專利名稱：：一種天然植物提取物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種從青錢(qián)柳葉片中分離純化的植物提取物制備方法及其應(yīng)用，該植物提取物具有a-葡萄糖苷酶抑制活性，可以用于糖尿病和降血糖藥物和食品的開(kāi)發(fā)。技術(shù)背景a-葡萄糖苷酶抑制劑是能夠影響碳水化合物吸收的物質(zhì)，主要降糖機(jī)制為能抑制小腸刷狀緣上各種a-葡萄糖苷酶，使淀粉類(lèi)分解為麥芽糖進(jìn)而分解為葡萄糖的速度和蔗糖分解為葡萄糖的速度減慢，其中對(duì)葡萄糖苷酶的抑制作用最強(qiáng)。據(jù)報(bào)道，20世紀(jì)70年代中期，國(guó)外在降血糖的研究中發(fā)現(xiàn)了(x-葡萄糖苷酶抑制劑。研究證實(shí)，a-葡萄糖苷酶抑制劑可以防治餐后高血糖癥和緩解高胰島素血癥，同時(shí)可以提高糖耐量，還可預(yù)防和治療肥胖癥和高三酰甘油血癥，用于治療因碳水化合物代謝紊亂而引起的疾病。a-葡萄糖苷酶抑制劑的代表藥物有阿卡波糖、米格列醇和伏格列波糖。此類(lèi)降糖藥的特點(diǎn)主要是降低餐后血糖而對(duì)降低空腹血糖無(wú)作用、安全和不增加胰島素的分泌，且在禁食狀態(tài)下服用該類(lèi)藥不會(huì)降低血糖，主要用于單用磺脲類(lèi)或雙胍類(lèi)餐后血糖控制不理想的患者，或單獨(dú)用于較輕的餐后血糖高者。對(duì)低體重、營(yíng)養(yǎng)不良、患消耗性疾病、消化營(yíng)養(yǎng)不良、肝腎功能損害、缺鐵性貧血、對(duì)孕婦、哺乳期婦女及18歲以下兒童均不宜應(yīng)用本藥。許多學(xué)者在篩選生物提取物中a-葡萄糖苷酶抑制劑方面進(jìn)行了大量的研究工作。近年來(lái)，從中草藥中篩選a-葡萄糖苷酶抑制劑的研究獲得重視，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)了許多天然的a-葡萄糖苷酶抑制劑，按其結(jié)構(gòu)可大致分為黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)、皂苷類(lèi)。青錢(qián)柳系胡桃科青錢(qián)柳屬植物，在我國(guó)南方各省分布廣泛，常生長(zhǎng)在山地濕潤(rùn)的森林中。其形態(tài)為落葉喬木，高可達(dá)25米。因其樹(shù)果翅圓形如錢(qián)，色青而柳下垂。青錢(qián)柳葉的主要化學(xué)成分是糖類(lèi)、氨基酸、維生素、有機(jī)酸、黃酮、三萜、內(nèi)脂、香豆精、皂甙、e-谷甾醇、咖啡因、青錢(qián)柳甙、甜茶樹(shù)甙，具有強(qiáng)身健體，增強(qiáng)免疫的功能，降血脂、降血糖、降血壓，減肥等作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種從青錢(qián)柳葉片中分離純化的天然植物提取物的制備方法。通過(guò)添加這種天然提取物獲得其對(duì)酶促反應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)所述提取物對(duì)a-葡萄糖苷酶活性具有抑制作用。根據(jù)這一特性，可將這種天然提取物應(yīng)用于降血糖產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。目前，臨床應(yīng)用中使用到的a-葡萄糖苷酶抑制劑藥物主要有阿卡波糖、米格列醇和伏格列波糖等幾種，另外從天然植物中篩選獲得a-葡萄糖苷酶抑制劑也越來(lái)越多，許多天然的a-葡萄糖苷酶抑制劑，按其結(jié)構(gòu)可大致分為黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)、皂苷類(lèi)。本發(fā)明涉及的是一種來(lái)源于青錢(qián)柳葉片的天然植物提取物以及該提取物的a-葡萄糖苷酶活性抑制試驗(yàn)，以提供一種新的(x-葡萄糖苷酶抑制劑的用藥方法與途徑。本發(fā)明還涉及該提取物應(yīng)用于降血糖藥物和功能食品的開(kāi)發(fā)。本發(fā)明所述的天然植物提取物的制備方法是將該葉片粉碎成碎末，加入醇進(jìn)行提取，離心后取上清液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)得到提取物干粉。