專利名稱：治療認知功能障礙的靶位的制作方法
治療認知功能障礙的耙位本申請是以下申請的分案申請申請曰2003年11月24日；申請?zhí)?200380109146.X(PCT/US2003/038191);發(fā)明名稱同上。1. 對相關申請的交叉引用本申請要求享有于2002年11月22日提交的美國申請序列號 60/413,152的權益，其全文并入作為參考。2. 政府支持本發(fā)明在政府支持下完成，獲得國家衰老研究所的基金笫POl AG09973號。政府擁有本發(fā)明的某些權利。3. 發(fā)明背景由于對認知功能障礙的認識日漸增加，開發(fā)出靈敏的方法以檢測 功能障礙并治療功能障礙的需求也日漸增加。存在許多病情，如癡呆 (如，雷維小體癡呆、血管癡呆、阿耳茨海默氏癥以及與HIV相關的 癡呆)、亨廷頓氏舞蹈病、帕金森氏癥、精神分裂癥、抑郁癥、肌萎 縮性脊髓側(cè)索硬化癥、輕度認知功能障礙(MCI)以及與年齡有關的認知 衰退(ARCD)，靈敏地檢測出認知功能障礙能使有這些病情的患者受 益。認知功能障礙(如，雷維小體癡呆、血管癡呆、阿耳茨海默氏癥 與HIV相關的癡呆、亨廷頓氏舞蹈病、帕金森氏癥、肌萎縮性脊髓倒 索硬化癥、MCI和ARCD)涉及的大量病況的主要危險因素是衰老。 患有這些病況的個體具有在整個病程中嚴重程度增加的認知癥狀。在 未患有這些病癥的情況下，衰老本身對于認知的影響對于定義疾病和 正常衰老的界線是至關重要的。同時，衰老對于認知的影響可以與神 經(jīng)退行性疾病、確定性易獲病性的病程、疾病的進展速率或其他特性 相互影響。開發(fā)認知功能障礙的檢測方法和療法的重要手段包括使用實驗室動物。以動物模型描述的認知功能障礙可能擴展到人的認知功能障礙 上。在與年齡相關的認知功能障礙的上下文范圍中，以遠系繁殖的年老的Long畫Evans鼠(Charles River Laboratories; Gallagher M， 等, Behav. Neurosci. 107: 618-626; 1993 )的廣泛行為特征可鑒定自然發(fā) 生的認知功能障礙的形式。該認知老化模型使用了在其一生中保持無 病原狀態(tài)的動物。在所有衰老的鼠上進行的生理機能和尸體解剖的測 試被用于排除患有會干擾衰老疾病或病癥研究的病況的動物。該模型 的重要特點是其反映出了老年人認知衰退的變化現(xiàn)象。另外，該模型 中的老年鼠的認知衰退的個體差異可用行為評估的方式來觀察，該評 估對中顳葉中相聯(lián)結構的功能靈敏，該系統(tǒng)對人的表述性記憶至關重 要。該模型的另 一個重要特點是其指導理解了造成與年齡相關的認知 功能障礙的基因多樣性。該對與年齡相關的認知功能障礙的遺傳影響 不可能是單基因的，即由單個基因中的缺失或突變造成的。單基因病 很少見而且一般影響年輕人。因為它們的嚴重性，單基因病經(jīng)常造成 不能達到平均期望壽命。在人中，大量常見且嚴重的病情影響成年人 群，隨著實足年齡的增加而增加了頻率和嚴重程度，而且這不能夠歸 因于單個基因(比如可參見，Hegele RA. Trends Endocrinol Metab. 2003 8: 371-377; Shih DQ，等Curr Diab Rep. 2002 2: 125-134; BarlassinaC,等J Am Soc Nephrol. 2002 Suppl 3: S155-S164)。不 斷增加的證據(jù)表明成熟期發(fā)病或與衰老相關的病情的遺傳組成反應出 了比由單基因病造成的絕對缺陷或極大功能增進更微妙的多基因表達 的改變。確定這些與年齡相關的病情的分子基礎的挑戰(zhàn)就是要鑒定基 因的多樣性并確認特定基因組中表達的相對小的改變是否真與遠系繁 殖的諸如人群的群體中的病情相關或?qū)е逻@些病情。所以，利用哺乳 動物遠系繁殖老化模型可幫助分析海馬中的多基因表達水平間的關系 和在遠系繁殖的年輕或老年個體中的學習能力.用Morris水迷宮(MWM)進行的行為評估中，在迷宮周圍的空間 提示結構的指導下，鼠學習并記下了逃跑平臺的位置。在探測試驗中， 利用測定動物搜索逃跑平臺位置的空間偏好來測試進行認知的基礎。 在研究群體中的老年鼠能毫無困難地游到可見的平臺上，但當隱藏平 臺時需要利用空間信息了，就可檢測年齡決定的功能障礙了。正如許系繁殖的Long-Evans品種中的老年鼠的個體表 現(xiàn)變化極大，那些鼠中的一部分表現(xiàn)得和年輕成體一樣，但大約 40-50%的落后于年輕個體表現(xiàn)的范圍(Gallagher等Behav. Neurosci. 107: 618-626， 1993)。年老鼠中的這種可變性反映出可靠的個體差異。 所以，在年老群體中， 一些動物認知功能有障礙了并被稱為年老功能 障礙的(AI)。其他動物認知功能沒有障礙，或年老功能無障礙的(AU)。 最初表征的幾周后利用MWM在新空間環(huán)境中進行的再次評估 中，AI動物一如既往的有障礙，而AU動物能再次熟練表現(xiàn)(Colombo 等Proc, Natl. Acad. Sci. 94: 14195-14199， 1997 )。在對AI和AU鼠 認知能力的MWM評估中的差異甚至在間隔3個月以上時仍是可靠的(Gallagher和Burwell， Neurobiol. Aging 10: 691- 708， 1989 )。另 外，MWM中的AI和AU特征能區(qū)分在其他行為任務中同樣年齡個體 的表現(xiàn)，所述行為任務需要同樣的認知功能，如Barnes圓形迷宮(Gallagher和Burwell Neurobiol. Aging 10: 691-708, 1989 )和放射 狀臂形迷宮(RAM)。這種嚙齒動物年老群體中自然產(chǎn)生的功能障礙顯 示認知老化是不可避免的或嚴格與實足年齡相聯(lián)系，而且重要的是， 它提供了機會用以比較造成衰退或持久記憶的大腦變化的軌跡，利用 該模型的其他背景研究顯示認知功能障礙的發(fā)生并不依賴于包括神經(jīng) 元缺失或相關回路的廣泛退化的神經(jīng)退行(Rapp和Gallagher Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 9926-9930， 1996)。所以，該模型可能是比要測 定神經(jīng)元缺失影響的準備工作更靈敏的認知老化測試方法。除了可靠性之外，該模型所用的認知評估已經(jīng)證明能對相關大腦 系統(tǒng)的老化影響靈敏。在AU和AI鼠的神經(jīng)回路中顯示有顯著的生物 學差異產(chǎn)生了，該回路對MWM中評估的認知功能至關重要。例如， 相對于AU并年輕的鼠，AI鼠中的海馬神經(jīng)元對某些化學遞質(zhì)具有減 弱的應答，如乙酰膽堿和谷氨酸(Nicolle等J. Neurosci. 19: 9604-9610， 1999)。在谷氨酸受體亞型的解剖分布研究中，利用該才莫 型可揭示出減少了紅藻氨酸鹽(kainate)結合在海馬的CA3區(qū)域，該 區(qū)域僅限于年老無障礙的鼠中并與年輕和年老障礙的鼠有區(qū)別(Nicolle等Neuroscience 74: 741-756， 1996),存在有越來越多對 認知功能障礙生物和遺傳基礎理解的需求。在一個方面，本發(fā)明描述了一種鑒別與諸如哺乳動物的個體所預 期行為相關的基因的方法，其包括提供一個具有預期行為的測試個體 的群體，提供一個缺少預期行為的對照個體的群體，各自分離并合并 來自測試和對照群體的神經(jīng)組織如海馬的表達的RNA，在每個對照和 測試RNA合并庫中測定大量基因的表達水平并從大量基因中選出一 個基因，所述基因的表達水平在哺乳動物的測試群體和對照群體間有 差異。選擇的基因是與預期行為相關的候選基因?？赏ㄟ^任何合適的 方式來檢測大量基因的表達水平，如微陣列分析、原位雜交組化、定 量PCR、 SAGE分析、Northern印跡分析或點印跡分析，或通過合適 的方法來測量蛋白質(zhì)水平，包括Western印跡、蛋白質(zhì)槽印跡或蛋白 質(zhì)陣列。大量基因可包括涉及谷氨酸轉(zhuǎn)運的基因，如EAAT1、 EAAT2、 EAAT3、 EAAT4和EAAT5，不同于谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白EAAT1、 EAAT2、 EAAT3、 EAAT4和EAAT5的基因或涉及神經(jīng)元間突觸間隙和/或突觸 外空間中谷氨酸分解代謝的基因，如天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶。優(yōu)選地， 從大量基因中選出的基因顯示出增加的表達水平。可選地，選出的基 因顯示出減少的表達水平。在另一方面，本發(fā)明描述了一種鑒別與個體預期認知功能相關的 基因的方法，其包括提供一個具有預期認知功能的哺乳動物測試群體， 提供一個缺少預期認知功能的哺乳動物對照群體，各自分離并合并來 自測試和對照群體的神經(jīng)組織如海馬的表達的RNA，在每個對照和測 試RNA合并庫中測定大量基因的表達水平并從大量基因中選出一個 基因，所述基因的表達水平在哺乳動物的測試群體和對照群體間有差 異。選擇的基因是與預期認知功能相關的候選基因。可通過任何合適 的方式來檢測大量基因的表達水平，如微陣列分析、原位雜交組化、 定量PCR、 SAGE分析、Northern印跡分析或點印跡分析，或通過合 適的方法來測量蛋白質(zhì)水平，包括Western印跡、蛋白質(zhì)槽印跡或蛋 白質(zhì)陣列。大量基因可包括涉及谷氨酸轉(zhuǎn)運的基因，如EAAT1、 EAAT2、 EAAT3、 EAAT4和EAAT5，不同于谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白EAAT1、 EAAT2、 EAAT3、 EAAT4和EAAT5的基因或涉及神經(jīng)元間突觸間隙 和/或突觸外空間中谷氨酸分解代謝的基因，如天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶。 優(yōu)選地，從大量基因中選出的基因顯示出增加的表達水平?？蛇x地，選出的基因顯示出減少的表達水平。本發(fā)明的另一個方面涉及一種篩選用于促進認知功能的化合物的 方法，其包括向諸如哺乳動物的個體給藥測試化合物，在給藥所述測平，將所述^因的所述表達水平與個體神經(jīng)組織參考表^水平進行比 較，其中該個體沒有給藥所述測試化合物，并測定所述基因的表達水 平是否與相應參考表達水平有差異，其中所述差異顯示測試化合物為 促進認知功能的候選治療劑。測試化合物可以是小分子，如但不限于 式I, II或III所示的那些分子。其他方法可以包括將所述基因的表達 水平與個體神經(jīng)組織參考表達水平進行比較，其中向該個體給藥了頭 孢曲松。可通過任何合適的方式來檢測基因的表達水平，如微陣列分析、原位雜交組化、定量PCR、 SAGE分析、Northern印跡分析或點 印跡分析，或通過合適的方法來測量蛋白質(zhì)水平，包括Western印跡、 蛋白質(zhì)槽印跡或蛋白質(zhì)陣列?；蚩梢允巧婕肮劝彼徂D(zhuǎn)運的，如 EAAT1、 EAAT2、 EAAT3、 EAAT4和EAAT5，或可以是涉及神經(jīng)元 間突觸間隙和/或突觸外空間中谷氨酸分解代謝的，如天冬氨酸氨基轉(zhuǎn) 移酶。優(yōu)選地，從大量基因中選出的基因顯示出增加的表達水平?？?選地，選出的基因顯示出減少的表達水平。本發(fā)明的另 一個方面涉及一種篩選用于促進認知功能的化合物的 方法，其包括向諸如哺乳動物的個體給藥測試化合物，在給藥所迷測基因的表達水平，將所述基因的所i表達k平與個體;經(jīng)組織參考表 達水平進行比較，其中該個體沒有給藥所述測試化合物，并測定所述 基因的表達水平是否與相應參考表達水平有差異，其中所述差異顯示 測試化合物為促進認知功能的候選治療劑。測試化合物可以是小分子， 如但不限于式I， II或III所示的那些分子，可通過任何合適的方式來 檢測基因的表達水平，如微陣列分析、原位雜交組化、定量PCR、 SAGE 分析、Northern印跡分析或點印跡分析，或通過合適的方法來測量蛋 白質(zhì)水平，包括Western印跡、蛋白質(zhì)槽印跡或蛋白質(zhì)陣列。優(yōu)選地， 從大量基因中選出的基因顯示出增加的表達水平?？蛇x地，選出的基 因顯示出減少的表達水平。