專利名稱：苦瓜中提取的化合物在制備預防和治療糖尿病和肥胖的藥物中的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于藥物化學領域，更具體而言，涉及一類從苦瓜中提取 的葫,烷型三碎類化合物及其藥物組合物在預防和治療糖尿病和肥胖 中的用途。
背景技術：
目前，世界上糖尿病患者已超過1.5億，預計到2025年將達3億。 而其中主要為II型糖尿病患者(T2D)。由于II型糖尿病的主要代謝異常 表現(xiàn)為胰島素抵抗，因此，胰島素增敏劑，即通過改善胰島素抵抗而 達到治療糖尿病藥物，是目前糖尿病藥物研究的熱點之一?，F(xiàn)有兩條 藥理學途徑可以改善胰島素抵抗 一是通過過氧化物酶體增生物激活 受體(PPARs)，或者AMPK。目前常用的兩類藥物為噻唑烷二酮類(TZDs) 和雙胍類藥物。遙唑烷二酮類雖被廣泛使用但是有許多不良反應，如
肥胖、液體渚留和心衰等。雙胍類的二曱雙胍不引起肥胖，但因其主 要作用于肝臟，而不是肌肉，所以它并不是一個令人滿意的治療糖尿 病的方法。尋找更理想的胰島素增敏劑是當前世界上糖尿病藥物研究 的熱點。
目前，世界上有超過IO億的成人超重，其中的3億人為肥胖患者， 而且呈急劇上升的趨勢，同時也導致肥胖相關疾病(如II型糖尿病、心 臟病、中風和高血壓等)發(fā)病率的不斷升高。造成超重和肥胖的主要原 因是高脂高熱々大食、缺乏運動和城市化進程地加快。目前市場上只有 兩個批準上市可長期使用的減肥藥物 一是奧利司他，為特異性胃腸
5道脂肪酶抑制劑，但其具有非常普遍的胃腸道不良反應；二是西布曲
明，為單胺再攝取的抑制劑，但其會升高血壓和加快心率。因此，尋 找安全和有效的減肥藥物是當前迫切需要解決的問題。
苦瓜(Momorafca c/zaraw"o L.)為葫，科苦瓜屬才直物。長期以來，我 國民間將苦瓜廣泛應用于清熱解毒、明目解毒、健胃消渴、緩瀉、驅 蟲等疾病?？喙现谢瘜W成分包括三薛皂苷、腦苷、蛋白質等。關于苦 瓜降血糖作用的報道非常廣泛。但是，對于苦瓜中提取的葫蘆烷型三 碎類化合物活性報道很少，僅2006年Liva Harinantenaina等(Chem. Pharm.Bull., 2006， 54， 1017-1021)報道苦瓜中提取的兩個三碎5卩，19-環(huán)氧-3p，2S-二羥葫，烷-6，Z3(五)-二烯，和3(3，7(3，25-三羥基葫,烷 -5，23(￡)-二烯-1^醛在400mg/kg劑量下對四氧嘧啶誘導的糖尿病小鼠 有降糖作用，但其使用糖尿病模型并不可靠。但未有文獻記載該類化 合物具有促進肌肉和脂肪細胞葡萄糖攝取、促進葡萄糖轉運蛋白 4(GLUT4)上膜、增加一磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMPK)活性，從而能 夠預防和治療糖尿病和肥胖。

發(fā)明內容
因此，本發(fā)明的目的是提供結構如下的苦瓜中提取的葫,烷型三 薛類化合物及其藥物組合物在制備預防和治療糖尿病和肥胖的藥物中 的應用，尤其是這類化合物具有刺激肌肉和脂肪細胞攝取葡萄糖、促 進葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)上膜、增加一磷酸腺苷激活蛋白激酶 (AMPK)活性，從而能夠預防和治療糖尿病和肥胖。因此，上述的苦瓜 中提取的葫蘆烷型三辟類化合物及其藥物組合物為肌肉和脂肪細胞葡 萄糖攝取促進劑、葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)上膜激動劑、 一磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMPK)激活劑。
本發(fā)明提供的具有預防和治療糖尿病和肥胖活性的從苦瓜中提取 的葫,烷型三碎類化合物，其具有如下結構式所示的結構
其中，R^為(3-D-葡萄吡喃糖基(1—6)-(3-D-葡萄吡喃糖基， R2為氫，R3、 R4、 R5和R^為羥基，R7曱基，且C5和C6形成雙鍵， C22、 C23、 C24的手性分別為S、 S、 R構型；
或R,為(3-D -木吡喃糖基(1—4)-[卩-D -葡萄吡喃糖基(1—6)] -|3-D-葡萄p比喃糖基，R2為氬，R3、 R4、 Rs和R^為羥基，R7曱基， 且C5和C6形成雙鍵，C22、 C23、 C24的手性分別為S、 S、 R構型；
或R2、 R6為羥基，Rp R3、 R4和Rs為氫，R7為醛基，且C5和 C6、 C23和C24形成雙4建；
