功能，該方法需要通過向哺乳動物給藥有效治療量的頭孢曲松或其類似物或衍生物，丙戊酸或其類似物或衍生物或MS-153或其類似物或衍生物來進(jìn)行。在哺乳動物表現(xiàn)出有障礙的認(rèn)知功能的情況下，有障礙的認(rèn)知功能可以與以下病情相關(guān)輕度認(rèn)知功能障礙、與年齡相關(guān)的認(rèn)知衰退、記憶力衰退、衰老或癡呆。另外，在哺乳動物表現(xiàn)出有障礙的認(rèn)知功能的情況下，有障礙的認(rèn)知功能可能與阿耳茨海默癥有關(guān)。
基于以下詳細(xì)說明和權(quán)利要求書，本發(fā)明的其他特點和優(yōu)點將是顯而易見的。
5.簡要


圖1是描述了在MWM評估中年輕和年老的大鼠的行為特征的圖。
圖2是描述了10只年老的大鼠在初始MWM表征與它們在RAM中的記憶力表現(xiàn)之間的可靠性的圖。
圖3是概述了哺乳動物谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白及其人類同源體在各種腦組織中發(fā)現(xiàn)的不同細(xì)胞類型中的分布的圖表。
圖4是概述了在年輕(Y)、年老有障礙的(AI)和年老無障礙(AU)的動物中利用微陣列反映出的EAAT2/GLT1、EAAT1/GLAST和EAAT3/EEAC1 mRNA的表達(dá)情況的圖表。
圖5是概述了在年輕(Y)、年老有障礙的(AI)和年老無障礙(AU)的動物中利用原位組化反映出的EAAT2/GLT1、EAAT1/GLAST和EAAT3/EEAC1 mRNA的豐度的圖表。
圖6是描述了在用頭孢曲松治療(每天注射200mg/kg im，持續(xù)一周)的AI大鼠中減少的記憶錯誤的圖表。
6.發(fā)明詳細(xì)說明 為了方便起見，在說明書、實施例和所附的權(quán)利要求書中所使用的某些術(shù)語集中在此。除非另有定義，此處所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有如同本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所通常理解的相同意義。
6.1定義 此處所用的冠詞“一”和“這”指一個或多于一個(即，至少一個)的冠詞的語法用語。例如，一要素指一個要素或多于一個的要素。
此處所用的″年老″指哺乳動物處在或接近其平均生命跨度的終點。例如，年老大鼠約為24-30個月大的年齡。年老的人為70歲或以上。
術(shù)語″脂肪族″為公認(rèn)的表述，其指直鏈、支鏈、環(huán)狀烷烴、烯烴或炔烴。在一些具體實施方式
中，本發(fā)明的脂肪族基團(tuán)為直鏈或支鏈并具有1至約20個碳原子。
術(shù)語″烷基″為公認(rèn)的表述，其包括飽和的脂肪族基團(tuán)，包括直鏈烷基基團(tuán)，支鏈的烷基基團(tuán)、環(huán)烷基(脂環(huán)族)基團(tuán)、烷基取代的環(huán)烷基基團(tuán)和環(huán)烷基取代的烷基基團(tuán)。在一些具體實施方式
中，直鏈或支鏈烷基在其主鏈中具有約30個或更少的碳原子(如，C1-C30直鏈、C3-C30支鏈)，并可選地，約20個或更少。同樣，環(huán)烷基在其環(huán)狀結(jié)構(gòu)中具有約3至10個碳原子，并可選地在環(huán)狀結(jié)構(gòu)中有約5、6或7個碳。術(shù)語″烷基″也被定義可包括鹵代的烷基。
術(shù)語″胺″和″氨基″為公認(rèn)的表述，其指未取代和取代的胺，如以下通式所代表的部分
其中R50、R51和R52各自獨立地代表氫、烷基、鏈烯基、-(CH2)m-R61或R50和R51和N原子結(jié)合在一起形成在環(huán)結(jié)構(gòu)中具有4至8個原子的雜環(huán)；R61代表芳基、環(huán)烷基、環(huán)鏈烯基、雜環(huán)或多環(huán)；而且m等于零或為1-8整數(shù)。在一些具體實施方式
中，R50或R51中僅有一個是羰基，如，R50、R5和氮一起并不形成亞胺。在其它具體實施方式
中，R50和R51(并任選R52)各自獨立地代表氫、烷基、鏈烯基或-(CH2)m-R61。所以，術(shù)語″烷基胺″包括胺基，如上所定義，其上附有取代的或未取代的烷基，即R50和R51中至少一個是烷基。
術(shù)語″酰氨基″為公認(rèn)的表述，其指如以下通式所代表的部分
其中R50如上定義，而且R54代表氫、烷基、鏈烯基或-(CH2)m-R61，其中m和R61如上定義。
術(shù)語″氨基甲?；鍨楣J(rèn)的表示作氨基-取代的羰基，其包括如以下通式所代表的部分
其中R50和R51如上定義。本發(fā)明中某些氨基的具體實施方式
包括可能不穩(wěn)定的亞胺。
術(shù)語″烷硫基″指烷基基團(tuán)，如上定義，其具有附于其上的硫基。在一些具體實施方式
中，″烷硫基″部分代表-S-烷基、-S-鏈烯基、-S-炔基和-S-(CH2)m-R61中的一個，其中m和R61如上定義。有代表性的烷硫基基團(tuán)包括甲硫基、乙基基等等。
術(shù)語″芳烷基″為公認(rèn)的表述，其指用芳基基團(tuán)(如，芳香族或芳香雜環(huán)基團(tuán))取代的烷基。
術(shù)語″鏈烯基″和″炔基″為公認(rèn)的表述，其指不飽和的脂肪族基團(tuán)，在長度以及可能的取代方面與如上所述的烷基類似，但各自至少包含一個雙鍵或三鍵。
除非碳的數(shù)目另外指出，″低級烷基″指烷基，如上定義，只具有1至10個碳，可選地在其主鏈結(jié)構(gòu)中有1至約6個碳原子。同樣，″低級鏈烯基″和″低級炔基″具有相似的鏈長。
術(shù)語″烷氧基的″或″烷氧基″為公認(rèn)的表述，其指烷基，如上定義，其上附有氧基。有代表性的烷氧基基團(tuán)包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等等。″醚″為兩個碳?xì)浠衔锿ㄟ^氧共價連結(jié)形成的。因此，使烷基成為醚的烷基取代基是或類似于烷氧基，如可以用-O-烷基、-O-鏈烯基、-O-炔基、-O-(CH2)m-R61中之一來表示，其中m和R61如上所述。
此處所用的″類似物″指功能上與另一個化學(xué)物質(zhì)相似的化合物，但其并不共有完全一樣的化學(xué)結(jié)構(gòu)。例如。頭孢曲松類似物與頭孢曲松足夠相似，盡管與頭孢曲松的結(jié)構(gòu)有微小差異，但其能在治療應(yīng)用中替代頭孢曲松。
此處所用的術(shù)語″陣列″和″矩陣″指在設(shè)備上可編址的位置或“地址”的排列。位置可以排列成兩維陣列、三維陣列，或其他矩陣形式。位置的數(shù)量能從幾個直至至少數(shù)十萬。最重要的是，每個位置代表完全獨立的反應(yīng)位點。“核酸陣列”指包含核酸探針的陣列，如寡核苷酸或基因的較大部分。在陣列上的核酸可以是單鏈的1。探針為寡核苷酸的陣列被稱為″寡核苷酸陣列″或″寡核苷酸芯片”。″微陣列″，在此也被稱為“生物芯片”、“生物學(xué)芯片”或“基因陣列”，是一種具有密度至少約100/cm2離散區(qū)域的陣列，密度優(yōu)選地至少約1000/cm2。微陣列中的區(qū)域具有典型的尺寸，如直徑范圍在約10-250μm之間，并在陣列中與其他區(qū)域以約相同距離分隔。
此處所用的″天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶″指催化草酰乙酸和谷氨酸轉(zhuǎn)變成天冬氨酸和2-酮戊二酸的酶(E.C.2.6.1.1)，以及編碼具有天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性的氨基酸的核酸和同源物(如可參見，GenBank登錄號BC000498或XM_062678)。天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶涉及突觸間隙和突觸外空間中的谷氨酸催化。前述的同源物相信存在于其他哺乳動物中，包括靈長類、犬科、貓科和嚙齒動物。
此處所用的″β-抑制蛋白2″指細(xì)胞內(nèi)支架/適應(yīng)連接蛋白質(zhì)，其幫助從活化的G蛋白質(zhì)-偶聯(lián)受體處轉(zhuǎn)送額外的信號。另外，這些蛋白質(zhì)涉及穿膜受體內(nèi)吞的內(nèi)吞作用中。β-抑制蛋白2也指編碼抑制蛋白蛋白質(zhì)的核酸。前述的同源物相信存在于其他哺乳動物中，包括靈長類、犬科、貓科和嚙齒動物。
術(shù)語″碳環(huán)″為公認(rèn)的表述，其指芳香族或非芳香族的環(huán)，其中環(huán)上的每個原子都是碳。
術(shù)語″羰基″為公認(rèn)的表述，其包括如以下通式所代表的那些部分
其中X50為鍵或代表氧或硫，而R55和R56代表氫、烷基、鏈烯基、-(CH2)m-R61或藥學(xué)上可接受的鹽，R56代表氫、烷基、鏈烯基或-(CH2)m-R61，其中m和R61如上定義。當(dāng)X50為氧而R55或R5不為氫，則該分子式代表“酯”。當(dāng)X50為氧而R5如上定義，則該部 1CDNA陣列可以是雙鏈的。分在此被稱為羧基，并且尤其當(dāng)R55為氫時，則該分子式代表″羧酸″。當(dāng)X50為氧而R56為氫，則該分子式代表″甲酸″。一般而言，當(dāng)以上分子式的氧原子替換為硫，則該分子式代表″硫代羰基″基團(tuán)。當(dāng)X50為硫而R55或R56不為氫，則該分子式代表″硫代酯″。當(dāng)X50為硫而R55為氫，則該分子式代表″硫代羧酸″。當(dāng)X50為硫而R56為氫，則該分子式代表″硫代甲酸″。在另一方面，當(dāng)X50為鍵而R55不為氫，則以上分子式代表″酮″基。當(dāng)X50為鍵而R55為氫，則以上分子式代表″醛″基。
術(shù)語″手性″為公認(rèn)的表述，其指具有鏡像體不能重疊的性質(zhì)的分子，而術(shù)語″非手性″指鏡像體能重疊的分子?！逶中苑肿印逯冈谔囟ㄟ^程中有轉(zhuǎn)化成手性分子潛力的分子。
術(shù)語″順式″為公認(rèn)的表述，其指在一個雙鍵邊上的2個原子或基團(tuán)的排列方式，使得這些原子或基團(tuán)原子或基團(tuán)處在雙鍵的同一側(cè)。順式構(gòu)型通常標(biāo)示為(Z)構(gòu)型。
此處所用的″認(rèn)知功能″指較高層次的智力、大腦過程，其涉及學(xué)習(xí)和記憶，包括但不僅限于，注意力、掌握、短期記憶、長期記憶和記憶恢復(fù)、以及表達(dá)對周遭和自身的興趣。在動物模型系統(tǒng)中，可用現(xiàn)有大量方式測定認(rèn)知功能，包括利用以下設(shè)施Morris水迷宮、Barnes圓形迷宮、升高的輻射臂狀迷宮、T形迷宮或任何其他個體要運用空間信息的迷宮?，F(xiàn)有已知的其他測試可用于評估認(rèn)知功能，如恐懼狀態(tài)、積極躲避、明亮的開放區(qū)域、黑暗活躍度計量、升高的正型迷宮、雙室探險測試或強(qiáng)迫游泳測試。人類中，可以不受限制的測量認(rèn)知功能。測量通過阿耳茨海默癥評估級別-認(rèn)知亞級別(ADAS-cog)；臨床全球印象的變化級別(CIBIC-正級別)；阿耳茨海默癥協(xié)作研究運動的每日生活級別(ADCS-ADL)；迷你精神狀態(tài)檢測(MMSE)；神經(jīng)精神病學(xué)目錄(NPI)；臨床癡呆等級級別(CDR)；劍橋神經(jīng)心理自動測試組(CANTAB)或Sandoz臨床評估-老年病(SCAG)來進(jìn)行。另外，可以利用成像技術(shù)來測量認(rèn)知功能，如正電子發(fā)射斷層撮影法(PET)、功能性磁共振成像(fMRI)、單光子發(fā)射計算斷層撮影法(SPECT)或任何其他可測定大腦功能的成像技術(shù)。
″促進(jìn)″認(rèn)知功能指影響有障礙的認(rèn)知功能從而使之更類似于與年齡相符的正常、無障礙個體的功能，其包括影響認(rèn)知功能已減少的狀態(tài)，如，相對于正常個體減少約10％、30％、50％、75％、90％或95％?？蓪⒄J(rèn)知功能促進(jìn)到任何可檢測的程度，但優(yōu)選足以促進(jìn)到使有障礙的個體能進(jìn)行每日正常生活行為。
″保持″認(rèn)知功能指影響正常或有障礙的認(rèn)知功能從而使之不衰退或不降至個體首次表現(xiàn)或診斷觀察值以下。
″有障礙的認(rèn)知功能″指與年齡相符的正常個體所觀察到狀況相比，不如其強(qiáng)健的認(rèn)知功能，其包括認(rèn)知功能已減少的狀態(tài)，如，相對于年齡相符的正常個體測量到的認(rèn)知功能，減少約10％、30％、50％、75％、90％或95％。有障礙的認(rèn)知功能可能與許多疾病或病癥相關(guān)，包括癡呆(如，雷維小體癡呆、血管癡呆、阿耳茨海默氏癥以及與HIV相關(guān)的癡呆)、亨廷頓氏舞蹈病、帕金森氏癥、精神分裂癥、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、輕度認(rèn)知功能障礙(MCI)以及與年齡有關(guān)的認(rèn)知衰退(ARCD)?？蛇x地，有障礙的認(rèn)知功能可以在個體中顯現(xiàn)，但不作為可診斷的疾病或病癥出現(xiàn)。例如，有障礙的認(rèn)知功能可以由個體中的細(xì)微代謝、毒性、神經(jīng)毒、因治療而引起的、熱量或化學(xué)變化而造成的。這些細(xì)微改變包括但不僅限于，局部缺血、供氧不足、腦血管意外、外傷、外科手術(shù)、壓力、質(zhì)量效應(yīng)、出血、輻射、血管痙攣、神經(jīng)變性疾病或病癥。
此處所用的″對照群體″指缺少與認(rèn)知功能相關(guān)的預(yù)期行為的哺乳動物，其通常包括不年輕的哺乳動物。
術(shù)語″共價鍵″為公認(rèn)的表述，其指在2個原子間的鍵，其中電子靜電吸附于這2個原子的核上，而且在核間增加的電子密度的凈效應(yīng)等于核間排斥力。當(dāng)鍵與金屬離子連在一起時，術(shù)語共價鍵包括等同的鍵。
術(shù)語″組合文庫″或″文庫″為公認(rèn)的表述，其指大量被術(shù)語稱為“成分”的化合物，在文庫中它們從一種或多種起始原料通過運用相同或不同的反應(yīng)物或反應(yīng)條件合成或制備而來的。有大量其他術(shù)語(以及其他技術(shù))與組合文庫相關(guān)。術(shù)語″鑒定標(biāo)簽″為公認(rèn)的表述，其指記錄一系列用于合成化學(xué)文庫的反應(yīng)步驟的手段。術(shù)語″固定″為公認(rèn)的表述，并且當(dāng)用于種類物時，其指一種狀態(tài)及種類物的行為，其中種類物附著于有吸附力的表面上，該吸附力大于所用環(huán)境對表面所用的吸附力。術(shù)語″固相支持物″為公認(rèn)的表述，其指不能溶解的基質(zhì)材料，并可以(任選)具有堅硬的或半堅硬的表面。術(shù)語″接頭″為公認(rèn)的表述，其指連接支持物的分子的分子或基團(tuán)，包括固相支持物或聚合支持物，以及組合文庫的成分。術(shù)語″聚合支持物″為公認(rèn)的表述，其指可溶或不溶的聚合物，其中化學(xué)部分可通過反應(yīng)與聚合支持物的功能性基團(tuán)共價鍵合。術(shù)語″聚合支持物的功能性基團(tuán)″為公認(rèn)的表述，其指聚合支持物的化學(xué)部分，聚合支持物能與化學(xué)部分反應(yīng)形成聚合物支持的氨基酯。
此處所用的″衍生物″指化合物如，頭孢菌素或丙戊酸的化學(xué)修飾?；衔锏幕瘜W(xué)修飾可包括諸如，以烷基、酰基或氨基替代氫。也可能是其他許多修飾?；衔锏难苌锉３衷衔镏辽僖粋€功能性質(zhì)。
此處所用的″預(yù)期行為″指如正常、無障礙個體中所觀察到的認(rèn)知功能的行為表現(xiàn)。例如，動物中的預(yù)期行為反映了動物的認(rèn)知功能，可用以下設(shè)施測量，如Morris水迷宮、Barnes圓形迷宮、升高的輻射臂狀迷宮、T形迷宮；或通過許多測試之任一，如恐懼狀態(tài)、積極躲避、明亮的開放區(qū)域、黑暗活躍度計量、升高的正型迷宮、雙室探險測試或強(qiáng)迫游泳測試。在人類中，預(yù)期行為反映了個體的認(rèn)知功能，可用個體進(jìn)行每日正常生活行為的能力來測量或可以實施大量認(rèn)知功能測試來測量，包括但不僅限于，ADAS-cog、CIBIC-正級數(shù)、ADCS-ADL、MMSE、NPI、CDR、CANTAB或SCAG。
術(shù)語″雜原子″為公認(rèn)的表述，其指除了碳或氫之外的元素的原子。示例的雜原子包括硼、氮、氧、磷、硫和硒。
術(shù)語″芳基″為公認(rèn)的表述，其指5-、6-和7-元單環(huán)芳香族基團(tuán)，其可以包括零至4個雜原子，例如，苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、噠嗪和嘧啶等等。那些在環(huán)結(jié)構(gòu)中具有雜原子的芳基基團(tuán)也可被稱為″雜芳基”。芳環(huán)可以用如上所述的那些取代基在一個或多個環(huán)上的位置上進(jìn)行取代，例如，鹵素、疊氮化物、烷基、芳烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、羥基、烷氧基、氨基、硝基、巰基、亞氨基、氨基甲?；?、磷酸酯、亞磷酸酯、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷硫基、磺?；?、磺酰氨基、酮、醛、酯、雜環(huán)基、芳香族或雜芳化合物的部分、-CF3、-CN等等。術(shù)語″芳基″也包括具有2個或多個環(huán)的多核環(huán)系統(tǒng)，其中鄰接的環(huán)共同擁有2個或多個碳原子(環(huán)為“稠環(huán)”)，其中至少有一個環(huán)是芳香族的，如，其他環(huán)可以是環(huán)烷基、環(huán)鏈烯基、環(huán)炔基、芳基和/或雜環(huán)基。
術(shù)語鄰、間和對為公認(rèn)的表述，其分別指1，2-、1，3-和1，4-二取代的苯。例如，稱為1，2-二甲苯和鄰二甲苯的就是同義詞。
術(shù)語″雜環(huán)基″或″雜環(huán)基團(tuán)″為公認(rèn)的表述，其指3-至約10-元環(huán)結(jié)構(gòu)，可選地3-至約7-元環(huán)結(jié)構(gòu)，其環(huán)結(jié)構(gòu)包括1至4個雜原子。雜環(huán)也可以是多環(huán)。雜環(huán)基基團(tuán)包括諸如，噻吩、噻蒽、呋喃、吡喃、異苯并呋喃、色烯、氧雜蒽、苯氧雜蒽、吡咯、咪唑、吡唑、異噻唑、異噁唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、噠嗪、吲嗪、異吲哚、吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、異喹嗪、喹啉、酞嗪、萘啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、嘧啶、菲咯啉、吩嗪、吩砒嗪、吩噻嗪、呋咱、吩噁嗪、吡咯烷、氧雜環(huán)戊烷、硫雜環(huán)戊烷、噁唑、哌啶、哌嗪、嗎啉、內(nèi)酯、諸如氮雜環(huán)丁烷內(nèi)酰胺和吡咯烷內(nèi)酰胺的內(nèi)酰胺、磺內(nèi)酰胺、磺酸內(nèi)酯等等。雜環(huán)可以用如上所述的那些取代基在一個或多個位置上進(jìn)行取代，例如，鹵素、烷基、芳烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、羥基、氨基、硝基、巰基、亞氨基、氨基甲酰基、磷酸酯、亞磷酸酯、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷硫基、磺?；⑼?、醛、酯、雜環(huán)基、芳香族或雜芳化合物的部分、-CF3、-CN等等。
此處所用的″差異表達(dá)″指組織中感興趣的基因的有差別的表達(dá)水平，包括定量和定性的測定，所述組織有差別地處理或暴露于不同的環(huán)境因子中或改變生理環(huán)境。
此處所用的″基因″或″基因序列″指基因的部分或完整的編碼序列、其互補(bǔ)物及其5′或3′未翻譯區(qū)域。基因的″編碼序列″指出現(xiàn)在基因mRNA轉(zhuǎn)錄中的那套核苷酸。″基因表達(dá)″指制備或轉(zhuǎn)錄基于基因DNA序列的RNA的過程?；虮磉_(dá)的“活化劑”指刺激基因的DNA序列轉(zhuǎn)錄為RNA轉(zhuǎn)錄體的化合物?！鍍?nèi)源″基因為在物種中天然存在的基因，不需要人工整合，如隨機(jī)插入或轉(zhuǎn)染進(jìn)生物體或細(xì)胞的基因組中。
此處所用的″谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白″指穿膜蛋白質(zhì)，其能從細(xì)胞外空間中，包括突觸間隙和突觸外空間，去除L-谷氨酸，即哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的初級興奮神經(jīng)遞質(zhì)?？梢栽谏窠?jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的膜中發(fā)現(xiàn)谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白。在人類中已經(jīng)鑒定了幾種谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白，其包括諸如，溶質(zhì)載體蛋白家族1成員1(SLC1A1或EAAC1或EAAT3；例如GenBank登錄號NM_004170)、溶質(zhì)載體蛋白家族1成員2(SLC1A2或EAAT2或GLT1；例如登錄號NM-_0041710)、溶質(zhì)載體蛋白家族1成員3(SLC1A3或EAAT1、GLAST或GLAST1；例如登錄號NM_004172)、溶質(zhì)載體蛋白家族1成員6(SLC1A6或EAAT4；例如GenBank登錄號NM_005071)和溶質(zhì)載體蛋白家族1成員7(SLC1A7或EAAT5；例如GenBank登錄號NM_006671)。另外，在Rattus norvegicus和Mus musculus中已經(jīng)鑒定了谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白(Slc1a1/Eaac1/REAAC1、Slc1a2/GluT/GLT-1/GluT-R、Slc1a3/Eaat1/GLAST/GluT-1和Slc1a6/Eaat4)。上述同源物據(jù)信存在于其他哺乳動物中，包括靈長類、犬科、貓科和嚙齒動物。通過給藥能增加谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白的谷氨酸轉(zhuǎn)運活性的試劑，能增加谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白的活性。已報道的能增加谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白活性的試劑的例子包括諸如，((R)-(-)-5-甲基-1-煙酰基-2-吡唑啉(MS-153；Shimada等，EurJ Pharmacol.386263-70，1999)；利多卡因(Do等，AnesthAnalg.951263-8，2002)和激酶抑制劑(如，Conradt，J Neurochem.681244-51，1997)。
此處所用的基因″表達(dá)水平″指基因表達(dá)的水平，可通過任何用于檢測基因表達(dá)存在、極限量、定量、定性的測試方法來測定，如，通過測定mRNA水平(如，通過″Northern印跡″或″微陣列分析″)或蛋白質(zhì)(如，通過檢測全長或截短多肽基因產(chǎn)物的量(如，用抗體的免疫學(xué)方法))。
術(shù)語″內(nèi)消旋化合物″為公認(rèn)的表述，其指具有至少兩個手性中心但由于平面或點對稱而無手性的化合物。
