專利名稱：：保婦康栓在制備治療宮頸癌的藥物中的應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及中藥保婦康栓的新醫(yī)藥用途，具體來說是在制備治療宮頸癌的藥物中的應用。技術背景宮頸癌是婦女最常見的惡性腫瘤之一，世界上每年確診宮頸癌新發(fā)病例470000例，其中80%以上發(fā)生在發(fā)展中國家，這些國家每年死于宮頸癌的婦女接近200000人，使這些婦女面臨著因宮頸癌造成的很高的疾病負擔。目前已經(jīng)明確高危型人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染是宮頸癌和癌前病變的主要危險因素。目前已經(jīng)確定的HPV亞型大約有100多種，其中約有35種亞型可感染生殖道，約30種型別在子宮頸癌中被發(fā)現(xiàn)。根據(jù)HPV亞型與宮頸癌的相關性可將HPV分為高危型和低危型。根據(jù)不同HPV亞型與宮頸癌發(fā)生的危險程度，已認定其中16,18，31，33，35，39，45，51，52，56，58,59，68等亞型主要與宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)有關，為高危型。臨床和流行病學的資料明確表明HPV16亞型比其它型別更容易引起宮頸上皮內(nèi)瘤變，此外，與HPV相關的宮頸癌以外的其它惡性腫瘤中HPV16陽性的比例高于子宮頸癌，HPV16、18亞型陽性的CIN患者較其它亞型易在更短時間內(nèi)進展。與宮頸癌有關的高危HPV亞型的治療目前尚無特效藥物，HPV疫苗接種的真正預防效果將為大幅降低HPV感染率和宮頸癌的發(fā)病風險提供絕好的機會，但是在未來幾十年里我們?nèi)匀灰M行規(guī)范的篩查和防治。目前治療HPV感染的藥物無確切療效，疫苗大規(guī)模投入臨床使用尚需時日，研制開發(fā)抗HPV藥物對于宮頸癌的防治具有重大意義。保婦康栓由莪術油和冰片兩味中藥組成，具有行氣破瘀、生肌止痛的功效。目前用于濕熱瘀滯所致的帶下病，癥見帶下量多、色黃、時有陰部瘙癢；霉菌性陰道炎、老年性陰道炎、宮頸麋爛見上述證侯者。臨床研究表明，采用保婦康栓陰道上藥聯(lián)合物理方法治療宮頸糜爛效果顯著，另外，保婦康栓還具有體外抗病原微生物的活性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供保婦康栓在制備治療宮頸癌的藥物中的應用。本發(fā)明提供保婦康栓在制備治療HPV引起的宮頸癌的藥物中的應用。本發(fā)明提供保婦康栓在制備治療HPV16亞型引起的宮頸癌的藥物中的應用。保婦康栓及其主要成分莪術油可抑制宮頸癌細胞系SiHa、CaSki以及宮頸永生化細胞系H8增殖。圖1.保婦康栓作用下CaSki細胞生長曲線。圖2.保婦康栓作用下H8細胞生長曲線。圖3.冰片加莪術油對CaSki細胞的生長抑制作用。具體實施方式下面結合附圖和具體實驗對本發(fā)明作進一步說明。材料與方法一、材料來源1細胞系CaSki細胞系，HPV16陽性的人宮頸癌細胞株，由中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所生物物理室提供；H8細胞系，人宮頸鱗狀上皮永生化細胞系，HPV16陽性細胞株，由中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所生物物理室提供；SiHa細胞系，HPV16陽性的人宮頸癌細胞株，由日本旭川醫(yī)科大學山下剛博士惠贈。2.主要試劑保婦康栓，海南碧凱藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，每粒重1.74g，其中含莪術油88mg，冰片75mg，其余成分為基質；莪術油、冰片及保婦康栓基質均由海南碧凱藥業(yè)有限公司提供；工具酶Taq■聚合酶(Pr騰ga);逆轉錄酶(M-MLVReverseTranscriptase)(Promega);分子標志物pBR322DNA/HaeIIIMarkers(600，500，400，300，200,100bp)(華美生物工程公司)；培養(yǎng)基和血清Dulbecco，sModifiedEagleMedium(DMEM)培養(yǎng)基(GIBCOBRL);胎牛血清(天津市川頁生化制品有限公司)；3.引物由上海生工生物工程技術服務有限公司，應用美國PE公司391型DNA自動合成儀合成，純化方式PAGE。二、實驗方法1.細胞培養(yǎng)CaSki、SiHa細胞在含5M胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，H8細胞在含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37°C，在5%0)2恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。