專利名稱：甘油連接的peg化的糖和糖肽的制作方法
相關(guān)申請的交叉參考
本申請要求享有2006年10月4日提交的美國臨時專利申請第60/828,208號的優(yōu)先權(quán)，通過參考將該臨時專利申請的全部內(nèi)容并入本文用于所有目的。

發(fā)明內(nèi)容
在示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明的“糖聚乙二醇化的(glycopegylated)”分子是通過酶介導(dǎo)在糖基化或非糖基化的肽與可酶促轉(zhuǎn)移的糖基(saccharyl)部分之間形成綴合物而產(chǎn)生的，所述可酶促轉(zhuǎn)移的糖基部分在其結(jié)構(gòu)內(nèi)包括修飾基團(tuán)，例如聚合物修飾基團(tuán)例如聚(乙二醇)。在示例性實(shí)施方案中，所述肽是選自以下的成員骨形態(tài)發(fā)生蛋白(例如，BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-13、BMP-14、BMP-15)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白(例如、NT-3、NT-4、NT-5)、生長分化因子(例如，GDF-5)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系產(chǎn)生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、腦產(chǎn)生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、馮·維勒布蘭德氏(von Willebrand)因子(vWF)蛋白酶、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII、具有全長因子VIII的vWF-因子VIII融合蛋白、具有B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII的vWF-因子VIII融合蛋白、紅細(xì)胞生成素(EPO)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素α、干擾素β、干擾素γ、α1-抗胰蛋白酶(ATT或α-1蛋白酶抑制劑)、葡糖腦苷脂酶、組織型纖溶酶原激活物(TPA)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、尿激酶、人脫氧核糖核酸酶、胰島素、乙型肝炎表面蛋白(HbsAg)、人生長激素、TNF受體-IgG Fc區(qū)域融合蛋白(EnbrelTM)、抗-HER2單克隆抗體(HerceptinTM)、呼吸道合胞病毒的蛋白F的單克隆抗體(SynagisTM)、TNF-α的單克隆抗體(RemicadeTM)、糖蛋白IIb/IIIa的單克隆抗體(ReoproTM)、CD20的單克隆抗體(RituxanTM)、抗凝血酶III(AT III)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、α-半乳糖苷酶(FabrazymeTM)、α-艾杜糖醛酸酶(AldurazymeTM)、促卵泡激素、β-葡糖苷酶、抗-TNF-α單克隆抗體(MLB5075)、胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、胰高血糖素樣肽-2(GLP-2)、β-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶A和成纖維細(xì)胞生長因子。聚合物修飾基團(tuán)連接于糖基部分(即，通過由兩個活性基團(tuán)反應(yīng)而形成的單個基團(tuán)連接)或通過連接體部分，例如，被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的雜烷基等連接。
因此，在一個方面，本發(fā)明提供PEG部分(例如，PEG)和肽(其具有與本領(lǐng)域認(rèn)可的治療性肽相似或在其它方面類似的體內(nèi)活性)之間的綴合物。在本發(fā)明的綴合物中，PEG部分通過完整的糖基(glycosyl)連接基團(tuán)與肽共價連接。示例性的完整的糖基連接基團(tuán)包括用PEG衍生化的唾液酸部分。
聚合物修飾基團(tuán)可以連接于肽上的糖基部分的任何位置。此外，聚合物修飾基團(tuán)可以連接于野生型肽或突變肽的氨基酸序列中的任何位置處的糖基殘基。
在示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通過糖基連接基團(tuán)與聚合物修飾基團(tuán)綴合的肽。示例性的肽綴合物包括糖基連接基團(tuán)，所述糖基連接基團(tuán)具有選自以下的化學(xué)式
在式I、Ia、II或IIa中，R2為H、CH2OR7、COOR7、COO-或OR7，其中R7表示H、被取代的或未被取代的烷基或被取代的或未被取代的雜烷基。符號R3、R4、R5、R6和R6’獨(dú)立地包括H、被取代的或未被取代的烷基、OR8、NHC(O)R9和糖基(saccaryl)部分。下標(biāo)d為0或1。R8和R9獨(dú)立地選自H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的雜烷基、唾液酸。R3、R4、R5、R6或R6’中的至少一個包括聚合物修飾基團(tuán)例如PEG。在示例性實(shí)施方案中，R6和R6’與它們所連接的碳合起來為唾液酸基(sialyl)部分的側(cè)鏈的部分。在另一個示例性實(shí)施方案中，這個側(cè)鏈用聚合物修飾基團(tuán)官能化。