一種篩選用于促進諸如哺乳動物的個體的認知功能的化合物的方法，包括如下步驟將測試化合物與表達圖4所列基因的細胞接觸， 如，谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白基因EAAT1、 2、 3、 4或5，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移 酶或垂體腺苦酸環(huán)化酶活化因子多肽(PACAP),并測定所述基因的表 達水平是否由于所述細胞接觸所迷測試化合物而改變，如果存在所述 改變則顯示所述化合物有能力促進諸如哺乳動物的個體所需的認知功 能?；衔锟梢允切》肿?，如式I， II或III所示的那些分子。細胞可 以來源于神經(jīng)組織，如培養(yǎng)的神經(jīng)元、培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)或初級神經(jīng)元 培養(yǎng)基；或可以是永生化的細胞、神經(jīng)元細胞系、神經(jīng)膠質(zhì)細胞系或 星形細胞細胞系。優(yōu)選地，從大量基因中選出的基因顯示出增加的表 達水平?？蛇x地，選出的基因顯示出減少的表達水平。本發(fā)明上述每一個方面中所用的測試化合物可以是小分子，如任 何笫三代頭孢菌素(頭孢磺吡芐、頭孢氨噻、頭孢唑肟、頭孢曲松、 頭孢哌酮、拉氧頭孢和頭孢他啶)、丙戊酸或MS-153。另外，測試化 合物可以活化基因表達，包括選自EAAT1、 EAAT2、 EAAT3、 EAAT4 和EAAT5的谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白，或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因?？蛇x地， 測試化合物可以是基因表達的抑制劑。在另一方面，本發(fā)明描述了一種文庫，其包括大量編碼基因的 cDNA序列，所述基因由于在哺乳動物中保持認知功能而在哺乳動物神 經(jīng)組織中差異表達。優(yōu)選地，文庫包括編碼基因的cDNA序列，所述 基因由于用頭孢曲松、丙戊酸或MS-153對哺乳動物處理而在神經(jīng)組織 中差異表達。文庫可以包括源于谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白基因的cDNA序列， 如EAAT1、 EAAT2、 EAAT3、 EAAT4和EAAT5，或源于天冬氨酸 氨基轉(zhuǎn)移酶的序列。文庫包含的cDNA至少有20%、 50°/。或80%的序 列源于谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白基因。本發(fā)明的另一方面是一種包括微陣列芯片，其包括其上各個編址 位置上附有cDNA序列的固相支持物，cDNA序列與上述cDNA文庫 的成分相對應，如那些在神經(jīng)組織中由于個體認知功能的保持或由于 用頭孢曲松或丙戊酸處理個體而造成差異表達的cDNA序列。微陣列 芯片的成分包括選自EAAT1、 EAAT2、 EAAT3、 EAAT4和EAAT5 的谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶序列。本發(fā)明也描述了 一種藥物組合物，包括有效治療量的刺激化合物， 所述化合物刺激圖4所列基因的神經(jīng)組織中的表達，所述基因是例如谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白基因EAAT1、 2、 3、 4或5、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶或 垂體腺苦酸環(huán)化酶活化因子多肽(PACAP)。藥物組合物還可以包含小 分子。在另一個方面，本發(fā)明描述了一種藥物組合物，包括有效治療量 的式I、 II或III化合物?？蛇x的，藥物組合物可包含除了頭孢曲松或 丙戊酸的有效治療量的化合物，其由通過將化合物給藥給諸如哺乳動 物的個體或細胞來篩選用于促進認知功能的化合物的方法來鑒定，并 在暴露或不暴露于化合物的條件下，測定在那些個體或細胞間的差異 化的基因表達。這些化合物是促進認知功能的候選化合物。本發(fā)明的另一方面描述了一種在諸如人的哺乳動物中保持認知功 能或在諸如人的哺乳動物中治療i^知功能障礙的方法，該方法通過刺表達來進行。另外，:諸如人的^:動物中保持認知功能需要包i"給 藥一種藥物組合物，其能刺激圖4所列基因的神經(jīng)組織表達，所述基 因是例如谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白基因EAAT1、 2、 3、 4或5,天冬氨酸氨基 轉(zhuǎn)移酶或垂體腺苷酸環(huán)化酶活化因子多肽(PACAP)。本發(fā)明也描述了一種在諸如人的哺乳動物中保持認知功能的方 法，需要包括給藥一種藥物組合物，其為下式任意一種小分子I、 II 或III。對于在諸如人的哺乳動物中保持認知功能的方法，需要包括給 藥式I的化合物，則哺乳動物不出現(xiàn)作為抗生素治療適應癥的傳染病 的癥狀。本發(fā)明也描述了在諸如人的哺乳動物中促進認知功能，需要包括 向所述哺乳動物給藥一定量的藥物組合物，其剌激圖4所列基因的神 經(jīng)組織的表達從而足以促進以下認知功能空間記憶的獲得，長期空 間記憶或空間記憶恢復。本發(fā)明也描述了在年老的諸如人的哺乳動物 中保持認知功能或治療認知功能障礙，并治療諸如人的哺乳動物中的 有障礙的認知功能，該方法需要通過向哺乳動物給藥有效治療量的頭 孢曲松或其類似物或衍生物，丙戊酸或其類似物或衍生物或MS-153 或其類似物或衍生物來進行。在哺乳動物表現(xiàn)出有障礙的認知功能的 情況下，有障礙的認知功能可以與以下病情相關輕度認知功能障礙、 與年齡相關的認知衰退、記憶力衰退、衰老或癡呆。另外，在哺乳動 物表現(xiàn)出有障礙的認知功能的情況下，有障礙的認知功能可能與阿耳茨海默癥有關?；谝韵略敿氄f明和權利要求書，本發(fā)明的其他特點和優(yōu)點將是 顯而易見的。5. 簡要


圖1是描述了在MWM評估中年輕和年老的大鼠的行為特征的圖。圖2是描述了 IO只年老的大鼠在初始MWM表征與它們在RAM 中的記憶力表現(xiàn)之間的可靠性的圖。圖3是概述了哺乳動物谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白及其人類同源體在各種腦 組織中發(fā)現(xiàn)的不同細胞類型中的分布的圖表。圖4是概述了在年輕(Y)、年老有障礙的(AI)和年老無障礙(AU)的 動物中利用微陣列反映出的EAAT2/GLT1 、 EAAT1/GLAST和 EAAT3/EEAC1 mRNA的表達情況的圖表。圖5是概述了在年輕(Y)、年老有障礙的(AI)和年老無障礙(AU) 的動物中利用原位組化反映出的EAAT2/GLT1、 EAAT1/GLAST和 EAAT3/EEAC1 mRNA的豐度的圖表。圖6是描述了在用頭孢曲;l^治療(每天注射200 mg/kg im，持續(xù) 一周)的AI大鼠中減少的記憶錯誤的圖表。6. 發(fā)明詳細說明為了方便起見，在說明書、實施例和所附的權利要求書中所使用 的某些術語集中在此。除非另有定義，此處所用的技術和科學術語具 有如同本發(fā)明所屬領域普通技術人員所通常理解的相同意義. 6. 1定義此處所用的冠詞"一"和"這"指一個或多于一個(即，至少一 個)的冠詞的語法用語。例如， 一要素指一個要素或多于一個的要素。此處所用的"年老"指哺乳動物處在或接近其平均生命跨度的終 點。例如，年老大鼠約為24-30個月大的年齡。年老的人為70歲或以 上。術語"脂肪族"為公認的表述，其指直鏈、支鏈、環(huán)狀烷烴、烯烴 或炔烴。在一些具體實施方式
中，本發(fā)明的脂肪族基團為直鏈或支鏈 并具有1至約20個碳原子。術語"烷基"為公認的表述，其包括飽和的脂肪族基團，包括直鏈 烷基基團，支鏈的烷基基團、環(huán)烷基(脂環(huán)族)基團、烷基取代的環(huán) 烷基基團和環(huán)烷基取代的烷基基團。在一些具體實施方式
中，直鏈或支鏈烷基在其主鏈中具有約30個或更少的碳原子(如，CVC3o直鏈、 CVC30支鏈)，并可選地，約20個或更少。同樣，環(huán)烷基在其環(huán)狀結 構中具有約3至10個碳原子，并可選地在環(huán)狀結構中有約5、 6或7 個碳。術語"烷基"也被定義可包括卣代的烷基。術語"胺"和"氨基"為公認的表述，其指未取代和取代的胺，如以 下通式所代表的部分<formula>formula see original document page 12</formula>其中R50、 R51和R52各自獨立地代表氫、烷基、鏈烯基、 -(CH2)m-R61或R50和R51和N原子結合在一起形成在環(huán)結構中具有 4至8個原子的雜環(huán)；R61代表芳基、環(huán)烷基、環(huán)鏈烯基、雜環(huán)或多環(huán)； 而且m等于零或為l-8整數(shù)。在一些具體實施方式
中，R50或R51中 僅有一個是羰基，如，R50、 R5和氮一起并不形成亞胺。在其它具體 實施方式中，R50和R51 (并任選R52)各自獨立地代表氫、烷基、鏈 蹄基或-(CH2)m-R61。所以，術語"烷基胺"包括胺基，如上所定義，其 上附有取代的或未取代的烷基，即R50和R51中至少一個是烷基。術語"酰氨基"為公認的表述，其指如以下通式所代表的部分<formula>formula see original document page 12</formula>如上定義，而且R54代表氬、烷基、鏈烯基或-(CH2)m-R61 ， 其中m和R61如上定義。術語"氨基甲酰基"為公認的表示作氨基-取代的羰基，其包括如以下通式所代表的部分其中R50和R51如上定義。本發(fā)明中某些氨基的具體實施方式
包 括可能不穩(wěn)定的亞胺。術語"烷硫基"指烷基基團，如上定義，其具有附于其上的硫基。 在一些具體實施方式
中，"烷硫基"部分代表-S-烷基、-S-鏈烯基、-S-炔基和-S-(CH2)m-R61中的一個，其中m和R61如上定義。有代表性 的烷硫基基團包括甲硫基、乙基基等等。術語"芳烷基"為公認的表述，其指用芳基基團(如，芳香族或芳 香雜環(huán)基團)取代的烷基。術語"鏈烯基"和"炔基"為公認的表述，其指不飽和的脂肪族基團， 在長度以及可能的取代方面與如上所述的烷基類似，但各自至少包含 一個雙鍵或三鍵。除非碳的數(shù)目另外指出，"低級烷基"指烷基，如上定義，只具有l(wèi) 至10個碳，可選地在其主鏈結構中有1至約6個碳原子。同樣，"低 級鏈烯基"和"低級炔基"具有相似的鏈長。術語"烷氧基的"或"烷氧基"為公認的表述，其指烷基，如上定義， 其上附有氧基。有代表性的烷氧基基團包括曱氧基、乙氧基、丙氧基、 叔丁氧基等等。"醚"為兩個碳氫化合物通過氧共價連結形成的。因此， 使烷基成為醚的烷基取代基是或類似于烷氧基，如可以用-O-烷基、-O-鏈烯基、-O-炔基、-0-(CH2)m-R61中之一來表示，其中m和R61如上 所述。此處所用的"類似物"指功能上與另一個化學物質(zhì)相似的化合物， 但其并不共有完全一樣的化學結構。例如。頭孢曲松類似物與頭孢曲松足夠相似，盡管與頭孢曲松的結構有微小差異，但其能在治療應用 中替代頭孢曲松。此處所用的術語"陣列"和"矩陣"指在設備上可編址的位置或"地 址"的排列。位置可以排列成兩維陣列、三維陣列，或其他矩陣形式。至至少數(shù)十萬。最重要的是，每個位置代表完 全獨立的反應位點。"核酸陣列"指包含核酸探針的陣列，如寡核普 酸或基因的較大部分。在陣列上的核酸可以是單鏈的1。探針為寡核普 酸的陣列被稱為"寡核苦酸陣列"或"寡核普酸芯片"。"微陣列"，在此 也被稱為"生物芯片"、"生物學芯片，，或"基因陣列"，是一種具有密度至少約100/ci^離散區(qū)域的陣列，密度優(yōu)選地至少約1000/cm2。 微陣列中的區(qū)域具有典型的尺寸，如直徑范圍在約10-250pm之間， 并在陣列中與其他區(qū)域以約相同距離分隔。此處所用的"天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶"指催化草酰乙酸和谷氨酸轉(zhuǎn)變 成天冬氨酸和2-酮戊二酸的酶(E. C. 2.6. 