此處所用的″促代謝谷氨酸受體″(mGluR)指G蛋白質(zhì)-偶聯(lián)的受體，其對神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸做出反應(yīng)?；谒鼈兊幕拘蛄邢嗨菩?、信號轉(zhuǎn)換聯(lián)系和藥理學(xué)圖譜，有3組mGluR。組I由mGluRl(mGluRla、mGluRlb、mGluRlc、mGluRld；如，GenBank登錄號NM_000838所示的人mGluRla剪切變體)和mGluR5(mGluR5a、mGluR5b；如，GenBank登錄號NM_000842所示的人mGluR5a剪切變體)組成，其確定與磷脂酶C偶聯(lián)。組II由mGluR2(如，GenBank登錄號NM_000839)和mGluR3(如，GenBank登錄號NM_000840)組成，其不與腺苷酸環(huán)化酶相聯(lián)。組II由mGluR4(mGluR4a、mGluR4b；如，GenBank登錄號NM_000841)，mGluR6(如GenBank登錄號NM_000843)，mGluR7(mGluR7a、mGluR7b；如，GenBank登錄號NM_000844所示的人mGluR7a剪切變體)和mGluR8(如，GenBank登錄號NM_000845)組成，其不與腺苷酸環(huán)化酶相聯(lián)。對于各個mGluR組，有大量可從商業(yè)渠道獲得激動劑和拮抗劑。例如，組I的激動劑包括但不限于L-使君子氨酸((L)-(+)-α-氨基-3，5-二氧代-1，2，4-噁二唑烷-2-丙酸)、(S)-3，5-二羥基苯基甘氨酸((S)-3，5-DHPG)、反式氮雜環(huán)丁烷-2，4-二甲酸(tADA)、(1S，3R)-1-氨基環(huán)戊烷-1，3-二甲酸((1S，3R)-ACPD)和(RS)-2-氯-5-羥基苯基甘氨酸(CHPG)；而拮抗劑包括但不限于(S)-4-羧基-3-羥基苯基甘氨酸((S)-4C3HPG)、7-(羥基亞氨基)環(huán)丙烯并[b]苯并吡喃-1a-甲酸乙酯(CPCCOEt)、(RS)-1氨基茚滿-1，5-二甲酸(AIDA；UPF523)、2-甲基-6-(苯基乙炔基)吡啶(MPE鹽酸鹽)、2-甲基-6-(2-苯基乙烯基)吡啶(SIB-1893)、6-甲基-2-(苯基偶氮)-3-吡啶酚(SIB-1757)和(S)-(+)-α-氨基-4-羧基-2-甲基苯乙酸(LY367385)。組II的激動劑包括(2S，2′R，3′R)-2-(2′，3′-二羧基環(huán)丙基)甘氨酸(DCGIV)、(2S，1′S，2′S)-2-(羧基環(huán)丙基)甘氨酸(L-CCG-I；(2S，3S，4S)-CCG)、(S)-3羧基-4-羥基苯基甘氨酸((S)-3C4HPG)和(2R，4R)-4-氨基吡咯烷-2，4-二甲酸((2R，4R)-APDC)；而拮抗劑包括(2S)-α-乙基谷氨酸(EGLU)和(2S)-2-氨基-2-[(1S，2S)-2-羧基環(huán)丙-1-基]-3-(黃嘌呤-9-基)丙酸(LY341495)。組III的激動劑包括(1S，3R，4S)-1-氨基環(huán)戊烷-1，2，4-三甲酸(ACPT-I)、L(+)-2-氨基-4-膦?；∷?L-AP4)、(R，S)-4-膦酰基苯基甘氨酸((R，S)-PPG)和O-磷酸-L-絲氨酸(L-SOP)；而拮抗劑包括(RS)-α-環(huán)丙基-4-膦?；交拾彼?CPPG)、(S)-2-氨基-2-甲基-4-膦?；∷?MAP4)和(RS)-α-甲基絲氨酸-O-磷酸酯(MSOP)。近來的證據(jù)表明與神經(jīng)膠質(zhì)相關(guān)的促代謝谷氨酸受體能改變谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)(Aronica等，Eur.J.Neurosci.2003；172106-18，2003)。
此處所用的″中年″指已經(jīng)過了性成熟期的哺乳動物，即，不年輕但也不接近物種的平均壽命跨度，即，不年老。例如，中年鼠約12-18個月大。中年的人在20至70歲之間。
此處所用的″神經(jīng)組織″指神經(jīng)系統(tǒng)的組織，即包含神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)的組織。特別指明，神經(jīng)組織可以指特定在大腦中發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)，包括“海馬組織”。海馬組織指在顳皮層發(fā)現(xiàn)的海馬狀結(jié)構(gòu)，包括內(nèi)鼻層、前下托、腦下腳、原腦下腳、齒狀回、以及已知為CA1、CA2、CA3和CA4的區(qū)域。海馬涉及的過程如短期記憶、長期記憶的形成、記憶恢復(fù)、表述性記憶和空間導(dǎo)航。
此處所用的″神經(jīng)保護(hù)″指組合物和治療方法，其具有減少、阻止或改善有障礙的認(rèn)知功能的作用，并保護(hù)、恢復(fù)或回復(fù)遭受有障礙的認(rèn)知功能的組織。
術(shù)語″硝基″為公認(rèn)的表述，其指-NO2；術(shù)語″鹵素″為公認(rèn)的表述，其指-F、-Cl、-Br或-I；術(shù)語″巰基″為公認(rèn)的表述，其指-SH；術(shù)語″羥基″指-OH；而術(shù)語″磺?；鍨楣J(rèn)的表述，其指-SO2-?！妍u化物″指具有相應(yīng)的鹵素陰離子，而“類鹵化物”按照Cotton和Wilkinson的《高級無機(jī)化學(xué)》第560頁中的定義。
術(shù)語″磷?；鍨楣J(rèn)的表述，其一般可以由以下通式表示
其中Q50表示S或O，而R59表示氫，低級烷基或芳基。當(dāng)用于取代時，如烷基，則磷酰烷基的磷?；鶊F(tuán)一般可以由以下通式表示
其中Q50和R59各自獨立地如上所定義，而Q51代表O、S或N。當(dāng)Q50為S時，磷?；糠譃椤辶虼姿狨ァ?。
術(shù)語″磷酰胺酸酯″為公認(rèn)的表述，其可以由以下通式表示
其中Q51、R50、R51和R59如上定義。
術(shù)語″膦胺酸酯″為公認(rèn)的表述，其可以由以下通式表示
其中Q51、R50、R51和R59如上定義，而R60代表低級烷基或芳基。
可以向鏈烯基和炔基進(jìn)行類似的取代從而產(chǎn)生諸如，氨基鏈烯基、氨基炔基、氨基甲?；溝┗被柞；不?、亞氨基鏈烯基、亞氨基炔基、鏈烯硫基、炔硫基、羰基-取代的鏈烯基或炔基。每個表述的定義，如，烷基、m、n等等，在任何結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)多于一次時，其意指在同一結(jié)構(gòu)中各處進(jìn)行獨立的定義。
術(shù)語″硒代烷基″為公認(rèn)的表述，其指其上附帶有取代的硒基基團(tuán)的烷基。示例的″硒醚″可以在烷基進(jìn)行取代，選自-Se-烷基、-Se-鏈烯基、-Se-炔基和-Se-(CH2)m-R61，m和R61如上定義。
術(shù)語三氟甲烷磺酰基、甲苯磺酰基、甲磺酰基和九氟丁烷磺?；鶠楣J(rèn)的表述，其分別指三氟甲烷磺酰基、對甲苯磺?；⒓谆酋；途欧⊥榛酋；鶊F(tuán)。術(shù)語三氟甲烷磺酸酯、甲苯磺酸酯、甲磺酸酯和九氟丁烷磺酸酯為公認(rèn)的表述，其分別指三氟甲烷磺酸酯、對甲苯磺酸酯、甲磺酸酯和九氟丁烷磺酸酯的功能基團(tuán)及包含所述基團(tuán)的分子。
縮寫Me、Et、Ph、Tf、Nf、Ts和Ms分別代表甲基、乙基、苯基、三氟甲烷磺?；酋；?、九氟丁烷磺?；?、對甲苯磺?；图谆酋；１绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員所用的有機(jī)化學(xué)縮寫的更全面的列表參見Journal of Organic Chemistry每一卷的第一期；該列表一般出現(xiàn)在稱為標(biāo)準(zhǔn)縮寫列表的表格中。
此處所用的″垂體腺苷酸環(huán)化酶活化因子多肽″(PACAP)指神經(jīng)多肽，其為cAMP-依賴性信號途徑的有效的活化因子。PACAP起多功能肽的作用并涉及多種過程，如調(diào)節(jié)激素分泌、能量代謝、神經(jīng)元存活，而且它是神經(jīng)膠質(zhì)谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白EAAT1和EAAT2的調(diào)節(jié)因子(Figiel和Engele，J.Neurosci.153596-3605，2000)。PACAP屬于選凝素/胰高血糖素/血管活性腸肽(VIP)超家族，并存在源于相同前體的兩種酰胺化形式，即PACAP38(38-氨基酸殘基)和PACAP27(27-氨基酸殘基)。PACAP的主要結(jié)構(gòu)在被囊動物、魚類、兩棲類和哺乳動物的整個進(jìn)化中高度保守，而且在果蠅中也測定出了PACAP-樣神經(jīng)肽。除了PACAP-38和PACAP-27，PACAP受體的第三類激動劑為Maxadilian。Maxadilan是有效的血管擴(kuò)張肽，其從吸血沙地蠅的唾液腺提取物中分離而得。近來已證實，盡管maxadilan同PACAP沒有明顯的氨基酸序列同源性，但在哺乳動物中，maxadilan與PACAP受體1型結(jié)合(Moro和LernerMaxadilan，J.Biol.Chem.272(2)966-70，1997)。PACAP及其受體主要都分布在神經(jīng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)中，顯示出高效的多效性功能。所以，激發(fā)PACAP受體的PACAP肽、Maxadilan或肽衍生物和類似物、肽-樣化合物和小分子激動劑能用于增加谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白的活性。
術(shù)語″多環(huán)″或″多環(huán)基團(tuán)″為公認(rèn)的表述，其指2個或多個環(huán)(如，環(huán)烷基、環(huán)鏈烯基、環(huán)炔基、芳基和/或雜環(huán)基)，其中2個鄰接的環(huán)共同擁有2個或多個碳，如，環(huán)是″稠環(huán)″。通過非鄰接的原子連接的環(huán)術(shù)語稱作“橋”環(huán)。多環(huán)的每個環(huán)可用如上所述的那些取代基來取代，例如，鹵素、烷基、芳烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、羥基、氨基、硝基、巰基、亞氨基、氨基甲酰基、磷酸酯、亞磷酸酯、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷硫基、磺?；?、酮、醛、酯、雜環(huán)基、芳香族或雜芳化合物部分、-CF3、-CN等等。
此處所用的″大量″指2或更多。
術(shù)語″前藥″為公認(rèn)的表述，其意為包含在生理條件下能轉(zhuǎn)化為本發(fā)明抗菌劑的化合物。制備前藥的普通方法是選擇在生理條件下能水解成預(yù)期化合物的部分。在其它具體實施方式
中，通過宿主動物的酶活性來轉(zhuǎn)化前藥。
術(shù)語″保護(hù)基團(tuán)″為公認(rèn)的表述，其指臨時保護(hù)潛在反應(yīng)功能基團(tuán)不發(fā)生不要的化學(xué)轉(zhuǎn)化的取代基。這些保護(hù)基團(tuán)的實例分別包括羧酸酯、醇的甲硅烷基醚及醛和酮的乙縮醛和縮酮?；瘜W(xué)保護(hù)基團(tuán)領(lǐng)域可參見Greene和Wuts的Protective Groups in Organic Synthesis(第2版，Wiley紐約，1991)的綜述。
術(shù)語″羥基-保護(hù)基團(tuán)″為公認(rèn)的表述，其指那些要保護(hù)在合成過程中羥基基團(tuán)不發(fā)生不要的反應(yīng)的基團(tuán)，其包括諸如，現(xiàn)有技術(shù)中已知的芐基或其他合適的酯或醚基團(tuán)。
術(shù)語″羧基-保護(hù)基團(tuán)″為公認(rèn)的表述，其指那些要保護(hù)在合成過程中羧酸基團(tuán)不發(fā)生不要的反應(yīng)的基團(tuán)，如氨基酸或肽的C末端或酸性或羥基吖庚因環(huán)的取代基。羧基保護(hù)基團(tuán)的實例包括諸如，芐基酯、環(huán)已基酯、4-硝基芐基酯、叔丁基酯、4-吡啶甲基酯等等。
術(shù)語″氨基-保護(hù)基團(tuán)″為公認(rèn)的表述，其指保護(hù)氨基基團(tuán)不參與與一些其他功能基團(tuán)發(fā)生的反應(yīng)的基團(tuán)，但其能在需要時從胺上去除。這些基團(tuán)如上述Greene和Wuts著作的第7章和Barton的ProtectiveGroups in Organic Chemistry的第2章(McOmie編輯，Plenum Press，紐約，1973)中所述的。合適基團(tuán)的例子包括?；Ｗo(hù)基團(tuán)，例如，甲?；?、丹?；⒁阴；?、苯甲酰基、三氟乙?；㈢牾；⒓籽趸牾；?、芐基和取代的芐基，如3，4-二甲氧基芐基、鄰硝基芐基和三苯基甲基；那些分子式-COOR的基團(tuán)，其中R包括諸如以下基團(tuán)的基團(tuán)，甲基、乙基、丙基、異丙基、2，2，2-三氯乙基、1-甲基-1-苯基乙基、異丁基、叔丁基、叔戊基、乙烯基、烯丙基、苯基、芐基、對硝基芐基、鄰硝基芐基和2，4-二氯芐基；?；腿〈孽；?，如甲酰基、乙?；?、氯乙?；?、二氯乙?；⑷纫阴；?、三氟乙?；?、苯甲?；蛯籽趸郊柞；?；其他基團(tuán)如，甲磺?；妆交酋；︿灞交酋；ο趸交一蛯妆交酋；?氨基羰基。優(yōu)選的氨基-保護(hù)基團(tuán)為芐基(-CH2C6H5)、?；鵞C(O)R1]或SiR13，其中R1為C1-C4烷基、鹵甲基或2-鹵-取代的-(C2-C4烷氧基)，芳香族尿烷保護(hù)基團(tuán)，例如，羰基芐氧基(Cbz)和脂肪族尿烷保護(hù)基團(tuán)，如叔丁氧基羰基(Boc)或9-芴基甲氧基羰基(FMOC)。
每種表述的定義，如低級烷基、m、n、p等等，當(dāng)其在結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)超過一次時，其意在同一結(jié)構(gòu)中不同位置各自獨立定義。
術(shù)語″吸電子基″為公認(rèn)的表述，其指有從相鄰原子吸引價電子傾向的取代基，即取代基相對于相鄰原子是電負(fù)性的。吸電子能力水平的量化由Hammett西格馬(σ)常數(shù)得出。該公知的常數(shù)在許多文獻(xiàn)中有敘述，例如，March，Advanced Organic Chemistry 251-59(McGrawHill Book Company紐約，1977)。Hammett常數(shù)值一般以負(fù)值表示供電子基團(tuán)(σ(P)＝-0.66表示NH2)而以正值表示吸電子基團(tuán)(σ(P)＝0.78表示硝基)，σ(P)顯示了相對替換性。示例的吸電子基包括硝基、?；⒓柞；?、磺?；?、三氟甲基、氰基、氯化物等等。示例的供電子基包括氨基、甲氧基等等。
此處所用的″RNA″指各種核糖核酸，如信使RNA、成熟RNA、多聚腺苷酸化的RNA，未多聚腺苷酸化的RNA和包含內(nèi)含子和/或5′或3′未翻譯區(qū)的RNA。此處所用的“表達(dá)的RNA”指通過聚合酶從基因組或線粒體DNA上轉(zhuǎn)錄的RNA。
術(shù)語″區(qū)域異構(gòu)體″為公認(rèn)的表述，其指具有相同分子式但在原子的連通性上有差異的化合物因此，″區(qū)域選擇過程″為相對其它異構(gòu)體偏好產(chǎn)生特定區(qū)域異構(gòu)體的過程，如，反應(yīng)產(chǎn)生統(tǒng)計學(xué)顯著增加的某種區(qū)域異構(gòu)體的產(chǎn)量。
術(shù)語″差向異構(gòu)體″為公認(rèn)的表述，其指具有完全相同化學(xué)構(gòu)造并包含超過一種立構(gòu)中心的分子，但其在這些立構(gòu)中心中僅有一個的構(gòu)型中有差異。
此處所用的″小分子″指一種成分，其具有小于約5kD的分子量，最優(yōu)選小于約4kD。小分子可以是核酸、肽、多肽、模擬肽、碳水化合物、脂或其它有機(jī)(含碳)或無機(jī)分子。許多制藥公司和供應(yīng)商有許多化學(xué)和/或生物混合物的文庫，通常是真菌、細(xì)菌或藻類的提取物，它們能用本發(fā)明的任何試驗來篩選從而鑒定能調(diào)節(jié)生物活性的化合物，如預(yù)期行為或認(rèn)知功能。
術(shù)語″立體異構(gòu)體″為公認(rèn)的表述，其指具有完全相同化學(xué)構(gòu)造化合物，但在原子或基團(tuán)的空間排列上有差異。特別地，″對映異構(gòu)體″指化合物的2個立體異構(gòu)體，它們的鏡像影像是不能互相重疊的。另一方面，″非對映異構(gòu)體″指具有2個或多個非對稱中心的立體異構(gòu)體，而且其分子不互為鏡像影像。
另外，″立體選擇過程″為相對產(chǎn)生其它可能的立體異構(gòu)體，更偏好產(chǎn)生反應(yīng)產(chǎn)物中特定立體異構(gòu)體的過程。″對映選擇過程″為偏向產(chǎn)生反應(yīng)產(chǎn)物中2個可能的對映異構(gòu)體中的一個過程。
術(shù)語″結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系″或″(SAR)″為公認(rèn)的表述，其指改變藥物或其它化合物分子結(jié)構(gòu)的方法，該方法改變了其與受體，酶，核酸或其他靶位等的相互作用。
此處所用的″個體″指哺乳動物，如人、非人靈長類、綿羊、牛、豬、馬、貓、鼠或犬。優(yōu)選地，個體為人。本發(fā)明所述的“需要”治療的個體或哺乳動物具有有障礙的認(rèn)知功能，該認(rèn)知功能能由在此所述的方法和組合物來改善?？梢岳斫狻叭〈被颉庇?..取代″包括隱含的限定，即這種取代符合取代原子和取代基所允許的價，而且取代形成穩(wěn)定的化合物，如不會自發(fā)通過諸如重排、環(huán)化、消除或其他反應(yīng)而產(chǎn)生變化。
術(shù)語″取代的″預(yù)期也包括有機(jī)化合物所允許的所有取代基。在一個廣義的方面，允許的取代基包括有機(jī)化合物的無環(huán)的和環(huán)的、分支的或不分支的、碳環(huán)的和雜環(huán)的、芳香族和非芳香族取代基。示例的取代基包括諸如如上所示的那些。合適有機(jī)化合物的允許的取代基可以是一個或多個并可以是相同或不同的。為了本發(fā)明的目的，雜原子，如氮，可以帶來有氫取代基和/或任何此處所述的有機(jī)化合物允許的取代基，其符合雜原子的價。本發(fā)明不以任何方式被有機(jī)化合物所允許的取代基限制。
術(shù)語″磺酸酯″為公認(rèn)的表述，其指可由如下通式所表示的部分
其中R57為電子對、氫、烷基、環(huán)烷基或芳基。
術(shù)語″硫酸酯″為公認(rèn)的表述，其包括由如下通式所表示的部分
其中R57如上定義。
術(shù)語″磺酰氨基″為公認(rèn)的表述，其包括由如下通式所表示的部分
其中R50和R56如上定義。
術(shù)語″氨磺?；鍨楣J(rèn)的表述，其指可由如下通式所表示的部分
其中R50和R51如上定義。
術(shù)語″磺?；鍨楣J(rèn)的表述，其指可由如下通式所表示的部分
其中R58為如下之一氫、烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基。
術(shù)語″亞砜基″為公認(rèn)的表述，其指可由如下通式所表示的部分
其中R58如上定義。
術(shù)語″合成″為公認(rèn)的表述，其指通過體外化學(xué)或酶學(xué)合成方法生產(chǎn)。
此處所用的″測試群體″指具有預(yù)期行為或認(rèn)知功能的個體。測試群體的成員可包括年輕、中年和老年個體。
此處所用的″治療劑″指化學(xué)化合物或組合物，當(dāng)向需要的個體適量給藥時，其能誘導(dǎo)預(yù)期的治療或預(yù)防效果?！逯委焺蹇梢允侨魏位瘜W(xué)部分或有生物、生理或藥理活性的生物物質(zhì)，其能局部或系統(tǒng)性地作用于需要的個體。化學(xué)治療劑的實例也被稱為“藥物”，已在公知文獻(xiàn)中描述了，如Merck索引，Physicians Desk Reference，和Pharmacological Basis of Therapeutics，而且它們包括但不限于藥劑；維生素；礦物質(zhì)補(bǔ)充劑；用于處理、診斷、治療或緩解疾病或病癥的物質(zhì)；影響機(jī)體結(jié)構(gòu)或功能的物質(zhì)或前藥，其在生理環(huán)境中被替代后能具有生物活性或更多活性?？股卦噭┖虵abI/FabK抑制劑是治療劑的實例。生物治療劑的實例包括含有基因并能將基因遞送到個體的載體。
治療劑誘導(dǎo)動物的局部或系統(tǒng)效應(yīng)，尤其是由藥物活性物質(zhì)造成的哺乳動物的，更特別的是人的。所以，治療劑可在動物或人中用于診斷、治療、緩解、治療或預(yù)防噁性病況或增強(qiáng)預(yù)期的身體或精神發(fā)育和/或狀態(tài)。
為了有效果，治療劑以產(chǎn)生預(yù)期局部或系統(tǒng)效應(yīng)的量或濃度以合理的利益/風(fēng)險率進(jìn)行遞送，從而應(yīng)用于任何治療中。這種治療劑的有效量會根據(jù)治療的個體和病情、個體的體重和年齡、病情的嚴(yán)重程度、給藥方式等而變化，其能由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員方便的確定。例如，本發(fā)明的某些組合物可以足以產(chǎn)生效果的量以合理的利益/風(fēng)險率來進(jìn)行給藥，從而應(yīng)用于這種治療中。有障礙的認(rèn)知功能的上下文中，能用標(biāo)準(zhǔn)行為或現(xiàn)有已知評估認(rèn)知功能的其他測試來評估呈現(xiàn)的治療效果的程度。
術(shù)語″反式″為公認(rèn)的表述，其指在一個雙鍵邊上的2個原子或基團(tuán)的排列方式，使得這些原子或基團(tuán)原子或基團(tuán)處在雙鍵的不同側(cè)。反式構(gòu)型通常標(biāo)示為(E)構(gòu)型。
此處所用的″治療″個體有障礙的認(rèn)知功能或″治療″具有有障礙的認(rèn)知功能的個體指通過合適的方法向個體提供治療劑，如，給藥藥物，從而使至少一個有障礙的認(rèn)知功能的癥狀穩(wěn)定或減輕。治療有障礙的認(rèn)知功能能防止功能障礙，延緩功能障礙的進(jìn)程或改善功能障礙(減輕疾病嚴(yán)重程度)或治療功能障礙。
此處所用的″載體″指組合物，其用于將DNA或RNA導(dǎo)入進(jìn)組織。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法可用于構(gòu)建包含核酸的表達(dá)載體，該核酸編碼與合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號相連的感興趣的蛋白質(zhì)。如參見，Sambrook & Russell，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第3版)，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(2001)和Ausebel等Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates& Wiley Interscience，N.Y(1989)所述的技術(shù)。
將載體或質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入細(xì)胞的合適方法包括脂/DNA復(fù)合物，如美國專利第5,578,475；5,627,175；5,705,308；5,744,335；5,976,567；6,020,202；6,051,429號所述的那些方法。合適的試劑包括lipofectamine，一種3∶1(w/w)的聚-陽離子脂三氟乙酸2，3-二油酰氧基-N-[2(精胺羧基-氨基甲?；?乙基]-N，N-二甲基-1-丙銨(DOSPA)(Chemical Abstracts登記名稱N-[2-(2，5-雙[(3-氨基丙基)氨基]-1-氧基戊基)氨基]乙基)-N，N-二甲基-2，3-雙(9-十八碳烯氧基)-1-丙銨-三氟乙酸鹽)的脂質(zhì)體配方，和膜過濾水中的中性脂二油烯基磷酯酰乙醇胺(DOPE)。實例有Lipofectamine 2000TM(可從Invitrogen(以前的Gibco/Life Technologies)#11668019處獲得)配方。其他試劑包括FuGENETM轉(zhuǎn)染試劑(非脂質(zhì)體形式中的脂和80％乙醇中的其他化合物的混合物，可從Roche Diagnostics Corp.#1814443處獲得)和LipoTAXITM轉(zhuǎn)染試劑(獲得自Invitrogen Corp.的脂配方，其能產(chǎn)生預(yù)期的生物活性蛋白質(zhì)。#204110)。可通過電穿孔來轉(zhuǎn)染細(xì)胞，如Roach和McNeish(Methods in Mol.Biol.1851(2002))所述的那樣。用來產(chǎn)生穩(wěn)定遺傳變化的細(xì)胞的合適病毒載體系統(tǒng)可以是基于腺病毒、慢病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、腺相關(guān)病毒(AAV)和其他病毒的，并可以用可從商業(yè)渠道獲得的病毒成分來制備。載體可通過現(xiàn)有技術(shù)導(dǎo)入到神經(jīng)細(xì)胞和組織中，包括注射(如注射到大腦特定區(qū)域)、通過使用動靜脈吻合流術(shù)導(dǎo)入血管空間或腦脊髓液中以及其他機(jī)械方法。
″年輕″指約性成熟年齡的青春期和正常成年哺乳動物，而且其時海馬剛完全成熟。對于鼠來說，″年輕″鼠為6-9個月大。對人來說，″年輕″人為10-20歲。
6.2引言認(rèn)知功能的行為和遺傳評估的聯(lián)合研究 用Morris水迷宮和輻射臂狀迷宮進(jìn)行的認(rèn)知功能的行為評估已經(jīng)用于鑒定與年齡相關(guān)的認(rèn)知功能的改變?；谄湔J(rèn)知功能，將這些行為評估用作為表征動物的方法，這樣就可以將認(rèn)知功能的行為評估與遺傳和生理測定結(jié)合起來，從而檢測大腦衰老效應(yīng)的差異。
為了獲得大腦中與年齡和行為相關(guān)的變化的基因模板，應(yīng)用基因表達(dá)陣列提供了同時分析成千上萬表達(dá)的基因的可能性。這些方法也提出了一些挑戰(zhàn)。首先，我們的鼠模型，類似于衰老人群，其包含遺傳上遠(yuǎn)系繁殖的群體，其能增加個體可變性，從而成為基因表達(dá)譜中的干擾因子。第二，用傳統(tǒng)定量方法來評估海馬中的特定mRNA的表達(dá)水平，我們發(fā)現(xiàn)與年齡和行為有關(guān)的基因表達(dá)變化通常相對較小，小于已經(jīng)報道的現(xiàn)有Genechip