在示例性實(shí)施方案中，聚合物修飾基團(tuán)通過連接體L結(jié)合于糖基連接基團(tuán)，通常通過糖基核上的雜原子(例如，N、O)結(jié)合，如以下所示
R1為聚合物修飾基團(tuán)和L選自鍵和連接基團(tuán)。下標(biāo)w表示選自1-6的整數(shù)，優(yōu)選為1-3，更優(yōu)選為1-2。示例性的連接基團(tuán)包括被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的雜烷基部分和唾液酸。連接體的示例性組成部分為?；糠?。另一個示例性的連接基團(tuán)為氨基酸殘基(例如，半胱氨酸、絲氨酸、賴氨酸和短的寡肽例如，Lys-Lys、Lys-Lys-Lys、Cys-Lys、Ser-Lys等)。
在L為鍵時，它是通過R1的前體上的反應(yīng)性官能團(tuán)與糖基連接基團(tuán)的前體上的具有互補(bǔ)反應(yīng)活性的反應(yīng)性官能團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)所形成的。在L為非零級連接基團(tuán)時，在與R1前體反應(yīng)之前L可以位于糖基部分上?；蛘?，可以將R1的前體和L合并為預(yù)先形成的盒(preformedcassette)，隨后將該預(yù)先形成的盒連接于糖基部分。如本文中所述的，具有適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)性官能團(tuán)的前體的選擇和制備在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。此外，前體的偶聯(lián)通過本領(lǐng)域中充分公知的化學(xué)方法進(jìn)行。
在示例性實(shí)施方案中，L是由提供被修飾的糖的氨基酸或小肽(例如，1-4個氨基酸殘基)形成的連接基團(tuán)，在被修飾的糖中，聚合物修飾部分通過被取代的烷基連接體連接。示例性的連接體包括甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸和半胱氨酸。本文中定義的氨基酸類似物也可用作連接體組分。所述氨基酸可以用通過?；I共價連接的連接體(例如，烷基、雜烷基)的另外的部分來修飾，所述酰基鍵例如由氨基酸殘基的胺部分形成的酰胺或氨基甲酸酯。
在示例性實(shí)施方案中，糖基連接基團(tuán)具有式I或Ia的結(jié)構(gòu)并且R5包括聚合物修飾基團(tuán)。在另一個示例性實(shí)施方案中，R5既包括聚合物修飾基團(tuán)又包括將聚合物修飾基團(tuán)連接于糖基核的連接體L。L可以是直鏈或支鏈的結(jié)構(gòu)。類似地，聚合物修飾基團(tuán)可以是支化的或線性的。
所述聚合物修飾基團(tuán)包括兩個或更多個重復(fù)單元，其可以是水溶性的或是基本上不溶于水。用于本發(fā)明化合物中的示例性的水溶性聚合物包括PEG(例如，m-PEG)、PPG(例如，m-PPG)、多聚唾液酸、聚谷氨酸酯、聚天冬氨酸酯、聚賴氨酸、聚乙烯亞胺、可生物降解型聚合物(例如，聚交酯、聚甘油酯)和官能化PEG(例如，末端官能化PEG)。
用于肽綴合物的糖基連接基團(tuán)的糖基核心選自天然的和非天然的呋喃糖類和吡喃糖類。非天然的糖類任選地在環(huán)上包括烷基化或酰基化的羥基和/或胺部分，例如，醚、酯和酰胺取代基。其它非天然糖類包括位于環(huán)上位置上的H、羥基、醚、酯或酰胺取代基，在該位置處所述取代基不存在于天然的糖類中。或者，所述碳水化合物缺失在衍生出其名稱的碳水化合物中存在的取代基，例如脫氧糖。另外的示例性的非天然糖包括被氧化(例如，-糖酸(-onic)和-糖醛酸(-uronic))和還原的(糖醇)碳水化合物。所述糖部分可以是單糖、寡糖或聚糖。
用作本發(fā)明的糖基連接基團(tuán)的部分的示例性天然糖包括葡萄糖、葡糖胺、半乳糖、半乳糖胺、巖藻糖、甘露糖、甘露糖胺、木聚糖(xylanose)、核糖、N-乙?；咸烟?、N-乙?；咸前贰-乙?；肴樘?、N-乙酰半乳糖胺和唾液酸。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包括以下部分的肽綴合物
其中D是選自以下的成員-OH和R1-L-HN-；G是選自以下的成員H和R1-L-和-C(O)(C1-C6)烷基；R1為包括直鏈或支化聚(乙二醇)殘基的部分；以及L為連接體，例如，鍵(“零級”)、被取代的或未被取代的烷基和被取代的或未被取代的雜烷基。在示例性實(shí)施方案中，在D為OH時，G為R1-L-；在G為-C(O)(C1-C6)烷基時，D為R1-L-NH-。
在另一個方面，本發(fā)明提供包括糖基連接基團(tuán)的肽綴合物，其中所述糖基連接基團(tuán)連接于所述肽的氨基酸殘基，并且其中所述糖基連接基團(tuán)包括具有選自以下的成員的化學(xué)式的唾液酸基(sialyl)連接基團(tuán)
其中