或Rt為氫，R2為氫，R3、 R4、 Rs和R6為羥基，R7曱基，且C5 和C6形成雙鍵，C22、 C23、 C24的手性分別為S、 S、 R構型。
本發(fā)明提供的具有預防和治療糖尿病和肥胖活性的藥物組合物， 其特征是，所述的組合物包含治療有效量的上述苦瓜中提取的葫,烷 型三碎類化合物中的一種或多種及其藥學上可接受的輔料。所述藥學 上可接受的輔料包括但不限于本領域人員共知的填充劑、賦形劑等。


7圖1是化合物momordicoside A對L6肌肉細胞葡萄糖攝取的影響。
圖2是各化合物對葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)轉位的影響。
圖3是化合物三羥基葫,烷-5，23(￡)- 二烯-19-醛和
22(5),23(i ),24(i ),25-四羥基葫蘆烷-5-烯對 一磷酸腺苷激活蛋白激酶
(AMPK)活性的影響。
圖4是化合物22(5),23CR),24(i ),25-四羥基葫蘆烷-5-烯在3T3-L1
脂肪細胞中對葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)轉位和AMPK磷酸化的劑量
依賴關系測試。
圖5是在抑制胰島素信號通路條件下，化合物22(5),23(i0,24(i )，25-四羥基葫蘆烷-5-烯對葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)轉位的影響。
圖6是化合物三羥基葫聲烷-5,23(￡> 二烯-19-醛和22(5),23(W)，24(i )，25-四羥基葫蘆烷-5-烯對蛋白激酶B(Akt)的活性影響圖。
具體實施例方式
下面結合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述，但不作為對本發(fā)明的限定。I.概要
本發(fā)明提供從苦瓜中提取分離獲得的葫，烷型三碎類化合物及其藥物組合物在制備預防和治療糖尿病和肥胖的藥物中的應用。
本發(fā)明所述的預防和治療糖尿病和肥胖活性指的是指能夠刺激肌肉和脂肪細胞攝取葡萄糖、促進葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)上膜、增加一磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMPK)活性。
8n.化合物
本發(fā)明提供的從苦瓜中提取的具有預防和治療糖尿病和肥胖活性
的葫，烷型三萜類化合物，其具有如下結構式所示的結構
其中，R,為(3-D-葡萄吡喃糖基(1—6)-p-D-葡萄吡喃糖基，R2為氫，R3、 R4、 Rs和R6為羥基，R7曱基，且C5和C6形成雙鍵，C22、 C23、 C24的手性分別為S、 S、 R構型；
或R,為卩-D -木吡喃糖基(1—4) - [p - D -葡萄吡喃糖基(1一6)]-p-D-葡萄吡喃糖基，112為氫，R3、 R4、 Rs和R6為羥基，R 曱基，且C5和C6形成雙鍵，C22、 C23、 C24的手性分別為S、 S、 R構型；
或R2、 R6為羥基，R,、 R3、 R4和Rs為氫，R7為醛基，且C5和C6、 C23和C24形成雙4建；
或R,為氫，112為氫，R3、 R4、 Rs和R6為羥基，R7曱基，且C5和C6形成雙鍵，C22、 C23、 C24的手性分別為S、 S、 R構型。
具體來說，為momordicosideA、 momordicoside B、 三羥基葫蘆烷-5,23(￡)-二烯-19-醛和22(5),23(i ),24(/ ),25-四羥基葫,烷-5-烯，其結構式分別如下momordicoside A
22(5),23(/ )，24(i ),25-四羥基葫蘆烷-5-烯
具體實施例
薄層層析(TLC)硅膠板及柱層析用硅膠(200 ~ 300目)由青島海洋化工廠生產；薄層層析斑點用^e克酸香蘭醛乙醇溶液噴霧顯色。在本文中，除非特別說明，涉及溶劑比例均為體積比。
實施例1
化合物的制備
取鮮苦瓜850kg，低溫冷凍干燥后稱重得85kg,粉碎，用90%(體
10積比)乙醇水溶液常溫下浸泡三次，每次3天，乙醇水溶液用量為生藥重的10倍。將三次所得乙醇溶液合并后減壓蒸餾，濃縮，獲得乙醇總