或微陣列方法中分辨率極限的基因表達(dá)水平的2倍差異。例如，Landfield及其同事的工作就由于不能檢測小于2倍的基因表達(dá)改變而受到限制(WO03/025122 A2)。
在此我們描述了克服這些挑戰(zhàn)的策略，證實了可靠的基因表達(dá)的小變化，我們用傳統(tǒng)方法顯示了該區(qū)分老年和年輕鼠的基因表達(dá)。分析更廣泛的基因顯示該方法可重復(fù)地顯示了很多基因，這些基因在與年老鼠行為相關(guān)的海馬中顯示出表達(dá)改變。
鑒定與認(rèn)知功能障礙相關(guān)的基因第一次使人們確定候選化合物是否能調(diào)節(jié)與正常認(rèn)知功能相關(guān)的基因表達(dá)。能調(diào)解這些更接近于諸如人的具有預(yù)期認(rèn)知功能的哺乳動物中表達(dá)水平的基因表達(dá)的化合物在用作為治療劑時，能預(yù)見其可恢復(fù)或增強(qiáng)認(rèn)知功能。用該方法，我們報道發(fā)現(xiàn)了與保持年老哺乳動物中認(rèn)知功能相關(guān)的基因。不僅限于推測，我們相信這種保持代表了活性生物過程，其能用合適的治療劑處理來引發(fā)或誘導(dǎo)。當(dāng)然，我們在此報道一種這樣的試劑為頭孢曲松，一種第三代頭孢菌素。另一種這樣的試劑為丙戊酸和MS-153。用下述篩選方法可鑒定并優(yōu)化其他這樣的治療劑。產(chǎn)生本發(fā)明的實驗方法和本發(fā)明本身以及本發(fā)明的實踐技術(shù)會在以下章節(jié)中敘述。
6.2.1分離RNA 當(dāng)從個體的組織樣品或細(xì)胞中分離RNA時，重要的是從個體中分離出組織或細(xì)胞后，防止基因表達(dá)的任何進(jìn)一步變化。已知表達(dá)水平的改變在震動后迅速發(fā)生，如熱休克或用脂多糖(LPS)或其他試劑活化。另外，組織和細(xì)胞中的RNA快速降解。因此，在優(yōu)選的具體實施方式
中，從個體中獲得的組織或細(xì)胞盡可能的速凍住。
RNA能通過大量方法從組織樣品中分離，如在實施例中所述的或用CsCl離心后的硫氰酸胍裂解(Chirgwin等，1979，Biochemistry 185294-5299)。在苯酚/硫氰酸胍混合物(得自Invitrogen)中使組織均一化并在異丙醇沉淀后用氯仿提取從而從冰凍組織中分離RNA。然后重懸浮RNA小顆粒并進(jìn)一步過RNeasy柱(Qiagen)來純化。所有RNA可以在缺少RNA酶抑制劑的情況下儲存于-80℃，并用瓊脂糖凝膠電泳來評估其完整性。能用所述從單個細(xì)胞中制備cDNA文庫的方法來從單個細(xì)胞中獲得RNA，如Dulac，C.(1998)Curr.Top.Dev.Biol.36，245和Jena等(1996)J.Immunol.Methods 190199所述的那樣。必須小心避免RNA降解，如加入RNA酶抑制劑。
然后可以富集特定物種的RNA樣品。在一個具體實施方式
中，從RNA樣品中分離聚(A)+RNA。一般而言，這種純化法有在mRNA上加上聚-A的好處。尤其，如上所指出，聚-T寡核苷酸可固定在固相支持物上從而用作mRNA的親合配體。達(dá)到該目的的試劑盒可從商業(yè)渠道獲得，如，MessageMaker試劑盒(Invitrogen #10298016)。
在一個具體實施方式
中，富集感興趣序列的RNA群，如那些涉及認(rèn)知功能的基因。能通過諸如引物特異性cDNA合成或基于cDNA合成的線性擴(kuò)增以及體外模板直接轉(zhuǎn)錄來進(jìn)行富集(如參見，Wang等(1989)PNAS 86，9717；以上的Dulac等，和以上的Jena等)。
富集的或不在特定物種或序列中的RNA群能進(jìn)一步被擴(kuò)增。該擴(kuò)增在使用來自單個或一些細(xì)胞的RNA時尤其重要。許多擴(kuò)增方法適用于本發(fā)明的方法中，包括諸如PCR；連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)(如參見，Wu和Wallace，Genomics 4,560(1989)，Landegren等，Science 241，1077(1988))；自持序列復(fù)制(SSR)(如參見，Guatelli等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，87，1874(1990))；基于序列的核酸擴(kuò)增(NASBA)和轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(如參見，Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，1173(1989))。對于PCR技術(shù)，如參見PCR TechnologyPrinciples andApplications for DNA Amplification(H.A.Erlich著，F(xiàn)reeman Press，N.Y.，N.Y.，1992)；PCR ProtocolsA Guide to Methods andapplications(編輯.Innis，等，Academic Press，San Diego，Calif.，1990)；Mattila等，Nucleic Acids Res.19，4967(1991)；Eckert等，PCR Methods and Applications 1，17(1991)；PCR(McPherson等著，IRL Press，Oxford)和美國專利第4,683,202號。擴(kuò)增方法如下所述，有Ohyama等(2000)BioTechniques 29530；Luo等(1999)Nat.Med.5，117；Hegde等(2000)BioTechniques 29548；Kacharmina等(1999)Meth.Enzymol.3033；Livesey等(2000)Curr.Biol.10301；Spirin等(1999)Invest.Ophtalmol.Vis.Sci.403108和Sakai等(2000)Anal.Biochem.28732。也可在細(xì)胞上原位進(jìn)行RNA擴(kuò)增和cDNA合成(如參見，Eberwine等(1992)PNAS 893010)?！宥縋CR″指利用PCR規(guī)程使人能確定樣品中反應(yīng)產(chǎn)物的量或反應(yīng)產(chǎn)物的數(shù)量。
所屬領(lǐng)域技術(shù)人員會理解如何使用擴(kuò)增方法，如果要獲得定量結(jié)果，必須注意使用保持或控制相對的核酸擴(kuò)增率以獲得定量的擴(kuò)增?！岸俊睌U(kuò)增的方法對所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。例如，定量PCR包括用相同引物同時共擴(kuò)增已知量的對照序列。這提供了內(nèi)部可用于校正PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。然后，高密度陣列可包括特異性探針做內(nèi)在擴(kuò)增的核酸的定量標(biāo)準(zhǔn)。
一個優(yōu)選的內(nèi)在標(biāo)準(zhǔn)為合成的AW106 cRNA。根據(jù)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，AW106 cRNA與分離自樣品的RNA結(jié)合。然后用反轉(zhuǎn)錄酶，反轉(zhuǎn)錄RNA產(chǎn)生DNA拷貝。然后(如，通過PCR)用標(biāo)記的引物擴(kuò)增cDNA序列。典型地通過電泳來分離擴(kuò)增產(chǎn)物，并確定(與擴(kuò)增產(chǎn)物成比例的)放射性的量。然后通過比較已知AW106RNA標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)生的信號來計算樣品中RNA的量。具體的定量PCR規(guī)程如PCR Protocols，A Guide to Methods and Applications，lords等，Academic Press，Inc.N.Y.，(1990)所述。
在優(yōu)選的具體實施方式
中，用反轉(zhuǎn)錄酶和由寡(dT)和編碼噬菌體T7啟動子的序列組成的引物反轉(zhuǎn)錄出樣品mRNA，用以提供單鏈DNA模板。用DNA聚合酶聚合出第二條DNA鏈。合成雙鏈cDNA后，加入T7 RNA聚合酶并從cDNA模板上轉(zhuǎn)錄出RNA。接下來從每個單鏈cDNA模板上進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄輪次使得擴(kuò)增了RNA。體外聚合的方法對所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的(如參見以上的Sambrook &Russell而且該特定方法在Van Gelder，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，871663-1667(1990)中有詳述，他們證明了根據(jù)該方法進(jìn)行的體外擴(kuò)增保持了各種RNA轉(zhuǎn)錄體的相對率)。另外，Eberwine等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，893010-3014提供了一種規(guī)程，其在體外轉(zhuǎn)錄中使用2輪擴(kuò)增以獲得大于初始材料106倍的增加，從而允許甚至在生物樣品有限的情況下來檢測表達(dá)。
所屬領(lǐng)域技術(shù)人員會理解上述直接轉(zhuǎn)錄方法提供了反義(aRNA)庫。當(dāng)反義RNA用作靶核酸時，選擇陣列中提供的寡核苷酸探針來互補(bǔ)反義核酸的亞序列。相反，當(dāng)靶核酸為正義核酸庫時，挑選寡核苷酸探針來互補(bǔ)正義核酸的亞序列。最終，當(dāng)核酸庫是雙鏈時，探針可以是任意意義的靶核酸，包括正義和反義鏈。
6.2.2分析RNA 在一些具體實施方式
中，相對于成百或成千的基因，足以確定一種或少量基因的表達(dá)。盡管微陣列能用于這些具體實施方式
中，但是也可用各種其它的檢測基因表達(dá)的方法。本節(jié)描述了一些檢測并定量mRNA或其編碼的多肽的示例方法。方法的第一步包括從細(xì)胞中分離出mRNA，該步驟可以以如上所述的方式進(jìn)行?？梢砸匀缟纤龅姆绞絹順?biāo)記一種或多種核酸。
在一個具體實施方式
中，樣品中獲得的mRNA反轉(zhuǎn)錄出第一條cDNA鏈并進(jìn)行PCR，如RT-PCR。內(nèi)務(wù)基因或其他表達(dá)不發(fā)生變化的基因能用作內(nèi)在的對照和進(jìn)行試驗的對照。PCR反應(yīng)后，電泳分離擴(kuò)增的產(chǎn)物并檢測。通過使用定量PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物的水平可與樣品中存在的RNA水平相關(guān)聯(lián)。擴(kuò)增的樣品也可以在瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠上分離，轉(zhuǎn)到濾膜上，而該濾膜雜交有感興趣的基因的特異探針。進(jìn)行平行PCR擴(kuò)增，如多重PCR，能同時分析大量的樣品。
使用的定量PCR技術(shù)是以TaqManTM探針的使用為基礎(chǔ)的。在存在寡核苷酸探針的情況下，通過PE Applied Biosystems 7700序列檢測系統(tǒng)上擴(kuò)增靶序列來進(jìn)行特定序列的檢測，其中探針的5’和3’端各自標(biāo)記有報告和淬滅熒光染(FQ探針)，其能在2個PCR引物間退火。當(dāng)探針結(jié)合在引物間時，僅能檢測到特定產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增進(jìn)行中，Taq聚合酶的5′-核酸酶活性開始從探針上切下報告染料。當(dāng)報告染料與淬滅染料物理分離時，用帶有CCD的照相機(jī)測定信號從而檢測出產(chǎn)生的信號。也可以使用諸如敘利亞綠的插入性染料。每個產(chǎn)生的信號等于一個裂解的探針，其與一個靶鏈的擴(kuò)增相對應(yīng)。根據(jù)提供的說明書，可利用PE Applied Biosystem TaqMan PCR核心試劑盒來進(jìn)行PCR反應(yīng)。進(jìn)一步，該技術(shù)如美國專利第6,326,462號所述。可選地，能從Applied Biosystems和Qiagen處獲得探針，與Invitrogen的鉑定量PCR試劑盒和Rotorgene 3000一起使用。
在另一個具體實施方式
中，通過點印跡分析和相關(guān)方法來確定mRNA的水平(如參見，G.A.Beltz等的Methods in Enzymology，Vol.100，Part B，R.Wu，L.Grossmam，K.Moldave，編著AcademicPress，紐約，第19章，第266-308頁，1985)。在一個具體實施方式
中，在濾膜上印跡(即，非共價鍵)特定量的從細(xì)胞中提取的RNA，而該濾膜雜交有感興趣的基因的特異探針。由于印跡能包含多點RNA，因此能同時分析大量RNA樣品。利用方法來檢測雜交，該方法依賴探針標(biāo)記的類型。在另一個點印跡方法中，一個或多個上或下調(diào)認(rèn)知功能障礙的基因的一個或多個探針吸附于膜上，并用獲得自和源自個體細(xì)胞或組織的RNA的標(biāo)記核酸來溫育該膜。這種點印跡本質(zhì)上就是包含少于微陣列探針數(shù)的陣列。
″點印跡″雜交有著廣泛的應(yīng)用并開發(fā)出許多版本(如參見，M.L.M.Anderson和B.D.Young的Nucleic Acid Hybridization-APractical Approach，B.D.Hames和S.J.Higgins，編.，IRL Press，Washington D.C.，第4章，第73-111頁，1985)。
另一種形式，即所謂的“三明治”雜交，包括將寡核苷酸探針共價結(jié)合到固相支持物上，并利用它們捕獲并檢測多個核酸靶位(如參見，M.Ranki等，基因，21，第77-85頁，1983；A.M.Palva，T.M.Ranki，和H.E.Soderlund的英國專利申請GB 2156074A，1985年10月2日；T.M.Ranki和H.E.Soderlund的美國專利第4,563,419號，1986年1月7日；A.D.B.Malcolm和J.A.Langdale的PCT WO86/03782，1986年7月3日；Y.Stabinsky，的美國專利第4,751,177號，1988年1月14日；T.H.Adams等的PCT WO 90/01564，1990年2月22日；R.B.Wallace等6 Nucleic Acid Res.11，p.3543，1979；和B.J.Connor等，80 Proc.Natl.Acad.Sci.USA pp.278-282，1983)。這些形式的多個版本被稱為“反點印跡”。
也能用Northern印跡來確定mRNA水平。電泳分離特定量的RNA并轉(zhuǎn)移到濾膜上，該濾膜然后雜交有相應(yīng)于感興趣基因地探針。該方法，盡管在要分析大量樣品和基因時更麻煩些，但它仍有非常準(zhǔn)確的優(yōu)點。
優(yōu)選的高通量基因表達(dá)分析的方法是系列(″SAGE″)技術(shù)，其首次由Velculescu等(1995)Science 270，484-487提出。SAGE的優(yōu)點是其具有能在特定細(xì)胞類型中檢測所有基因的潛力，提供出有關(guān)這些基因相關(guān)表達(dá)的定量信息，允許迅速比較2個細(xì)胞中基因的基因表達(dá)，并產(chǎn)生能用于鑒定檢測的基因的序列信息。所以至今，SAGE方法已證明其能可靠地在各種細(xì)胞類型中檢測調(diào)節(jié)和非調(diào)節(jié)基因的表達(dá)(Velculescu等(1997)Cell 88，243-251；Zhang等(1997)Science276，1268-1272和Velculescu等(1999)Nat.Genet.23，387-388)。
產(chǎn)生并探測核酸的技術(shù)例如在上述的Sambrook & Russell(上文)中有進(jìn)一步描述。
可選地，可通過原位雜交組化來確定一種或多種上或下調(diào)認(rèn)知功能障礙的基因的表達(dá)水平。在一個具體實施方式
中，按照現(xiàn)有已知的技術(shù)，從個體中獲得組織樣品，制備切片并進(jìn)行原位雜交，從而檢測感興趣的基因的表達(dá)水平。
以上方法可用于評估內(nèi)源基因表達(dá)的增加，所述基因可通過向哺乳動物導(dǎo)入新的轉(zhuǎn)錄單位或基因活化構(gòu)建體來活化，轉(zhuǎn)錄單位或基因活化構(gòu)建體包括內(nèi)源調(diào)節(jié)序列、內(nèi)源外顯子和剪接位點，可操作地與內(nèi)源基因的第二個外顯子相連，其中細(xì)胞包含內(nèi)源外顯子和在內(nèi)源基因中存在的外顯子(如參見，美國專利第5,641,670；5,773,746；5,733,761；5,968,502；6,702,989和6,565,844號)。
在其他方法中，通過測量基因編碼的蛋白質(zhì)水平來檢測基因的表達(dá)水平。如通過免疫沉淀、ELISA或免疫組化來進(jìn)行該方法，利用的試劑如抗體，其特異檢測基因編碼的蛋白質(zhì)。其它技術(shù)包括Western印跡分析。免疫試驗常用于定量細(xì)胞樣品中的蛋白質(zhì)水平，并且許多其他免疫試驗技術(shù)出現(xiàn)在現(xiàn)有技術(shù)中。本發(fā)明不局限于特定試驗過程，并因而要包括同源的和異源的過程。本發(fā)明能進(jìn)行的示例的免疫試驗包括熒光極化免疫試驗(FPIA)、熒光免疫試驗(FIA)、酶免疫試驗(EIA)、懸液抑制免疫試驗(NIA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和放射免疫試驗(RIA)。指示部分或標(biāo)記基團(tuán)能吸附于特定抗體上并選擇從而使之達(dá)到各種方法所使用的需求，其中通常通過可用的試驗設(shè)備和兼容的免疫試驗過程來規(guī)范這些方法。用于進(jìn)行各種上述免疫試驗的常規(guī)技術(shù)對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是已知的。
對于細(xì)胞分泌的多肽，可在生物流體中測定這些多肽的表達(dá)水平。
在一些具體實施方式
中，可通過以下章節(jié)所詳述的微陣列分析來檢測和/或測定mRNA水平。
6.3引言微陣列 一般而言，用陣列來確定表達(dá)譜包括以下步驟(a)從個體獲得mRNA樣品并制備其標(biāo)記的核酸(″靶核酸”或”靶″)；(b)在足以使靶核酸與陣列上相應(yīng)探針結(jié)合的條件下，將靶核酸與陣列接觸，如通過雜交或特異結(jié)合；(c)可選地從陣列上去除未結(jié)合的靶；(d)檢測結(jié)合的靶，和(e)分析結(jié)果。此處所用的″核酸探針探針”或”探針″為吸附在陣列上的核酸，而″靶核酸″為與陣列雜交的核酸。以下將更詳細(xì)地描述這些步驟的每一步。
6.3.1標(biāo)記用于微陣列分析的核酸 一般而言，要標(biāo)記靶分子從而允許檢測靶分子與微陣列的雜交?！皹?biāo)記”指探針直接或通過與一個或多個信號產(chǎn)生系統(tǒng)的成分的結(jié)合形式來包含一種信號產(chǎn)生系統(tǒng)的成分，因而其是可檢測的。直接可檢測標(biāo)記的實例包括整合于、通常是共價結(jié)合于探針部分的同位素和熒光部分，或可檢測標(biāo)記的能結(jié)合于探針分子功能部分的光活化或化學(xué)活化的衍生物，探針部分如核苷酸單體，如，引物的dNMP。
在富集和/或擴(kuò)增RNA期間或之后標(biāo)記核酸。例如，用公知的寡dT引物或隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄法從mRNA來制備標(biāo)記的cDNA(如參見，Klug和Berger，1987，Methods Enzymol.152316-325)。在存在有結(jié)合了可檢測標(biāo)記的dNTP的情況下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，最優(yōu)選為熒光標(biāo)記的dNTP?？蛇x地，在存在標(biāo)記的dNTP的情況下，分離的mRNA可轉(zhuǎn)化成由體外雙鏈cDNA轉(zhuǎn)錄而合成的標(biāo)記的反義RNA(Lockhart等，Nature Biotech.141675，1996)。在可選的具體實施方式
中，在缺少可檢測標(biāo)記的情況下合成cDNA或RNA探針，然后進(jìn)行標(biāo)記，如通過結(jié)合生物素標(biāo)記的dNTP或rNTP，或一些相似的方法(如光交聯(lián)生物素的補(bǔ)骨脂素衍生物與RNA)，接著加入標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素(如藻紅蛋白結(jié)合的抗生蛋白鏈菌素)或等價物。
在一個具體實施方式
中，在42℃溫浴60分鐘包含RNA和0.5mMdGTP，dATP和dCTP加上0.1mM dTTP和熒光脫氧核糖核苷酸(如，0.1mM若丹明110 UTP(Perken Elmer Cetus)或0.1mM Cy3 dUTP(Amersham))的混合物和反轉(zhuǎn)錄酶(如SuperScriptTM II，LTI Inc.)來合成標(biāo)記的cDNA。
感興趣的熒光部分或標(biāo)記包括香豆素及其衍生物，如7-氨基-4-甲基香豆素，氨基香豆素，bodipy染料，如Bodipy FL、瀑布蘭，熒光素及其衍生物，如熒光素異硫氰酸酯、俄勒岡綠，若丹明染料，如德克薩斯紅、四甲基若丹明、曙紅和藻紅，花青染料，如Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、FluorX，大環(huán)螯合的鑭系離子，如，量子染料TM，熒光能量轉(zhuǎn)化染料，如噻唑橘紅-溴乙非啶異質(zhì)二聚體、TOTAB、丹?；?，等。個別熒光化合物具有連接設(shè)備或本發(fā)明實驗中所需檢測元素的功能，或能修飾取得這些功能，這樣的化合物包括，如，丹?；龋粺晒馑?，如3，6-二羥基-9-苯基二苯吡喃醇；若丹明異硫氰酸酯；N-苯基1-氨基-8-磺酸萘；N-苯基2-氨基-6-磺酸萘；4-乙酰氨基-4-異硫氰基-芪-2，2′-二磺酸；芘-3-磺酸；2-甲苯氨基萘-6-磺酸酯；N-苯基-N-甲基-2-氨基萘-6-磺酸酯；溴化乙錠；stebrine；亞金氨基-0，2-(9′-蒽)棕櫚酸酯；丹?；字Ｒ掖及?；N，N′-二十八烷基噁羰花青N，N′-二己基噁羰花青；部花青，4-(3′-芘基)硬脂酸酯；d-3-氨基脫氧馬萘雌酮；1 2-(9′-蒽基)硬脂酸酯；2-甲基蒽；9-乙烯基蒽；2，2′(亞乙烯基對亞苯基)雙苯噁唑；對雙(2-甲基-5-苯基-噁唑基))苯；6-二甲基氨基-1，2-苯并吩嗪；視黃醇；雙(3′-氨基吡啶)1，10-癸烷基二碘化物；hellibrienin磺酸萘腙；氯代四環(huán)素；N-(7-二甲基氨基-4-甲基-2-氧代-3-色烯基)馬來酰亞胺；N-(對-(2苯并咪唑基)-苯基)馬來酰亞胺；N-(4-氟萘基)馬來酰亞胺；雙(高香草醛酸)；刃天青；4-氯-7-硝基-2，1，3-苯甲酰噁二唑；部花青540；試鹵靈；孟加拉玫瑰紅和2，4-二苯基-3(2H)-呋喃酮(如參見，Kricka，1992，Nonisotopic DNA Probe Techniques，Academic Press San Diego，Calif.)。許多熒光標(biāo)記可通過商業(yè)渠道從SIGMA-AIdrich，Amersham Biosciences，Molecular Probes，Pfizer(以前的Pharmacia)，BD Biosciences(以前的CLONTECH)，ChemGenesCorp.，Glen Research Corp.，Invitrogen，F(xiàn)luka Chemica-BiochemikaAnalytika(Fluka Chemie AG，Buchs，瑞士)，和Applied Biosystems(Foster City，Calif.)以及其他技術(shù)人員知道的商業(yè)渠道獲得。
化學(xué)發(fā)光標(biāo)記包括蟲熒光素和2，3-二氫酞吖嗪二酮，如發(fā)光氨。
感興趣的同位素部分或標(biāo)記包括32P、33P、35P、125I、2H、14C等等(參見Zhao等，Gene 156207，1995；Pietu等，Genome Res.6492，1996)。
標(biāo)記也可以是信號產(chǎn)生系統(tǒng)成分，其與一種或多種相同系統(tǒng)其他的成分一起提供可監(jiān)測的標(biāo)記。這些標(biāo)記的示例有特異結(jié)合配對成分，如配體，如生物素、熒光素、異羥基洋地黃毒甙元、抗原、多價陽離子、鰲合基團(tuán)等等，其中該成分特異結(jié)合于信號產(chǎn)生系統(tǒng)的其它成分，其中其他成分直接或間接提供可檢測的信號，如結(jié)合了熒光部分或能將底物轉(zhuǎn)化成發(fā)色產(chǎn)物的酶部分的抗體，如堿性磷酸酶結(jié)合抗體等等。
其他感興趣的標(biāo)簽包括那些僅在相連探針特異結(jié)合靶分子時提供信號的標(biāo)簽，其中這些標(biāo)簽包括“分子燈塔”，如Tyagi & Kramer，Nature Biotechnology 14303，1996和EP 0 070 685 B1所述。其他感興趣的標(biāo)簽包括那些如美國專利第5,563,037號；WO 97/17471和WO 97/17076所述的標(biāo)簽。
在一些情況下，在雜交后標(biāo)記雜交的靶核酸。例如，當(dāng)標(biāo)記dNTP的生物素用于諸如擴(kuò)增或轉(zhuǎn)錄時，抗生蛋白鏈菌素結(jié)合報告基團(tuán)可用于標(biāo)記雜交的復(fù)合物。
在其它具體實施方式
中，不標(biāo)記靶核酸。在這種情況下，可用胞質(zhì)共振來測定雜交，如Thiel等，Anal.Chem.694948，1997所述。
在一個具體實施方式
中，多(如2、3、4、5或更多)套靶核酸被標(biāo)記并用于雜交反應(yīng)(“多重”分析)中。例如，一套核酸可與一種細(xì)胞或組織樣品的RNA相對應(yīng)，而另一套核酸可與另一種細(xì)胞或組織樣品的RNA相對應(yīng)。多套核酸可用不同標(biāo)記來標(biāo)記，如，具有獨特發(fā)色譜的不同熒光標(biāo)簽，因而可以區(qū)分它們。然后混合這些套核酸并將它們同時與微陣列雜交。
雙色熒光標(biāo)記的應(yīng)用和確定基因表達(dá)改變的檢測方案如Shena等，Science 270467-470，1995所述。利用標(biāo)記有2種不同熒光基團(tuán)的cDNA的優(yōu)點為可直接并有內(nèi)在對照地比較mRNA水平，該水平與制得的2種細(xì)胞狀態(tài)中的每個陣列化的基因相對應(yīng)，而且由于實驗條件(如雜交條件)細(xì)微差異造成的變化不會影響接下來的分析。
在雜交大量靶核酸時使用的可分辨標(biāo)記的例子是公知的，其包括2種或更多種不同發(fā)射波長的熒光染料，像Cy3和Cy5，熒光蛋白質(zhì)和染料的組合，像phicoerythrin和Cy5，2種或更多種具有不同發(fā)射能量的同位素，像32P和33P，具有不同散射譜的金或銀顆粒，在不同處理條件產(chǎn)生信號的標(biāo)記，像溫度、pH、用其他試劑處理等，或在處理后的不同時間點產(chǎn)生信號。基于不同底物特異性的酶(堿性磷酸酶/過氧化物酶)，使用一種或多種酶產(chǎn)生信號可以有更多種可分辨的標(biāo)記。
另外，為了減少實驗錯誤，優(yōu)選在雙色差異雜交實驗中顛倒使用熒光標(biāo)記以減少偏向個別基因或陣列位置點的偏差。換句話說，優(yōu)選首先用一種來自兩種測量細(xì)胞的mRNA標(biāo)記(如用第一種熒光色標(biāo)記來自第一種細(xì)胞的核酸并用第二種熒光色標(biāo)記來自第二種細(xì)胞的核酸)來測定基因表達(dá)，然后用相反的標(biāo)記(如，用第二種熒光色標(biāo)記來自第一種細(xì)胞的核酸并用第一種熒光色標(biāo)記來自第二種細(xì)胞的核酸)來測量來自兩種細(xì)胞的基因表達(dá)。在暴露水平和震蕩對照參數(shù)水平以上的多次測量提供了另外的實驗錯誤的對照。
在雜交到陣列之前可評估標(biāo)記核酸的質(zhì)量。例如，標(biāo)記核酸樣品能與探針雜交，該探針衍生自基因的5′、中間和3′部分，該基因已知或懷疑存在于核酸樣品中。這可以指示標(biāo)記核酸是否是全長的核酸或它們是否降解了。在一個具體實施方式
中，Affymetrix(Santa Clara，CA)的GeneChip