CaSki、SiHa、H8細胞接種密度均為100ml培養(yǎng)瓶，10.0X107l0ml;6孔培養(yǎng)板，3.0X1073ml;24孔培養(yǎng)板，1.0X1071ml;96孔培養(yǎng)板0.2X107200ul。2.藥物濃度選擇1)保婦康栓藥物濃度選擇將1枚保婦康栓(水溶性)溶解于44ml無血清的DMEM培養(yǎng)基中，其所含保婦康栓濃度為3.95X10^g/L，待溶液澄清后，用孔徑為0.22"m的濾器過濾除菌，分裝后4t避光保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)預試驗結果，實驗組最終加入的保婦康栓濃度分別為19.77mg/L(莪術油lmg/L，冰片0.85mg/L，基質17.97mg/L)，39.55mg/L(莪術油2mg/L，冰片1.7mg/L，基質35.94mg/U，79.09mg/L(莪術油4mg/L，冰片3.4g/ml，基質71.88g/ml)，對照組則加入等量的培養(yǎng)基。參照保婦康栓中基質(O，10mg/L，20mg/L，40mg/L，80rag/L，100mg/L)和冰片濃度(0，1.4mg/L，2.8mg/L，5,6mg/L，11.2mg/L，22mg/L)，測定加藥后CaSki細胞增殖力。4.細胞形態(tài)觀察1)活細胞照相將對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板培養(yǎng)板，每孔3X1(T個細胞，在各實驗組的6孔培養(yǎng)板中每孔放置一片蓋玻片，形成附有細胞的蓋片，第二天細胞貼壁后更換為含藥培養(yǎng)基，培養(yǎng)三天后，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并照相。觀察不同濃度保婦康栓作用下CaSki、H8細胞系形態(tài)學變化。2)Giemsa染色觀察SiHa、CaSki、H8細胞系三種細胞實驗均分2組①對照組，等量乙醇；②藥物處理組，莪術油濃度分別為15mg/L，25mg/L,35mg/L。固定方法稍作改變，其它步驟按常規(guī)進行。在各實驗組的6孔培養(yǎng)板中每孔放置一片蓋玻片，接種3X1()5個對數(shù)生長期細胞。培養(yǎng)3d后用三氯醋酸(TCA)固定，每孔加預冷的5(^TCA液600yl(TCA最終濃度為10%)固定，加TCA時輕輕地加在培養(yǎng)液表面(使死亡或凋亡的細胞被固定在原位)，靜置5分鐘后再將平板移至4'C放置1小時。取出蓋玻片，用去離子水洗3遍，再用PBS沖洗2遍，甩干。用現(xiàn)配的Giemsa染色液(Giemsa染液貯存液pH7.0PBS=1:染色15min，用自來水沖去玻片上多余的染料，空氣干燥，二甲苯透明，光學樹脂膠封固。在光學顯微鏡下分別用低、高倍鏡觀察細胞。5.四甲基偶氮唑藍比色法檢測不同濃度的保婦康栓對細胞生長抑制情況將CaSki、H8細胞接種于六板96孔細胞培養(yǎng)板，每孔3000個細胞，第二天更換為含藥培養(yǎng)基，所含保婦康栓濃度分別為19.77mg/L，39.55mg/L，79.09mg/L，并設正常對照，每個濃度平行5孔。37°C，5線培養(yǎng)24小時后每孔加入5mg/ml四甲基偶氮唑藍(MTT)20u1，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，棄去上清液，每孔加入二甲基亞砜150ul，37。C放置20分鐘，震蕩使藍紫色結晶完全溶解后，酶標儀測定OD值，波長492nm，連續(xù)6天，作生長曲線。同法將SiHa、CaSki、H8細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔3000個細胞，第二天更換為含藥培養(yǎng)基，所含莪術油濃度分別為15mg/L，25mg/L，35mg/L，并設空白對照組。連續(xù)6天做生長曲線，結果見表l-4，及圖1-4。表1保婦康栓對CaSki細胞的生長抑制作用(0D，i土SD，n=5)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2保婦康栓對H8細胞的生長抑制作用(0D，7±SD，n=5)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表3冰片加莪術油對CaSki細胞的生長作用<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表4基質對CaSki細胞生長的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>與對照組比較，P>0.05結果由圖1至圖3及表1至表4可以看出，MTT檢測發(fā)現(xiàn)不同濃度保婦康栓對宮頸癌細胞CaSki以及宮頸永生化細胞H8均有生長抑制作用，隨著作用時間以及藥物濃度增加作用越明顯(見圖1，3)。