專利名稱：一種新的蛇毒多肽及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
專利說(shuō)明一種新的蛇毒多肽及其制備方法和應(yīng)用 發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種新的蛇毒多肽。

背景技術(shù)：
蛇毒是毒蛇蛇腺分泌的物質(zhì)，具有多種藥理作用，例如鎮(zhèn)痛、止血、抑制血栓形成和抗腫瘤等，目前已有一些蛇毒制劑應(yīng)用于臨床。蛇毒是成分最復(fù)雜的一類動(dòng)物毒物，每一種蛇毒所含的活性成分，粗略估計(jì)至少有20種，主要包括各種酶類和毒蛋白，大部分的活性組分直接進(jìn)入體內(nèi)都可能使機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，例如心臟毒性、神經(jīng)毒性等，這些毒副作用是限制蛇毒制劑在臨床治療方面應(yīng)用的主要原因。
隨著各種相關(guān)學(xué)科的迅速發(fā)展，對(duì)蛇毒的研究層次逐漸從粗毒水平向蛇毒組分分離純化及其功能研究的水平深入，研究熱點(diǎn)也逐漸從研究較為透徹的蛇毒對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)的作用方面轉(zhuǎn)為抗腫瘤作用及機(jī)制方面。目前，從蛇毒中分離純化了多種具有抗腫瘤作用的組分，這些組分主要是一些細(xì)胞毒素、磷脂酶A2和解離素。
蝮蛇在我國(guó)分布廣泛，蝮蛇毒的來(lái)源豐富，價(jià)格相對(duì)便宜。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，國(guó)內(nèi)的學(xué)者只從蝮蛇毒中分離了一些神經(jīng)生長(zhǎng)因子、具有抗血小板聚集的多肽，國(guó)外的學(xué)者也只是從蝮蛇毒中分離出了一種具有細(xì)胞毒作用的神經(jīng)毒素，而蝮蛇毒中抗腫瘤的高純度的有效成分暫時(shí)還比較少。
國(guó)知局于2006年7月12日授權(quán)公告了一項(xiàng)發(fā)明專利(CN1800208)，該專利公開了一種從蝮蛇粗毒中分離出來(lái)的具有抗腫瘤作用的蛇毒多肽，其氨基酸序列為N-GEECDCGSPENPCCD，式中字母為單字母符號(hào)的氨基酸序列縮寫，所代表的氨基酸殘基的定義如下S為絲氨酸、E為谷氨酸、N為天冬酰胺、D為天冬氨酸、P為脯氨酸、G為甘氨酸、C為半胱氨酸，端頭N表示氨基末端。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的蛇毒多肽。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種蛇毒多肽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案是 一種蛇毒多肽，該多肽的N-端1～15個(gè)氨基酸為N-EAEEDEDDDAAAANC(I)，分子量為7554Da，可由以下方法制備得到 用水充分溶解蝮蛇粗毒，離心取上清液，在HPLC層析系統(tǒng)上用C18反相柱進(jìn)行層析，最后冷凍干燥，得白色粉末狀物質(zhì)即可，其中所述的層析的過(guò)程是以乙腈和0.1％的三氟乙酸為流動(dòng)相，在溫度為20～28℃下以7ml/min的流速按以下程序進(jìn)行梯度洗脫120min0.1％三氟乙酸的洗脫梯度為100％～20％遞減，乙腈的洗脫梯度為0～80％遞增；洗脫到50～60分鐘時(shí)收集OD210nm為0.5～2.0的組分； 上述式(I)中字母為單字母符號(hào)的氨基酸序列縮寫，所代表的氨基酸殘基的定義如下E為谷氨酸、A為丙氨酸、D為天冬氨酸、N為天冬酰胺、C為半胱氨酸，N表示氨基末端。
本發(fā)明蛇毒多肽須在-20℃下保存。
本發(fā)明所述的蛇毒多肽具有較好的抗腫瘤作用，可用于制備抗腫瘤的藥物。