Test3陣列可用于該目的。該陣列包含表示特定基因子集的探針，這些基因來自幾種包括哺乳動物的生物體。所以，標(biāo)記核酸樣品的質(zhì)量能通過將一小部分樣品與陣列雜交來確定，如Affymetrix(Santa Clara，CA)的GeneChip

Test3陣列。
6.3.2微陣列分析 用于本發(fā)明的優(yōu)選的陣列，如微陣列，包括基因的一種或多種探針，所述基因為涉及認(rèn)知功能的候選基因。示例的陣列包括一種或多種用來研究認(rèn)知功能的感興趣的基因，如那些GeneChip

鼠表達(dá)集合230或GeneChip

鼠神經(jīng)U34陣列上的基因，其包含超過1,200條與神經(jīng)生物學(xué)研究相關(guān)的序列(包括激酶、細(xì)胞表面的基因)。另外，通過同時跟蹤分布于整個基因組的將近1,500個被稱為單核苷酸多態(tài)性(SNP)的基因變體，人們可以使用GeneChip

HuSNPTM陣列來研究整個人的基因組。SNP是很好的基因組搜索標(biāo)記，因為它們簡單、豐富、廣泛并帶來大多數(shù)的人群基因的變化。利用高通量技術(shù)，如基因GeneChip

陣列，SNP比諸如微衛(wèi)星序列的傳統(tǒng)標(biāo)記更容易跟蹤。
陣列可以包括與至少10，優(yōu)選至少20，至少50，至少100或至少1000個基因。陣列可以包括與約10％、20％、50％、70％、90％或95％列于圖3的基因或其他微陣列上可用的基因相對應(yīng)的探針。陣列可以包括與約10％、20％、50％、70％、90％或95％列于圖3的基因相對應(yīng)的探針，或與其他在細(xì)胞中高至少2倍、優(yōu)選至少3倍、更優(yōu)選至少4倍、5倍、7倍并最優(yōu)選至少約10倍表達(dá)的基因相對應(yīng)的探針。一個所用的示例優(yōu)選陣列為實施例中所用和所述的陣列。
可有一種或多于一種探針與微陣列上的每一個基因相對應(yīng)。例如，微陣列可以包括2至20個探針與一個基因相對應(yīng)，并優(yōu)選約5至10個。探針可與基因的全長RNA序列或其互補(bǔ)序列相對應(yīng)，所述基因特征為疾病候選基因，或它們可與其一部分相對應(yīng)，所述部分足夠長足以允許特定雜交。這些探針可包括約50個核苷酸至約100、200、500或1000個核苷酸或超過1000個核苷酸。如此處進(jìn)一步所述的，微陣列可進(jìn)一步包含寡核苷酸探針，其由約10至50個核苷酸組成，優(yōu)選約15至30個核苷酸并更優(yōu)選20-25個核苷酸。探針優(yōu)選為單鏈。探針與其靶有足夠的互補(bǔ)性，從而提供序列特異性雜交所預(yù)期的水平(見下文)。
典型地，本發(fā)明所用的陣列具有每cm2大于100個不同探針的位點密度。優(yōu)選地，陣列具有每cm2大于500個的位點密度，更優(yōu)選大于約1000/cm2，最優(yōu)選大于約10,000/cm2。優(yōu)選地，陣列在單個片基上有大于100個不同的探針，更優(yōu)選大于約1000個不同的探針，更優(yōu)選大于約10,000個不同的探針并最優(yōu)選在單個片基上有大于100,000個不同的探針。
如下所述，通過現(xiàn)有已知的方法來制備微陣列，或由公司來定制它們，如Affymetrix(Santa Clara，CA)。
一般而言，可用兩種類型的微陣列。這兩種類型被稱為“合成”和“遞送”。在合成類型中，通過用核苷酸原位合成核酸逐步制備微陣列。在每一輪合成中，加入核苷酸生成鏈，直至獲得所期望的長度。在微陣列的遞送類型中，用各種遞送技術(shù)將制成的核酸放在已知位置上。大量文獻(xiàn)描述了不同的微陣列技術(shù)，如，Shena等，Tibtech 16301，1998；Duggan等，Nat.Genet.2110，1999；Bowtell等，Nat.Genet.2125，1999。
Affymetrix(Santa Clara，CA)開發(fā)了一種新的合成技術(shù)，其將照相平版印刷技術(shù)與DNA合成化學(xué)結(jié)合在一起從而能生產(chǎn)高密度的寡核苷酸微陣列。這些芯片在約1.6cm2面積中包括多至400,000組寡核苷酸。寡核苷酸以其3′端的錨定來最大化單鏈核酸雜交的有效性。這些被稱為“GeneChip

”的芯片一般包括特定基因的幾個寡核苷酸，如，在15-20之間，如16個寡核苷酸。由于Affymetrix(Santa Clara，CA)出售定制的微陣列，所以包含能上或下調(diào)認(rèn)知功能障礙的基因的微陣列能從Affymetrix(Santa Clara，CA)處訂購。
也能通過機(jī)械微點樣來制備微陣列，如Synteni(Fremont，CA)商業(yè)化的那些。根據(jù)這些方法，少量核酸可印在固相表面上。Synteni制備的微點樣陣列在約3.6cm2面積中包含多至10,000組cDNA。
第三組微陣列技術(shù)為″按需點滴″遞送方法，最先進(jìn)的噴墨技術(shù)，其利用壓電和其他推進(jìn)形式來把核酸從小管中傳送到固相表面上。有幾個中心開發(fā)了噴墨技術(shù)，包括Incyte Pharmaceuticals(Palo Alto，CA)和Protogene(Palo Alto，CA)。該技術(shù)形成10,000個點/cm2的密度。也可參見Hughes等，Nat.Biotechn.19342，2001。
陣列優(yōu)選包括對照和參照核酸。對照核酸為能用于顯示雜交有效的核酸。例如，所有的Affymetrix(Santa Clara，CA)表達(dá)陣列包含幾種原核基因的探針集，如，E.coli生物素合成中的bioB、bioC和bioD以及P1噬菌體的cre。在這些基因或其部分的混合物存在的情況下進(jìn)行與這些陣列的雜交，如Affymetrix(Santa Clara，CA)提供的有該效果的混合物(部分號900299)，其能驗證雜交的有效性。包括靶核酸的對照核酸也能是用體外轉(zhuǎn)錄從cDNA克隆合成的mRNA。其它可包括在陣列中的對照基因為聚A對照，如dap、lys、phe、thr和trp(其包括在Affymetrix的GeneChip