提物。將乙醇總提物加水(50L)稀釋后與二氯曱烷(20L)液液分配，得二氯曱烷部位和水溶液。再將其水溶液與正丁醇(20L)進行液液分配，得正丁醇部位800g。將800g正丁醇部位與500g AB - 8型大孔樹脂(天津骨膠廠生產)拌樣，將拌有樣品的樹脂加入裝有3kgAB-8樹脂的層析柱上。分別用12L純水、30%乙醇(體積比)和95%乙醇(體積比)洗脫，分別得到部位KG6 600g、 KG7 60g和KG8 80g。
將活性部位提取物KG8 80g用2kg 100-200目珪膠進行柱層析，依次用體積比為40:3:1、 20:3:1、 10:3:1和65:35:10的氯仿:曱醇:水的下層液體10L洗脫，每500ml濃集為一餾分，通過TLC板檢測，展開劑可用體積比為10:1、 6:1、 4:1的氯仿:曱醇或者體積比為10:3:1、 65:35:10的氯仿:甲醇:水的下層液體，5%硫酸-香蘭醛顯色，根據(jù)TLC板顯示，將相似組分合并并濃縮，將Rf值為0.3-0.4(展開劑氯仿:曱醇9:1)的組分合并得到組分1;將Rf值為0.3-0.4(展開劑氯仿:曱醇:水10:3:1下層)的組分合并得到組分8。
將上述組分1用氯仿:甲醇(20:l)1000ml進行硅膠柱層析，每20ml濃集為一餾分，通過TLC板檢測，展開劑為氯仿:甲醇10:1, 5%硫酸-香蘭醛顯色，將根據(jù)TLC板顯示Rf值約等于0.4的斑點的洗脫液合并并濃縮，得化合物三羥基葫，烷-5，23(￡)-二烯-19-醛120mg。
將上述組分8用MCI柱層析，30%-70%曱醇水溶液洗脫劑各1000ml梯度洗脫，所得40。/。組分再進行RP-18柱層析，30%-60%曱醇水溶液500ml梯度洗脫，每20ml濃集為一餾分，通過TLC版^r測，展開劑為氯仿:曱醇:水8:3:1(下層液體)，5%硫酸-香蘭醛顯色，將根據(jù)TLC板顯示Rf值約等于0.4、 0.3的斑點的洗脫液合并并濃縮，得化合
ii物momordicoside A 250mg和momordicoside B 300mg 。
將momordicoside A 40mg在37。C下0.1M醋酸水溶液中放置7天， 再將所獲得產物進行制備薄層層析，展開劑氯仿:曱醇5:1, Rf值0.5至 0.6處合并即為22(5),23(R)，24(R),25-四羥基葫蘆烷-5-烯10mg。
試驗實施例1
測試化合物momordicoside A對L6肌肉細胞葡萄糖攝取的影響(圖
1)
L6細胞完全分化為肌管后，換以含0.5°/。BSA的無血清DMEM培 養(yǎng)16小時后，加入化合物momordicoside A (終濃度50(iM)處理1小時 20分鐘，空白對照組加入等體積的DMSO，然后用37。C預溫的lxPBS 清洗細胞兩遍，加入不含或含胰島素(終濃度為100nM)的0.5%BSA的 Krebs緩沖液(NaCl 140mM， KCl 5mM, MgS04 2.5mM， CaCl2 lmM， HEPES 20mM, pH7.4), 37。C孵育40分鐘后，加入2 - [1，2-3H(N)]-脫 氧-D-葡萄糖溶液(終濃度為0.5fxCi/ml), 37。C作用10分鐘，用冰浴的 1 xPBS洗3遍終止反應，之后加入0.15ml 0.1 %Triton裂解細胞，液閃 計數(shù)，用蛋白量校正CPM值后計算L6細胞的葡萄糖攝取量。
結果顯示momordicoside A以IO一劑量對L6細胞作用2小時 后，其基礎水平和胰島素刺激下的葡萄糖攝取均明顯增加(圖1)。 數(shù) 據(jù)以平均值士標準誤(X士SE)表示(n=3)。 *p<0.05與相應條件下空白對 照纟且比豸交。
試驗實施例2
各化合物對葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)轉位活性測試(圖2)
L6細胞完全分化為肌管后，加入各測試化合物三羥基葫聲烷-5，23(￡> 二烯-19-醛、22GS),23(i ),24(i ),25-四羥基葫蘆烷-5-烯、 momordicoside A和momordicoside B(終濃度10(iM)處理細胞2小時， 100nM的胰島素(陽性對照)。數(shù)據(jù)以平均值士標準誤(X士SE)表示 (n=3-4)。 ***p<0.001與溶劑對照組比較。實驗結果表明化合物三羥 基葫,烷-5，23(￡)-二烯-19-醛和22(外23(/ )，24(7 )，25-四羥基葫，烷-5-烯能夠促進葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)轉移到細胞膜上，從而使葡萄糖 被細胞攝取。
試驗實施例3