為了更好的理解本發(fā)明，下面用本發(fā)明蛇毒多肽進(jìn)行體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明蛇毒多肽在腫瘤治療藥物領(lǐng)域中的用途。
采用人肝癌細(xì)胞株Hep3B為模型進(jìn)行本發(fā)明蛇毒多肽的抗腫瘤活性檢測(cè)。具體方法如下所述。
一、體外抑制腫瘤實(shí)驗(yàn) 1、實(shí)驗(yàn)分組 本發(fā)明蛇毒多肽治療組采用本發(fā)明蛇毒多肽處理，本發(fā)明蛇毒多肽制備方法見(jiàn)實(shí)施例1； 陽(yáng)性對(duì)照組采用蝮蛇粗毒處理； 正常對(duì)照組正常培養(yǎng)，不給予任何藥物干預(yù)。
2、實(shí)驗(yàn)方法 1)Hep3B細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，即以0.25％胰蛋白酶消化，1000×g離心3min，細(xì)胞沉淀以10％FBS的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整至5×104/ml，96孔培養(yǎng)板每孔接種200ul，置于37℃、5％CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24小時(shí)。
2)每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，每孔中加入10μl本發(fā)明蛇毒多肽，上述條件下繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)； 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
3)細(xì)胞培養(yǎng)6小時(shí)后，每孔加入10μl的CCK-8(cell counting kit 8)試劑，37℃，5％CO2及飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)。
4)用酶標(biāo)儀測(cè)定在波長(zhǎng)為450nm處的吸光度值(OD)，600nm作為參考波長(zhǎng)，光密度越低代表存活細(xì)胞越少。
本發(fā)明蛇毒多肽的形態(tài)學(xué)結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2和圖3。正常培養(yǎng)Hep3B細(xì)胞呈單層生長(zhǎng)，細(xì)胞密度均勻分布，細(xì)胞呈梭形生長(zhǎng)良好。在培養(yǎng)細(xì)胞中加入蛇毒多肽2小時(shí)后，細(xì)胞與細(xì)胞之間間隙變寬，隨著時(shí)間增加，間隙變大，整體細(xì)胞呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞漂浮，本發(fā)明蛇毒多肽作用24小時(shí)以后，全部細(xì)胞漂浮。本發(fā)明蛇毒多肽對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響(各組OD450)見(jiàn)表1。
表1本發(fā)明蛇毒多肽對(duì)Hep3B細(xì)胞增殖的影響 注1、2、3、4、5為復(fù)孔。
二、動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 1、將S180瘤源小鼠于傳代接種后10天在無(wú)菌條件下從腹腔抽出瘤液，用無(wú)菌生理鹽水調(diào)整瘤細(xì)胞數(shù)至5×106個(gè)/ml，。
2、21只小鼠(18-22g/只)，分別接種上述瘤液0.2ml于右大腿皮下后被隨機(jī)分為本發(fā)明蛇毒多肽組，陽(yáng)性對(duì)照組(蝮蛇粗毒治療)和空白對(duì)照組。除空白組外，其余各組接種次日同時(shí)灌胃給藥，給藥量0.2ml，每日給藥一次，連續(xù)10天，停藥次日稱重，解剖后剝離皮下瘤體，稱瘤重。按下式計(jì)算抑瘤率(％)＝(空白組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/空白組平均瘤重×100％。