上)。
參照核酸能將一個實驗與另一個實驗的結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化，并在定量的水平上比較多個實驗。示例的參照核酸包括已知表達(dá)水平的內(nèi)務(wù)基因，如甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、己糖激酶和肌動蛋白。
也可為靶基因的探針、表達(dá)水平對照或標(biāo)準(zhǔn)化對照提供錯配對照。除了存在一種或多種錯配對照之外，錯配對照可為寡核苷酸探針或其他與其相應(yīng)測試或?qū)φ仗结樢粯拥暮怂帷?br> 陣列也可包含能與基因的大于一個的等位基因雜交的探針。例如陣列能包含一個識別特定基因等位基因1的探針和另一個識別等位基因2的探針。
微陣列能如下制備。在一個具體實施方式
中，寡核苷酸陣列在固相支持物上合成。示例的固相支持物包括玻璃、塑料、聚合物、金屬、非金屬、陶瓷、有機(jī)物等。利用芯片遮蓋技術(shù)和光保護(hù)化學(xué)，可能產(chǎn)生有序的核酸探針陣列。這些陣列，其被稱作諸如“DNA芯片”或非常大量的固定聚合物陣列(″VLSIPSTM″陣列)，它們能在約1cm2至幾cm2面積的片基上包括數(shù)百萬確定的探針區(qū)域，在其上整合了少量至數(shù)百萬探針的集合(如參見，美國專利第5,631,734號)。
構(gòu)建固相核酸陣列以檢測靶核酸已有文獻(xiàn)描述了。參見Fodor等，Science，251767-777，1991；Sheldon等，Clinical Chemistry 39(4)718-719，1993；Kozal等，Nature Medicine 2(7)753-759，1996和Hubbell美國專利第5,571,639號；Pinkel等PCT/US95/16155(WO96/17958)；美國專利第5,677,195；5,624,711；5,599,695；5,451,683；5,424,186；5,412,087；5,384,261；5,252,743和5,143,854號；PCT專利公開號92/10092和93/09668；和PCT WO 97/10365。簡言之，組合策略允許利用最少的合成步驟來合成包含大量探針的陣列。例如，僅用32步化學(xué)合成步驟就可能合成并吸附所有可能的DNA 8聚寡核苷酸(48或65,536種可能的組合)。一般而言，VLSIPSTM過程僅利用4n步合成步驟就提供了一種在陣列上產(chǎn)生4n個不同寡核苷酸探針的方法(如參見，美國專利第5,631,734；5,143,854號和PCT專利公開號WO 90/15070；WO 95/11995和WO 92/10092)。
在玻璃上光指示組合合成的寡核苷酸陣列能用自動磷酯酰氨化學(xué)和芯片遮蓋技術(shù)來進(jìn)行，該技術(shù)與在計算機(jī)芯片產(chǎn)業(yè)中的光刻技術(shù)相似。典型地，玻璃表面用包含功能基團(tuán)的硅烷試劑來衍生化，如由光敏保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的羥基或胺基。光分解作用通過照相平版遮蓋選擇性地用于暴露功能性基團(tuán)，然后其迅速與引入的5′-光保護(hù)核苷磷酯酰氨來反應(yīng)。磷酯酰氨只在照亮的那些位點反應(yīng)(所以用去除光敏保護(hù)基團(tuán)來曝光)。所以，磷酯酰氨僅加到前一步驟選擇曝光的那些區(qū)域。重復(fù)這些步驟，直至在固相表面上合成出預(yù)期的序列陣列。
設(shè)計遮蓋以減少合成循環(huán)次數(shù)的算法如Hubbel等，美國專利第5,571,639號和美國專利第5,593,839號所述。如美國專利第5,571,639號所述，計算機(jī)系統(tǒng)可用于選擇在片基上的核酸探針并設(shè)計陣列排布。
另一種合成高密度陣列的方法如美國專利第6,083,697號所述。通過使用輻射起始的催化系統(tǒng)，該方法利用了新的化學(xué)擴(kuò)增過程從而輔助合成多聚物序列。該方法包括使用光敏化合物，其用作催化劑以促進(jìn)多聚物序列形成的方式來化學(xué)改變合成的中間體。該光敏化合物包括一般被稱為輻射活化的催化劑(RAC)化合物，和更特異的光活化催化劑(PAC)。RAC本身能化學(xué)改變合成中間體或它們能活化自催化化合物，其能以合成中間體與后加的合成中間體或其他化合物結(jié)合的方式來化學(xué)改變合成中間體。
通過向機(jī)械限制流徑的支持物上的細(xì)胞遞送單體來以組合的方式合成陣列。參見Winkler等，EP 624,059。也可通過用噴墨打印機(jī)將單體試劑點樣到支持物上來合成陣列。參見Pease等，EP 728,520。
根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)和此處進(jìn)一步描述的方法來制備cDNA探針，如用序列特異性引物來進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)。能化學(xué)合成寡核苷酸探針?？蓮闹T如GenBank、其他公共數(shù)據(jù)庫或文獻(xiàn)來獲得制備探針的基因或cDNA的序列。
核酸探針可以是天然的核酸，化學(xué)修飾的核酸，如，包含核苷酸類似物，只要它們具有活化的符合連接化學(xué)的羥基。保護(hù)基團(tuán)本身可以是對光不穩(wěn)的。可選地，保護(hù)基團(tuán)在某些化學(xué)條件下可以是不穩(wěn)定的，如酸。在該示例中，固相支持物的表面能包含依曝光而能產(chǎn)生酸的組合物。所以，片基區(qū)域的曝光在該區(qū)域產(chǎn)生了酸，在曝光區(qū)域去除了保護(hù)基團(tuán)。而且合成方法能用3′-保護(hù)的5′-0-磷酯酰氨-活化的脫氧核酸。在該情況下，以5′至3′方向合成寡核苷酸，形成了自由的5′端。
用能制造成千寡核苷酸的96孔自動多路寡核苷酸合成儀(A.M.O.S.)來合成陣列上的寡核苷酸(Lashkari等，PNAS 937912，1995)。
可以理解通過有目的的應(yīng)用來影響寡核苷酸設(shè)計。例如，所有探針期望可具有相似的熔融溫度。因此，調(diào)節(jié)探針的長度從而使陣列上所有探針的熔融溫度都很近似(可以理解在不同探針具有不同GC含量的情況下，需要不同探針的不同長度來獲得特定的T[m])。盡管在探針設(shè)計中熔融溫度為基本要考慮的內(nèi)容，但其他因素任選用于進(jìn)一步調(diào)節(jié)探針的構(gòu)建，如選擇抗引物自互補(bǔ)等。
陣列，如微陣列，可以在為以后應(yīng)用而制備或購買后方便地儲存。在合適的條件下，特定陣列能儲存至少約6個月并可以儲存多至1年或更長。陣列一般儲存于約-20℃至室溫之間的溫度下，而陣列優(yōu)選封存于諸如袋的塑料容器中并避光。
6.3.3將靶核酸與微陣列雜交 下一步是在足以使靶核酸與陣列的探針結(jié)合的條件下，將靶核酸與陣列接觸。在有選的具體實施方式
中，在足以使靶核酸與陣列上的探針發(fā)生雜交的條件下，將靶核酸與陣列接觸靶核酸，選擇雜交條件從而提供與其水平的雜交特異性。
陣列與靶核酸的接觸包括用包含靶核酸的水介質(zhì)與陣列接觸。根據(jù)特定的陣列構(gòu)型以各種不同的方式來獲得接觸。例如，當(dāng)陣列只包括“平皿狀”剛性片基表面上的大小分離式探針，可通過僅僅將陣列放在含靶核酸溶液的容器里來完成接觸，如聚乙烯袋等。在其它具體實施方式
中，當(dāng)陣列放入2個剛性平皿包圍的分離介質(zhì)中時，就存在通過電泳法遞送靶核酸的機(jī)會?？蛇x地，當(dāng)陣列裝入具有流體入口和出口端的生物芯片設(shè)備中時，能將靶核酸溶液導(dǎo)入到小室中，在該小室中通過入口端引入靶分子樣品，可以手動或用自動設(shè)備來進(jìn)行流體導(dǎo)入。在多孔的具體實施方式
中，靶核酸溶液導(dǎo)入到包含陣列的反應(yīng)室中，可以手動進(jìn)行，如用吸液管，或用自動流體處理設(shè)備。
靶核酸溶液和探針的接觸將保持足夠的時間以使靶和探針發(fā)生結(jié)合。盡管要依賴探針和靶的性質(zhì)，接觸一般要保持從約10分鐘至24小時的時間，通常約30分鐘至12小時，更通常為約1小時至6小時。
當(dāng)使用商品化的微陣列時，由生產(chǎn)商提供足夠的雜交條件。當(dāng)使用非商品化的微陣列時，根據(jù)以下雜交指導(dǎo)以及大量關(guān)于使用微陣列的公開文獻(xiàn)所述的雜交條件來確定足夠的雜交條件。
選擇最優(yōu)的核酸雜交和洗滌條件從而使探針“特異地結(jié)合”或“特異地雜交”于特定的陣列位點，即探針雜交、復(fù)合或結(jié)合于具有互補(bǔ)核酸序列的序列陣列的位點上，但不雜交于非互補(bǔ)核酸序列的位點上。此處所用的一個聚核苷酸序列被認(rèn)為與另一個互補(bǔ)，這時，如果較短的聚核苷酸小于或等于25個堿基時，則利用標(biāo)準(zhǔn)堿基配對規(guī)則就可使得沒有錯配存在，或者如果較短的聚核苷酸大于25個堿基時，則有不超過5％的錯配。優(yōu)選地，聚核苷酸是完全互補(bǔ)的(沒有錯配)。能容易地證實通過進(jìn)行包括陰性對照的雜交試驗，能使特定雜交條件導(dǎo)致特定的雜交。
在允許基本特異性雜交的條件下進(jìn)行雜交。探針長度和GC含量決定了雜交的Tm，所以雜交條件對要獲得探針對模板核酸特異性雜交來說是必要的。這些因素對于所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的，并也能在試驗中測試。大量的核酸雜交指南可在Tijssen(1993)，″Laboratory Techniques in biochemistry and molecularbiology-hybridization with nucleic acid probes″中發(fā)現(xiàn)。一般而言，選擇的嚴(yán)謹(jǐn)條件比在特定離子強(qiáng)度和pH下特定序列的熱熔點(Tm)低約5℃。Tm指(在特定離子強(qiáng)度和pH下的)溫度，在該溫度下50％的靶序列全匹配的探針雜交。選擇的高嚴(yán)謹(jǐn)條件等與特定探針的Tm點。有時術(shù)語″Td″用于定義溫度，在該溫度下至少一半探針從完全匹配的靶核酸上解離下來。在任何情況下，可用大量估計Tm或Td的預(yù)估技術(shù)，其一般如在前的Tijssen所述的。典型地，預(yù)計雙鏈形式的G-C堿基對比Tm高3℃，而預(yù)計A-T堿基對高約2℃，理論上最大值至多約80-100℃?？墒牵懈鼜?fù)雜的Tm和Td模型可用，其適于解釋G-C堆積作用、溶劑效應(yīng)、預(yù)計試驗溫度等。例如，可將探針設(shè)計成具有解離溫度(Td)為約60℃，可使用以下公式設(shè)計Td＝(((((3x#GC)+(2x#AT))x37)-562)/#bp)-5；其中#GC、#AT和#bp分別為涉及探針與模板DNA退火中的鳥嘌呤-胞嘧啶堿基對數(shù)、腺嘌呤-胸腺嘧啶堿基對數(shù)和總堿基對數(shù)。
完全匹配的二聚體和錯配的二聚體之間的穩(wěn)定性差異可能是相當(dāng)小的，尤其在僅有一個堿基錯配時，兩者之間的相互差異小至0.5度(參見，Tibanyenda，N.等，Eur.J.Biochem.13919，1984和Ebel，S.等，Biochem.3112083，1992)。更重要的是，能理解當(dāng)同源區(qū)域的長度增加時，對于整個二聚體穩(wěn)定性，單個堿基錯配的效應(yīng)減少了。
核酸雜交的理論和實踐如S.Agrawal(編)Methods in MolecularBiology，第20卷；和Tijssen(1993)″Laboratory Techniques inbiochemistry and molecular biology-hybridization with nucleic acidprobes″中所述，并如″Overview of principles of hybridization and thestrategy of nucleic acid probe assays″，Elsevier，紐約的第二章第I部分提供了對核酸雜交的基礎(chǔ)指導(dǎo)。
某些微陣列有“活性”性質(zhì)，即，它們提供了發(fā)生在每個特定微位置上的雜交反應(yīng)(或任何其他親和性反應(yīng))所有方面的獨立控制。這些設(shè)備提供了一種新的影響雜交反應(yīng)的機(jī)制，其被稱為電子嚴(yán)謹(jǐn)控制(ESC)。這些活性設(shè)備能在每個微位置上電子化地產(chǎn)生“不同的嚴(yán)謹(jǐn)條件”。所以，最好能在相同的混合溶液中進(jìn)行所有雜交。這些測試如Sosnowski等，美國專利第6,051,380號所述。
在優(yōu)選的具體實施方式
中，在雜交期間，利用去污劑(如C-TAB)或阻斷劑(如精子DNA、cot-1 DNA等)來減少背景信號從而減少非特異性結(jié)合。在特別優(yōu)選的具體實施方式
中，在約0.5mg/ml DNA(如青魚精子DNA)中進(jìn)行雜交。雜交中使用阻斷劑對所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的(如參見，Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology，第24卷Hybridization With Nucleic Acid Probes，P.Tijssen，編Elsevier，N.Y.，(1993)的第8章)。
根據(jù)靶核酸上使用的特定標(biāo)記，該方法在檢測步驟前可再或不進(jìn)一步包含未結(jié)合標(biāo)記去除的步驟。例如，在某些測試形式(如″同源測試形式″)中，僅在與探針特異結(jié)合的靶上產(chǎn)生了可檢測信號。如此，在這些測試形式中，不需要未結(jié)合標(biāo)記去除的步驟就可檢測雜交形式。在其它具體實施方式
中，使用的標(biāo)記可產(chǎn)生信號，而無論靶是否與其探針特異結(jié)合，在這些具體實施方式
中，未結(jié)合標(biāo)記的靶從支持物表面上去除。去除未結(jié)合標(biāo)記的靶的一種方法是進(jìn)行公知的洗滌技術(shù)，其中為去除未結(jié)合標(biāo)記的靶而使用的各種洗滌溶劑和規(guī)程是所屬領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并可以使用?？蛇x地，用電泳法去除未結(jié)合標(biāo)記的靶。
當(dāng)用相同標(biāo)記檢測所有靶序列時，為每種生理來源使用不同的陣列(其中可包括在不同時間使用相同陣列)。通過為不同的靶群體(代表試驗的每個不同生理來源)使用不同的和可分辨的標(biāo)記，以上方法可改變以提供多重分析。按照多重方法，同時為每個不同的靶群體使用相同的陣列。
在另一個具體實施方式
中，利用電荷偶聯(lián)設(shè)備(CCD)成像照相機(jī)來實時監(jiān)視雜交(Guschin等，Anal.Biochem.250203，1997)。在光纖維束上合成陣列使讀數(shù)變得簡單和靈敏(Healy等，Anal.Biochem.251270，1997)。在另一個具體實施方式
中，利用僅激活結(jié)合在表面上的熒光基團(tuán)的隱失波效應(yīng)，在微陣列上進(jìn)行實時雜交檢測，而不需要洗滌(如參見，Stimpson等，PNAS 926379，1995)。
6.3.4檢測雜交的核酸和分析微陣列的結(jié)果 以上步驟導(dǎo)致在陣列表面上產(chǎn)生出靶核酸的雜交形式。用基于靶核酸特定標(biāo)記而選擇的特定檢測形式以各種方式檢測或使這些形式可視化。代表性的檢測方法包括閃爍計數(shù)，放射自顯影，測量熒光，比色測定，測量光發(fā)射、光散射等等。
一種檢測方法包括陣列掃描儀，其商品可從Affymetrix(SantaClara，CA)處獲得，如417TM陣列儀、418TM陣列掃描儀或AgilentGeneArrayTM掃描儀。該掃描儀由裝有WindowsR界面和易用軟件工具的系統(tǒng)計算機(jī)來控制。輸出是16-bit位的.tif文件，其能直接輸入或直接以各種應(yīng)用軟件來讀取。優(yōu)選的掃描設(shè)備如美國專利第5,143,854和5,424,186號所述。
當(dāng)使用熒光標(biāo)記的探針時，用掃描共聚焦激光顯微鏡檢測轉(zhuǎn)錄陣列每個位點上的熒光發(fā)射。在一種具體實施方式
中，使用合適的激發(fā)線路，可為所用的2個熒光基團(tuán)中的每一個各自進(jìn)行掃描，可選地，可用激光使得在兩個特異于2個熒光基團(tuán)的波長處同時使標(biāo)本發(fā)光并同時分析2個熒光基團(tuán)發(fā)出的光(參見Shalon等，Genome Research 6639-645，1996)。在優(yōu)選的具體實施方式
中，用激光熒光掃描儀和可控制X-Y相的計算機(jī)和顯微鏡來掃描陣列。用多線路、混合氣體激光器獲得2個熒光基團(tuán)的連續(xù)激發(fā)并通過波長分開發(fā)射光并用光電倍增管來檢測。在一個使用了熒光靶核酸的具體實施方式
中，用激光器激發(fā)熒光標(biāo)記的靶來掃描陣列，其中靶與探針陣列區(qū)域雜交，然后用電荷偶聯(lián)設(shè)備(″CCD″)對大范圍陣列掃描成像。熒光激光掃描設(shè)備如上述Schena等所述?？蛇x地，光纖維束如Ferguson等，Nature Biotech.141681-1684，1996所述，其可用于監(jiān)視mRNA豐度水平。
在數(shù)據(jù)收集操作后，數(shù)據(jù)一般進(jìn)行數(shù)據(jù)分析操作。為輔助樣品分析操作，設(shè)備讀數(shù)器讀出的數(shù)據(jù)一般用數(shù)字計算器來分析。典型地，計算機(jī)會有合適的程序接受并儲存設(shè)備的數(shù)據(jù)并分析和報告收集的數(shù)據(jù)，如，背景的減少，多色圖像的去卷積，標(biāo)記或去除人工產(chǎn)物，適當(dāng)校驗對照，標(biāo)準(zhǔn)化信號，解釋熒光數(shù)據(jù)從而確定雜交靶的量，標(biāo)準(zhǔn)化背景和單堿基錯配雜交，等等。在優(yōu)選的具體實施方式
中，系統(tǒng)包含了檢索功能，使人們檢索特定模式，如，與差異基因表達(dá)相關(guān)的模式，如在患有認(rèn)知功能障礙的病人樣品的表達(dá)譜和相應(yīng)正常個體表達(dá)譜之間的。系統(tǒng)優(yōu)選能使人們檢索超過2個樣品間的基因表達(dá)的模式。
需要分析數(shù)據(jù)的系統(tǒng)為可視、可處理并可分析基因表達(dá)數(shù)據(jù)的普通、靈活的系統(tǒng)。這種系統(tǒng)優(yōu)選包括瀏覽和操作表達(dá)數(shù)據(jù)的圖形用戶界面，其使用戶選擇性地觀看和突出顯示感興趣的基因。系統(tǒng)也優(yōu)選包括排序和檢索功能并優(yōu)選可為普通用戶所用，其可安裝PC，Mac或Unix工作站。系統(tǒng)中也優(yōu)選包括聚類算法，其在質(zhì)量上比現(xiàn)有的更有效。優(yōu)選分級調(diào)節(jié)這種算法的精度，從而使聚類的詳細(xì)水平能按需有系統(tǒng)地精選。
可用大量算法分析基因表達(dá)譜的數(shù)據(jù)，如，進(jìn)行類型比較。在一些具體實施方式
中，按需把共調(diào)解的基因分組。這就能比較大量譜了。鑒定這些基因組別的優(yōu)選具體實施方式
包括聚類算法(對于聚類算法的綜述，如參見，F(xiàn)ukunaga，1990，Statistical Pattern Recognition，第2版，Academic Press，San Diego；Everitt，1974，Cluster Analysis，LondonHeinemann Educ.Books；Hartigan，1975，ClusteringAlgorithms，紐約Wiley；Sneath和Sokal，1973，NumericalTaxonomy，F(xiàn)reeman；Anderberg，1973，Cluster Analysis forApplications，Academic Press紐約)。
聚類分析用于幫助減少復(fù)雜的成千時間曲線模式，減少成較少的有代表性的聚類。一些系統(tǒng)允許基于序列的基因的聚類化和可視化。其他系統(tǒng)允許基于其他基因特征的聚類化，如，它們的表達(dá)水平(如參見，美國專利第6,203,987號)。其他系統(tǒng)允許時間曲線的聚類化(如參見，美國專利第6,263,287號)。用hclust規(guī)則進(jìn)行聚類分析(如參見，軟件包S-正的″hclust″規(guī)則，MathSoft，Inc.，Cambridge，Mass.)。
在一些特定的具體實施方式
中，按照它們轉(zhuǎn)錄的共變化程度，大概為共調(diào)節(jié)，來進(jìn)行基因分組，如美國專利第6,203,987號所述。具有共變化轉(zhuǎn)錄體的基因組別的術(shù)語稱為“基因集”。聚類分析或其他統(tǒng)計分類方法能用于分析與各種混亂體系相對應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄的共變化，如，由疾病或藥物造成的。在一個特定的具體實施方式
中，聚類算法應(yīng)用于表達(dá)譜來構(gòu)建“相似樹”或”聚類樹″，其與由所顯示共調(diào)節(jié)量決定的基因相關(guān)?；蚣x處于聚類樹的分枝上，通過了分枝層次中不同水平的聚類樹。
在一些具體實施方式
中，基因表達(dá)譜轉(zhuǎn)變成投射狀的基因表達(dá)譜。投射狀的基因表達(dá)譜集中了基因集表達(dá)的值。在一些具體實施方式
中，通過在每個基因集中平均化基因的表達(dá)水平來獲得該轉(zhuǎn)變。在另一些具體實施方式
中，可使用其他線性投射過程。投射操作表示在較小和更有生物學(xué)意義的坐標(biāo)集上的譜，通過在每個細(xì)胞成分集中平均化其來減少測量錯誤的效應(yīng)并幫助譜的生物學(xué)解釋。
能比較的值包括整體表達(dá)水平；平均表達(dá)水平，如，其可來自不同實驗、相同個體的不同樣品或不同個體的樣品；以及表達(dá)水平率。
6.3.5微陣列的數(shù)據(jù)分析方法 優(yōu)選用計算機(jī)系統(tǒng)將一種或多種能上調(diào)認(rèn)知功能障礙抑制的基因的表達(dá)水平與沒有認(rèn)知功能障礙抑制的參考表達(dá)水平作比較，如，患有疾病或正常個體的表達(dá)水平。在一個具體實施方式
中，能從2個樣品中獲得一種或多種表達(dá)水平，而這2個表達(dá)水平集導(dǎo)入計算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行比較。在一個優(yōu)選的具體實施方式
中，一個一種或多種表達(dá)水平的集合導(dǎo)入計算機(jī)系統(tǒng)與計算機(jī)系統(tǒng)中已有的值進(jìn)行比較，或者導(dǎo)入計算機(jī)可讀形式中以后再導(dǎo)入計算機(jī)系統(tǒng)。
在一個具體實施方式
中，本發(fā)明提供了本發(fā)明基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)或至少一個能上調(diào)個體中認(rèn)知功能障礙抑制的基因的表達(dá)水平對應(yīng)值的計算機(jī)可讀形式。值可以是實驗中獲得的mRNA表達(dá)水平，如，微陣列分析。值也可以是相對于參考基因標(biāo)準(zhǔn)化的mRNA表達(dá)水平，其表達(dá)在多種條件下的多種細(xì)胞中為恒定的，如，GAPDH。在其它具體實施方式
中，計算機(jī)中的值為不同樣品中標(biāo)準(zhǔn)化或未標(biāo)準(zhǔn)化mRNA水平間的比率或差異。
計算機(jī)可讀介質(zhì)可包含至少2、至少3、至少5、10、20、50、100、200、500或更多個基因的值。在一個優(yōu)選的具體實施方式
中，計算機(jī)可讀介質(zhì)包含至少一個表達(dá)譜。
基因表達(dá)數(shù)據(jù)可以是表格的形式，如Excel表格。數(shù)據(jù)可以是單獨的或其可以是較大數(shù)據(jù)庫的一部分，如可包含其他表達(dá)譜，如公共用的數(shù)據(jù)庫。計算機(jī)可讀形式可以位于計算機(jī)中。在另一個具體實施方式
中，本發(fā)明提供能顯示基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)的計算機(jī)。
本發(fā)明提供兩種或多種細(xì)胞或組織樣品中可比較單個基因表達(dá)水平的方法。在一些具體實施方式
中，可比較多個基因的表達(dá)水平。例如，至少2、至少3、至少5、10、20、50、100、200、500或更多個基因的表達(dá)水平。在具體實施方式
中比較表達(dá)譜。
在一個具體實施方式
中，本發(fā)明提供確定能上調(diào)認(rèn)知功能障礙抑制的一種或多種基因的表達(dá)水平間相似性的方法。方法優(yōu)選包括在第一個樣品中獲得能上調(diào)認(rèn)知功能障礙抑制的一種或多種基因的表達(dá)水平，并將這些值輸入計算機(jī)，所述計算機(jī)包括(i)包含記錄的數(shù)據(jù)庫，該記錄包含未處理的對照樣品中一種或多種基因表達(dá)水平的相應(yīng)值，以及(ii)處理器指令，如用戶界面，其能接受選擇一個或多個值來與儲存在計算機(jī)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。計算機(jī)可進(jìn)一步包含將比較數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成圖或表或其他輸出形式的工具。
在一個具體實施方式
中，本發(fā)明提供一種系統(tǒng)，其包含接收一個或多個基因的基因表達(dá)數(shù)據(jù)的工具；將所述一個或多個基因之一的基因表達(dá)數(shù)據(jù)與普通參考框架進(jìn)行比較的工具；以及呈現(xiàn)比較結(jié)果的工具。該系統(tǒng)可進(jìn)一步包含聚類數(shù)據(jù)的工具。
在另一個具體實施方式
中，本發(fā)明提供一種分析基因表達(dá)數(shù)據(jù)的計算機(jī)程序，其包括(i)接收多個基因的基因表達(dá)輸入數(shù)據(jù)的計算機(jī)編碼以及(ii)將所述多個基因之一的所述基因表達(dá)數(shù)據(jù)與普通參考框架進(jìn)行比較的計算機(jī)編碼。
本發(fā)明也提供了一種機(jī)器可讀的或計算機(jī)可讀的介質(zhì)，其包括進(jìn)行如下步驟的程序說明(i)將查詢細(xì)胞中能上調(diào)NMD抑制的一個或多種基因表達(dá)水平的多個相應(yīng)值與包含一個或多種參考細(xì)胞的參考表達(dá)記錄和細(xì)胞類型注釋的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較；以及(ii)在表達(dá)水平相似性基礎(chǔ)上，顯示與查詢細(xì)胞最相似的細(xì)胞。
2個生物樣品中的相對表達(dá)水平，如mRNA豐度，能被計分為混亂度(相對豐度有差異)或不混亂的(即，相對豐度是相同的)。例如，混亂度可以是2種來源的RNA間表達(dá)水平的差異因子約為25％(1種來源的RNA比另一來源的豐度高25％)，更通常約50％，更通常的因子約2(2倍豐度)，3(3倍豐度)或5(5倍豐度)?；靵y度能用計算機(jī)來計算并表示比較結(jié)果。
優(yōu)選地，除了將混亂度鑒定為正或負(fù)的，確定混亂度的大小是有益的。如上所述，通過計算差異標(biāo)記所用的2種熒光基團(tuán)的發(fā)射率，或所屬領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的類似方法，來進(jìn)行這個。
計算機(jī)可讀介質(zhì)可進(jìn)一步包含表達(dá)水平或表達(dá)譜標(biāo)示符的指針，如從哪個來源獲得的，如從哪個病人獲得的。標(biāo)示符能反映疾病期、病人接受的治療或任何其他表達(dá)水平來源的說明。
操作中，文中本發(fā)明系統(tǒng)的接收基因表達(dá)數(shù)據(jù)的工具、比較基因表達(dá)數(shù)據(jù)的工具、顯示工具、標(biāo)準(zhǔn)化工具和聚類工具能包括一個帶有此處所述各個功能的編程計算機(jī)，其帶有硬件或硬件和軟件；能在此進(jìn)行特異性鑒定操作的邏輯電路或編程計算機(jī)的其他成分，其由計算機(jī)程序控制；或編碼了可執(zhí)行指令的計算機(jī)儲存器，這些指令代表了計算機(jī)程序，能使計算機(jī)以此處所述的特定方式來起作用。
所屬領(lǐng)域技術(shù)人員會理解本發(fā)明的系統(tǒng)和方法可應(yīng)用于各種系統(tǒng)，包括運行MS-DOS或Microsoft Windows的IBM-兼容個人電腦。另外，個人電腦會有所有與該系統(tǒng)相關(guān)的硬件或軟件成分從而用戶會有可能的存儲器、網(wǎng)絡(luò)連接、打印能力和各種計算機(jī)語言的編程能力。有了合適的計算機(jī)系統(tǒng)，用戶首先能往計算機(jī)系統(tǒng)中裝載表達(dá)譜數(shù)據(jù)，美國專利第6,203,987號?；蚣V的定義裝載入存儲介質(zhì)或遠(yuǎn)程計算機(jī)的存儲器中，優(yōu)選通過網(wǎng)絡(luò)載入動態(tài)基因集數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)。接著用戶運行投射軟件，進(jìn)行將表達(dá)譜轉(zhuǎn)化成投射表達(dá)譜的步驟。然后顯示投射表達(dá)譜。
在另一個示例的實施方案中，用戶首先將投射譜導(dǎo)入儲存器。然后用戶將參考譜導(dǎo)入儲存器。接下來，用戶運行比較軟件，進(jìn)行客觀比較譜的步驟。
7.篩選能促進(jìn)或保持認(rèn)知功能的化合物 通過本發(fā)明指導(dǎo)，利用本發(fā)明的體外和體內(nèi)篩選方法能鑒定調(diào)節(jié)與認(rèn)知功能相關(guān)的基因表達(dá)的試劑。
本發(fā)明提供了鑒定用于促進(jìn)或保持哺乳動物認(rèn)知功能的試劑的方法，如，鼠和人。在一個方面，篩選方法包括進(jìn)行鑒定試劑的方法，所述試劑能調(diào)節(jié)編碼谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白的基因的表達(dá)或調(diào)解由該基因編碼的谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白的活性，如EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4或EAAT5。為了簡化，以下所寫的″EAAT″指EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4和EAAT5中的每一個，指包括所有基因/蛋白質(zhì)的組，并指所有小組組合(如，EAAT1和EAAT2)?？蛇x地，篩選方法包括進(jìn)行鑒定試劑的試驗，所述試劑能調(diào)節(jié)天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)。
許多不同篩選規(guī)程可用來鑒定試劑，所述試劑能調(diào)節(jié)哺乳動物細(xì)胞中的EAAT和/或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)水平(如鼠細(xì)胞、非人靈長類細(xì)胞或人細(xì)胞)。一般而言，篩選方法包括篩選多種試劑(“測試試劑”)來鑒定能改變EAAT活性或水平的試劑，可通過諸如但不限于，結(jié)合到EAAT多肽，阻止抑制劑與EAAT多肽結(jié)合，或增加EAAT基因的表達(dá)。另外，篩選方法包括篩選多種試劑來鑒定能改變天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性或水平的試劑，可通過諸如但不限于，結(jié)合到天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶多肽，阻止抑制劑與天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶多肽結(jié)合，或增加天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)。
“測試試劑”包括各種普通類型的化合物，其包括但不限于，小有機(jī)分子、已知藥物、多肽；碳水化合物，如寡糖和多糖；聚核苷酸；脂或磷脂；脂肪酸；類固醇或氨基酸類似物。可從文庫中得到測試試劑，如天然產(chǎn)物文庫和組合文庫。許多不同類型的文庫可從商業(yè)渠道獲得而且制備文庫的方法如PCT公開WO 93/06121，WO 95/12608，WO 95/35503，WO 94/08051和WO 95/30642所述。另外，已知自動測試的方法能允許短期內(nèi)篩選幾千種化合物。
某些篩選方法包括篩選能增加細(xì)胞中EAAT和/或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶蛋白表達(dá)或活性的化合物。這些方法能包括進(jìn)行基于細(xì)胞的測試，其中將測試化合物與一種或多種表達(dá)EAAT基因或蛋白質(zhì)的細(xì)胞接觸，然后檢測EAAT表達(dá)(如EAAT的RNA水平)或活性的改變。另一種方法包括進(jìn)行基于細(xì)胞的測試，其中將測試化合物與一種或多種表達(dá)天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因或蛋白質(zhì)的細(xì)胞接觸，然后檢測天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)(如天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的RNA水平)或活性的改變。所以，在具體實施方式
中，方法包括將細(xì)胞與測試試劑接觸并確定在有測試試劑存在的情況下，基因的表達(dá)水平是否改變，其中表達(dá)的改變(如增加)顯示測試試劑能用于促進(jìn)或保持認(rèn)知功能。能在體外、體內(nèi)或離體接觸細(xì)胞。典型地，相對于缺少測試化合物的表達(dá)，表達(dá)增加至少約10％、至少約20％、至少約50％、至少約75％或至少約100％。
在具體實施方式
中，本發(fā)明提供一種篩選試劑以確定其能用于減少認(rèn)知功能障礙的方法，該方法通過提供能表達(dá)谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白或哺乳動物神經(jīng)細(xì)胞所表達(dá)的天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因的細(xì)胞，將細(xì)胞與測試試劑接觸；并在存在測試試劑的情況下，確定谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白(如EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4和EAAT5之一種或多種)和/或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AT)的活性或表達(dá)水平是否增加了，其中該增加顯示了測試試劑能用于促進(jìn)或保持認(rèn)知功能。通過已知技術(shù)來評估表達(dá)，包括檢測EAAT或AT mRNA比率或豐度的改變。谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白的蛋白質(zhì)活性能由現(xiàn)有方法來評估，包括測定3H-谷氨酸攝入細(xì)胞的攝入量(Lin等，Nature 41084-88，2001)。天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)活性能由現(xiàn)有方法來評估，包括在存在NADH的情況下的蘋果酸脫氫酶的偶聯(lián)反應(yīng)(Karmen，J Clin Invest 34131，1955；Amador和Wacker，Clin Chem 8343，1962)。
通常該測定包括比較相對于相似細(xì)胞或沒有接觸測試化合物的細(xì)胞(即對照細(xì)胞)的測試細(xì)胞中的活性或表達(dá)。在相關(guān)的具體實施方式
中，測試化合物給藥給多細(xì)胞生物(如動物)。EAAT或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶成分可以完全是細(xì)胞或多細(xì)胞生物內(nèi)源產(chǎn)生的，或可以是重組細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因生物的，其中包含一種或多種重組表達(dá)的EAAT和/或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶蛋白。利用公開的基因和蛋白質(zhì)序列以及常規(guī)方法來表達(dá)重組的EAAT和/或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶蛋白(如參見，Ausubel等，Current Protocols In Molecular Biology，GreenePublishing and Wiley-Interscience，紐約(2002年重版))。
利用表達(dá)EAAT和/或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因的細(xì)胞類型可以進(jìn)行試驗，在各種具體實施方式
中，包括培養(yǎng)的細(xì)胞(如基本培養(yǎng)基上的細(xì)胞或建立的細(xì)胞系)和體內(nèi)細(xì)胞。示例的細(xì)胞包括神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、混合的神經(jīng)培養(yǎng)劑或細(xì)胞，在所述細(xì)胞中EEAT和/或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)是由重組表達(dá)所誘導(dǎo)的。這些細(xì)胞(如基本培養(yǎng)基)可從胚胎海馬中獲得。許多其他合適的細(xì)胞或細(xì)胞系對從業(yè)人員來說是已知的。
試劑對細(xì)胞中或體外系統(tǒng)中EAAT和/或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)的影響能與基線值作比較，基線值一般是沒有測試試劑的細(xì)胞或體外系統(tǒng)的表達(dá)水平。也可以為不表達(dá)EAAT和/或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞確定表達(dá)水平，定作陰性對照。另外，這些細(xì)胞一般與測試細(xì)胞具有實質(zhì)上相同的遺傳性質(zhì)。
其他基于細(xì)胞的測試有報告測試，其不必用表達(dá)EAAT和/或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞來進(jìn)行。這些測試中的某些用異源核酸構(gòu)建體來進(jìn)行，該構(gòu)建體包括EAAT或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因啟動子，該啟動子可操作地與編碼可檢測產(chǎn)物的報告基因相連。EAAT基因啟動子在大多數(shù)情況下位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游(或5′)約300至1000 bp的區(qū)域中，例如Su等，PNAS 1001955-1960，2003所述的。天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因啟動子在大多數(shù)情況下位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游(或5′)約300至1000 bp的區(qū)域中，例如Obaru等，J Mol Biol.20013-22，1988所述的。某些EAAT和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因啟動子如GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和科學(xué)文獻(xiàn)所述。能用許多不同的報告基因。示例的報道基因包括綠色熒光蛋白、J-葡糖苷酸酶、氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶、熒光素酶、J-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶等等。在這些測試中，帶有報告構(gòu)建體的的細(xì)胞與測試化合物接觸。測試化合物使得可檢測的報告基因表達(dá)，所述化合物是要么通過與之結(jié)合而活化啟動子或引發(fā)級聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生活化啟動子的分子。各種不同類型的細(xì)胞可用于報告測試中(如真核細(xì)胞，如酵母、COS、CHO、HepG2和HeLa細(xì)胞系)。
鑒定能增加EAAT或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)活性的試劑也可包括篩選能結(jié)合EAAT或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)的化合物，至少一些這樣鑒定出的化合物可能是EAAT或冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的調(diào)節(jié)因子。在這些篩選中鑒定的前導(dǎo)化合物能用作合成更具活性的類似物的基礎(chǔ)。所以，在一個方面，本發(fā)明提供了一種篩選試劑以確定其用于減輕認(rèn)知功能障礙的方法，該方法通過(a)將EAAT或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因編碼的多肽或表達(dá)這種多肽的細(xì)胞與測試化合物接觸，和(b)確定多肽是否與測試化合物結(jié)合。這種結(jié)合顯示了測試試劑能用于減輕認(rèn)知功能障礙。結(jié)合試驗通常包括將EAAT或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶多肽與一種或多種測試化合物接觸并給予足夠的時間使蛋白質(zhì)和測試化合物形成結(jié)合復(fù)合體。確定測試化合物直接結(jié)合EAAT或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶多肽的能力，可通過諸如將化合物于放射性同位素或酶標(biāo)記偶聯(lián)來完成，從而通過檢測復(fù)合物中標(biāo)記的EAAT或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶多肽來確定化合物與EAAT或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶多肽的結(jié)合。用大量已確立的任何分析技術(shù)來檢測形成的任何結(jié)合復(fù)合物。蛋白質(zhì)結(jié)合試驗包括但不僅限于測量共沉淀、在非變性SDS聚丙烯酰胺凝膠上共轉(zhuǎn)移以及Western印跡上共轉(zhuǎn)移的方法(如參見，E.C.Hulme，1992，A Practical Approach/The Practical Approach Series(Series Eds D.Rickwood和BD Hames)中的″受體-配體相互作用″，IRL Press at Oxford University Press)。用于這些試驗的EAAT(或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)多肽可以是純化的或重組的。如上所指出的，EAAT(或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)蛋白質(zhì)的重組表達(dá)和純化能用常規(guī)方法來完成。
EAAT或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶蛋白能在體內(nèi)與一種或多種細(xì)胞和細(xì)胞外分子(如，但不僅限于，肽、蛋白質(zhì)、激素、協(xié)同因子和核酸)相互作用，這些分子在此被稱為“結(jié)合體”。已知有方法來鑒定其天然的EAAT體內(nèi)結(jié)合體，如雙和三雜交試驗(如參見。美國專利第5,283,31號；Zervos等，1993，Cell 72223-232；Madura等，1993，J.Biol.Chem.26812046-12054；Bartel等，1993，Biotechniques 14920-924；Iwabuchi等，1993 Oncogene 81693-1696；BrentW094/10300)。這些EAAT或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)結(jié)合體可涉及由EAAT或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶蛋白或EAAT或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶蛋白介導(dǎo)信號途徑的下游元件所造成的信號傳遞，或可選地，發(fā)現(xiàn)可以是EAAT或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶蛋白的抑制劑。通過本發(fā)明的應(yīng)用可設(shè)計現(xiàn)有測試用以鑒定能調(diào)節(jié)(如，如正向或負(fù)向影響)EAAT或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)及其結(jié)合體之間相互作用的化合物。典型地，能干擾EAAT或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)及其結(jié)合體之間相互作用的化合物的試驗包括制備包含EAAT或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)及其結(jié)合體的反應(yīng)混合物，在一定條件下并給予足夠的時間使2種產(chǎn)物相互作用并結(jié)合，進(jìn)而形成復(fù)合物。為了測試試劑的抑制能力，在存在和缺少測試化合物的情況下制備反應(yīng)混合物。在本發(fā)明的范圍內(nèi)也包括直接檢測的方法，該方法無需進(jìn)一步樣品處理就在同質(zhì)或異質(zhì)性試驗中檢測EAAT或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)及其天然結(jié)合體和/或測試化合物之間的相互作用。例如，可用熒光能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(如參見，Lakowicz等，美國專利第5,631,169號；Stavrianopoulos等，美國專利第4,868,103號)。
在一個方面，上述試驗鑒定的試劑可以給藥給實驗動物以測定它們認(rèn)知促進(jìn)和保持活性(如參見以下實施例)。
在一個方面，本發(fā)明描述了一種篩選用于促進(jìn)哺乳動物認(rèn)知功能的化合物的方法，通過向哺乳動物給藥測試化合物，在給藥所述測試化合物后，確定哺乳動物中一種或多種EAAT或AT基因的表達(dá)水平，將基因的表達(dá)水平與沒有給藥測試化合物的哺乳動物神經(jīng)組織中的參考表達(dá)水平進(jìn)行比較，并確定基因表達(dá)水平與相應(yīng)參考水平的差異，其中差異顯示了測試化合物為促進(jìn)認(rèn)知功能的候選治療劑。方法也可進(jìn)一步包括將基因表達(dá)水平與給藥了頭孢曲松或丙戊酸的哺乳動物神經(jīng)組織中的參考水平進(jìn)行比較的步驟。在一個具體實施方式
中，哺乳動物為大鼠，如老年大鼠。
8.治療方法和組合物 本發(fā)明另一個具體實施方式
與具有任何上述治療效果的藥物或無菌組合物以及藥學(xué)上可接受載體的給藥有關(guān)。這些藥物組合物可包含分子，如小分子，其能有益地調(diào)節(jié)與衰老期間保持或促進(jìn)認(rèn)知功能相關(guān)的基因表達(dá)。
發(fā)明人出人預(yù)料地發(fā)現(xiàn)了在大腦神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞周圍的細(xì)胞外空間中，包括突觸間隙和突觸外空間，減少L-谷氨酸水平與衰老期間保持或促進(jìn)認(rèn)知功能相關(guān)。在一個方面，本發(fā)明提供一種保持或促進(jìn)哺乳動物認(rèn)知功能(如，治療與衰老有關(guān)的認(rèn)知功能障礙)的方法，通過增加腦細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)來進(jìn)行。在相關(guān)的方面中，本發(fā)明提供一種減輕哺乳動物與衰老相關(guān)的認(rèn)知功能障礙的方法，其通過增加腦細(xì)胞表達(dá)的谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白的活性來進(jìn)行。
在一個方面，通過向哺乳動物給藥小分子來增加谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)或活性。示例的小分子包括頭孢菌素及其類似物或衍生物、丙戊酸及其類似物或衍生物、MS-153及其類似物衍生物和促代謝谷氨酸受體(mGluR的；參見以上Aronica等所述)的激動劑。小分子可直接增加轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)或活性(如通過與轉(zhuǎn)運蛋白的編碼基因的啟動子相互作用，或通過與蛋白質(zhì)產(chǎn)物本身相互作用)或間接進(jìn)行(如增加蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性，所述蛋白質(zhì)能刺激轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)或活性，或者減少蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性，所述蛋白質(zhì)能抑制轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)或活性)和PACAP(″垂體腺苷酸環(huán)化酶活化因子多肽″)。
其它能增加谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)或活性的示例化合物包括利多卡因(Do等，Anesth Analg.2002 951263-8″The effects of lidocaine onthe activity of glutamate transporter EAAT3the role of proteinkinase C and phosphatidylinositol 3-kinase″) 和激酶抑制劑(如Conradt，J Neurochem.1997681244-51″Inhibition of thehigh-affinity brain glutamate transporter GLAST-1 via directphosphorylation″)。
示例說明但不作為限制的示例的治療化合物在以下章節(jié)會有更詳細(xì)的描述。
8.1示例的治療組合物 示例的小分子，其能有益地調(diào)節(jié)與衰老期間促進(jìn)或保持認(rèn)知功能相關(guān)的基因(如EAAT基因)表達(dá)，其包括式I與頭孢菌素有關(guān)的化合物
其中，每個符號獨立表示 L為O或S； R為H、C1-10烷基、C1-10烷氧基、芳基、芳烷基、-OCH2CO2H； R1為-(CH2)n-C(O)X 其中 X為OH、NR2、SH、O-堿金屬或-OC(CH3)OC(O)OCH(CH3)2； 和 n為0-6并且包括0和6的整數(shù)； R2為H、C1-10烷基、C2-8鏈烯基或-(CH2)a-W-R3 其中R3為H、C1-10烷基、-C(O)C1-10烷基、-C(O)NR2、芳基、芳烷基或A； W為O、S或NR4；和 a為1-6并且包括1和6的整數(shù)； 其中R4為H、C1-10烷基、-C(O)C1-10烷基、芳基、芳烷基或R3和R4一起可形成未取代的或取代的雜烷基或雜芳基環(huán)；