是修飾基團(tuán)。R2是選自以下的成員H、CH2OR7、COOR7、COO-和OR7。R7是選自以下的成員H、被取代的或未被取代的烷基和被取代的或未被取代的雜烷基。R3和R4是獨(dú)立地選自以下的成員H、被取代的或未被取代的烷基、OR8和NHC(O)R9。R8和R9獨(dú)立地選自H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的雜烷基和唾液酸基。La為選自以下的連接體鍵、被取代的或未被取代的烷基和被取代的或未被取代的雜烷基。X5、R16和R17獨(dú)立地選自非反應(yīng)性基團(tuán)和聚合物部分(例如聚(氧化烯烴)、例如，PEG)。非反應(yīng)性基團(tuán)包括被認(rèn)為是基本上無反應(yīng)性的、中性的和/或在生理學(xué)pH下是穩(wěn)定的基團(tuán)，例如，H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的雜烷基等等。示例性的聚合物部分包括在以下式IIIa及其示例中所示的支化結(jié)構(gòu)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，這些式中的PEG部分可以用其它聚合物代替。示例性的聚合物包括聚(氧化烯烴)家族的那些。X2和X4是將聚合物部分R16和R17連接于C的獨(dú)立地被選擇的連接片段。下標(biāo)j為選自1到15的整數(shù)。
在另一個示例性實(shí)施方案中，聚合物修飾基團(tuán)具有下式所示結(jié)構(gòu)
其中下標(biāo)m和n是獨(dú)立地選自0到5000的整數(shù)。A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10和A11是獨(dú)立地選自以下的成員H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的雜烷基、被取代的或未被取代的環(huán)烷基、被取代的或未被取代的雜環(huán)烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的雜芳基、-NA12A13、-OA12和-SiA12A13。A12和A13是獨(dú)立地選自以下的成員被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的雜烷基、被取代的或未被取代的環(huán)烷基、被取代的或未被取代的雜環(huán)烷基、被取代的或未被取代的芳基和被取代的或未被取代的雜芳基。
在示例性實(shí)施方案中，聚合物修飾基團(tuán)具有包括下式所示部分的結(jié)構(gòu)
在上式的另一個示例性實(shí)施方案中，聚合物修飾基團(tuán)具有下式所示的結(jié)構(gòu)
在示例性實(shí)施方案中，m和n是獨(dú)立地選自約1到約5000的整數(shù)，優(yōu)選約100到約4000，更優(yōu)選約200到約3000，更優(yōu)選約300到約2000和更優(yōu)選約400到約1000。在示例性實(shí)施方案中，m和n是獨(dú)立地選自約1到約500的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，m和n是獨(dú)立地選自約1到約70、約70到約150、約150到約250、約250到約375和約375到約500的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，m和n是獨(dú)立地選自約10到約35、約45到約65、約95到約130、約210到約240、約310到約370和約420到約480的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，m和n為選自約15到約30的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，m和n為選自約50到約65的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，m和n為選自約100到約130的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，m和n為選自約210到約240的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，m和n為選自約310到約370的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，m和n為選自約430到約470的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，A1和A2各自是選自-OH和-OCH3的成員。
根據(jù)這個實(shí)施方案的示例性聚合物修飾基團(tuán)包括以下部分
本發(fā)明提供包括糖基連接基團(tuán)的肽綴合物，其中糖基連接基團(tuán)連接于肽的氨基酸殘基，并且其中糖基連接基團(tuán)包括下式所示的唾液酸基連接基團(tuán)
其中
為修飾基團(tuán)。下標(biāo)s為選自1到20的整數(shù)。下標(biāo)f為選自1到2500的整數(shù)。
Q是選自以下的成員H和被取代的或未被取代的C1-C6烷基。
在示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明提供下式所示的被修飾的糖