分別用不同濃度的保婦康栓成分一冰片和基質處理CaSki細胞，第五天MTT值與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)。不同濃度冰片加莪術油處理CaSki細胞第五天，MTT值與單加莪術油組相比無顯著性差異(P〉0.05)。6.細胞周期檢測CaSki、H8細胞兩種細胞接種在六孔板，每孔3X105個對數(shù)生長期細胞，分兩組:①對照組，等量乙醇；②藥物處理組，所含保婦康栓濃度分別為19.77mg/L，39.55mg/L，79.09mg/L;同法將SiHa、CaSki、H8細胞接種于六孔板，實驗均分2組①對照組，等量乙醇；②藥物處理組，莪術油濃度分別為15mg/L，25mg/L，35mg/L。具體步驟(1)消化細胞，計數(shù)。(2)將5X104對數(shù)生長期細胞接種于6孔板中，每組設三個平行孔。(3)5%C02孵箱37'C培養(yǎng)三天后，收取細胞和上清。先取出6孔板中的細胞上清，置于20ml離心管中，再消化細胞，吹打置于同一離心管管中，1200rpm離心7min，棄上清，加5mlPBS洗，1200rpm離心7mn，棄上清，加lml生理鹽水，將細胞轉移至1.5ml離心管中，1200rpm離心7min，棄上清，加500ul75%冷乙醇固定，吹打混勻。(4)置于4'C冰箱保存，作流式細胞術。經(jīng)0.01%RNA酶處理胞漿RNA、50mg/L碘化丙錠(propidiumiodide,PI)DNA染色30min后，經(jīng)300目細胞篩過濾除去成團細胞，用流式細胞儀檢測細胞周期中不同時相的細胞百分比和細胞凋亡率。每份標本測定5000個細胞。根據(jù)DNA含量區(qū)分細胞所處細胞周期時相，結果見表5-6。表5保婦康栓作用下CaSki細胞周期分布和細胞凋亡率Cellcycle(%)apoptosis(%)GlG2Scontrol79.9±0.7110.25±0.219.8±0.420.94±0.00339.55mg/L75.5±1.5611.1±0.7112.55±0.641.18±0.00179.09mg/L74.9±1.13*12.15±0.2113.4±0.85*3.09±0.001*注P<0.05comparedwithcontrol表6保婦康栓作用下H8細胞周期分布和細胞凋亡率Cellcycle(%)apoptosis(%)GlG2Scontrol74.2±1.8412±1.0213.75±1.770.68±0.00239.55mg/L72.8±2.6912.4±0.8515±1.560.69±0.00279.09mg/L76.75±2.629.75±0.0713.55±2.762.33±0.005注P〉0.05comparedwithcontrol結果由表5和6可以看出，保婦康栓作用于H8細胞，Gl期減少，但是均無統(tǒng)計學差異(P〉0.05)。保婦康栓作用于CaSki細胞，Gl期細胞減少(P<0.05)，S期細胞增加(P<0.05)，使細胞阻滯于S期。保婦康栓作用于H8細胞,加藥組凋亡率略增加，但無統(tǒng)計學差異(P〉0.05)。保婦康栓作用于CaSki細胞，加藥組凋亡率略增加，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。7.半定量RT-PCR方法檢測HPV16E6E7mRNA表達水平(1)總RNA提取1)收集107細胞，PBS洗2遍，充分振蕩；2)向樣品管中加入1000u14N異硫氰酸胍、20raMNaAc(pH5.2)、0.IMP巰基乙醇、0.5%十二烷基肌氨酸鈉混合液，充分振蕩，使沉淀完全溶解；3)室溫，12000rpm離心5min;4)取上清，加200u1氯仿充分混勻，12000rpm離心5min;5)小心吸取上層水相，加入等體積的(約450ul)酚-氯仿-異戊醇(25:24:1)溫和混勻，12000rpm離心3min;重復該步驟一遍；6)吸取上清(約450ul)，加入l/10體積的3MNaAc、一倍體積的異丙醇，-20°C30min以上；7)12000rpm離心10min，棄上清；8)加入lml75%乙醇，振蕩混勻，12000rpm離心5min，棄上清；重復該步驟一遍；9)敞開試管蓋室溫晾干約10min;10)加入25ulDEPC處理水，即為所提總RNA，樣品-80。C保存。(2)RT(逆轉錄)反應①取約5yg總RNA于一支0.5ml離心管中，65。