表2本發(fā)明化合物對(duì)荷S180小鼠腫瘤大小的影響 結(jié)果如表2所示，說(shuō)明本發(fā)明蛇毒多肽對(duì)腫瘤有較好的抑制作用。



圖1是無(wú)本發(fā)明蛇毒多肽處理的對(duì)照Hep3B細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化圖。
圖2是本發(fā)明蛇毒多肽處理6小時(shí)后引起的Hep3B細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化圖。
圖3是本發(fā)明蛇毒多肽處理24小時(shí)后引起的Hep3B細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化圖。
圖4是蝮蛇粗毒的高效液相分離圖譜，蝮蛇粗毒經(jīng)C18反相高效液相色譜層析和梯度洗脫，圖中箭頭所指為本發(fā)明蛇毒多肽。
圖5是本發(fā)明蛇毒多肽純度檢測(cè)的高效液相圖。
圖6是本發(fā)明蛇毒多肽質(zhì)譜圖。
圖7是本發(fā)明蛇毒多肽的N端部份氨基酸序列測(cè)定結(jié)果，從上至下，左側(cè)空白對(duì)照1，標(biāo)準(zhǔn)1，殘基1E(Glu)；右側(cè)殘基2A(Ala)，殘基3E(Glu)，殘基4E(Glu)。
圖8是A本發(fā)明蛇毒多肽的N端部份氨基酸序列測(cè)定結(jié)果，從上至下，左側(cè)殘基5D(Asp)，殘基6E(Glu)，殘基7D(Asp)；右側(cè)殘基8D(Asp)，殘基9D(Asp)，殘基10A(Ala)。
圖9是本發(fā)明蛇毒多肽的N端部份氨基酸序列測(cè)定結(jié)果。從上至下，左側(cè)殘基11A(Ala)，殘基12A(Ala)，殘基13A(Ala)；右側(cè)殘基14N(Asn)，殘基15C(Cys)。
具體實(shí)施方法 制備例 方法 1)尖吻蝮蛇粗毒20mg充分溶于500μl超純水，4℃，5000rpm×5min離心，去除不溶性物質(zhì)，取上清液備用。
2)用直徑為5μm，孔徑為300

的反相硅膠C18顆粒作為固定相充填劑，制成高效液相色譜C18反相制備柱(20×300mm)。色譜流動(dòng)相為0.1％三氟乙酸和乙腈，流速為7ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，在HPLC層析系統(tǒng)上，以0.1％三氟乙酸+乙腈為流動(dòng)相，其中0.1％三氟乙酸洗脫梯度從100％-20％，乙腈洗脫梯度從0-80％，洗脫時(shí)間為120min，分離溫度為25℃，在洗脫時(shí)間53分鐘收集吸光度為0.5-2.0的組分。
圖4為蝮蛇粗毒經(jīng)C18反相高效液相色譜層析和梯度洗脫后的分離圖譜，紅色箭頭所指為所收集的物質(zhì)的峰，即本發(fā)明蛇毒多肽。
純度鑒定 1)色譜分析條件色譜分析柱(C18反相分析柱4.6×250mm，江蘇漢邦科技有限公司)，色譜柱固定相為反相硅膠C18顆粒，直徑5μm，孔徑300

(德國(guó)Merck公司)，流動(dòng)相為0.1％三氟乙酸(TFA)+乙腈；流速為1ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)210nm；用0.1％TFA+乙腈作流動(dòng)相梯度洗脫40min，0.1％TFA的洗脫濃度從100％-20％遞減，乙腈的洗脫濃度從0-80％遞增。
2)進(jìn)樣將凍干的本發(fā)明蛇毒多肽用純水溶解后，以10ug/ml進(jìn)樣。
3)檢測(cè)與分析用高效液相色譜層析系統(tǒng)Waters 2695進(jìn)行分析，在波長(zhǎng)為210nm處檢測(cè)，以面積歸一化積分方法計(jì)算本發(fā)明蛇毒多肽的純度。
結(jié)果表3和如圖5所示，在洗脫時(shí)間22分鐘左右，出現(xiàn)單一的對(duì)稱性的峰，純度計(jì)算為98％。