1.1)，以及編碼具有天冬氨酸 氨基轉(zhuǎn)移酶活性的氨基酸的核酸和同源物(如可參見，GenBank登錄 號BC000498或XM_062678 )。天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶涉及突觸間隙 和突觸外空間中的谷氨酸催化。前述的同源物相信存在于其他哺乳動 物中，包括靈長類、犬科、貓科和嚙齒動物。此處所用的"P-抑制蛋白2"指細胞內(nèi)支架/適應連接蛋白質(zhì)，其幫 助從活化的G蛋白質(zhì)-偶聯(lián)受體處轉(zhuǎn)送額外的信號。另外，這些蛋白質(zhì) 涉及穿膜受體內(nèi)吞的內(nèi)吞作用中。P-抑制蛋白2也指編碼抑制蛋白蛋 白質(zhì)的核酸。前述的同源物相信存在于其他哺乳動物中，包括靈長類、 犬科、貓科和嚙齒動物。術語"碳環(huán)"為公認的表述，其指芳香族或非芳香族的環(huán)，其中環(huán) 上的每個原子都是碳。術語"羰基"為公認的表述，其包括如以下通式所代表的那些部分<formula>formula see original document page 29</formula>其中X50為鍵或代表氧或硫，而R55和R56代表氫、烷基、鏈烯 基、-(CH2)m-R61或藥學上可接受的鹽，R56代表氫、烷基、鏈烯基或 -(CH2)m-R61，其中m和R61如上定義。當X50為氧而R55或R5不 為氫，則該分子式代表"酯"。當X50為氧而R5如上定義，則該部CDNA陣列可以是雙鏈的。分在此被稱為羧基，并且尤其當R55為氫時，則該分子式代表"羧酸"。 當X50為氧而R56為氫，則該分予式代表"甲酸"。 一般而言，當以上 分子式的氧原子替換為硫，則該分子式代表"硫代羰基"基團。當X50 為硫而R55或R56不為氫，則該分子式代表"硫代酯"。當X50為疏而 R55為氫，則該分子式代表"硫代羧酸"。當X50為硫而R56為氬，則 該分子式代表"硫代甲酸"。在另一方面，當X50為鍵而R55不為氬， 則以上分子式代表"酮"基。當X50為鍵而R55為氫，則以上分子式代 表"醛"基。術語"手性"為公認的表述，其指具有鏡像體不能重疊的性質(zhì)的分 子，而術語"非手性"指鏡像體能重疊的分子。"原手性分子"指在特定 過程中有轉(zhuǎn)化成手性分子潛力的分子。術語"順式"為公認的表述，其指在一個雙鍵邊上的2個原子或基 團的排列方式，使得這些原子或基團原子或基團處在雙鍵的同一側(cè)。 順式構型通常標示為(Z)構型。此處所用的"認知功能"指較高層次的智力、大腦過程，其涉及學 習和記憶，包括但不僅限于，注意力、掌握、短期記憶、長期記憶和 記憶恢復、以及表達對周遭和自身的興趣。在動物模型系統(tǒng)中，可用 現(xiàn)有大量方式測定認知功能，包4舌利用以下設施Morris水迷宮、 Barnes圓形迷宮、升高的輻射臂狀迷宮、T形迷宮或任何其他個體要 運用空間信息的迷宮?，F(xiàn)有已知的其他測試可用于評估認知功能，如 恐懼狀態(tài)、積極躲避、明亮的開放區(qū)域、黑暗活躍度計量、升高的正 型迷宮、雙室探險測試或強迫游泳測試。人類中，可以不受限制的測 量認知功能。測量通過阿耳茨海默癥評估級別-認知亞級別 (ADAS-cog);臨床全球印象的變化級別(CIBIC-正級別)；阿耳茨海默 癥協(xié)作研究運動的每日生活級別(ADCS-ADL);迷你精神狀態(tài)檢測 (MMSE);神經(jīng)精神病學目錄(NPI);臨床癡呆等級級別(CDR);劍橋 神經(jīng)心理自動測試組(CANTAB)或Sandoz臨床評估-老年病(SCAG)來 進行。另外，可以利用成像技術來測量認知功能，如正電子發(fā)射斷層 撮影法(PET)、功能性磁共振成像(fMRI)、單光子發(fā)射計算斷層撮影法 (SPECT)或任何其他可測定大腦功能的成像技術。"促進"認知功能指影響有障礙的認知功能從而使之更類似于與年 齡相符的正常、無障礙個體的功能，其包括影響認知功能已減少的狀態(tài)，如，相對于正常個體減少約10%、 30%、 50%、 75%、 90%或95%。 可將認知功能促進到任何可檢測的程度，但優(yōu)選足以促進到使有障礙 的個體能進行每日正常生活行為。"保持"認知功能指影響正?；蛴姓系K的認知功能從而使之不衰退 或不降至個體首次表現(xiàn)或診斷觀察值以下。"有障礙的認知功能"指與年齡相符的正常個體所觀察到狀況相 比，不如其強健的認知功能，其包括認知功能已減少的狀態(tài)，如，相 對于年齡相符的正常個體測量到的認知功能，減少約10% 、 30% 、 50% 、 75%、卯％或95%。有障礙的認知功能可能與許多疾病或病癥相關， 包括癡呆(如，雷維小體癡呆、血管癡呆、阿耳茨海默氏癥以及與HIV 相關的癡呆)、亨廷頓氏舞蹈病、帕金森氏癥、精神分裂癥、肌萎縮 性脊髓側(cè)索硬化癥、輕度認知功能障礙(MCI)以及與年齡有關的認知衰 退(ARCD)?？蛇x地，有障礙的認知功能可以在個體中顯現(xiàn)，但不作為 可診斷的疾病或病癥出現(xiàn)。例如，有障礙的認知功能可以由個體中的 細微代謝、毒性、神經(jīng)毒、因治療而引起的、熱量或化學變化而造成 的。這些細微改變包括但不僅限于，局部缺血、供氧不足、腦血管意 外、外傷、外科手術、壓力、質(zhì)量效應、出血、輻射、血管痙攣、神 經(jīng)變性疾病或病癥。此處所用的"對照群體"指缺少與認知功能相關的預期行為的哺乳 動物，其通常包括不年輕的哺乳動物。術語"共價鍵"為公認的表述，其指在2個原子間的鍵，其中電子 靜電吸附于這2個原子的核上，而且在核間增加的電子密度的凈效應 等于核間排斥力。當鍵與金屬離子連在一起時，術語共價鍵包括等同 的鍵。術語"組合文庫"或"文庫"為公認的表述，其指大量被術語稱為"成 分"的化合物，在文庫中它們從一種或多種起始原料通過運用相同或 不同的反應物或反應條件合成或制備而來的。有大量其他術語(以及 其他技術)與組合文庫相關。術語"鑒定標簽"為公認的表述，其指記 錄一系列用于合成化學文庫的反應步驟的手段。術語"固定"為公認的 表述，并且當用于種類物時，其指一種狀態(tài)及種類物的行為，其中種 類物附著于有吸附力的表面上，該吸附力大于所用環(huán)境對表面所用的 吸附力。術語"固相支持物"為公認的表述，其指不能溶解的基質(zhì)材料，并可以(任選)具有堅硬的或半堅硬的表面，術語"接頭"為公認的表 述，其指連接支持物的分子的分予或基團，包括固相支持物或聚合支 持物，以及組合文庫的成分。術語"聚合支持物"為公認的表述，其指 可溶或不溶的聚合物，其中化學部分可通過反應與聚合支持物的功能 性基團共價鍵合。術語"聚合支持物的功能性基團"為公認的表述，其 指聚合支持物的化學部分，聚合支持物能與化學部分反應形成聚合物 支持的氨基酯。此處所用的"衍生物"指化合物如，頭孢菌素或丙戊酸的化學修飾。 化合物的化學修飾可包括諸如，以烷基、?；虬被娲鷼?。也可能 是其他許多修飾。化合物的衍生物保持原化合物至少一個功能性質(zhì)。此處所用的"預期行為"指如正常、無障礙個體中所觀察到的認知 功能的行為表現(xiàn)。例如，動物中的預期行為反映了動物的認知功能，可用以下設施測量，如Morris水迷宮、Barnes圓形迷宮、升高的輻射 臂狀迷宮、T形迷宮；或通過許多測試之任一，如恐懼狀態(tài)、積極躲 避、明亮的開放區(qū)域、黑暗活躍度計量、升高的正型迷宮、雙室探險 測試或強迫游泳測試。在人類中，預期行為反映了個體的認知功能， 可用個體進行每日正常生活行為的能力來測量或可以實施大量認知功 能測試來測量，包括但不僅限于，ADAS-cog、 CIBIC-正級數(shù)、 ADCS-ADL、 MMSE、 NPI、 CDR、 CANTAB或SCAG。術語"雜原子"為公認的表述，其指除了碳或氫之外的元素的原子。 示例的雜原子包括硼、氮、氧、磷、硫和硒。術語"芳基"為公認的表述，其指5-、 6-和7-元單環(huán)芳香族基團， 其可以包括零至4個雜原子，例如，苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、職 唑、嚷唑、三唑、吡唑、吡咬、吡喚、峻噢和嘧咬等等。那些在環(huán)結 構中具有雜原子的芳基基團也可被稱為"雜芳基"。芳環(huán)可以用如上所 述的那些取代基在一個或多個環(huán)上的位置上進行取代，例如，卣素、 疊氮化物、烷基、芳烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、羥基、烷氧基、 氨基、硝基、巰基、亞氨基、氨基甲?；?、磷酸酯、亞磷酸酯、羰基、 羧基、甲硅烷基、醚、烷硫基、磺?；?、磺酰氨基、酮、醛、酯、雜 環(huán)基、芳香族或雜芳化合物的部分、-CF3、 -CN等等。術語"芳基"也 包括具有2個或多個環(huán)的多核環(huán)系統(tǒng)，其中鄰接的環(huán)共同擁有2個或 多個碳原子(環(huán)為"稠環(huán)")，其中至少有一個環(huán)是芳香族的，如，其他環(huán)可以是環(huán)烷基、環(huán)鏈烯基、環(huán)炔基、芳基和/或雜環(huán)基。術語鄰、間和對為公認的表述，其分別指1，2-、 1，3-和1，4-二取代 的苯。例如，稱為1，2-二甲苯和鄰二甲苯的就是同義詞。術語"雜環(huán)基"或"雜環(huán)基團"為公認的表述，其指3-至約10-元環(huán)結 構，可選地3-至約7-元環(huán)結構，其環(huán)結構包括l至4個雜原子。雜環(huán) 也可以是多環(huán)。雜環(huán)基基團包括諸如，參吩、噢蒽、呋喃、吡喃、異 苯并呋喃、色烯、氧雜蒽、苯氧雜蒽、吡咯、咪唑、吡唑、異瘞唑、 異P惡唑、吡啶、吡溱、嘧啶、噠秦、丐l噢、異p引咮、吲咮、吲唑、噤 呤、喹嗪、異喹嗪、喹啉、酞嗪、萘啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶 咬、呻唑、"t啉、菲咬、吖咬、嘧吱、菲咯啉、汾溱、汾跳喚、吩逸 嗪、呋咱、吩聰嗪、吡咯烷、氧雜環(huán)戊烷、硫雜環(huán)戊烷、嗯唑、哌啶、 哌溱、嗎啉、內(nèi)酯、諸如氮雜環(huán)丁烷內(nèi)酰胺和吡咯烷內(nèi)酰胺的內(nèi)酰胺、 磺內(nèi)酰胺、磺酸內(nèi)酯等等。雜環(huán)可以用如上所述的那些取代基在一個 或多個位置上進行取代，例如，卣素、烷基、芳烷基、鏈烯基、炔基、 環(huán)烷基、羥基、氨基、硝基、巰基、亞氨基、氨基曱?；⒘姿狨?、 亞磷酸酯、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷硫基、磺?；⑼?、醛、 酯、雜環(huán)基、芳香族或雜芳化合物的部分、-CF3、 -CN等等。此處所用的"差異表達"指組織中感興趣的基因的有差別的表達水 平，包括定量和定性的測定，所逸組織有差別地處理或暴露于不同的 環(huán)境因子中或改變生理環(huán)境。此處所用的"基因"或"基因序列"指基因的部分或完整的編碼序 列、其互補物及其5'或3'未翻譯區(qū)域?；虻?編碼序列"指出現(xiàn)在基 因mRNA轉(zhuǎn)錄中的那套核苷酸。"基因表達"指制備或轉(zhuǎn)錄基于基因 DNA序列的RNA的過程?；虮磉_的"活化劑，，指刺激基因的DNA 序列轉(zhuǎn)錄為RNA轉(zhuǎn)錄體的化合物."內(nèi)源"基因為在物種中天然存在的 基因，不需要人工整合，如隨機插入或轉(zhuǎn)染進生物體或細胞的基因組 中。此處所用的"谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白"指穿膜蛋白質(zhì)，其能從細胞外空間 中，包括突觸間隙和突觸外空間，去除L-谷氨酸，即哺乳動物中樞神 經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的初級興奮神經(jīng)遞質(zhì)?？梢栽谏窠?jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的 膜中發(fā)現(xiàn)谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白。