化合物三羥基葫,烷-5，23(五)-二烯-19-醛和22(5)，23(i )，24(^)，25-四 羥基葫,烷-5-烯對一磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMPK)活性測試(圖3)
3T3-L1脂肪細胞在10pM化合物2mM 5-氨基-4-咪唑曱酰胺核苷 酸(AIC,陽性對照)或DMSO溶劑對照條件下孵浴60min, 100nM胰 島素處理2min或25min，然后通過相應的抗體來測定細胞裂解液中的 蛋白pACC和pAMPK。用14-3-3總蛋白量作為上樣量質控。結果顯示 化合物三羥基葫^烷-5,23(^-二烯-19-醛和22(5)，23(i ),24(尺),25-四羥基 葫蘆烷-5-烯能明顯激活AMPK信號通路，進一步對糖尿病和肥胖有治 療作用。
試驗實施例4
22(5),23CR)，240R),25-四羥基葫,烷-5-烯在3T3-L1脂肪細胞中對葡 萄糖轉運蛋白4(GLUT4)轉位和AMPK磷酸化的劑量依賴關系測試(圖 4)
根據(jù)試驗實施例2和3的實驗方法，對22(5)，23(/ ),24(i ),25-四羥 基葫聲烷-5-烯在不同濃度(10, l(T7， l(T6， 1(^M)下進行測試，實驗
13結果如圖4所示。其中A是對葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)轉位影響的 劑量依賴曲線；B是在3T3-L1脂肪細胞中不同濃度下對一磷酸腺苷激 活蛋白激酶(AMPK)活性的影響；C是在3T3-L1脂肪細胞中不同濃度 下磷酸化一磷酸腺苷激活蛋白激酶(pAMPK)和總一磷酸腺普激活蛋白 激酶(tAMPK)比值的定量圖。實驗表明化合物22(5),23(/ )，24("，25-四羥基葫？烷-5-烯對葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)上膜的作用與對 AMPK磷酸化的效果(即激活AMPK信號通路)有很強的相關性，并且 在10^M濃度下，達到最大效果。
試驗實施例5
化合物22(5),23CR)，24(i )，25-四羥基葫,烷-5-烯在3T3-L1脂肪細 胞和L6肌肉細胞中對胰島素信號通路[即磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶 B(PI-3K/Akt)通路]影響的測試。
A、 在分化的3T3-L1脂肪細胞中，以DMSO為溶劑(DMSO最終 濃度為0.2%)，加入或不加入渥曼青霉素(wortmanin，磷脂酰肌醇3激 酶抑制劑)的條件下，加入10pM化合物22(5),23(/ )，24(7 ),25-四羥基葫 聲烷-5-烯或100nM胰島素(陽性對照)，按試驗實施例2所述方法進行 葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)轉位活性測試。數(shù)據(jù)以平均值i標準誤(X士SE) 表示。*p<0.05, **p<0.01,與溶劑對照組比較。實驗結果表明磷脂 酰肌醇3激酶抑制劑渥曼青霉素不影響化合物22(外23(7 )，24(7 ),25-四 羥基葫,烷-5-烯對葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)轉位的活性，即化合物 22(5)，23(i ),24(i ),25-四羥基葫，烷-5-烯對GLUT4轉位活性不依賴于 胰島素信號通路(圖5)。
B、 3T3-L1脂肪細胞和L6肌肉細胞在10pM化合物三羥基葫,烷 -5,23(五)-二烯-19-醛和22(5),23CR),24(i ),25-四羥基葫,烷-5-烯、100nM
14胰島素(陽性^f照)或DMSO溶劑對照條件下孵浴30min，然后通過相應 的抗體來測定磷酸化的蛋白激酶B[Akt (S473)]、總蛋白激酶B (14-3-3)。 * p<0.05， **p<0.01，與溶劑對照組比較。實驗結果表明: 化合物三羥基葫,烷-5,23(￡)-二烯-19-醛和22(5)，23(7 ),24(7 )，25-四羥基 葫蘆烷-5-烯并不能促進蛋白激酶B的磷酸化，表明化合物三羥基葫, 烷-5,23(￡)-二烯-19-醛和22(6),23(/ ),24(7 )，25-四羥基葫蘆烷-5-烯并不 影響胰島素信號通路(圖6)。