線表示單或雙鍵； R5為R1、H、SO3H、芳基、C1-10烷基、芳烷基；或當(dāng)

線為雙鍵時，R5選自＝CHCH2CO2H和＝NR； m為0或1；和 A為式Ia的芳基或雜芳基
其中，每個符號獨立表示 J為O、S、NR6或CR6；和 y為1或2； 其中R6為電子對、H、C1-10烷基、C1-10烷氧基、芳基或-NR2；或A為式Ib或Ic的雜環(huán)烷基
其中，每個符號獨立表示 J為O、S或NR；和 X為O或H2。
式I所述特定類型的化合物包括″頭孢曲松″，其指廣譜的頭孢菌素抗生素，(6R，7R)-7-[2-(2-氨基-4-噻唑基)乙醛酰氨基]-8-氧代-3-[[(1，2，5，6-四氫-2-甲基-5，6-二氧代-旁-三嗪-3-基)硫基]甲基]-5-硫雜-1-氮雜二環(huán)[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸，72-(Z)-(O-甲基肟)，二鈉鹽，倍半水合物。頭孢曲松可從Roche的商業(yè)渠道獲得，商品名為Rocephin。制備化合物分子式的方法可在例如，美國專利第5,574,155；5,739,346；5,856,502；5,869,649；5,945,414；5,945,532 6,090,801號中找到。頭孢曲松衍生物包括任意第三代頭孢菌素，其能殺死好氧的革蘭氏陰性桿菌。第三代頭孢菌素的例子有頭孢磺吡芐、頭孢氨噻、頭孢唑肟、頭孢曲松、頭孢哌酮、拉氧頭孢和頭孢他啶。
其他能有益地調(diào)節(jié)與衰老期間促進(jìn)或保持認(rèn)知功能相關(guān)的基因(如EAAT基因)表達(dá)的小分子的例子包括與丙戊酸有關(guān)的式II的化合物
其中，每個符號獨立表示 X為-OH、C1-10烷氧基、-O-堿金屬、-N(R1)2、-SH或-S-C1-10烷基； R為直鏈或支鏈C1-30烷基；和 R1為H、C1-10烷基、C2-10鏈烯基、C2-10炔基、芳基或芳烷基； 條件是R可以是未取代的或由一個或多個-OH、C1-10烷氧基、-N(R1)2、-SH、-S-C1-10烷基或芳基取代。
式II所述特定類型的化合物包括″丙戊酸″，其指抗痙攣的藥物2-丙基戊酸，其與增加大腦γ-氨基丁酸(GABA)的濃度有關(guān)。在此也列出丙戊酸其他名稱或說明，如DepakoteTM、ValproateTM、ValreleaseTM和丙戊酸鈉。制備化合物分子式的方法可在例如，美國專利第4,558,070；4,595,695；4,654,370；4,895,873；4,913,906；5,017,613；5,019,398；5,049,586；5,162,573；5,440,023；5,856,569；6,131,106和6,610,326號中找到。
其他能有益地調(diào)節(jié)與衰老期間促進(jìn)或保持認(rèn)知功能相關(guān)的基因(如EAAT基因)表達(dá)的小分子的例子包括與(R)-(-)-5-甲基-1-煙?；?2-吡唑啉有關(guān)的式III的化合物
其中，每個符號獨立表示 R為H、C1-C10烷基、C2-C10鏈烯基、C2-C10炔基、芳基或芳烷基； R1為H、C1-C10烷基、C2-C10鏈烯基、C2-C10炔基、芳基或芳烷基； R2為包含1-4個雜原子的雜環(huán)或雜芳基環(huán)，雜原子選自N、O或S； L為O、S或NR；和 X為CR2、O或S。
式III所述特定類型的化合物包括(R)-(-)-5-甲基-1-煙酰基-2-吡唑啉(MS-153)。
還包括在本發(fā)明方法中的有藥學(xué)上可接受的加成鹽和式I、II和III化合物的復(fù)合物。在化合物可有一個或多個手性中心的情況下，除非特別指明，本發(fā)明包括每個獨特的外消旋化合物和每個獨特的未外消旋的化合物。在化合物有不飽和碳-碳雙鍵的情況下，順式(Z)和反式(E)異構(gòu)體都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在抑制劑以互變異構(gòu)體的形式存在的情況下，如酮-烯醇互變異構(gòu)，如