在人類中已經(jīng)鑒定了幾種谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白， 其包括諸如，溶質(zhì)載體蛋白家族1成員1 (SLC1A1或EAAC1或EAAT3;例如GenBank登錄號NM—004170)、溶質(zhì)載體蛋白家族 1成員2( SLC1A2或EAAT2或GLT1;例如登錄號NM——0041710 )、 溶質(zhì)載體蛋白家族1成員3( SLC1A3或EAAT1、GLAST或GLAST1; 例如登錄號NM—004172 )、溶質(zhì)載體蛋白家族1成員6 ( SLC1A6 或EAAT4;例如GenBank登錄號NM一005071 )和溶質(zhì)載體蛋白家 族1成員7( SLC1A7或EAAT5;例如GenBank登錄號NM一006671 )。 另夕卜，在Rattus norvegicus和Mus musculus中已經(jīng)鑒定了谷氨酸轉(zhuǎn)運 蛋白 (Slclal/Eaacl/REAAC1 、 Slcla2/GluT/GLT-l/GluT-R 、 Slcla3/Eaatl/GLAST/GIuT-l和Slcla6/Eaat4)。上述同源物據(jù)信存在 于其他哺乳動物中，包括靈長類、犬科、貓科和嚙齒動物。通過給藥 能增加谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白的谷氨酸轉(zhuǎn)運活性的試劑，能增加谷氨酸轉(zhuǎn)運 蛋白的活性。已報道的能增加谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白活性的試劑的例子包括 諸如，((R)-(-)-5-甲基-l-煙?；?2-吡唑啉(MS-153; Shimada等，Eur J Pharmacol. 386: 263-70， 1999);利多卡因(Do等，AnesthAnalg. 95: 1263-8， 2002)和激酶抑制劑(如，Conradt， J Neurochem. 68: 1244-51， 1997)。此處所用的基因"表達水平"指基因表達的水平，可通過任何用于 檢測基因表達存在、極限量、定量、定性的測試方法來測定，如，通 過測定mRNA水平(如，通過"Northern印跡"或"微陣列分析")或 蛋白質(zhì)(如，通過檢測全長或截短多肽基因產(chǎn)物的量(如，用抗體的 免疫學方法))。術語"內(nèi)消旋化合物，，為公認的表述，其指具有至少兩個手性中心 但由于平面或點對稱而無手性的化合物。此處所用的"促代謝谷氨酸受體"(mGluR)指G蛋白質(zhì)-偶聯(lián)的受 體，其對神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸做出反應?；谒鼈兊幕拘蛄邢嗨菩?、信 號轉(zhuǎn)換聯(lián)系和藥理學圖譜，有3組mGluR。組I由mGluRl( mGluRla、 mGluRlb、 mGluRlc、 mGluRld;如，GenBank登錄號NM_000838 所示的人mGluRla剪切變體)和mGluR5 ( mGluR5a、 mGluR5b;如， GenBank登錄號NM—000842所示的人mGluR5a剪切變體)組成，其 確定與磷脂酶C偶聯(lián)。組II由mGluR2 (如，GenBank登錄號 NM—000839)和mGluR3 (如，GenBank登錄號NM—000840 )組成， 其不與腺苷酸環(huán)化酶相聯(lián)。組II由mGluR4 ( mGluR4a、 mGluR4b;如，GenBank登錄號NM—000841 ) ， mGluR6 (如GenBank登錄號 NM—000843) ， mGluR7 (mGluR7a、 mGluR7b;如，GenBank登錄 號NM—000844所示的人mGluR7a剪切變體)和mGluR8(如，GenBank 登錄號NM一000845 )組成，其不與腺苦酸環(huán)化酶相聯(lián)。對于各個mGluR 組，有大量可從商業(yè)渠道獲得激動劑和拮抗劑。例如，組I的激動劑 包括但不限于1^使君子氨酸((1^)-(+)- oc -氨基-3，5-二氧代-1，2，44惡二唑 烷-2-丙酸)、(S)-3，5-二羥基苯基甘氨酸((S)-3,5-DHPG)、反式氮雜環(huán)丁 烷-2，4- 二曱酸(tADA) 、 (1S，3R)-1-氨基環(huán)戊烷-1,3- 二甲酸 ((1S，3R)-ACPD)和(RS)-2-氯-5-羥基苯基甘氨酸(CHPG);而拮抗劑包括 但不限于(S)-4-羧基-3-羥基苯基甘氨酸((S)-4C3HPG)、 7-(羥基亞氨基) 環(huán)丙烯并[b苯并吡喃-la-甲酸乙酯(CPCCOEt)、 (RS)-1氨基茚滿-1，5-二甲酸(AIDA; UPF523)、 2-曱基-6-(苯基乙炔基)吡啶(MPE鹽酸鹽)、 2-曱基-6-(2-苯基乙烯基)吡啶(SIB-1893)、 6-甲基-2-(苯基偶氮)-3-吡吱 酚(SIB-1757)和(S)-(+)-ot-氨基-4-羧基-2-曱基苯乙酸(LY367385)。組II 的激動劑包括(2S，2'R，3，R)-2-(2'，3'-二羧基環(huán)丙基)甘氨酸(DCGIV)、 (2S，1'S，2'S)國2-(羧基環(huán)丙基)甘氨酸(L-CCG-I; (2S，3S,4S)畫CCG)、 (S)-3 羧基-4-羥基苯基甘氨酸((S)-3C4HPG)和(2R，4R)-4-氨基吡咯烷-2,4-二 甲酸((2R，4R)-APDC);而拮抗劑包括(2S》ct -乙基谷氨酸(EGLU)和 (2S)畫2-氨基畫2-[(lS，2S)畫2-羧基環(huán)丙-1-基-3-(黃嘌呤-9-基)丙酸 (LY341495)。組III的激動劑包括(lS，3R，4S)-l-氨基環(huán)戊烷-l，2，4-三甲 酸(ACPT-I)、 L(+)-2-氨基-4-膦?；∷?L-AP4)、 (R，S)-4-膦醜基苯基 甘氨酸((R,S)-PPG)和O-磷酸-L-絲氨酸(L-SOP);而拮抗劑包括(RS)-a -環(huán)丙基-4-膦?；交拾彼?CPPG)、 (S)-2-氨基-2-甲基-4-膦酰基丁 酸(MAP4)和(RS)- a -曱基絲氨酸-O-磷酸酯(MSOP)。近來的證據(jù)表明 與神經(jīng)膠質(zhì)相關的促代謝谷氨酸受體能改變谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白的表達 (Aronica等，Eur. J. Neurosci. 2003; 17: 2106-18， 2003)。此處所用的"中年"指已經(jīng)過了性成熟期的哺乳動物，即，不年輕 但也不接近物種的平均壽命跨度，即，不年老。例如，中年鼠約12-18 個月大。中年的人在20至70歲之間。此處所用的"神經(jīng)組織"指神經(jīng)系統(tǒng)的組織，即包含神經(jīng)元和神經(jīng) 膠質(zhì)的組織。特別指明，神經(jīng)組織可以指特定在大腦中發(fā)現(xiàn)的結構， 包括"海馬組織"。海馬組織指在顳皮層發(fā)現(xiàn)的海馬狀結構，包括內(nèi)鼻層、前下托、腦下腳、原腦下腳、齒狀回、以及已知為CA1、 CA2、 CA3和CA4的區(qū)域。海馬涉及的過程如短期記憶、長期記憶的形成、 記憶恢復、表述性記憶和空間導航。此處所用的"神經(jīng)保護"指組合物和治療方法，其具有減少、阻止 或改善有障礙的認知功能的作用，并保護、恢復或回復遭受有障礙的 認知功能的組織。術語"硝基"為公認的表述，其指-NOz;術語"卣素"為公認的表述， 其指-F、 -Cl、 -Br或-I;術語，，巰基"為公認的表述，其指-SH;術語" 羥基"指-OH;而術語"磺?；?為公認的表述，其指-SOr。，'卣化物" 指具有相應的卣素陰離子，而"類卣化物"按照Cotton和Wilkinson 的《高級無機化學》第560頁中的定義。術語"磷?；?為公認的表述，其一般可以由以下通式表示Q50 IIOR59其中Q50表示S或O，而R59表示氬，低級烷基或芳基。當用 于取代時，如烷基，則磷酰烷基的磷酰基團一般可以由以下通式表示<formula>formula see original document page 21</formula>其中Q50和R59各自獨立地如上所定義，而Q51代表0、S或N。 當Q50為S時，磷酰基部分為"硫代磷酸酯"。術語"磷酰胺酸酯"為公認的表述，其可以由以下通式表示o-Q51—p-oOQ51_p—OR59R50 R51R50 R51其中Q51、 R50、 R51和R59如上定義' 術語"膦胺酸酯"為公認的表迷，其可以由以下通式表示:R60 Q51—p——o-R60Q51——p—OR59R50 R51入 R50 R51其中Q51、 R50、 R51和R59如上定義，而R60代表低級烷基或 芳基?？梢韵蜴溝┗腿不M行類似的取代從而產(chǎn)生諸如，氨基鏈烯基、 氨基炔基、氨基甲酰基鏈烯基、氨基甲?；不?、亞氨基鏈烯基、亞 氨基炔基、鏈烯硫基、炔硫基、羰基-取代的鏈烯基或炔基。每個表述 的定義，如，烷基、m、 n等等，在任何結構中出現(xiàn)多于一次時，其意 指在同一結構中各處進行獨立的定義。術語"硒代烷基"為公認的表述，其指其上附帶有取代的硒基基團 的烷基。示例的"硒醚"可以在烷基進行取代，選自-Se-烷基、-Se-鏈烯 基、-Se-炔基和-Se-(CH2)m-R61， m和R61如上定義。術語三氟甲烷磺?；?、甲苯磺?；?、甲磺酰基和九氟丁烷磺?；?為公認的表述，其分別指三氟曱烷磺?；?、對甲苯磺酰基、甲磺?；?和九氟丁烷磺?；鶊F。術語三氟甲烷磺酸酯、甲苯磺酸酯、甲磺酸 酯和九氟丁烷磺酸酯為公認的表迷，其分別指三氟曱烷磺酸酯、對甲 苯磺酸酯、甲磺酸酯和九氟丁烷磺酸酯的功能基團及包含所述基團的 分子?？s寫Me、 Et、 Ph、 Tf、 Nf、 Ts和Ms分別代表甲基、乙基、苯基、三氟曱烷磺?；酋；?、九氟丁烷磺?；?、對曱苯磺?；图谆酋?基。本領域普通技術人員所用的有機化學縮寫的更全面的列表參見Journal of Organic Chemistry每一巻的第 一期；該列表一般出現(xiàn)在稱 為標準縮寫列表的表格中。此處所用的"垂體腺苷酸環(huán)化酶活化因子多肽"(PACAP)指神經(jīng)多 肽，其為cAMP-依賴性信號途徑的有效的活化因子。PACAP起多功能 肽的作用并涉及多種過程，如調(diào)節(jié)激素分泌、能量代謝、神經(jīng)元存活， 而且它是神經(jīng)膠質(zhì)谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白EAAT1和EAAT2的調(diào)節(jié)因子 (Figiel和Engele， J. Neurosci. 15: 3596- 3605， 2000) 。 PACAP 屬于選凝素/胰高血糖素/血管活性腸肽(VIP)超家族，并存在源于相同 前體的兩種酰胺化形式，即PACAP38 (38-氨基酸殘基)和PACAP27 (27-氨基酸殘基)。PACAP的主要結構在被嚢動物、魚類、兩棲類 和哺乳動物的整個進化中高度保守，而且在果蠅中也測定出了 PACAP-樣神經(jīng)肽。除了 PACAP-38和PACAP-27, PACAP受體的第 三類激動劑為Maxadilian。 Maxadilan是有效的血管擴張肽，其從吸 血沙地蠅的唾液腺提取物中分離而得。近來已證實，盡管maxadilan 同PACAP沒有明顯的氨基酸序列同源性，但在哺乳動物中，maxadilan 與PACAP受體1型結合(Moro和Lerner : Maxadilan, J. Biol. Chem. 272 (2): 966-70， 1997) 。 PACAP及其受體主要都分布在神經(jīng)和內(nèi)分 泌系統(tǒng)中，顯示出高效的多效性功能。所以，激發(fā)PACAP受體的 PACAP肽、Maxadilan或肽衍生物和類似物、肽-樣化合物和小分子 激動劑能用于增加谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白的活性。術語"多環(huán)"或"多環(huán)基團"為公認的表述，其指2個或多個環(huán)(如， 環(huán)烷基、環(huán)鏈烯基、環(huán)炔基、芳基和/或雜環(huán)基)，其中2個鄰接的環(huán) 共同擁有2個或多個碳，如，環(huán)是"稠環(huán)"。通過非鄰接的原子連接的 環(huán)術語稱作"橋"環(huán)。多環(huán)的每個環(huán)可用如上所述的那些取代基來取 代，例如，自素、烷基、芳烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、羥基、氨 基、硝基、巰基、亞氨基、氨基甲?；?、磷酸酯、亞磷酸酯、羰基、 羧基、甲硅烷基、醚、烷硫基、磺酰基、酮、醛、酯、雜環(huán)基、芳香 族或雜芳化合物部分、-CF3、 -CN等等。此處所用的"大量"指2或更多。術語"前藥"為公認的表述，其意為包含在生理條件下能轉(zhuǎn)化為本發(fā)明抗菌劑的化合物。制備前藥的普通方法是選擇在生理條件下能水 解成預期化合物的部分。在其它具體實施方式