C保溫10min，離心數(shù)秒，放置冰浴中；②在上面離心管中加入隨機引物lul、10mMdNTPlul、5XRT緩沖液4ul、酶混合液(含逆轉錄酶M-MLV20u、RNA酶抑制劑20u)lul，用DEPC-ddH20補足至20u1;③室溫放置IOmin，37。C保溫30min;95。C5min，4'C5min，迅速放入-20。C凍存。(3)PCR反應①取O.5ml離心管，依次加入10XPCR緩沖液4.5ul、10mMdNTPlul、25mMMgCl24ul、上、下游引物各lul(50pmo1)(陽性內(nèi)參照加通用引物e-actin50ng/ul上、下游引物lul)、2u/ulTaq酶lul、RT反應產(chǎn)物(cDNA第一鏈)5u1，用DEPC-ddH20補足至50ul;②離心數(shù)秒，上PCR儀擴增，擴增參數(shù)為94。C預變性5min;94。C變性45s，50。C復性45s,72'C延伸1min，擴增30個循環(huán)；72'C延伸加時5min;PCR產(chǎn)物4。C保存；③1.2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果，電壓40V。結果CaSki和H8細胞用保婦康栓藥物處理后，可見細胞生長稀疏，部分細胞固縮。(4)半定量分析應用ScionImage4.0(NIH)軟件進行電泳條帶圖像灰度值的半定量分析。待測基因電泳條帶灰度比值=待測條帶灰度值/同一份標本內(nèi)參照5-actin條帶灰度值。每個加藥樣本至少檢測三次，結果見表7。表7保婦康栓作用下RT-PCR產(chǎn)物電泳條帶灰度值<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>結果本實驗中在保婦康栓作用下，CaSKi和H8兩種細胞HPV16E6E7基因片段mRNA表達均明顯低于對照組(P〈0.01)，并呈劑量依賴關系(P〈0.01)。8統(tǒng)計學處理用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，進行單因素方差分析(AN0VA)、t檢驗等。結論.-、保婦康栓以及莪術油對于CaSki和H8細胞增殖的作用MTT檢測結果表明，保婦康栓可以抑制CaSki和H8細胞的增殖，隨著藥物濃度的增加，抑制作用增強?；罴毎障嗵崾颈D康栓可以殺傷細胞，細胞生長稀疏，崩解破碎，證實藥物對兩種細胞系增殖有抑制作用。MTT法檢測結果顯示莪術油對于SiHa、CaSki和H8細胞的具有生長抑制作用，隨著藥物濃度的增加，抑制作用增強。呈現(xiàn)劑量-效應關系?；罴毎障嗪虶imsa染色結果均提示提示莪術油可以殺傷細胞，細胞生長稀疏，崩解破碎，證實藥物對三種細胞增殖有抑制作用。二、保婦康栓對于細胞周期的影響本試驗流式細胞術結果顯示，在不同濃度的保婦康栓作用下，CaSki細胞凋亡率高于對照組。加藥組CaSki細胞Gl期減少，G2、S期增加，細胞阻滯于S期。結果表明婦康栓可以阻斷DNA的合成和復制，有效的抑制腫瘤細胞的增殖。故推測保婦康栓通過促進P16表達，改變細胞周期進程，同時抑制P53表達，阻止細胞分裂，抑制細胞的增殖。三、保婦康栓對于HPV16E6E7基因mRNA表達的影響高危型HPV感染是宮頸癌發(fā)生的必要條件。高危型HPV產(chǎn)生兩種癌蛋白E6和E7蛋白，癌蛋白可與宿主細胞的細胞周期調(diào)節(jié)蛋白(抑癌蛋白如p53、Rb等)相結合(E6蛋白與p53結合，E7蛋白和Rb、cyclinA結合)，導致細胞周期控制失常，發(fā)生癌變并促進腫瘤進展。本實驗中在保婦康栓作用下，兩種細胞系HPV16E6E7基因片段mRNA表達均明顯低于對照組，且存在劑量依賴關系。保婦康栓可能通過抑制腫瘤細胞HPV16E6E7表達，激活P53和Rb通路促進細胞衰老和凋亡。四、保婦康栓及其主要成分莪術油可抑制宮頸癌細胞系SiHa、CaSki以及宮頸永生化細胞系H8增殖，其機制可能與抑制HPV16E6E7表達有關。權利要求1、保婦康栓在制備治療宮頸癌的藥物中的應用。2、如權利要求l所述的保婦康栓在制備治療宮頸癌的藥物中的應用，其特征在于所述的治療宮頸癌的藥物是指治療HPV引起的宮頸癌的藥物。3、如權利要求2所述的保婦康栓在制備治療宮頸癌的藥物中的應用，其特征在于所述的治療宮頸癌的藥物是指治療HPV16亞型引起的宮頸癌的藥物。全文摘要本發(fā)明公開了一種保婦康栓在制備治療宮頸癌的藥物中的應用。表明保婦康栓可以殺傷細胞，細胞生長稀疏，崩解破碎，證實藥物對兩種細胞系增殖有抑制作用。文檔編號A61K31/045GK101229340SQ20081000287公開日2008年7月30日申請日期2008年1月8日優(yōu)先權日2008年1月8日發(fā)明者康曉飛,符成龍,容陳申請人:海南碧凱藥業(yè)有限公司