表3 分子量鑒定 采用電噴霧質(zhì)譜(Electrospray ionization mass spectrum，ESI-MS)測(cè)定蛇毒蛋白組份的分子量。
1、儀器與試劑 MicromassZQ電噴霧質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司)，Milli-Q純水器(美國(guó)Millipore公司)，甲醇為色譜純(德國(guó)Merck公司)。
2、方法 質(zhì)譜條件電噴霧離子源，正離子檢測(cè)方式，毛細(xì)管電壓3KV，椎孔電壓30V，離子源溫度108℃，毛細(xì)管溫度180℃，去溶劑溫度180℃，毛細(xì)管和去溶劑氣體(N2)，流速350L/hr。
樣品的準(zhǔn)備經(jīng)高效液相色譜層析系統(tǒng)Waters 2695檢測(cè)本發(fā)明蛇毒多肽蛋白組分溶液，分別與甲醇配成1∶10(v/v)溶液，直接進(jìn)樣。
3、數(shù)據(jù)分析采集的數(shù)據(jù)用masslynx4.0進(jìn)行分析，計(jì)算分子量，結(jié)果如圖6所示，測(cè)得分子量為7554Da。
N-端氨基酸序列的測(cè)定方法 采用EDMAN降解法來(lái)測(cè)定本發(fā)明蛇毒多肽的N端部份氨基酸序列，本實(shí)驗(yàn)在北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行。結(jié)果如圖7、8和9所示，N-端1-15個(gè)氨基酸是N-EAEEDEDDDAAAANC。
應(yīng)用例 制劑處方
本發(fā)明蛇毒多肽 20g 微晶纖維素 48g 可溶性淀粉 30g 滑石粉 2g 共制1000片，每片含該化合物100mg。
制備方法
稱取本發(fā)明蛇毒多肽20g，加可溶性淀粉稀釋成50g，混勻，再稱取微晶纖維素48g，用95％乙醇制軟材，過(guò)篩制粒，低溫50℃干燥，整粒，加入滑石粉2g，混勻，壓片(每0.1g)，質(zhì)檢、包裝，即得。
用法用量
每次2-3片，每日3次。
適用人群
適用各種腫瘤患者。
權(quán)利要求
1、一種新的蛇毒多肽，該多肽的N端1～15個(gè)氨基酸為N-EAEEDEDDDAAAANC(I)，分子量為7554Da，由以下方法制備得到
用水充分溶解蝮蛇粗毒，離心取上清液，在HPLC層析系統(tǒng)上用C18反相柱進(jìn)行層析，最后冷凍干燥，得白色粉末狀物質(zhì)即可，其中所述的層析的過(guò)程是以乙腈和0.1％的三氟乙酸為流動(dòng)相，在溫度為20～28℃下以7ml/min的流速按以下程序進(jìn)行梯度洗脫120min0.1％三氟乙酸的洗脫梯度為100％～20％遞減，乙腈的洗脫梯度為0～80％遞增；洗脫到50～60分鐘時(shí)收集OD210nm為0.5～2.0的組分；
式(I)中字母為單字母符號(hào)的氨基酸序列縮寫，所代表的氨基酸殘基的定義如下E為谷氨酸，A為丙氨酸，D為天冬氨酸，N為天冬酰胺，C為半胱氨酸，N表示氨基末端。
2、權(quán)利要求1所述的蛇毒多肽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的蛇毒多肽，該多肽是從蝮蛇粗毒里提取出來(lái)的，其分子量為7554Da，N端1-15個(gè)氨基酸的序列如式I所示，式中E為谷氨酸，A為丙氨酸，D為天冬氨酸，N為天冬酰胺，C為胱氨酸，N表示氨基末端。本發(fā)明所述的蛇毒多肽具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性，可用于制備抗腫瘤的藥物。N-EAEEDEDDDAAAANC (I)。
文檔編號(hào)A61K38/17GK101314617SQ200810029548
公開日2008年12月3日 申請(qǐng)日期2008年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月18日
發(fā)明者王廣發(fā), 吳少瑜, 張嘉杰, 饒進(jìn)軍, 偉 徐, 琳 呂, 吳曙光 申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)