和

，每種互變異構(gòu)體的形式都被認(rèn)為包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，無論存在于等式或以合適R′取代來形成一種形式。任何取代基在任何一個符號位的意義是獨立表義的，或任何其他取代基的意義，在任何其他符號位也是如此。
也包括在本發(fā)明的方法中的有式I、II和III化合物的前藥。
本發(fā)明所用的藥物組合物可以通過任何途徑給藥，包括但不限于，口服、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動脈內(nèi)、脊髓內(nèi)、 鞘內(nèi)、心室內(nèi)、經(jīng)過皮膚、皮下、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、腸道、局部、舌下或直腸給藥的方法。
組合物可以單獨或與至少一種其他試劑聯(lián)合給藥，如與穩(wěn)定化合物，其可包含于任何無菌、生物相容的藥物載體中給藥，載體包括但不限于，鹽水、緩沖鹽液、葡萄糖和水。組合物可以單獨或與其他試劑、藥物或激素聯(lián)合向患者給藥。
本發(fā)明組合物所含的某些化合物可以以特定幾何或立體異構(gòu)體的形式存在。另外，本發(fā)明的聚合物也可以有光學(xué)活性。本發(fā)明涵蓋了所有這些化合物，包括順-和反-異構(gòu)體、R-和S-對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、(D)-異構(gòu)體、(L)-異構(gòu)體、其外消旋混合物和其他混合物，都落入本發(fā)明的范圍之內(nèi)。其他不對稱的碳原子可存在于取代基中，如烷基。所有這些異構(gòu)體及其混合物都要包含在本發(fā)明中。
例如，如果需要本發(fā)明化合物的特定對映異構(gòu)體，可以通過非對稱合成或通過手性輔助化合物衍生來制備，其中最終非對映異構(gòu)體混合物被分離并裂解輔助基團(tuán)從而提供純的所需的對映異構(gòu)體?？蛇x地，當(dāng)分子包含諸如氨基的堿性基團(tuán)或諸如羧基的酸性基團(tuán)時，用合適的光學(xué)活性酸或堿來形成非對映異構(gòu)體，接著溶解非對映異構(gòu)體，從而通過現(xiàn)有的分級結(jié)晶或?qū)游龇▉硖幚恚又@得純的對映異構(gòu)體。
為了本發(fā)明的目的，根據(jù)CAS版，Handbook of Chemistry andPhysics，67版.，1986-87，內(nèi)封面的元素周期表來鑒定化學(xué)元素。也是為了本發(fā)明的目的，術(shù)語″碳?xì)浠衔铩逯赴ㄋ芯哂兄辽僖粋€氫和一個碳原子的所有允許的化合物。在廣義的方面，允許的碳?xì)浠衔锇o環(huán)和環(huán)狀、分支和未分支、碳環(huán)和雜環(huán)、芳香族和非芳香族的有機(jī)化合物，其可以被取代或未被取代。
8.2治療組合物 在此所述的組合物的預(yù)期的等價物包括相當(dāng)于此處組合物的并與其具有相同共性的組合物，其中取代基或成分進(jìn)行一種或多種簡單的變化而又不為感興趣的組合物的特性帶來不利影響。
除了活性成分，如一種或多種治療劑，本發(fā)明的藥物組合物可以包含合適的藥學(xué)上可接受的載體，其包含能幫助活性化合物制備成藥學(xué)上使用的制劑的賦形劑和輔劑。更詳細(xì)的配伍和給藥技術(shù)可在最新版的Remington′s Pharmaceutical Sciences(Maack Publishing Co.，Easton，Pa.)中找到。
用現(xiàn)有藥學(xué)上可接受載體與口服的藥物組合物配伍，以適合的劑量口服給藥。這些載體能使藥物組合物配成片劑、丸劑、糖錠、膠囊、液體、凝膠、糖漿、膏劑、懸浮劑等等，由患者來攝取。
通過將活性化合物與固相賦形劑組合并最終處理成來獲得口服的藥物制劑并最終處理成顆粒狀混合物(任選在磨碎后)從而獲得片劑或糖錠的核心。如需要，可加入合適的輔劑。合適的賦形劑包括碳水化合物或蛋白質(zhì)填料，如糖，其包括乳糖、蔗糖、甘露糖和山梨醇；淀粉，其來自玉米、小麥、水稻、馬鈴薯或其他植物；纖維素，如甲基纖維素、羥基丙基甲基-纖維素或羧甲基纖維素鈉；樹膠，包括阿拉伯膠和黃芪膠；和蛋白質(zhì)，如明膠和膠原蛋白。如果需要，加入破碎或增溶的試劑，如交聯(lián)的聚乙烯基吡咯烷酮、瓊脂和褐藻酸或其鹽，如褐藻酸鈉。
糖錠的核心可與合適的包衣聯(lián)合使用，如濃縮的糖溶液，其也可包含阿拉伯膠、滑石粉、聚乙烯基吡咯烷酮、聚羰乙烯膠、聚乙烯基乙二醇和/或二氧化鈦，紫膠漆溶液，和合適的有機(jī)溶劑或溶劑混合物。染料或色素也可加入到片劑或糖錠包衣中從而區(qū)分產(chǎn)物或表征活性化合物的量，即劑量。
能口服使用的藥物制劑包括由明膠制成的適合推送的膠囊，以及由明膠和包衣制成的密封軟膠囊，如甘油或山梨醇。適合推送的膠囊能包含與填料或粘合劑混合在一起的活性成分，如與乳糖或淀粉，潤滑劑，如滑石粉或硬脂酸鎂，并任選有穩(wěn)定劑。在軟膠囊中，活性化合物可溶于或懸浮于合適的液體中，如脂肪油，液體，或液體的聚乙烯基乙二醇，并混有或沒有穩(wěn)定劑。
適合胃腸外給藥的藥物配方可以以水溶液配伍，優(yōu)選以生理相容的緩沖液，如Hanks溶液，Ringer溶液，或生理鹽水。注射懸浮水劑可包含增加懸浮液粘性的物質(zhì)，如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。另外，活性化合物的懸浮液可以制備成合適的注射懸浮油劑。合適的親脂性溶劑或載體包括脂肪油，如芝麻油或合成脂肪酸酯，如乙基油酸，甘油三酯或脂質(zhì)體。非脂聚陽離子氨基聚合物也可用于遞送。任選地，懸浮液液可包含合適的穩(wěn)定劑或試劑以增加化合物的溶解性并能制備高濃度溶液。
對于局部或鼻部給藥，適合穿過特定屏障的滲透劑用于配方中。這些滲透劑一般是公知的。
本發(fā)明藥物組合物可以現(xiàn)有已知的方式來制備，如通過常規(guī)的混合、溶解、制粒、制糖錠、細(xì)磨、乳化、制膠囊、包埋或凍干過程的方式。
藥物組合物可制成鹽并與許多酸一起形成，包括但不限于，鹽酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸和琥珀酸。相對于那些相應(yīng)的游離堿的形式。鹽傾向于更易溶于水或其他質(zhì)子化溶劑中。在其他情況下，優(yōu)選的制劑可以是凍干粉，其可包含以下之任意或全部1mM至50mM的組氨酸，0.1％至2％蔗糖和2％至7％甘露糖，其pH范圍為4.5至5.5，其與前面的緩沖液組合使用。
制備出藥物組合物之后，可將它們置于合適的容器中并標(biāo)記能用于明確病情的治療。對于頭孢曲松的給藥，例如，這樣的標(biāo)記將包括用量、頻率和給藥方法。
適用于本發(fā)明的藥物組合物包括組合物，其中包含有效量的活性成分以獲得要求的目的。確定有效劑量完全在所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍中。
對于任何化合物，最初可在細(xì)胞培養(yǎng)試驗中估算有效治療劑量，如根據(jù)上述的Aronica等的方法，或在動物模型中估算，如在小鼠、大鼠、兔、狗或豬中。動物模型也可用于確定給藥的和時濃度范圍和途徑。如此述所述，尤其優(yōu)選的動物模型使用有行為特點的鼠。然后可用這些信息確定人中的有用劑量和給藥途徑。
有效治療劑量指活性成分的量，例如頭孢曲松、頭孢曲松類似物、頭孢曲松衍生物、丙戊酸、丙戊酸類似物、丙戊酸衍生物、MS-153、MS-153類似物或MS-153衍生物，其能改善癥狀或病情?？赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)流程在細(xì)胞培養(yǎng)中或用實驗動物來確定療效和毒性，如通過計算ED50(在群體的50％中有效治療的劑量)或LD50(使群體的50％致死的劑量)統(tǒng)計值。療效比毒效的劑量比率為治療參數(shù)，其能以LD50/ED50來表示。優(yōu)選顯示大的治療參數(shù)的藥物組合物。細(xì)胞培養(yǎng)試驗和動物研究中獲得的數(shù)據(jù)用于闡明人所用的劑量范圍。這些組合物中所含的劑量優(yōu)選處于循環(huán)濃度的范圍內(nèi)，其包括很小的ED50或沒有毒性。根據(jù)所用的劑量形式、患者的敏感性和給藥途徑，劑量可在該范圍內(nèi)變化。
由從業(yè)人員根據(jù)與需要治療的個體相關(guān)的因素來確定精確的劑量。調(diào)節(jié)劑量和給藥以提供足夠的活性部分的水平或保持預(yù)期的效果。要考慮的因素包括認(rèn)知功能障礙的程度、個體的健康概況、年齡、體重、個體的性別、給藥的時間和頻率、藥物組合、反應(yīng)敏感性、以及對治療的反應(yīng)。根據(jù)特定配方的半衰期和清除率，長效的藥物組合物的給藥可以每3至4天，每周，或每兩周一次。
根據(jù)給藥途徑，普通劑量可在約0.1μg至100,000μg間變化，總劑量至多約1克。特定劑量和遞送方法的指導(dǎo)已在文獻(xiàn)中提供了并一般可供所屬領(lǐng)域從業(yè)人員使用。
為了在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的靶上取得治療效果，所述靶如EAAT1、2、3、4或5，本發(fā)明方法中所用的化合物在外周給藥時應(yīng)當(dāng)能容易地穿過血腦屏障?？墒牵荒艽┻^血腦屏障的化合物人能通過諸如心室內(nèi)給藥途徑直接有效地進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。
術(shù)語″藥學(xué)上可接受的鹽″為公認(rèn)的表述，其指化合物的相對無毒的、無機(jī)和有機(jī)酸加成鹽，包括例如，本發(fā)明組合物所包含的那些。
術(shù)語″藥學(xué)上可接受的載體″為公認(rèn)的表述，其指藥學(xué)上可接受的的材料、組合物或載體，如液體或固體填料、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包裝膠囊的材料，它們涉及運載或運輸任何特定組合物或其成分，從身體的一個器官或部分運至身體的另一個器官或部分。每種載體必須是“可接受的”，其意義為能與特定組合物及其成分相容并對患者無害。一些可用作藥學(xué)上可接受載體的材料的例子包括(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；(3)纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉，乙基纖維素和醋酸纖維素；(4)粉狀黃芪膠；(5)麥芽；(6)明膠；(7)滑石粉；(8)賦形劑，如可可油和栓劑的蠟；(9)油，如花生油、棉子油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和豆油；(10)乙二醇，如丙烯基乙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙烯基乙二醇；(12)酯，如乙基油酸和乙基月桂酸；(13)瓊脂；(14)緩沖劑，如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15)褐藻酸；(16)無熱原的水；(17)等滲鹽水；(18)Ringer溶液；(19)乙基乙醇；(20)磷酸緩沖液；和(21)其他用于藥物配方中的無毒相容的物質(zhì)。
術(shù)語″系統(tǒng)給藥″、″系統(tǒng)地給藥″、″外周給藥″和″外周性給藥的″為公認(rèn)的表述，其指除了直接向中樞神經(jīng)系統(tǒng)給藥外，向個體給藥組合物、治療或其他材料，從而使之能進(jìn)入患者的系統(tǒng)，并由此影響代謝和其它類似過程，例如，皮下給藥。
術(shù)語″腸胃外給藥″和″腸胃外給藥的″為公認(rèn)的表述，其指除了腸道和局部給藥之外的給藥模式，通常通過注射進(jìn)行，其包括但不僅限于，靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、被膜內(nèi)、眼眶內(nèi)、心臟內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)過氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、以及胸骨內(nèi)注射和輸液。
9.實施例 本發(fā)明，如一般所述的那樣，可以容易地通過參考以下實施例來理解，包括的實施例僅僅為了說明本發(fā)明的某些方面和具體實施方式
，其并不以任何方式來限制本發(fā)明。
9.1表征年輕、年老有障礙的(AI)和年老無障礙的(AU)動物 9.1.1 Morris水迷宮(MWM)和輻射臂狀迷宮(RAM)的受試者 我們用MWM對9只年輕(4-6個月)和18只年老(25-27個月)無病的雄性Long-Evans鼠進(jìn)行行為測試并用相同的動物進(jìn)行微陣列分析。另外10只年老的鼠在MWM中測試，然后在RAM中進(jìn)行訓(xùn)練和測試，經(jīng)過兩項任務(wù)用以評估對認(rèn)知功能中個體差異的測試-再測試的可靠性。
9.1.2 Morris水迷宮的設(shè)備 MWM的設(shè)備由注水(27℃)的大圓形池(直徑1.83m；高度0.58m)組成，其中通過添加無毒色素或一些其他物質(zhì)來使之不透明。在典型的“隱藏平臺”版任務(wù)中，訓(xùn)練鼠尋找偽裝的白色逃跑平臺(高度34.5cm)，該平臺位于迷宮一個四分之一部分的中心，低于水平面僅1.0cm。該平臺能縮進(jìn)桶的底部或在行為測試期間從迷宮外面升至其正常位置。該平臺的位置在一個實驗至另一個實驗中保持恒定。因為沒有位置線索來標(biāo)記平臺的位置，所以鼠從池子周邊任何起始位置上有效定位的能力依賴于使用迷宮周圍的信息。迷宮用綴有白色圖案的黑色簾布來包圍以提供空間線索構(gòu)造。第二個平臺(高37.5cm)，其表面為黑色，在線索訓(xùn)練期間將其升至高于水面2cm，使用人物版本來控制不與認(rèn)知相關(guān)的因素。鼠在池中的行為用懸掛在池中央2.5m上面的照相機(jī)來記錄，照相機(jī)與視頻跟蹤系統(tǒng)(HVS高級圖像跟蹤器VP200)和運行HVS軟件的PC計算機(jī)相連，它們由Richard Baker的HVSImage，Hampton，英國開發(fā)。
9.1.3 Morris水迷宮過程 針對認(rèn)知的衰老效應(yīng)的靈敏度并針對遠(yuǎn)系繁殖的Long-Evans鼠的年老群體中個體差異的可靠測量，我們優(yōu)化了MWM規(guī)程(GallagherM，Burwell R，Burchinal M.Behav.Neurosci.107618-626；1993)。
鼠每天接受3項試驗，試驗之間間隔60秒，連續(xù)進(jìn)行8天。在每個訓(xùn)練試驗中，鼠從池周邊四個空間等分的起始位點之一釋放入迷宮。起始位點在試驗之間發(fā)生變化，因此防止使用響應(yīng)策略(如，總是從起始位置左拐來定位逃離平臺)。如果鼠在任何試驗中在90秒內(nèi)沒有定位出逃離平臺，則實驗人員向鼠指示平臺，其中保持30秒。每6次試驗包括一個探測試驗以評估迷宮中空間偏好的發(fā)展。在這些試驗中，鼠在平臺縮回池底時游30秒，到時平臺升至其普通位置來完成逃離試驗。在用隱藏平臺來完成規(guī)程中，用可視的平臺來評估鼠的線索學(xué)習(xí)。在一個6個訓(xùn)練試驗期中，該平臺的位置在各個試驗之間發(fā)生改變。
按照分析訓(xùn)練試驗和探測試驗成績的目的，我們用接近的動物位置。通過取樣迷宮中動物的位置(10X/秒)來獲得接近測定值從而提供在平均1秒內(nèi)逃離平臺的距離記錄。對于探測試驗和訓(xùn)練試驗，執(zhí)行糾正過程從而使試驗成績相對無偏差，該偏差由池周邊各個起始位置到目標(biāo)的差異而造成的。在進(jìn)行該糾正中，為每此試驗計算平均游速(路徑長度/潛伏期)。然后在計算試驗成績前，從記錄中減去以該速度從試驗中所用的起始位置游到目標(biāo)所需的時間，即在訓(xùn)練試驗中的累積距離和探測試驗中目標(biāo)的平均距離。所以，設(shè)計用接近測量獲得的得分來反映搜索錯誤，代表了最佳搜索的偏差，即至目標(biāo)的直接路徑并在探測試驗期間在該位置緊鄰處搜索。
9.1.4 Morris水迷宮分析 編譯視頻追蹤的計算機(jī)記錄以提供迷宮中每個鼠成績數(shù)據(jù)。用變化分析來分析對訓(xùn)練試驗和探測試驗的測定值。
9.1.5 Morris水迷宮的數(shù)據(jù)結(jié)果 隱藏、偽裝平臺中的訓(xùn)練成績在年輕和年老組的鼠之間有差異[F(1，23)＝12.69，p＜.002]。對于可視平臺中的線索訓(xùn)練試驗，組之間沒有產(chǎn)生差異。在線索訓(xùn)練中逃離的潛伏期為年輕的平均是9.36秒，而年老鼠是10.60秒。
以內(nèi)插值替換的探測試驗中的平均接近測量值用于對每個單個受試者計算空間學(xué)習(xí)指數(shù)，其具體如Gallagher M，Burwell R，BurchinalM.Behav.Neurosci.107618-626；1993所述。當(dāng)鼠快速學(xué)會搜索接近其位置的平臺時，其空間指數(shù)低?？傮w來說，年老的鼠與年輕的有差異[F(1，23)＝15.18，p＜.001]。相對于年輕學(xué)習(xí)群體的學(xué)習(xí)指數(shù)譜，年老的鼠分成無障礙或有障礙的。處在年輕鼠的標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)(指數(shù)得分＜241)的年老的鼠定為年老無障礙的(圖1)。指數(shù)得分處于年輕成績范圍之外的余下的年老個體定為年老有障礙的。
9.1.6輻射臂狀迷宮的設(shè)備 升高的八臂狀輻射迷宮的每個臂(7×75cm)從八邊形中心平臺(30cm直徑，51.5cm高)的每個面上突出來。臂上的清晰側(cè)面墻有10cm高并以65°夾角形成槽。食物孔(4cm直徑，2cm深)位于每個臂的末端。樹脂玻璃構(gòu)建的塊(30cmH×12cmW)安置以阻擋任何臂的入口。在圍繞設(shè)備的室中提供了許多其它的迷宮線索并通過高過頭的固定設(shè)備來照明。
9.1.7輻射臂狀迷宮流程 首先讓鼠在8分鐘期間習(xí)慣于迷宮，連續(xù)進(jìn)行4天。在這些期間的每一個中，在RAM上散布著獎勵食物，最初放在平臺中心和臂上，然后漸進(jìn)地就放到臂上了。在該習(xí)慣階段后，使用標(biāo)準(zhǔn)訓(xùn)練規(guī)程，其中食物小球位于每個臂的末端。鼠每天接受一次試驗，進(jìn)行18天；當(dāng)所有8個食物小球都被獲取了或已進(jìn)行了16個選擇或過去了15分鐘，則終止每天的試驗。錯誤包括回到已經(jīng)取掉食物的臂上(所有4個爪子都抓在臂上)。該階段結(jié)束后，通過在試驗期間加入延遲來增加要求記憶力的任務(wù)。堵住每個試驗中3個臂的開口。封閉的臂的特性和構(gòu)造在試驗之間發(fā)生改變。使鼠在5個臂上獲取食物，所述的臂在試驗一開始就允許進(jìn)入。然后從迷宮中去除鼠60秒，在此時間中去除迷宮上的障礙，由此允許進(jìn)入所有8個臂。然后將鼠放回平臺中心，使其獲取剩下的獎勵食物。
9.1.8輻射臂狀迷宮分析 在測試試驗中用60秒使記憶力發(fā)生錯誤，這時鼠回到5個在延遲前已訪問過的臂中的一個。在4個連續(xù)的測試試驗中計算每只鼠的成績的平均值。利用參數(shù)統(tǒng)計(非配對的t-測驗)來比較年輕和年老組之間的成績。利用相關(guān)性分析(Pearson氏r)來檢測年老鼠(N＝10)在Morris水迷宮(學(xué)習(xí)指數(shù)得分)和輻射臂狀迷宮(記憶力錯誤)間成績的關(guān)系。
9.1.9輻射臂狀迷宮的結(jié)果 在RAM的延遲版中的年輕成年鼠的成績以延遲間隔的函數(shù)變化，變化范圍在60秒至8小時(Chappell等Neuropharmacology 37481-488，1998)。以前在MWM中表征的年老鼠相對于年輕鼠，在60秒延遲后發(fā)生了更多的記憶力錯誤(p＜.025)。平均年輕鼠發(fā)生0.17個錯誤，而年老的鼠平均發(fā)生1.52個錯誤。可是，10只年老的鼠在RAM中顯示出廣泛范圍的成績。發(fā)現(xiàn)在最初的MWM表征和在RAM中記憶力成績顯著相關(guān)(r值＝.82，數(shù)據(jù)如圖2所示)。
9.2年輕、年老有障礙(AI)和年老無障礙(AU)動物中的基因表達(dá)分析 9.2.1從有行為特征的動物中制備RNA 27只有行為特征的鼠(數(shù)據(jù)如圖1所示)用過量的戊巴比妥鈉(100mg/kg)殺死。從兩側(cè)分離海馬并凍存(-80℃)。稱重每個動物的海馬并在合適體積的苯酚-鳥糞胺異硫氰酸(Trizol試劑；1ml每100mg的組織中最少用1ml體積)中均漿。用氯仿(每ml的Trizol用200μl)抽提每個樣品并用異丙醇沉淀。空氣干燥RNA小球并重懸于DEPC處理水溶液中。所有樣品儲存于-80℃。根據(jù)廠商說明，用Qiagen′s Rneasy少量RNA提取試劑盒來進(jìn)一步純化一部分RNA并接著儲存于-80℃。通過測定260nm處的吸收光來定量樣品并用260nm和280nm處的吸收比率來確定純度。通過瓊脂糖凝膠電泳來確證樣品的完整性和濃度。掃描瓊脂糖凝膠的照片，利用NIH-成像來轉(zhuǎn)化并定量像素。然后如果需要，可調(diào)節(jié)濃度。
對于基因微陣列分析，匯總同一表型的3種(為Y，AI或AU)鼠的樣品來對3種GeneChip

/表型的樣品大小產(chǎn)生獨立的微陣列分析。根據(jù)MWM中空間學(xué)習(xí)指數(shù)獲得的行為特征，匯總組織到表I中。
表I 9.2.2反轉(zhuǎn)錄和與微陣列的雜交 用Affymetrix Enzo生物陣列高產(chǎn)RNA轉(zhuǎn)錄標(biāo)記系統(tǒng)制備用于雜交的cRNA標(biāo)記探針。將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并轉(zhuǎn)化成生物素標(biāo)記的cRNA。反轉(zhuǎn)錄之前，加入每種標(biāo)記系統(tǒng)所提供的內(nèi)在標(biāo)準(zhǔn)以測試RNA。然后在進(jìn)行實驗性GeneChip

雜交前，在對照芯片上測試cRNA以保證反轉(zhuǎn)錄和標(biāo)記是最優(yōu)的。將cRNA應(yīng)用于U34A AffymetrixGeneChip