中，通過宿主動物的酶 活性來轉(zhuǎn)化前藥。術語"保護基團"為公認的表迷，其指臨時保護潛在反應功能基團 不發(fā)生不要的化學轉(zhuǎn)化的取代基。這些保護基團的實例分別包括羧酸 酯、醇的甲硅烷基醚及醛和酮的乙縮醛和縮酮?；瘜W保護基團領域可參見Greene和Wuts的Protective Groups in Organic Synthesis (第2 版，Wiley:紐約，1991)的綜述。術語"羥基-保護基團"為公認的表述，其指那些要保護在合成過程 中羥基基團不發(fā)生不要的反應的基團，其包括諸如，現(xiàn)有技術中已知 的節(jié)基或其他合適的酯或醚基團。術語"羧基-保護基團"為公認的表述，其指那些要保護在合成過程 中羧酸基團不發(fā)生不要的反應的基團，如氨基酸或肽的C末端或酸性 或羥基吖庚因環(huán)的取代基。羧基保護基團的實例包括諸如，千基酯、 環(huán)已基酯、4-硝基千基酯、叔丁基酯、4-吡啶甲基酯等等。術語"氨基-保護基團"為公認的表述，其指保護氨基基團不參與與 一些其他功能基團發(fā)生的反應的基團，但其能在需要時從胺上去除。 這些基團如上述Greene和Wuts著作的第7章和Barton的Protective Groups in Organic Chemistry的第2章(McOmie編輯，Plenum Press， 紐約，1973 )中所述的。合適基團的例子包括?；Ｗo基團，例如， 甲?；⒌；?、乙酰基、苯曱?；⑷阴；?、琥珀酰基、甲氧 基琥珀?；?、千基和取代的千基，如3，4-二甲氧基節(jié)基、鄰硝基千基 和三苯基甲基；那些分子式-COOR的基團，其中R包括諸如以下基團 的基團，甲基、乙基、丙基、異丙基、2，2，2-三氯乙基、l-甲基-l-苯基 乙基、異丁基、叔丁基、叔戊基、乙烯基、烯丙基、苯基、芐基、對 硝基芐基、鄰硝基芐基和2，4-二氯卡基；?；腿〈孽；?，如甲?；?乙?；?、氯乙酰基、二氯乙?；?、三氯乙酰基、三氟乙?；?、苯曱酰 基和對甲氧基苯曱酰基；其他基團如，甲磺?；?、對甲苯磺?；?、對 溴苯磺?；?、對硝基苯基乙基和對曱苯磺酰基-氨基羰基。優(yōu)選的氨基-保護基團為芐基(-CH2C6Hs)、?；鵞C(O)Rl]或SiRl3，其中Rl為C廣d 烷基、卣甲基或2-卣-取代的-(C2-d烷氧基)，芳香族尿烷保護基團， 例如，羰基千氧基(Cbz)和脂肪族尿烷保護基團，如叔丁氧基羰基(Boc)或9-芴基甲氧基羰基(FMOC)。每種表述的定義，如低級烷基、m、 n、 p等等，當其在結構中出 現(xiàn)超過一次時，其意在同一結構中不同位置各自獨立定義。術語"吸電子基"為公認的表述，其指有從相鄰原子吸引價電子傾 向的取代基，即取代基相對于相鄰原子是電負性的。吸電子能力氷平 的量化由Hammett西格馬(a)常數(shù)得出。該公知的常數(shù)在許多文獻中 有敘述，例如，March, Advanced Organic Chemistry 251-59( McGraw Hill Book Company:紐約，1977) 。 Hammett常數(shù)值一般以負值表示供電子基團(CT(P)--O. M表示NH;j)而以正值表示吸電子基團((T(P)=0.78表示硝基)，cj(P)顯示了相對替換性。示例的吸電子基包括硝基、?；?、甲?；?、磺酰基、三氟甲基、氰基、氯化物等等。示例的供電 子基包括氨基、甲氧基等等。此處所用的"RNA"指各種核糖核酸，如信使RNA、成熟RNA、 多聚腺苷酸化的RNA，未多聚腺苷酸化的RNA和包含內(nèi)含子和/或5' 或3'未翻譯區(qū)的RNA。此處所用的"表達的RNA"指通過聚合酶從基 因組或線粒體DNA上轉(zhuǎn)錄的RNA。術語"區(qū)域異構體"為公認的表述，其指具有相同分子式但在原子 的連通性上有差異的化合物因此，"區(qū)域選擇過程"為相對其它異構體 偏好產(chǎn)生特定區(qū)域異構體的過程，如，反應產(chǎn)生統(tǒng)計學顯著增加的某 種區(qū)域異構體的產(chǎn)量.術語"差向異構體"為公認的表述，其指具有完全相同化學構造并 包含超過一種立構中心的分子，但其在這些立構中心中僅有一個的構 型中有差異。此處所用的"小分子"指一種成分，其具有小于約5kD的分子量， 最優(yōu)選小于約4kD。小分子可以是核酸、肽、多肽、模擬肽、碳水化 合物、脂或其它有機(含碳)或無機分子。許多制藥公司和供應商有 許多化學和/或生物混合物的文庫，通常是真菌、細菌或藻類的提取物， 它們能用本發(fā)明的任何試驗來篩選從而鑒定能調(diào)節(jié)生物活性的化合 物，如預期行為或認知功能。術語"立體異構體"為公認的表述，其指具有完全相同化學構造化 合物，但在原子或基團的空間排列上有差異。特別地，"對映異構體" 指化合物的2個立體異構體，它們的鏡像影像是不能互相重疊的。另一方面，"非對映異構體"指具有2個或多個非對稱中心的立體異構體， 而且其分子不互為鏡像影像。另外，"立體選擇過程"為相對產(chǎn)生其它可能的立體異構體，更偏 好產(chǎn)生反應產(chǎn)物中特定立體異構體的過程。"對映選擇過程"為偏向產(chǎn) 生反應產(chǎn)物中2個可能的對映異構體中的一個過程。術語"結構-活性關系"或"(SAR)"為公認的表述，其指改變藥物 或其它化合物分子結構的方法，該方法改變了其與受體，酶，核酸或 其他靶位等的相互作用。此處所用的"個體"指哺乳動物，如人、非人靈長類、綿羊、牛、 豬、馬、貓、鼠或犬。優(yōu)選地，個體為人。本發(fā)明所述的"需要"治 療的個體或哺乳動物具有有障礙的認知功能，該認知功能能由在此所 述的方法和組合物來改善?？梢岳斫?取代，，或"用...取代"包括隱含 的限定，即這種取代符合取代原子和取代基所允許的價，而且取代形 成穩(wěn)定的化合物，如不會自發(fā)通過諸如重排、環(huán)化、消除或其他反應 而產(chǎn)生變化。術語"取代的"預期也包括有機化合物所允許的所有取代基。在一 個廣義的方面，允許的取代基包括有機化合物的無環(huán)的和環(huán)的、分支 的或不分支的、碳環(huán)的和雜環(huán)的、芳香族和非芳香族取代基。示例的 取代基包括諸如如上所示的那些。合適有機化合物的允許的取代基可 以是一個或多個并可以是相同或不同的。為了本發(fā)明的目的，雜原子， 如氮，可以帶來有氫取代基和/或任何此處所述的有機化合物允許的取 代基，其符合雜原子的價。本發(fā)明不以任何方式被有機化合物所允許 的取代基限制。術語"磺酸酯"為公認的表述，其指可由如下通式所表示的部分<formula>formula see original document page 27</formula>其中R57為電子對、氫、烷基、環(huán)烷基或芳基。 術語"疏酸酯"為公認的表述，其包括由如下通式所表示的部分-O—S——OR57其中R57如上定義。術語"磺酰氨基"為公認的表述，其包括由如下通式所表示的部分:R50 O其中R50和R56如上定義，術語"氨磺酰基"為公認的表述，其指可由如下通式所表示的部分:<formula>formula see original document page 27</formula>其中R50和R51如上定義。術語"磺?；?為公認的表述，其指可由如下通式所表示的部分:-S——R58其中R58為如下之一 氫、烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、雜 環(huán)基、芳基或雜芳基。術語'，亞砜基"為公認的表述，其指可由如下通式所表示的部分R58其中R58如上定義。術語"合成"為公認的表述，其指通過體外化學或酶學合成方法生產(chǎn)。此處所用的"測試群體"指具有預期行為或認知功能的個體。測試 群體的成員可包括年輕、中年和老年個體。此處所用的"治療劑"指化學化合物或組合物，當向需要的個體適 量給藥時，其能誘導預期的治療或預防效果。"治療劑"可以是任何化 學部分或有生物、生理或藥理活性的生物物質(zhì)，其能局部或系統(tǒng)性地作用于需要的個體?；瘜W治療劑的實例也被稱為"藥物"，已在公知 文獻中描述了 ， 如 Merck索引，Physicians Desk Reference, 和 Pharmacological Basis of Therapeutics,而且它們包括但不限于藥劑； 維生素；礦物質(zhì)補充劑；用于處理、診斷、治療或緩解疾病或病癥的 物質(zhì)；影響機體結構或功能的物質(zhì)或前藥，其在生理環(huán)境中被替代后 能具有生物活性或更多活性?？股卦噭┖虵abl/FabK抑制劑是治療 劑的實例。生物治療劑的實例包括含有基因并能將基因遞送到個體的 載體。治療劑誘導動物的局部或系統(tǒng)效應，尤其是由藥物活性物質(zhì)造成 的哺乳動物的，更特別的是人的。所以，治療劑可在動物或人中用于 診斷、治療、緩解、治療或預防嗯性病況或增強預期的身體或精神發(fā)育和/或狀態(tài)。為了有效果，治療劑以產(chǎn)生預期局部或系統(tǒng)效應的量或濃度以合 理的利益/風險率進行遞送，從而應用于任何治療中。這種治療劑的有 效量會根據(jù)治療的個體和病情、個體的體重和年齡、病情的嚴重程度、 給藥方式等而變化，其能由本領域普通技術人員方便的確定。例如， 本發(fā)明的某些組合物可以足以產(chǎn)生效果的量以合理的利益/風險率來進 行給藥，從而應用于這種治療中。有障礙的認知功能的上下文中，能 用標準行為或現(xiàn)有已知評估認知功能的其他測試來評估呈現(xiàn)的治療效 果的程度。術語"反式"為公認的表述，其指在一個雙鍵邊上的2個原子或基 團的排列方式，使得這些原子或基團原子或基團處在雙鍵的不同側(cè)。 反式構型通常標示為(E)構型。此處所用的"治療"個體有障礙的認知功能或"治療"具有有障礙的 認知功能的個體指通過合適的方法向個體提供治療劑，如，給藥藥物， 從而使至少一個有障礙的認知功能的癥狀穩(wěn)定或減輕。治療有障礙的 認知功能能防止功能障礙，延緩功能障礙的進程或改善功能障礙(減 輕疾病嚴重程度)或治療功能障礙。此處所用的"載體"指組合物，其用于將DNA或RNA導入進組織。所屬領域技術人員公知的方法可用于構建包含核酸的表達載體，該核 酸編碼與合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號相連的感興趣的蛋白質(zhì)。如參見，Sambrook & Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第 3版)，Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. (2001)和Ausebel等 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience， N. Y (1989)所述的才支術。將栽體或質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入細胞的合適方法包括脂/DNA復合物，如美國 專利第 5,578,475; 5,627,175; 5,705,308; 5,744,335; 5,976,567; 6,020,202 ; 6,051,429號所述的那些方法。合適的試劑包括 lipofectamine， 一種3: 1(w/w)的聚-陽離子脂三氟乙酸2，3-二油酰氧基 -N- [2(精胺羧基-氨基甲?；?乙基-N，N-二甲基-l-丙銨(DOSPA) (Chemical Abstracts登記名稱N-2- (2，5-雙[(3-氨基丙基)氨基]曙1-氧基戊基)氨基乙基)-N, ^二曱基-2，3-雙(9-十八碳烯氧基)-1-丙銨-三氟乙酸鹽)的脂質(zhì)體配方，和膜過濾水中的中性脂二油烯基磷酯酰乙醇胺(DOPE)。