本發(fā)明更具體地是取烘干的葉片粉碎，按l:20g/ml加50X乙醇，抽提3小時(shí)，離心取上清，同法再抽提兩次，合并上清液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)得到提取物干粉。本發(fā)明還提供該提取物的a-葡萄糖苷酶活性抑制實(shí)驗(yàn)及相關(guān)數(shù)據(jù)，具體如下1.在a-葡萄糖苷酶催化pNPG的實(shí)驗(yàn)體系中加入不同質(zhì)量的該植物提取物，a-葡萄糖苷酶催化活性隨著提取物質(zhì)量的提高而降低。并以阿卡波糖對(duì)a-葡萄糖苷酶的抑制作為對(duì)比實(shí)驗(yàn)。2.針對(duì)不同濃度的底物pNPG，進(jìn)行該提取物對(duì)a-葡萄糖苷酶進(jìn)行抑制動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。3.不同植物提取物的量對(duì)a-葡萄糖苷酶的活性抑制實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有制備方法簡(jiǎn)單，成本低，天然植物來(lái)源廣，植物提取物的藥用價(jià)值高，應(yīng)用范圍廣，可應(yīng)用于降血糖藥物和功能食品的開(kāi)發(fā)等特點(diǎn)。圖1是青錢(qián)柳提取物對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖2a是青錢(qián)柳提取物對(duì)a-葡萄糖苷酶半抑制量測(cè)實(shí)驗(yàn)曲線圖。圖2b是阿卡波糖對(duì)a-葡萄糖苷酶半抑制量測(cè)實(shí)驗(yàn)曲線圖。圖3是青錢(qián)柳提取物對(duì)a-葡萄糖苷酶抑制動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)曲線圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1:到固體抽提物。更具體的是取烘干的葉片200克，用粉碎機(jī)打碎，按l:20g/ml加50X乙醇室溫?cái)嚢璩樘?小時(shí)，8000rpm室溫離心15分鐘，取上清。同法再抽提兩次，合并上清液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)得到固體抽提物。實(shí)施案2:a-葡萄糖苷酶活性半抑制濃度的測(cè)定1.制作對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線a-葡萄糖苷酶活力的測(cè)定以無(wú)色的對(duì)硝基苯酚-a-D-葡萄糖苷(pNPG)作反應(yīng)底物，經(jīng)a-葡萄糖苷酶水解a-l，4-葡萄糖苷鍵后釋放出對(duì)硝基苯酚(pNP)，在堿性條件下后者是黃色的，最后通過(guò)監(jiān)測(cè)400nm下的pNP產(chǎn)生量作為a-l，4-葡萄糖苷酶活性大小的判定標(biāo)準(zhǔn)。按下表分別取不同體積的對(duì)硝基苯酚1Ommol/L，用50mmol/L磷酸緩沖液(pH6.8)稀釋成一系列濃度。然后在分光光度儀上測(cè)定400nm處的光密度，以PNP濃度為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)作曲線，見(jiàn)附圖1所示。表一標(biāo)準(zhǔn)曲線做法<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>2.ci-葡萄糖苷酶活力測(cè)定a-葡萄糖苷酶活力的測(cè)定以無(wú)色的對(duì)硝基苯酚-a-D-葡萄糖苷(pNPG)作反應(yīng)底物，經(jīng)a-葡萄糖苷酶水解a-l，4-葡萄糖苷鍵后釋放出對(duì)硝基苯酚(pNP)，最后通過(guò)監(jiān)測(cè)400nm下的pNP產(chǎn)生量作為a-l，4-葡萄糖苷酶活性大小的判定標(biāo)準(zhǔn)。