陣列中。這些陣列包括7000個鼠的表達(dá)基因和1000個EST的特異序列，并包括最近開發(fā)的、較小的神經(jīng)科學(xué)基因微陣列上的所有基因?；蛐酒瑧?yīng)用流體儀自動將標(biāo)記的導(dǎo)入到基因陣列上并在基因芯片雜交箱中進(jìn)行雜交。用以共聚焦激光掃描為基礎(chǔ)的基因陣列掃描儀來檢測并定量每個寡聚體集合的雜交信號。
9.2.3微陣列的數(shù)據(jù)分析 基因芯片分析套件和Affymetrix MAS4.0以及更近開發(fā)出的MAS5.0算法用于我們的數(shù)據(jù)分析。兩個算法都有默認(rèn)的初始值，其基于已知的陰性基因和每個芯片的平均信號強(qiáng)度?；谟葾ffymetrix預(yù)先確定的寡核苷酸集合的標(biāo)準(zhǔn)化和計數(shù)方法被用于基因芯片間的比較。兩個算法都產(chǎn)生與每個表達(dá)基因相對應(yīng)的完全匹配(PM)的寡聚物的每個集合的表達(dá)水平值，該值是相對于不匹配(MM)的寡聚物的集合的，設(shè)計用來計算抑制完全匹配的cRNA雜交所需改變的堿基。MAS4.0經(jīng)驗算法用原始數(shù)據(jù)來產(chǎn)生平均差異調(diào)用，其提供了每個基因的PM寡聚物相對于對照MM寡聚物的雜交信號強(qiáng)度的測量方法。存在(P)，邊際(M)，或缺少(A)的絕對調(diào)用是以PM寡聚物的數(shù)量為基礎(chǔ)的，其與MM寡聚物正相關(guān)。MAS5.0統(tǒng)計算法基本根據(jù)相同類型的比較但應(yīng)用統(tǒng)計方法來產(chǎn)生p值以增強(qiáng)當(dāng)前反映的表達(dá)水平高于背景的調(diào)用可能性。另外，將統(tǒng)計學(xué)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用于信號算法以計算雜交信號強(qiáng)度，其要能最小化每個探針的PM和MM寡聚物內(nèi)逸出值的影響。體現(xiàn)表達(dá)水平的數(shù)據(jù)中的基本差異由2個算法來生成，其就是設(shè)計MAS5.0來減少陰性表達(dá)水平，該陰性表達(dá)水平會導(dǎo)致高估2個比較組間改變了表達(dá)水平的基因數(shù)量?？偟膩碚f，從每個寡聚物集合用MAS5.0得來的信號小于用MAS4.0的。
我們的模型的能力部分在于比較Y，AU和AI這3組的能力，從而鑒定那些基因，所述基因會在年輕和年老的海馬之間產(chǎn)生改變并由此一般與衰老過程相關(guān)，并鑒定那些區(qū)分AU和AI鼠的基因。通過該過程鑒定出的基因特異地與衰老-認(rèn)知功能障礙或保持認(rèn)知功能相關(guān)。
在此處產(chǎn)生的公開數(shù)據(jù)中，我們進(jìn)行了一系列分析步驟以鑒定3個年老和認(rèn)知功能障礙模型的信息基因集。集合1包括感興趣的基因，其不同于年輕的而只有年老的功能。集合2包括感興趣的基因，其在有障礙的年老鼠中相對于年輕和年老無障礙的產(chǎn)生了改變。集合3(被稱為年老無障礙的基因)由基因組成，所述基因在年老無障礙的中相對于年輕和年老有障礙的產(chǎn)生了改變，并因此可以與衰老誘導(dǎo)的認(rèn)知功能保持有關(guān)。在MAS5.0分析前從完整微陣列數(shù)據(jù)集中產(chǎn)生出每種集合，然后用相似的算法進(jìn)行效果大小分析。
在此處我們描述了產(chǎn)生集合3(年老無障礙的基因)的步驟，其中包括了谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白。在第一步中，芯片上所有探針集合的值代表年輕鼠(N＝3)中的基因表達(dá)并檢測年老有障礙(N＝3)的檢測標(biāo)準(zhǔn)。從進(jìn)一步考察中去掉所有用MAS5.0分析的絕對調(diào)用中未達(dá)到檢測標(biāo)準(zhǔn)的探針對的集合。然后行簡單的效果分析以確定芯片上2組(年輕和年老有障礙的)的值的效果大小相差不超過1.0。所有探針集達(dá)到所有檢測標(biāo)準(zhǔn)和匯總在比較組中的標(biāo)準(zhǔn)(年輕和年老有障礙的效果大小相差不超過1.0或更大)。對這些匯總的年輕和年老有障礙的集合與年老無障礙芯片的相應(yīng)探針集進(jìn)行簡單的效果分析。簡單效果分析產(chǎn)生384個探針集，代表能保持衰老誘導(dǎo)的認(rèn)知功能的“感興趣的基因”，效果大小為1.25或更大。顯著性推論統(tǒng)計測試的有力分析表明微陣列試驗的樣品大小(3個年老無障礙的芯片和6個匯總比較組的芯片)能以p＜.05檢測到80％強(qiáng)的基因有2.5或更大的效果大小差異?，F(xiàn)在接下來用9個年老無障礙的和每個比較組(年輕和年老有障礙)中有9個受試者的樣品大小進(jìn)行的分析中，預(yù)計效果大小為1.25及以上的會有80％的統(tǒng)計學(xué)可能。
9.2.4微陣列的結(jié)果 在人和嚙齒動物神經(jīng)系統(tǒng)中檢測到了谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白的差異表達(dá)(圖3)。這些轉(zhuǎn)錄子中的2個沒有在海馬結(jié)構(gòu)中表達(dá)(EAAT4和EAAT5)。剩下的3個轉(zhuǎn)錄子在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中有不同的細(xì)胞位置模式，其都在海馬中表達(dá)。在GLT-1具有5.87(年老無障礙基因的效果大小分析中的最大值)效果大小的微陣列數(shù)據(jù)集和GLAST中年老無障礙基因(集合3)的效果大小分析中，第二個谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白具有1.93的效果大小(圖4)。在兩種情況下，相對于匯總比較的年輕和年老有障礙的，谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白mRNA都在無障礙年老的鼠中增量。如微陣列實驗設(shè)計有力分析所預(yù)期的，相對于比較年輕和年老有障礙的，GLT1 mRNA顯著增加了(p＜.0002)。在相似的分析中，GLAST也顯著增加了(p＝.0484；圖4)。
相對于年輕和年老有障礙的，年老無障礙的天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶mRNA的差異也顯示了谷氨酸在年老并保持認(rèn)知功能的鼠中也受差異調(diào)節(jié)。天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶是一種細(xì)胞外谷氨酸失活的主要機(jī)制，其探針集顯示相對于不互相有差異的Y+AI，在AU鼠中有顯著的增長。mRNA的效果大小為2.58。
微陣列上的探針集為鑒定了的垂體腺苷酸環(huán)化酶活化因子多肽的基因(PACAP；GenBank登錄號AI227715；EST224410)，其調(diào)節(jié)谷氨酸轉(zhuǎn)運和代謝(Figiel和Engele，J.Neurosci.153596-3605，2000)。相對于比較年輕和年老有障礙的鼠，PACAP mRNA在年老無障礙的中顯著升高了(效果大小為3.29，t＝4.13，p＜.005；圖4)。
因為PACAP受體是顯示脫敏作用的類型，所以β-抑制蛋白2mRNA的強(qiáng)烈增加可對谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白起作用。β-抑制蛋白2具有雙重功能，即受體內(nèi)吞作用和通過同一受體來介導(dǎo)信號級聯(lián)反應(yīng)(Wei等，PNAS，100；10782-7，2003；Aha等，PNAS，100；1740-4，2003；如，GenBank登錄號XM_345084)。相對于比較年輕和年老有障礙的，年老無障礙鼠中β-抑制蛋白2的探針集顯示出顯著的升高(效果大?。?.78，t＝2.59，p＜.05)。
9.2.5原位雜交組化分析 接下來用獨立的動物集合(每組N為3或4)利用海馬切片進(jìn)行原位雜交組化分析。
9.2.6原位雜交探針的制備 我們有反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)來產(chǎn)生與谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白相對應(yīng)的特異探針，其中通過微陣列分析已鑒定了該蛋白在AU鼠海馬中起上調(diào)作用。年老鼠(具有(AU)得分或不在(AT)年輕動物得分內(nèi)的動物集)海馬中制得的RNA用寡聚T和反轉(zhuǎn)錄酶來進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。然后將該cDNA用作正義和反義寡聚物探針(表II)在第一輪PCR反應(yīng)中的模版來擴(kuò)增雙鏈與下述特定谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白對應(yīng)的cDNA。使用標(biāo)準(zhǔn)PCR條件(94℃初始變性4分鐘，72℃退火40秒，35個循環(huán)為94℃變性30秒，55℃退火30秒并72℃延伸30秒，72℃最后延伸4分鐘并降溫至4℃)。PCR的整個產(chǎn)物在溴化乙錠-瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳以確證產(chǎn)生了合適大小的探針。用每個擴(kuò)增出的cDNA和延長的寡聚物(表II)進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，所述寡聚物包括與SP6啟動子序列相應(yīng)的正義寡聚物加上最初用于延伸每種谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白PCR產(chǎn)物的正義寡聚物，以及包括T7啟動子序列和最初每種谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白反義寡聚物的反義寡聚物。這分別用正義和反義鏈上的SP6和T7啟動子產(chǎn)生出特異性谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白cDNA。用乙醇沉淀收集PCR產(chǎn)物并用自動DNA測序儀和SP6引物來確證核苷酸序列。
確證了序列的與每種谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白相對應(yīng)的帶有SP6和T7啟動子位點的PCR產(chǎn)物用于體外DNA直接轉(zhuǎn)錄出每種第二輪谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白PCR產(chǎn)物的正義和反義RNA。進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，使用了每種PCR產(chǎn)物，SP6或T7聚合酶(每種探針的分別反應(yīng)中所用的每個酶)，未標(biāo)記的核苷三磷酸和高度特異活性的35S標(biāo)記的尿苷三磷酸。這些反應(yīng)產(chǎn)生了3種放射性標(biāo)記的反義谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白探針，其通過堿基配對特異識別組織切片中每種不同的谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白mRNA，并產(chǎn)生了相應(yīng)的正義探針，其包含與谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白mRNA相同的序列，其不能與mRNA進(jìn)行堿基配對并用作陰性對照。反義探針與Y，AU和AI鼠中能代表整個海馬部分的海馬冷凍切片一起溫浴。正義探針與海馬較少選擇的區(qū)域一起雜交，但足以確證均一的陰性雜交信號并確認(rèn)用反義探針?biāo)玫碾s交信號的特異性。在雜交并洗滌后，將切片放到X射線膠片上并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)定量自動射線照相(Bizon 2001)來定量信號。
用于衍生模板來制備谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白原位雜交組化的正義和反義RNA探針的寡聚物如表II所述。
表II 9.2.7制備用于原位雜交組化的組織 11只有行為特征的鼠(n＝4年輕的和n＝7年老的)用過量戊巴比妥鈉(100mg/kg)并用4％溶于0.1M pH 7.4磷酸緩沖液(PPB)的多聚甲醛心臟灌輸殺死。在7點至10點間進(jìn)行所有的灌輸。固定后，從頭蓋骨中取出大腦并立即從周圍組織中切出左右測海馬體。切出的海馬體在PPB中固定24小時，溶于包含20％蔗糖的PPB防凍液中24小時，在粉狀干冰上以“伸展的”方向冷凍，并儲存于-80℃，直至進(jìn)一步處理。
每個動物海的馬狀突起用冷凍顯微切片機(jī)進(jìn)行切片，按經(jīng)度軸切成冠狀(25mm)，并收集進(jìn)冰冷的PPB中。自由流動的組織切片用含0.75％甘氨酸的0.1M pH，7.2的磷酸緩沖液(PB)洗滌，并用0.1M PB單獨洗滌以除去多余的固定劑。切片在37℃以蛋白質(zhì)酶K(在含0.05％SDS的0.1M Tris緩沖液中有1mg/ml)處理30分鐘，在含0.25％乙酸酐的0.1M pH 8.0三乙醇胺中乙?；?，并用2X檸檬酸鈉緩沖液(SSC；1XSSC＝0.15M氯化鈉和0.015M檸檬酸鈉，pH 7.0)沖洗。然后在60℃雜交組織42-44小時，雜交液包含50％甲酰胺，1X Denhardt溶液，10％葡聚糖硫酸酯，4XSSC，0.25mg/ml酵母tRNA，0.3mg/ml青魚精子DNA，100mm二硫蘇糖醇(DTT)，以及合適的35S-標(biāo)記的cRNA，其終濃度為1X107 CPM/ml。雜交后，用4XSSC以30分鐘間隔洗滌切片2次，在50％甲酰胺/2XSSC于60℃洗滌一次，然后于37℃用核酶(在含1mM乙烯基-二氨基四乙酸的10mM Tris緩沖液中有20mg/ml)處理30分鐘。進(jìn)一步洗滌組織切片，用遞減的SSC緩沖液洗滌，其中含100mM DTT，直至最終用0.1XSSC洗滌，并將其放于明膠包被的載波片上進(jìn)行膠片放射自顯影?？諝飧稍锏暮ｑR體切片用14C-標(biāo)準(zhǔn)(American RadiolabeledChemicals，Inc.，St.Louis，MO)至β-max超膠片(AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，New Jersey)曝光24-72小時。喙冠狀切片的曝光時間為110-130小時。用GBX顯象劑處理膠片并用Kodak快速定影劑定影。
通過膠片放射自顯影光密度分析用MCID成像系統(tǒng)(ImagingResearch，St.Catherine′s，Ontario，加拿大)來定量原位雜交標(biāo)記。對于每張曝光的組織切片膠片，線性化膠片密度并將其校正到相對14C-標(biāo)準(zhǔn)。計算值(mCi/克蛋白質(zhì))，取6-8個組織切片的多次測量的平均值。每組中每只鼠平均的雜交信號強(qiáng)度取平均值以獲得組平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。用一路ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計比較。對于所有的統(tǒng)計測驗，95％的置信水平(p＜0.05)被認(rèn)為是顯著的。
9.2.8原位雜交組化的結(jié)果 相對于年輕和年老有障礙的，GLT1的豐度在年老無障礙的中顯著較大(p＜.03)，而且也發(fā)現(xiàn)了有較大的GLAST mRNA的趨勢(p＝.089；圖5)。表示用于原位雜交的鼠的認(rèn)知狀態(tài)的學(xué)習(xí)指數(shù)得分與微陣列研究中的動物的相似；年老無障礙(182，223，240)、年輕(177，219，200，227)和年老有障礙(290，285，297，298)。
在微陣列數(shù)據(jù)集和原位數(shù)據(jù)集中，第三個谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白mRNA(EAAC1)的值對于無障礙年老的組在數(shù)量上高于比較年輕和年老有障礙的鼠，但那些差異并不在統(tǒng)計學(xué)上顯著。微陣列中一個探針集(AF038571)的mRNA顯示相對于年老有障礙的，在年老無障礙中EAAC1顯著升高。在EAAC1的第二個探針集中的mRNA顯示有相同的趨勢(年老無障礙的大于年老有障礙，p＝.09)。
9.3用頭孢曲松保持認(rèn)知功能 9.3.1頭孢曲松對年輕鼠GLTI mRNA的處理效果 年輕鼠每天肌肉注射200mg/kg的頭孢曲松(N＝2)或其載體(N＝3)，持續(xù)一周。殺死后，切下海馬并冷凍。
9.3.2實時反轉(zhuǎn)錄-PCR法來定量GLT-1 mRNA 9.3.2.1制備用于實時RT-PCR的RNA 從用頭孢曲松或鹽水處理的動物(每種條件3只年輕動物)的右側(cè)海馬處用Trizol試劑提取RNA并通過Qiagen Rneasy柱純化，其方式與微陣列實驗中所用的過程完全一樣。在確定濃度和完整性后(用微陣列RNA相同的方式)，樣品稀釋到每微升50ng的濃度。在總體積10μl中用Applied Biosysten′s Taqman反轉(zhuǎn)錄試劑以以下條件反轉(zhuǎn)錄100ng的該樣品lx反轉(zhuǎn)錄緩沖液，0.5mM每種dNTP，5.5mMMgCl2，1.25單位/μL的Multiscribe反轉(zhuǎn)錄酶，0.4單位/μL的Rnase抑制劑，和2.5μM寡聚dT引物。在室溫溫浴樣品10分鐘，接著于48℃45分鐘，然后于95℃5分鐘。樣品稀釋到1∶20和1∶100以用于實時PCR反應(yīng)。通過合并從2個分別的動物的海馬體中提取純化的RNA來產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)RNA并反轉(zhuǎn)錄該RNA，條件與上述實驗樣品的完全一樣，除了500ng RNA用于50μl的反應(yīng)中。通過連續(xù)稀釋將標(biāo)準(zhǔn)cDNA稀釋到1∶20，1∶100，1∶500和1∶2500。另外，200ng標(biāo)準(zhǔn)RNA置于20μl反應(yīng)中，使用以上相同的條件除了省略反轉(zhuǎn)錄酶。該樣品被稱為非RT樣品，包括其是要顯示RNA樣品本身背景活性。該樣品連續(xù)稀釋至1∶20和1∶100。
9.3.2.2實時PCR PCR反應(yīng)在三溫容器中進(jìn)行，每個GLTla，GLT1和GAPDH的cDNA樣品使用2種不同的濃度，即cDNA稀釋度為1∶20和1∶100。PCR反應(yīng)中的cDNA最終濃度為100pg/μl和20pg/μl，而且其是由RNA輸入濃度外推得來的。在所有4個稀釋度應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)來獲得外推為100pg/μl、20pg/μl、4pg/μl和0.8pg/μl的終濃度。PCR反應(yīng)混合物利用Invitrogen的Platinum定量PCR試劑盒來以相同的引物和探針集組裝所有樣品，然后為每個cDNA以每種濃度裝在分開的管里。然后將cDNA加入混合物中，然后將其分裝于3個實時PCR管中的每一個中。在RotorGene 3000(Corbett Research)中以以下條件進(jìn)行所有反應(yīng)50℃ 2分鐘，95℃ 5分鐘，然后進(jìn)行95℃ 25秒和60℃60秒的45個循環(huán)。在GAPDH的Joe頻道和GLT1和GLT1a探針/引物集的FAM/SYBR頻道上獲得數(shù)據(jù)。對所有的運行都使用尖峰抑制和動態(tài)管標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化。GLT1或GLTla和GAPDH的實時PCR偶爾在分開的運行中進(jìn)行。
對于GAPDH，優(yōu)化的反應(yīng)條件是0.6單位Platinum Taq DNA聚合酶，20mM Tris-HCl(pH 8.4)，50mM KCl，200μM dGTP，200μMdATP，200μM dCTP，400uM dUTP，0.4單位UDG，4.5mM MgCl2，200nM正向引物，200nM反向引物，50nM用5′端的Vic和3′端的TAMRA淬滅基團(tuán)標(biāo)記的探針。引物和探針可從Applied Biosystems(Cat#4308313)處獲得；序列未知，但擴(kuò)增長度為177bp。
對于GLT1，優(yōu)化的反應(yīng)條件是0.6單位Platinum Taq DNA聚合酶，20mM Tris-HCl(pH 8.4)，50mM KCl，200μM dGTP，200μMdATP，200μM dCTP，400uM dUTP，0.4單位UDG，6.0mM MgCl2，50nM正向引物，200nM反向引物，50nM探針。擴(kuò)增長度為65bp。正向引物為5′GAG CTG GAC ACC ATT GAC TC 3′而且反向引物為5′GAC TGC GTC TTG GTC ATT TC 3′。探針為5′CAA CAC CGAATG CAC GAA GAC ATC 3′，標(biāo)記有5′6-fam和3′tamra。
對于GLT 1a，優(yōu)化的反應(yīng)條件是0.6單位Platinum Taq DNA聚合酶，20mM Tris-HCl(pH 8.4)，50mM KCl，2000M dGTP，200μMdATP，200μM dCTP，400 uM dUTP，0.4單位UDG，6.0mM MgCl2，200nM正向引物，200nM反向引物，100nM探針。擴(kuò)增長度為76bp。正向引物為5′ATG AGT GCA AGG TAA CTC TGG 3′而且反向引物為5′TCA CGT TTC CAA GGT TCT TC 3′。探針為5′CCA ATG GAAAGT CAG CTG ACT GCA 3′，標(biāo)記有5′6-fam和3′BHQ1(黑洞淬滅基團(tuán)1)。
9.3.2.3實時PCR的數(shù)據(jù)分析 用DDCt法確定GAPDH和GLT1或GLTla的比較量(Livak和Schmittgen，Methods 25402-408 2001)。所有反應(yīng)的初始值設(shè)在0.05熒光單位上并用Rotorgene軟件來確定每個樣品的Ct。確定每個GLT1cDNA在每個濃度的平均Ct值并扣除GAPDH的平均值。如果GAPDH值大于15％或低于平均GAPDH值，則棄去樣品。在用藥物處理的動物中，GLT1 mRNA平均增加1.34倍，而在用藥物處理的動物中，GLTla mRNA平均增加1.27。這些值與微陣列中觀察到的AU鼠GLT1的完全改變一致，其增加了1.31。
9.4頭孢曲松處理對年老鼠的RAM成績的影響 在MWM中表征認(rèn)知狀態(tài)之后，將無障礙的年老鼠分配到2種處理條件之一中(200mg/kg的對照載體或頭孢曲松)，條件根據(jù)它們MWM鼠學(xué)習(xí)值得分來定。最初在兩種處理條件下的鼠用RAM任務(wù)來訓(xùn)練(適應(yīng)、無延遲版、然后60秒延遲)。然后每日在早上(8:00-9:00AM)注射載體或藥物。每日，鼠接受輻射臂狀迷宮的測試，其中延遲擴(kuò)大到3小時。在第8-10天(注射7天之后)，在3小時延遲時進(jìn)行關(guān)鍵的測試。相對于同時測試的年輕組，接受載體的年老鼠的記憶力錯誤顯著升高。相對于接受載體的年老鼠，接受藥物給藥的年老鼠只有較少的錯誤(圖6)。該初始飛行評估使用了3只用藥物處理的鼠和4只載體處理的年老鼠，該評估用其他有行為特征的鼠來重復(fù)進(jìn)行以將樣本大小增加到每組7-8只鼠。
9.4.1頭孢曲松處理對年老鼠的GLTI mRNA的影響 完成RAM測試時，處死接受了載體和藥物處理的年老鼠。冷凍切下的海馬并儲存(-80℃)來分析GLT1 mRNA，這在用其他年老鼠重復(fù)完成行為測試時進(jìn)行。如果藥物處理增加了GLT1 mRNA，如預(yù)期的以相同劑量對年輕鼠進(jìn)行藥物處理的效果那樣，則進(jìn)行微陣列分析用以比較用頭孢曲松處理的年老有障礙鼠和對照年老有障礙個體的基因表達(dá)譜。
9.4.2頭孢曲松處理對MWM測試-再測試的影響 在標(biāo)準(zhǔn)MWM規(guī)程中表征年老鼠并在幾周或幾月后在新的空間環(huán)境中用MWM進(jìn)行測試，就獲得了測試-再測試的可靠性。用MWM可在再測試中評估化合物改善患認(rèn)知功能障礙的年老鼠功能的臨床前效果。通過2個任務(wù)(RAM和MWM)處理的有效性強(qiáng)化了藥物對認(rèn)知功能作用的證據(jù)，該作用不依賴于2個任務(wù)間有區(qū)別的其他成分(如，成績的運動基礎(chǔ))。
9.5用其他化合物改善并保持認(rèn)知功能 該工作包括向年輕鼠給藥測試化合物或載體，從而建立一種療法以改善或保持認(rèn)知功能。測試化合物包括丙戊酸，調(diào)節(jié)促代謝谷氨酸受體(mGluR)活性的化合物以及調(diào)節(jié)垂體腺苷酸環(huán)化酶活化因子多肽(PACAP)表達(dá)的化合物。MWM中表征的年老有障礙鼠分配接受藥物或載體治療并在RAM中測試。谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)和其他基因譜的分析，如mGluR表達(dá)和活性，PACAP表達(dá)或β抑制蛋白2表達(dá)，它們之后在完成行為測試時進(jìn)行。
9.6等價物 盡管描述了個別發(fā)明特定的具體實施方式
的時候，但以上說明是示例性的而不是限制性的。依據(jù)本說明書的論述，本發(fā)明的許多變體對所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說變得顯而易見了。所附的權(quán)利要求不是要要求保護(hù)所有這些具體實施方式
和變體，而是通過參考權(quán)利要求以來確定本發(fā)明的全部范圍，以及等價體和說明書以及這些變體的全部范圍。
在此所提及的所用公開文獻(xiàn)和專利其全文都納入本文參考，如同每一個公開文獻(xiàn)或?qū)＠济鞔_并各自納入?yún)⒖?。在發(fā)生沖突的情況下，以本申請，包括在此的任何定義為準(zhǔn)。
本申請引用的每篇參考文獻(xiàn)的內(nèi)容全文，包括公開文本、專利和專利申請，在此都納入?yún)⒖肌?br> 權(quán)利要求
1. 能刺激谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白基因的神經(jīng)組織表達(dá)的化合物在制備用于治療哺乳動物認(rèn)知功能障礙的藥物中的應(yīng)用。
2. 權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白基因是EAAT2/GLT1或EAAT1/GLAST。
3. 權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述化合物具有下式
其中，每個符號獨立表示
R為H、C1-C10烷基、C2-C10鏈烯基、C2-C10炔基、芳基或芳烷基；
R1為H、C1-C10烷基、C2-C10鏈烯基、C2-C10炔基、芳基或芳烷基；
R2為包含1-4個雜原子的雜環(huán)或雜芳基環(huán)，雜原子選自N、O或S；
L為O、S或NR；和
X為CR2、O或S。
4. 權(quán)利要求3的應(yīng)用，其中所述化合物是(R)-(-)-5-甲基-1-煙?；?2-吡唑啉。
5. 權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述化合物具有下式
其中，每個符號獨立表示
L為O或S；
R為H、C1-10烷基、C1-10烷氧基、芳基、芳烷基、-OCH2CO2H；
R1為-(CH2)n-C(O)X
其中
X為OH、NR2、SH、O-堿金屬或-OC(CH3)OC(O)OCH(CH3)2；和
n為0至6并且包括0和6的整數(shù)；
R2為H、C1-10烷基、C2-8鏈烯基或-(CH2)a-W-R3
其中
R3為H、C1-10烷基、-C(O)C1-10烷基、-C(O)NR2、芳基、芳烷基或A；
W為O、S或NR4；和
a為1-6并且包括1和6的整數(shù)；
其中
R4為H、C1-10烷基、-C(O)C1-10烷基、芳基、芳烷基或R3和R4一起可形成未取代的或取代的雜烷基或雜芳基環(huán)；
線表示單或雙鍵；
R5為R1、H、SO3H、芳基、C1-10烷基、芳烷基；或當(dāng)
線為雙鍵時，R5選自＝CHCH2CO2H和＝NR；
m為0或1；和
A為式Ia的芳基或雜芳基
其中，每個符號獨立表示
J為O、S、NR6或CR6；和
y為1或2；
其中R6為電子對、H、C1-10烷基、C1-10烷氧基、芳基或-NR2；
或A為式Ib或Ic的雜環(huán)烷基
其中，每個符號獨立表示
J為O、S或NR；和
X為O或H2。
6. 權(quán)利要求5的應(yīng)用，其中所述化合物不是頭孢曲松。
7. 權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述化合物具有下式
其中，每個符號獨立表示
X為-OH、C1-10烷氧基、-O-堿金屬、-N(R1)2、-SH或-S-C1-10烷基；
R為直鏈或支鏈C1-30烷基；和
R1為H、C1-10烷基、C2-10鏈烯基、C2-10炔基、芳基或芳烷基；
條件是R可以是未取代的或被一個或多個-OH、C1-10烷氧基、-N(R1)2、-SH、-S-C1-10烷基或芳基取代。
8. 權(quán)利要求7的應(yīng)用，其中所述化合物不是丙戊酸。
9. 權(quán)利要求1-8任一項的應(yīng)用，其中所述哺乳動物是人。
10. 權(quán)利要求1-8任一項的應(yīng)用，其中所述認(rèn)知功能障礙是輕度認(rèn)知功能障礙、年齡相關(guān)的認(rèn)知衰退或記憶力喪失。
11. 權(quán)利要求1-8任一項的應(yīng)用，其中所述認(rèn)知功能障礙是阿耳茨海默癥。
12. 權(quán)利要求1-11任一項的應(yīng)用，其中所述化合物是通過一種篩選用于保持或促進(jìn)認(rèn)知功能的化合物的方法而鑒定的，所述方法包括以下步驟(a)向哺乳動物給藥測試化合物；(b)在給藥所述測試化合物后，確定所述哺乳動物神經(jīng)組織中谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達(dá)水平；(c)將所述基因的所述表達(dá)水平與其在沒有給藥所述測試化合物的哺乳動物神經(jīng)組織中的參考表達(dá)水平相比較；和，(d)確定所述基因的表達(dá)水平是否與其相應(yīng)的參考表達(dá)水平不同。
13. 一種篩選用于促進(jìn)認(rèn)知功能的化合物的方法，其包括以下步驟
(a)向哺乳動物給藥測試化合物；
(b)在給藥所述測試化合物后，確定所述哺乳動物神經(jīng)組織中谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達(dá)水平；
(c)將所述基因的所述表達(dá)水平與其在沒有給藥所述測試化合物的哺乳動物神經(jīng)組織中的參考表達(dá)水平相比較；和，
(d)確定所述基因的表達(dá)水平是否與其相應(yīng)的參考表達(dá)水平不同，其中所述差異顯示測試化合物是促進(jìn)認(rèn)知功能的候選治療劑。
14. 一種篩選用于促進(jìn)哺乳動物認(rèn)知功能的化合物的方法，其包括以下步驟
(a)將測試化合物與表達(dá)谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白基因的細(xì)胞接觸；和
(b)確定所述基因的表達(dá)水平是否通過將所述細(xì)胞與所述測試化合物接觸而改變，所述改變?nèi)绻嬖趧t顯示所述化合物有促進(jìn)哺乳動物所需認(rèn)知功能的能力。
全文摘要
本發(fā)明的發(fā)明名稱是治療認(rèn)知功能障礙的靶位。本發(fā)明涉及鑒定涉及認(rèn)知功能障礙的基因的方法和用于治療認(rèn)知功能障礙的組合物。本發(fā)明還涉及能刺激谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白基因的神經(jīng)組織表達(dá)的化合物在制備用于治療哺乳動物認(rèn)知功能障礙的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號A61K31/546GK101249091SQ20081008253
公開日2008年8月27日 申請日期2003年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月22日
發(fā)明者M·加拉赫爾, P·K·倫德 申請人:約翰斯·霍普金斯大學(xué)