實例有Lipofectamine 2000TM (可從Invitrogen (以前 的Gibco/Life Technologies ) # 11668019處獲得)配方.其他試劑包括 FuGENETM轉(zhuǎn)染試劑(非脂質(zhì)體形式中的脂和80%乙醇中的其他化 合物的混合物，可從Roche Diagnostics Corp. # 1814443處獲得)和 LipoTAXlTM轉(zhuǎn)染試劑(獲得自Invitrogen Corp.的脂配方，其能產(chǎn)生 預期的生物活性蛋白質(zhì)。#204110 )?？赏ㄟ^電穿孔來轉(zhuǎn)染細胞，如 Roach和McNeish (Methods in Mol. Biol. 185: 1 (2002))所述的那樣。 用來產(chǎn)生穩(wěn)定遺傳變化的細胞的合適病毒載體系統(tǒng)可以是基于腺病 毒、慢病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、腺相關病毒(AAV)和其他病毒的，并可以用 可從商業(yè)渠道獲得的病毒成分來制備。載體可通過現(xiàn)有技術導入到神 經(jīng)細胞和組織中，包括注射(如注射到大腦特定區(qū)域)、通過使用動 靜脈吻合流術導入血管空間或腦脊髓液中以及其他機械方法。"年輕"指約性成熟年齡的青春期和正常成年哺乳動物，而且其時 海馬剛完全成熟。對于鼠來說，"年輕"鼠為6-9個月大。對人來說， '，年輕"人為10-20歲。6.2引言:認知功能的行為和遺傳評估的聯(lián)合研究用Morris水迷宮和輻射臂狀迷宮進行的認知功能的行為評估已 經(jīng)用于鑒定與年齡相關的認知功能的改變?；谄湔J知功能，將這些 行為評估用作為表征動物的方法，這樣就可以將認知功能的行為評估 與遺傳和生理測定結合起來，從而檢測大腦衰老效應的差異。為了獲得大腦中與年齡和行為相關的變化的基因模板，應用基因 表達陣列提供了同時分析成千上萬表達的基因的可能性。這些方法也 提出了一些挑戰(zhàn)。首先，我們的鼠模型，類似于衰老人群，其包含遺 傳上遠系繁殖的群體，其能增加個體可變性，從而成為基因表達譜中 的干擾因子。第二，用傳統(tǒng)定量方法來評估海馬中的特定mRNA的表 達水平，我們發(fā)現(xiàn)與年齡和行為有關的基因表達變化通常相對較小， 小于已經(jīng)報道的現(xiàn)有Genechip⑧或微陣列方法中分辨率極限的基因表 達水平的2倍差異。例如，Landfield及其同事的工作就由于不能檢測 小于2倍的基因表達改變而受到限制(W003/025122 A2)。在此我們描述了克服這些挑戰(zhàn)的策略，證實了可靠的基因表達的 小變化，我們用傳統(tǒng)方法顯示了該區(qū)分老年和年輕鼠的基因表達。分 析更廣泛的基因顯示該方法可重復地顯示了很多基因，這些基因在與年老鼠行為相關的海馬中顯示出表達改變。鑒定與認知功能障礙相關的基因第 一次使人們確定候選化合物是 否能調(diào)節(jié)與正常認知功能相關的基因表達。能調(diào)解這些更接近于諸如 人的具有預期認知功能的哺乳動物中表達水平的基因表達的化合物在 用作為治療劑時，能預見其可恢復或增強認知功能。用該方法，我們 報道發(fā)現(xiàn)了與保持年老哺乳動物中認知功能相關的基因。不僅限于推 測，我們相信這種保持代表了活性生物過程，其能用合適的治療劑處 理來引發(fā)或誘導。當然，我們在此報道一種這樣的試劑為頭孢曲松，一種第三代頭孢菌素。另一種這樣的試劑為丙戊酸和MS-153。用下述 篩選方法可鑒定并優(yōu)化其他這樣的治療劑。產(chǎn)生本發(fā)明的實驗方法和 本發(fā)明本身以及本發(fā)明的實踐技術會在以下章節(jié)中敘述。 6. 2. 1分離RNA當從個體的組織樣品或細胞中分離RNA時，重要的是從個體中分 離出組織或細胞后，防止基因表達的任何進一步變化。已知表達水平 的改變在震動后迅速發(fā)生，如熱休克或用脂多糖(LPS)或其他試劑活 化。另外，組織和細胞中的RNA快速降解。因此，在優(yōu)選的具體實施 方式中，從個體中獲得的組織或細胞盡可能的速凍住。RNA能通過大量方法從組織樣品中分離，如在實施例中所述的或 用CsCl離心后的硫氰酸胍裂解(Chirgwin等，1979， Biochemistry 18: 5294-5299)。在苯酚/硫氰酸胍混合物(得自Invitrogen)中使組織均 一化并在異丙醇沉淀后用氯仿提取從而從冰凍組織中分離RNA。然后 重懸浮RNA小顆粒并進一步過RNeasy柱(Qiagen)來純化。所有RNA 可以在缺少RNA酶抑制劑的情況下儲存于-80"C，并用瓊脂糖凝膠電 泳來評估其完整性。能用所述從單個細胞中制備cDNA文庫的方法來 從單個細胞中獲得RNA,如Dulac， C. (1998) Curr. Top. Dev. Biol. 36， 245和Jena等(1996) J. Immunol. Methods l卯199所述的那樣。 必須小心避免RNA降解，如加入RNA酶抑制劑。然后可以富集特定物種的RNA樣品。在一個具體實施方式
中，從 RNA樣品中分離聚(A)+RNA。 一般而言，這種純化法有在mRNA上 加上聚-A的好處。尤其，如上所指出，聚-T寡核苷酸可固定在固相支 持物上從而用作mRNA的親合配體。達到該目的的試劑盒可從商業(yè)渠 道獲得，如，MessageMaker試劑盒(Invitrogen #10298016),在一個具體實施方式
中，富集感興趣序列的RNA群，如那些涉及 認知功能的基因。能通過諸如引物特異性cDNA合成或基于cDNA合 成的線性擴增以及體外模板直接轉(zhuǎn)錄來進行富集(如參見，Wang等 (1989)PNAS86， 9717;以上的Dulac等，和以上的Jena等)。富集的或不在特定物種或序列中的RNA群能進一步被擴增。該擴 增在使用來自單個或一些細胞的RNA時尤其重要。許多擴增方法適用 于本發(fā)明的方法中，包括諸如PCR;連接酶鏈式反應(LCR)(如參見， Wu和Wallace, Genomics 4,560 (1989)， Landegren等，Science 241， 1077 (1988));自持序列復制(SSR)(如參見，Guatelli等，Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87， 1874 (1990));基于序列的核酸擴增(NASBA)和 轉(zhuǎn)錄擴增(如參見，Kwoh等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86， 1173 (1989))。對于PCR技術，如參見PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (H. A. Erlich著，F(xiàn)reeman Press, N. Y.， N. Y., 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and applications (編輯.Innis， 等，Academic Press, San Diego， Calif.， 1990) ; Mattila等，Nucleic Acids Res. 19， 4967 (1991); Eckert等， PCR Methods and Applications 1， 17(1991); PCR ( McPherson等著， IRL Press, Oxford)和美國專利第4,683,202號。擴增方法如下所述， 有Ohyama等(2000) BioTechniques 29: 530; Luo等(1999) Nat. Med. 5， 117; Hegde等(2000) BioTechniques 29: 548; Kacharmina等(1999) Meth. Enzymol.303: 3; Livesey等(2000) Curr. Biol. 10: 301; Spirin 等(1999) Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. 40: 3108和Sakai等(2000) Anal. Biochem. 287: 32。也可在細胞上原位進行RNA擴增和cDNA合成(如 參見，Eberwine等(1992) PNAS 89 :3010 )。"定量PCR"指利用PCR 規(guī)程使人能確定樣品中反應產(chǎn)物的量或反應產(chǎn)物的數(shù)量。所屬領域技術人員會理解如何使用擴增方法，如果要獲得定量結 果，必須注意使用保持或控制相對的核酸擴增率以獲得定量的擴增。"定量"擴增的方法對所屬領域技術人員來說是公知的。例如，定量 PCR包括用相同引物同時共擴增已知量的對照序列。這提供了內(nèi)部可 用于校正PCR反應的標準。然后，高密度陣列可包括特異性探針做內(nèi) 在擴增的核酸的定量標準。一個優(yōu)選的內(nèi)在標準為合成的AW106 cRNA。 # 據(jù)所屬領域技術人員已知的標準技術，AW106 cRNA與分離自樣品的RNA結合。然 后用反轉(zhuǎn)錄酶，反轉(zhuǎn)錄RNA產(chǎn)生DNA拷貝。然后(如，通過PCR) 用標記的引物擴增cDNA序列。典型地通過電泳來分離擴增產(chǎn)物，并 確定(與擴增產(chǎn)物成比例的)放射性的量。然后通過比較已知AW106 RNA標準產(chǎn)生的信號來計算樣品中RNA的量。具體的定量PCR規(guī)程 如PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, lords等， Academic Press, Inc. N.Y., (1990)所述。在優(yōu)選的具體實施方式
中，用反轉(zhuǎn)錄酶和由寡(dT)和編碼噬菌體 T7啟動子的序列組成的引物反轉(zhuǎn)錄出樣品mRNA，用以提供單鏈 DNA模板。用DNA聚合酶聚合出第二條DNA鏈。合成雙鏈cDNA 后，加入T7RNA聚合酶并從cDNA模板上轉(zhuǎn)錄出RNA。接下來從每 個單鏈cDNA模板上進行的轉(zhuǎn)錄輪次使得擴增了 RNA。體外聚合的方 法對所屬領域技術人員來說是公知的(如參見以上的Sambrook & Russell而且該特定方法在Van Gelder,等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 1663-1667 (1990)中有詳述，他們證明了根據(jù)該方法進行的體外擴 增保持了各種RNA轉(zhuǎn)錄體的相對率)。另外，Eberwine等Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3010-3014提供了 一種規(guī)程，其在體外轉(zhuǎn)錄中使 用2輪擴增以獲得大于初始材料106倍的增加，從而允許甚至在生物樣 品有限的情況下來檢測表達。所屬領域技術人員會理解上述直接轉(zhuǎn)錄方法提供了反義(aRNA) 庫。當反義RNA用作靶核酸時，選擇陣列中提供的寡核苷酸探針來 互補反義核酸的亞序列。相反，當靶核酸為正義核酸庫時，挑選寡核 苷酸探針來互補正義核酸的亞序列。最終，當核酸庫是雙鏈時，探針 可以是任意意義的耙核酸，包括正義和反義鏈。 6. 2.2分析RNA在一些具體實施方式
中，相對于成百或成千的基因，足以確定一 種或少量基因的表達。盡管微陣列能用于這些具體實施方式
中，但是 也可用各種其它的檢測基因表達的方法。本節(jié)描述了一些檢測并定量 mRNA或其編碼的多肽的示例方法。方法的第一步包括從細胞中分離 出mRNA，該步驟可以以如上所述的方式進行?？梢砸匀缟纤龅姆?式來標記一種或多種核酸。在一個具體實施方式