由于胰島素信號通路和AMPK信號通路是調節(jié)葡萄糖轉運蛋白 4(GLUT4)轉位和葡萄糖攝取的兩條主要信號通路，圖5和圖6中的結 果和與圖3和4獲得的結果吻合，即表明了所述化合物是通過AMPK 信號通路來調節(jié)葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)轉位和葡萄糖的攝取。
權利要求
1、一類結構式如下的苦瓜中提取的葫蘆烷型三萜類化合物在制備預防和治療糖尿病和肥胖的藥物中的用途其中，R1為β-D-葡萄吡喃糖基(1→6)-β-D-葡萄吡喃糖基，R2為氫，R3、R4、R5和R6為羥基，R7甲基，且C5和C6形成雙鍵，C22、C23、C24的手性分別為S、S、R構型；或R1為β-D-木吡喃糖基(1→4)-[β-D-葡萄吡喃糖基(1→6)]-β-D-葡萄吡喃糖基，R2為氫，R3、R4、R5和R6為羥基，R7甲基，且C5和C6形成雙鍵，C22、C23、C24的手性分別為S、S、R構型；或R2、R6為羥基，R1、R3、R4和R5為氫，R7為醛基，且C5和C6、C23和C24形成雙鍵；或R1為氫，R2為氫，R3、R4、R5和R6為羥基，R7甲基，且C5和C6形成雙鍵，C22、C23、C24的手性分別為S、S、R構型。
2、根據(jù)權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的化合物為momordicoside A ， 其結構如下<formula>formula see original document page 2</formula>
3、根據(jù)權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的化合物為
4、根據(jù)權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的化合物為三羥基葫，烷-5,23(￡)-二烯-19-醛，其結構如下
5、根據(jù)權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的化合物為22(5)，23(i )，24(i )，25-四羥基葫,烷-5-烯，其結構如下
6、 根據(jù)權利要求1 5任一項所述的用途，其特征在于，所述的苦瓜中提取的葫蘆烷型三萜皂苷類化合物為葡萄糖攝取促進劑、葡萄糖轉運蛋白4上膜激動劑、 一磷酸腺苷激活蛋白激酶激活劑。
7、 一種具有預防和治療糖尿病和肥胖活性的藥物組合物，其特征在于，所述的組合物包含治療有效量的結構式如下的苦瓜中提取的葫，烷型三辟類化合物中的 一種或多種及其藥學上可接受的輔料<formula>formula see original document page 4</formula>其中，Ri為卩-D -葡萄吡喃糖基(1—6)-卩-D -葡萄吡喃糖基，R2為氫，R3、 R4、 Rs和R6為羥基，R7曱基，且C5和C6形成雙鍵，C22、 C23、 C24的手性分別為S、 S、 R構型；或為(3-D -木吡喃糖基(1—4) - [|3 - D -葡萄吡喃糖基(1—6)]-卩-D-葡萄吡喃糖基，R2為氫，R3、 R4、 Rs和R6為羥基，R 曱基，且C5和C6形成雙鍵，C22、 C23、 C24的手性分別為S、 S、 R構型；或R2、 R6為羥基，R,、 R3、 R4和Rs為氫，R 為醛基，且C5和C6、 C23和C24形成雙4建；或R!為氳，R2為氫，R3、 R4、 Rs和R6為羥基，R 曱基，且C5和C6形成雙鍵，C22、 C23、 C24的手性分別為S、 S、 R構型。
全文摘要
本發(fā)明公開了從葫蘆科(Cucurbitaceae)苦瓜屬苦瓜(Momordica charantia L.)中分離得到的結構式如下(1)的葫蘆烷型三萜類化合物在制備預防和治療糖尿病和肥胖的藥物中的醫(yī)藥用途。上述葫蘆烷型三萜類化合物為葡萄糖攝取促進劑、葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)上膜激動劑、一磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMPK)激活劑，從而能夠預防和治療糖尿病和肥胖。
文檔編號A61P3/04GK101496806SQ200810033348
公開日2009年8月5日 申請日期2008年1月31日 優(yōu)先權日2008年1月31日
發(fā)明者陽 葉, 葉冀明, 大衛(wèi)·E·詹姆斯, 李希強, 柯昌強, 格里高利·庫尼, 愛德華·W·克里根, 譚敏佳, 彤 陳 申請人:中國科學院上海藥物研究所;澳大利亞伽爾文醫(yī)學研究所