試劑(1)緩沖液含lmg/ml牛白蛋白的50mMpH6.8K2HP04-KH2P04;(2)1.50mol/L對(duì)硝基苯酚-a-D-葡萄糖苷(pNPG)溶液90.2mgpNPG溶于200ml0.05mol/L緩沖液(pH6.8)中；酶活力二(AXn)/(VXt)式中V-酶液量(ml);n—酶液稀釋倍數(shù)；t一反應(yīng)時(shí)間(min)。3.a-葡萄糖苷酶活性半抑制濃度的測(cè)定測(cè)IC50時(shí)，先將不同濃度提取物與酶在37'C保溫10分鐘，然后加入測(cè)活體系，測(cè)活方法如上所述。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，青錢(qián)柳葉片提取物對(duì)a-葡萄糖苷酶活性具有明顯的抑制作用，見(jiàn)附圖2所示，其對(duì)a-葡萄糖苷酶活性的半抑制濃度為30.2pg/ml，低于阿卡波糖對(duì)a-葡萄糖苷酶活性的半抑制濃度(100.33pg/ml)，可見(jiàn)青錢(qián)柳葉片提取物對(duì)a-葡萄糖苷酶活性的抑制要強(qiáng)于阿卡波糖。表二提取物與阿卡波糖對(duì)a-葡萄糖苷酶活性抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實(shí)施例3提取物對(duì)a-葡萄糖苷酶的抑制動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)將7.5pl0.04mg/mla-葡萄糖苷酶與5pl植物提取物混合37'C保溫20分鐘后，加入不同濃度反應(yīng)底物體系中，測(cè)定其活性隨時(shí)間變化情況。其中分別含1.5mmoLpNPG20^1、40(^1、80^1、160^1、320pl、400^1、500^1。總體系600pl，不足量以0.05mol/L磷酸緩沖液補(bǔ)足。結(jié)果表明，將該提取物處理過(guò)的a-葡萄糖苷酶加入到不同濃度催化底物pNPG中，a-葡萄糖苷酶的活性都明顯地被抑制了，見(jiàn)附圖3所示。權(quán)利要求1、一種天然植物提取物的制備方法，該方法是將青錢(qián)柳葉片粉碎成碎末，加入醇進(jìn)行提取，離心后取上清液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)得到提取物干粉。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然植物提取物的制備方法，其特征在于取烘干的青錢(qián)柳葉片粉碎，按l:20g/ml加50X乙醇，抽提3小時(shí)，離心取上清，同法再抽提兩次，合并上清液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)得到提取物干粉。全文摘要一種天然植物提取物的制備方法，它是將青錢(qián)柳葉片粉碎成碎末，加入醇進(jìn)行提取，離心后取上清液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)得到提取物干粉；本發(fā)明更具體地是取烘干的青錢(qián)柳葉片粉碎，按1∶20g/ml加50％乙醇，抽提3小時(shí)，離心取上清，同法再抽提兩次，合并上清液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)得到提取物干粉；本發(fā)明涉及一種從青錢(qián)柳葉片中分離純化的天然植物提取物及其應(yīng)用；通過(guò)添加這種天然提取物獲得其對(duì)酶促反應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)所述提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性具有抑制作用；根據(jù)這一特性，可將這種天然提取物應(yīng)用于降血糖產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。文檔編號(hào)A61P3/10GK101244118SQ20081006116公開(kāi)日2008年8月20日申請(qǐng)日期2008年3月13日優(yōu)先權(quán)日2008年3月13日發(fā)明者周海夢(mèng),孟凡國(guó),胡衛(wèi)江,邱愛(ài)東申請(qǐng)人:浙江清華長(zhǎng)三角研究院;嘉興博泰生物科技發(fā)展有限公司