中，樣品中獲得的mRNA反轉(zhuǎn)錄出第一條cDNA鏈并進行PCR，如RT-PCR。內(nèi)務基因或其他表達不發(fā)生變化 的基因能用作內(nèi)在的對照和進行試驗的對照。PCR反應后，電泳分離 擴增的產(chǎn)物并檢測。通過使用定量PCR，擴增產(chǎn)物的水平可與樣品中 存在的RNA水平相關聯(lián)。擴增的樣品也可以在瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝 膠上分離，轉(zhuǎn)到濾膜上，而該濾膜雜交有感興趣的基因的特異探針。 進行平行PCR擴增，如多重PCR，能同時分析大量的樣品。使用的定量PCR技術是以TaqManTM探針的使用為基礎的。在存 在寡核苷酸探針的情況下，通過PE Applied Biosystems 7700序列檢測 系統(tǒng)上擴增耙序列來進行特定序列的檢測，其中探針的5，和3，端各自 標記有報告和淬滅熒光染(FQ探針)，其能在2個PCR引物間退火。 當探針結合在引物間時，僅能檢測到特定產(chǎn)物。PCR擴增進行中，Taq 聚合酶的5，-核酸酶活性開始從探針上切下報告染料.當報告染料與淬 滅染料物理分離時，用帶有CCD的照相機測定信號從而檢測出產(chǎn)生的 信號。也可以使用諸如敘利亞綠的插入性染料。每個產(chǎn)生的信號等于 一個裂解的探針，其與一個靶鏈的擴增相對應。根據(jù)提供的說明書， 可利用PE Applied Biosystem TaqMan PCR核心試劑盒來進行PCR反 應。進一步，該:技術如美國專利第6,326,462號所述。可選地，能從 Applied Biosystems和Qiagen處獲得探針,與InvUrogen的賴定量PCR 試劑盒和Rotorgene 3000 —起〗吏用。在另一個具^^實施方式中，通過點印跡分析和相關方法來確定 mRNA的水平(如參見，G. A. Beltz等的Methods in Enzymology， Vol. 100， Part B， R. Wu, L. Grossmam, K. Moldave,編著Academic Press,紐約，第19章，第266-308頁，1985)。在一個具體實施方式
中，在濾膜上印跡(即，非共價鍵)特定量的從細胞中提取的RNA， 而該濾膜雜交有感興趣的基因的特異探針。由于印跡能包含多點RNA, 因此能同時分析大量RNA樣品。利用方法來檢測雜交，該方法依賴探 針標記的類型。在另一個點印跡方法中， 一個或多個上或下調(diào)認知功 能障礙的基因的一個或多個探針吸附于膜上，并用獲得自和源自個體 細胞或組織的RNA的標記核酸來溫育該膜。這種點印跡本質(zhì)上就是包 含少于微陣列探針數(shù)的陣列。Practical Approach, B. D. Hames和S. J. Higgins， 編.，IRL Press, Washington D.C.，第4章，第73-111頁，1985)。另一種形式，即所謂的"三明治，，雜交，包括將寡核苷酸探針共 價結合到固相支持物上，并利用它們捕獲并檢測多個核酸靶位(如參 見，M.Ranki等，基因，21,第77-85頁，1983; A. M. Palva， T. M. Ranki，和H. E. Soderlund的英國專利申請GB 2156074A, 1985年 IO月2日；T. M.Ranki和H. E. Soderlund的美國專利第4，563，419 號，1986年1月7日；A. D. B. Malcolm和J. A. Langdale的PCT WO 86/03782， 1986年7月3日；Y. Stabinsky，的美國專利第4,751,177 號，1988年1月14日；T.H.Adams等的PCT WO 90/01564， 1990 年2月22日；R. B. Wallace等6 Nucleic Acid Res. 11， p. 3543， 1979; 和B. J. Connor等，80 Proc. Natl. Acad. Sci. USA pp. 278-282， 1983 )。 這些形式的多個版本被稱為"反點印跡"。也能用Northern印跡來確定mRNA水平。電泳分離特定量的 RNA并轉(zhuǎn)移到濾膜上，該濾膜然后雜交有相應于感興趣基因地探針。 該方法，盡管在要分析大量樣品和基因時更麻煩些，但它仍有非常準 確的優(yōu)點。優(yōu)選的高通量基因表達分析的方法是系列("SAGE")技術，其首次 由Velculescu等(1995) Science 270， 484-487提出。SAGE的優(yōu)點是其 具有能在特定細胞類型中檢測所有基因的潛力，提供出有關這些基因 相關表達的定量信息，允許迅速比較2個細胞中基因的基因表達，并 產(chǎn)生能用于鑒定檢測的基因的序列信息。所以至今，SAGE方法已證 明其能可靠地在各種細胞類型中檢測調(diào)節(jié)和非調(diào)節(jié)基因的表達 (Velculescu等(1997) Cell 88， 243-251; Zhang等(1997) Science 276， 1268-1272和Velculescu等(1999) Nat. Genet. 23， 387- 388)。產(chǎn)生并探測核酸的^t術例如在上述的Sambrook & Russell (上文) 中有進一步描述?？蛇x地，可通過原位雜交組化來確定一種或多種上或下調(diào)認知功 能障礙的基因的表達水平。在一個具體實施方式
中，按照現(xiàn)有已知的 技術，從個體中獲得組織樣品，制備切片并進行原位雜交，從而檢測 感興趣的基因的表達水平。以上方法可用于評估內(nèi)源基因表達的增加，所述基因可通過向哺乳動物導入新的轉(zhuǎn)錄單位或基因活化構建體來活化，轉(zhuǎn)錄單位或基因 活化構建體包括內(nèi)源調(diào)節(jié)序列、內(nèi)源外顯子和剪接位點，可操作地與 內(nèi)源基因的第二個外顯子相連，其中細胞包含內(nèi)源外顯子和在內(nèi)源基因中存在的外顯子(如參見，美國專利第5，641，670; 5，773，746; 5,733,761; 5,968,502; 6，702，989和6,565,844號)。在其他方法中，通過測量基因編碼的蛋白質(zhì)水平來檢測基因的表 達水平。如通過免疫沉淀、ELISA或免疫組4匕來進行該方法，利用的 試劑如抗體，其特異檢測基因編碼的蛋白質(zhì)。其它技術包括Western 印跡分析。免疫試驗常用于定量細胞樣品中的蛋白質(zhì)水平，并且許多 其他免疫試驗技術出現(xiàn)在現(xiàn)有技術中。本發(fā)明不局限于特定試驗過程， 并因而要包括同源的和異源的過程。本發(fā)明能進行的示例的免疫試驗 包括熒光極化免疫試驗(FPIA)、熒光免疫試驗(FIA)、酶免疫試驗(EIA)、 懸液抑制免疫試驗(NIA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(EUSA)和放射免疫試驗 (RIA)。指示部分或標記基團能吸附于特定抗體上并選擇從而使之達到 各種方法所使用的需求，其中通常通過可用的試驗設備和兼容的免疫 試驗過程來規(guī)范這些方法。用于進行各種上述免疫試驗的常規(guī)技術對 本領域普通技術人員是已知的。對于細胞分泌的多肽，可在生物流體中測定這些多肽的表達水平。在一些具體實施方式
中，可通過以下章節(jié)所詳述的微陣列分析來 檢測和/或測定mRNA水平。 6.3引言微陣列一般而言，用陣列來確定表達譜包括以下步驟(a)從個體獲得 mRNA樣品并制備其標記的核酸("靶核酸，，或，，靶")；(b)在足以使 靶核酸與陣列上相應探針結合的條件下，將靶核酸與陣列接觸，如通 過雜交或特異結合；(c)可選地從陣列上去除未結合的靶；(d)檢測結合 的耙，和(e)分析結果。此處所用的"核酸探針探針"或"探針"為吸附在 陣列上的核酸，而"靶核酸"為與陣列雜交的核酸.以下將更詳細地描 述這些步驟的每一步。 6.3. 1標記用于微陣列分析的核酸一般而言，要標記靶分子從而允許檢測耙分子與微陣列的雜交。 "標記"指探針直接或通過與一個或多個信號產(chǎn)生系統(tǒng)的成分的結合 形式來包含一種信號產(chǎn)生系統(tǒng)的成分，因而其是可檢測的。直接可檢測標記的實例包括整合于、通常是共價結合于探針部分的同位素和熒 光部分，或可檢測標記的能結合于探針分子功能部分的光活化或化學活化的衍生物，探針部分如核苷酸單體，如，引物的dNMP。在富集和/或擴增RNA期間或之后標記核酸。例如，用公知的寡 dT引物或隨機引物反轉(zhuǎn)錄法從mRNA來制備標記的cDNA (如參見， Klug和Berger， 1987， Methods Enzymol. 152: 316-325)。在存在 有結合了可檢測標記的dNTP的情況下進行反轉(zhuǎn)錄，最優(yōu)選為熒光標 記的dNTP?？蛇x地，在存在標記的dNTP的情況下，分離的mRNA可 轉(zhuǎn)化成由體外雙鏈cDNA轉(zhuǎn)錄而合成的標記的反義RNA (Lockhart 等，Nature Biotech. 14: 1675， 1996)。在可選的具體實施方式
中， 在缺少可檢測標記的情況下合成cDNA或RNA探針，然后進行標記， 如通過結合生物素標記的dNTP或rNTP，或一些相似的方法(如光交 聯(lián)生物素的補骨脂素衍生物與RNA)，接著加入標記的抗生蛋白鏈菌 素(如藻紅蛋白結合的抗生蛋白鏈菌素)或等價物。在一個具體實施方式
中，在42°C溫浴60分鐘包含RNA和0.5mM dGTP， dATP和dCTP加上0.1 mM dTTP和焚光脫氧核糖核苷酸(如， 0.1 mM若丹明110 UTP (Perken Elmer Cetus)或0.1 mM Cy3 dUTP (Amersham))的混合物和反轉(zhuǎn)錄酶(如Superscript II， LTI Inc.) 來合成標記的cDNA。感興趣的熒光部分或標記包括香豆素及其衍生物，如7-氨基-4-甲 基香豆素，氨基香豆素，bodipy染料，如Bodipy FL、瀑布蘭，熒光 素及其衍生物，如熒光素異硫氰酸酯、俄勒岡綠，若丹明染料，如德 克薩斯紅、四甲基若丹明、曙紅和藻紅，花青染料，如Cy2、 Cy3、 Cy3.5、 Cy5、 Cy5.5、 Cy7、 FluorX，大環(huán)螯合的鑭系離子，如，量子 染料TM，熒光能量轉(zhuǎn)化染料，如噻唑橘紅-溴乙非啶異質(zhì)二聚體、 TOTAB、丹?；?。個別熒光化合物具有連接設備或本發(fā)明實驗中 所需檢測元素的功能，或能修飾取得這些功能，這樣的化合物包括， 如，丹?；?；熒光素，如3，6-二羥基-9-苯基二苯吡喃醇；若丹明異 疏氰酸酯；N-苯基l-氨基-8-磺酸萘；N-苯基2-氨基-6-磺酸萘；4-乙酰 氨基-4-異硫氰基-芪-2，2'-二磺酸；芘-3-磺酸；2-曱苯氨基萘-6-磺酸酯； N-苯基-N-曱基-2-氨基萘-6-磺酸酯；溴化乙錠；stebrine;亞金氨基-0，2-(9'-蒽)棕櫚酸酯；丹酰基磷脂酰乙醇胺；N， N'-二十八烷基曙羰花青N， N'-二己基P惡羰花青；部花青，4-(3，-芘基)硬脂酸酯；d-3-氨基脫氧 馬萘雌酮；12- (9'-蒽基)硬脂酸酯；2-甲基蒽；9-乙蜂基蒽；2，2'(亞乙 烯基對亞苯基)雙苯卩惡唑；對雙(2-甲基-5-苯基-聰唑基))苯；6-二曱基氨 基-l，2-苯并吩嗪；視黃醇；雙(3'-氨基吡啶)l，10-癸烷基二碘化物； hembrienin磺酸萘腙；氯代四環(huán)素；N-(7-二甲基氨基-4-曱基-2-氧代-3誦 色烯基)馬來酰亞胺；N-(對-(2苯并咪唑基)-苯基)馬來酰亞胺；N-(4-氟萘基)馬來酰亞胺；雙(高香草醛酸)；刃天青；4-氯-7-硝基-2，l，3-苯甲 酰嗯二唑；部花青540;試自靈；孟加拉玫瑰紅和2，4-二苯基-3(2H)-吹喃酮(如參見，Kricka， 1992， Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press San Diego, Calif.).許多熒光標記可通過商業(yè)渠道從 SIGMA-Aldrich, Amersham Biosciences, Molecular Probes, Pfizer (以 前的Pharmacia), BD Biosciences (以前的CLONTECH), ChemGenes Corp., Glen Research Corp., Invitrogen， Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, 瑞士》和Applied Biosystems (Foster City, Calif.)以及其他技術人員知道的商業(yè)渠道獲得。化學發(fā)光標記包括蟲熒光素和2，3-二氫酞吖溱二酮，如發(fā)光氨。感興趣的同位素部分或標記包括32P、 33P、 35P、 125I、 2H、 14C 等等(參見Zhao等，Gene 156: 207, 1995; Pietu等，Genome Res. 6: 492, 1996)。標記也可以是信號產(chǎn)生系統(tǒng)成分，其與一種或多種相同系統(tǒng)其他 的成分一起提供可監(jiān)測的標記。這些標記的示例有特異結合配對成分， 如配體，如生物素、熒光素、異羥基洋地黃毒甙元、抗原、多價陽離 子、鰲合基團等等，其中該成分特異結合于信號產(chǎn)生系統(tǒng)的其它成分， 其中其他成分直接或間接提供可檢測的信號，如結合了熒光部分或能 將底物轉(zhuǎn)化成發(fā)色產(chǎn)物的酶部分的抗體，如堿性磷酸酶結合抗體等等。其他感興趣的標簽包括那些僅在相連探針特異結合靶分子時提供 信號的標簽，其中這些標簽包括"分子燈塔"，如Tyagiifc Kramer, Nature Biotechnology 14: 303， 1996和EP 0 070 685 Bl所述。其他 感興趣的標簽包括那些如美國專利笫5，563，037號；WO 97/17471和 WO 97/17076所述的標簽。在一些情況下，在雜交后標記雜交的耙核酸。例如，當標記dNTP 的生物素用于諸如擴增或轉(zhuǎn)錄時，抗生蛋白鏈菌素結合報告基團可用于標記雜交的復合物，在其它具體實施方式
中，不標記靶核酸。在這種情況下，可用胞質(zhì)共振來測定雜交，如Thiel等，Anal. Chem. 69: 4948， 1997所述。 在一個具體實施方式
中，多(如2、 3、 4、 5或更多)套靶核酸被 標記并用于雜交反應("多重"分析)中。例如， 一套核酸可與一種 細胞或組織樣品的RNA相對應，而另一套核酸可與另一種細胞或組織 樣品的RNA相對應。多套核酸可用不同標記來標記，如，具有獨特發(fā) 色語的不同熒光標簽，因而可以區(qū)分它們。然后混合這些套核酸并將 它們同時與微陣列雜交。雙色熒光標記的應用和確定基因表達改變的檢測方案如Shena等， Science 270: 467-470， 1995所述。利用標記有2種不同熒光基團的cDNA 的優(yōu)點為可直接并有內(nèi)在對照地比較mRNA水平，該水平與制得的2 種細胞狀態(tài)中的每個陣列化的基因相對應，而且由于實驗條件(如雜 交條件)細微差異造成的變化不會影響接下來的分析。在雜交大量靶核酸時使用的可分辨標記的例子是公知的，其包括: 2種或更多種不同發(fā)射波長的熒光染料，像Cy3和Cy5，熒光蛋白質(zhì) 和染料的組合，像phkoerythrin和Cy5， 2種或更多種具有不同發(fā)射 能量的同位素，像"P和"P,具有不周散射譜的金或銀顆粒，在不同 處理條件產(chǎn)生信號的標記，像溫度、pH、用其他試劑處理等，或在處 理后的不同時間點產(chǎn)生信號。基于不同底物特異性的酶(堿性磷酸酶/ 過氧化物酶)，使用一種或多種酶產(chǎn)生信號可以有更多種可分辨的標 記。另外，為了減少實驗錯誤，優(yōu)選在雙色差異雜交實驗中顛倒使用 熒光標記以減少偏向個別基因或陣列位置點的偏差。換句話說，優(yōu)選 首先用一種來自兩種測量細胞的mRNA標記(如用第一種熒光色標記 來自第一種細胞的核酸并用第二種熒光色標記來自第二種細胞的核 酸)來測定基因表達，然后用相反的標記(如，用第二種熒光色標記來 自第一種細胞的核酸并用第一種熒光色標記來自第二種細胞的核酸)來 測量來自兩種細胞的基因表達。在暴露水平和震蕩對照參數(shù)水平以上 的多次測量提供了另外的實驗錯誤的對照。在雜交到陣列之前可評估標記核酸的質(zhì)量。例如，標記核酸樣品 能與探針雜交，該探針衍生自基因的5'、中間和3'部分，該基因已知或懷疑存在于核酸樣品中。這可以指示標記核酸是否是全長的核酸或它們是否降解了。在一個具體實施方式
中，Affymetrix (Santa Clara, CA)的GeneChip Test3陣列可用于該目的。該陣列包含表示特定基 因子集的探針，這些基因來自幾種包括哺乳動物的生物體。所以，標 記核酸樣品的質(zhì)量能通過將一小部分樣品與陣列雜交來確定，如 Affymetrix (Santa Clara, CA)的GeneChip Test3陣列。 6.3.2微陣列分析用于本發(fā)明的優(yōu)選的陣列，如微陣列，包括基因的一種或多種探 針，所述基因為涉及認知功能的候選基因。示例的陣列包括一種或多 種用來研究認知功能的感興趣的基因，如那些GeneChip⑧鼠表達集合 230或GeneChip 鼠神經(jīng)U34陣列上的基因，其包含超過1，200條與 神經(jīng)生物學研究相關的序列(包括激酶、細胞表面的基因)。另外， 通過同時跟蹤分布于整個基因組的將近1,500個被稱為單核苷酸多態(tài) 性(SNP)的基因變體，人們可以使用GeneChip⑧HuSNpTM陣列來研究 整個人的基因組。SNP是4艮好的基因組搜索標記，因為它們簡單、豐 富、廣泛并帶來大多數(shù)的人群基因的定化。利用高通量技術，如基因 GeneChip⑧陣列，SNP比諸如微衛(wèi)星序列的傳統(tǒng)標記更容易跟蹤。陣列可以包括與至少10，優(yōu)選至少20，至少50,至少100或至少 1000個基因。陣列可以包括與約10°/。、 20%、 50%、 70%、 90%或95% 列于圖3的基因或其他微陣列上可用的基因相對應的探針.陣列可以 包括與約10%、 20%、 50%、 70°/ 、 90%或95%列于圖3的基因相對 應的探針，或與其他在細胞中高至少2倍、優(yōu)選至少3倍、更優(yōu)選至 少4倍、5倍、7倍并最優(yōu)選至少約IO倍表達的基因相對應的探針。 一個所用的示例優(yōu)選陣列為實施例中所用和所述的陣列。可有一種或多于一種探針與微陣列上的每一個基因相對應。例如， 微陣列可以包括2至20個探針與一個基因相對應，并優(yōu)選約5至10 個。探針可與基因的全長RNA序列或其互補序列相對應，所述基因特 征為疾病候選基因，或它們可與其一部分相對應，所述部分足夠長足 以允許特定雜交。這些探針可包括約50個核普酸至約100、 200、 500 或1000個核苷酸或超過1000個核苦酸。如此處進一步所述的，微陣 列可進一步包含寡核苷酸探針，其由約10至50個核苷酸組成，優(yōu)選 約15至30個核苷酸并更優(yōu)選20-25個核苷酸。探針優(yōu)選為單鏈。探針與其靶有足夠的互補性，從而提供序列特異性雜交所預期的水平(見 下文)。典型地，本發(fā)明所用的陣列具有每《112大于IOO個不同探針的位 點密度。優(yōu)選地，陣列具有每cm2大于500個的位點密度，更優(yōu)選大 于約1000/cm2,最優(yōu)選大于約10,000/ cm2。優(yōu)選地，陣列在單個片 基上有大于100個不同的探針，更優(yōu)選大于約1000個不同的探針，更 優(yōu)選大于約10,000個不同的探針并最優(yōu)選在單個片基上有大于 100,000個不同的探針。如下所述，通過現(xiàn)有已知的方法來制備微陣列，或由公司來定制 它們，如Affymetrix (Santa Clara, CA)。一般而言，可用兩種類型的微陣列。這兩種類型被稱為"合成" 和"遞送"。在合成類型中，通過用核苷酸原位合成核酸逐步制備微 陣列。在每一輪合成中，加入核苷酸生成鏈，直至獲得所期望的長度。 在微陣列的遞送類型中，用各種遞送技術將制成的核酸放在已知位置 上。大量文獻描述了不同的微陣列:技術，如，Shena等，Tibtech 16: 301, 1998; Duggan等，Nat. Genet. 21: 10， 1999; Bowtell等，Nat-Genet. 21: 25， 1999。Affymetrix (Santa Clara， CA)開發(fā)了 一種新的合成技術，其將照 相平版印刷技術與DNA合成化學結合在一起從而能生產(chǎn)高密度的寡 核苦酸微陣列。這些芯片在約1.6 cm2面積中包括多至400,000組寡核 苷酸。寡核苷酸以其3'端的錨定來最大化單鏈核酸雜交的有效性。這 些被稱為"GeneChip "的芯片 一般包括特定基因的幾個寡核苷酸， 如，在15-20之間，如16個寡核苷酸，由于Affymetrix (Santa Clara, CA)出售定制的微陣列，所以包含能上或下調(diào)認知功能障礙的基因的 微陣列能從Affymetrix (Santa Clara, CA)處訂購。也能通過機械微點樣來制備微陣列，如Synteni (Fremont, CA)商 業(yè)化的那些。根據(jù)這些方法，少量核酸可印在固相表面上。Synteni制 備的微點樣陣列在約3.6 cn^面積中包含多至10,000組cDNA。第三組微陣列技術為"按需點滴"遞送方法，最先進的噴墨技術， 其利用壓電和其他推進形式來把核酸從小管中傳送到固相表面上。有 幾個中心開發(fā)了噴墨技術，包括Incyte Pharmaceuticals (Palo Alto, CA)和Protogene (Palo Alto， CA)。該技術形成10,000個點/cm2的密度。也可參見Hughes等，Nat. Biotechn. 19: 342， 2001。陣列優(yōu)選包括對照和參照核酸。對照核酸為能用于顯示雜交有效 的核酸。例如，所有的Affymetrix (Santa Clara, CA)表達陣列包含幾 種原核基因的探針集，如，E. coli生物素合成中的WoB、 bioC和bioD 以及P1噬菌體的cre。在這些基因或其部分的混合物存在的情況下進 行與這些陣列的雜交，如Affymetrix (Santa Clara, CA)提供的有該效 果的混合物(部分號900299)，其能驗證雜交的有效性。包括耙核酸 的對照核酸也能是用體外轉(zhuǎn)錄從cDNA克隆合成的mRNA。其它可包 括在陣列中的對照基因為聚A對照，如dap、 lys、 phe、 thr和trp (其 包括在Affymetrix的GeneChip⑧上)。參照核酸能將一個實驗與另一個實驗的結果標準化，并在定量的 水平上比較多個實驗。示例的參照核酸包括已知表達水平的內(nèi)務基因， 如甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、己糖激酶和肌動蛋白。也可為靶基因的探針、表達水平對照或標準化對照提供錯配對照。 除了存在一種或多種錯配對照之外，錯配對照可為寡核苷酸探針或其 他與其相應測試或?qū)φ仗结樢粯拥暮怂?。陣列也可包含能與基因的大于一個的等位基因雜交的探針。例如 陣列能包含一個識別特定基因等位基因1的探針和另一個識別等位基 因2的探針。微陣列能如下制備。在一個具體實施方式
中，寡核苷酸陣列在固 相支持物上合成。示例的固相支持物包括玻璃、塑料、聚合物、金屬、 非金屬、陶瓷、有機物等。利用芯片遮蓋技術和光保護化學，可能產(chǎn) 生有序的核酸探針陣列，這些陣列，其被稱作諸如"DNA芯片"或非 常大量的固定聚合物陣列("VLSIPSTM"陣列)，它們能在約lcm2 至幾cm2面積的片基上包括數(shù)百萬確定的探針區(qū)域，在其上整合了少 量至數(shù)百萬探針的集合(如參見，美國專利第5，631,734號)。構建固相核酸陣列以檢測靼核酸已有文獻描述了 。參見Fodor等， Science, 251: 767-777， 1991; Sheldon等，Clinical Chemistry 39 (4): 718-719， 1993; Kozal等，Nature Medicine 2 (7): 753-759, 1996和 Hubbell美國專利第5，571，639號；Pinkel等PCT/US95/16155 (WO 96/17958);美國專利笫5，677，195; 5,624,711; 5，599，695; 5，451，683; 5,424,186; 5,412,087; 5， 384,261; 5,252,743和5,143,854號；PCT專利公開號92/10092和93/09668;和PCT WO 97/10365。簡言之， 組合策略允許利用最少的合成步驟來合成包含大量探針的陣列。例如， 僅用32步化學合成步驟就可能合成并吸附所有可能的DNA 8聚寡核 苷酸(48或65,536種可能的組合)。 一般而言，VLSIPSTM過程僅 利用4n步合成步驟就提供了一種在陣列上產(chǎn)生4n個不同寡核苷酸探 針的方法(如參見，美國專利第5,631,734; 5,143,854號和PCT專利
發(fā)明者J·D·羅思斯坦, M·加拉赫爾, P·K·倫德 申請人:約翰斯·霍普金斯大學