其中R1為聚合物部分；L選自鍵和連接基團(tuán)；R2是選自以下的成員H、CH2OR7、COOR7和OR7；R7是選自以下的成員H、被取代的或未被取代的烷基和被取代的或未被取代的雜烷基；R3和R4是獨(dú)立地選自以下的成員H、被取代的或未被取代的烷基、OR8和NHC(O)R9；以及R8和R9獨(dú)立地選自H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的雜烷基、唾液酸和多聚唾液酸。下標(biāo)w表示選自1-6的整數(shù)，優(yōu)選為1-3和更優(yōu)選為1-2。示例性的連接基團(tuán)包括被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的雜烷基部分和唾液酸。連接體的示例性組成部分為?；糠帧?br> 本發(fā)明提供形成肽的綴合物的方法。所述方法包括使肽與被修飾的糖供體接觸，所述被修飾的糖供體帶有與糖共價連接的修飾基團(tuán)。被修飾的糖部分在酶的作用下從供體轉(zhuǎn)移到肽的氨基酸或糖基殘基上。代表性的酶包括但不限于糖基轉(zhuǎn)移酶，例如，唾液酸轉(zhuǎn)移酶。所述方法包括在適合于將被修飾的糖部分從供體轉(zhuǎn)移到肽的氨基酸或糖基殘基上的條件下使肽與a)被修飾的糖供體；以及b)能夠?qū)⒈恍揎椀奶遣糠謴谋恍揎椀奶枪w轉(zhuǎn)移到肽的氨基酸或糖基殘基上的酶接觸，從而合成所述肽綴合物。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟a)之前，使肽與唾液酸酶接觸，從而除去肽上的至少一部分唾液酸。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，使肽與唾液酸酶、糖基轉(zhuǎn)移酶和被修飾的糖供體接觸。在這個實(shí)施方案中，使肽基本上同時地與唾液酸酶、糖基轉(zhuǎn)移酶和被修飾的糖供體相接觸，不論各種組分的添加順序如何。反應(yīng)在適合于唾液酸酶從肽除去唾液酸殘基、以及糖基轉(zhuǎn)移酶將被修飾的糖部分從被修飾的糖供體轉(zhuǎn)移到肽的氨基酸或糖基殘基上的條件下進(jìn)行。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，脫唾液酸化(desialylation)和綴合在同一容器中進(jìn)行，并且優(yōu)選經(jīng)過脫唾液酸化的肽在綴合步驟之前不經(jīng)純化。在另一個示例性實(shí)施方案中，所述方法另外包括牽涉肽綴合物的唾液酸化(sialylation)的‘加帽’步驟。這個步驟在包含唾液酸酶、唾液酸轉(zhuǎn)移酶和被修飾的糖供體的相同的反應(yīng)容器中進(jìn)行，而不進(jìn)行事先純化。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，進(jìn)行肽的脫唾液酸化，并且將脫唾液酸肽純化。然后使純化的脫唾液酸肽經(jīng)歷綴合反應(yīng)條件。在另一個示例性實(shí)施方案中，所述方法另外包括牽涉肽綴合物的唾液酸化的‘加帽’步驟。這個步驟在包含唾液酸酶、唾液酸轉(zhuǎn)移酶和被修飾的糖供體的相同的反應(yīng)容器中進(jìn)行，而不進(jìn)行事先純化。
在另一個示例性實(shí)施方案中，加帽步驟，即肽綴合物的唾液酸化，在包含唾液酸酶、唾液酸轉(zhuǎn)移酶和被修飾的糖供體的相同的反應(yīng)容器中進(jìn)行，而不進(jìn)行事先純化。
在示例性實(shí)施方案中，所述接觸時間少于20小時，優(yōu)選少于16小時，更優(yōu)選少于12小時，甚至更優(yōu)選少于8小時和更優(yōu)選少于4小時。
在另一個方面，本發(fā)明提供肽綴合物反應(yīng)混合物。所述反應(yīng)混合物包括a)唾液酸酶；b)為選自以下成員的酶糖基轉(zhuǎn)移酶、外切糖苷酶和內(nèi)切糖苷酶；c)被修飾的糖；以及d)肽。
在另一個示例性實(shí)施方案中，唾液酸酶與肽的比選自0.1U/L∶2mg/mL到10U/L∶1mg/mL，優(yōu)選0.5U/L∶2mg/mL，更優(yōu)選1.0U/L∶2mg/mL，甚至更優(yōu)選10U/L∶2mg/mL，還更優(yōu)選0.1U/L∶1mg/mL，更優(yōu)選0.5U/L∶1mg/mL，甚至更優(yōu)選1.0U/L∶1mg/mL和還更優(yōu)選10U/L∶1mg/mL。
在示例性實(shí)施方案中，所述肽綴合物中的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％包括至多兩個PEG部分。所述PEG部分可以通過一鍋燴(one-pot)工藝添加，或者可以在將脫唾液酸肽純化之后添加它們。
在另一個示例性實(shí)施方案中，所述肽綴合物的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％包括至多一個PEG部分。所述PEG部分可以通過一鍋燴工藝添加，或者可以在將脫唾液酸肽純化之后添加它。
在另一個示例性實(shí)施方案中，所述方法另外包括“加帽”，或向肽綴合物添加唾液酸。在另一個示例性實(shí)施方案中，添加唾液酸酶，隨后推遲30分鐘、1小時、1.5小時或2小時，然后添加糖基轉(zhuǎn)移酶、外切糖苷酶或內(nèi)切糖苷酶。
在另一個示例性實(shí)施方案中，添加唾液酸酶，隨后推遲30分鐘、1小時、1.5小時或2小時，然后添加糖基轉(zhuǎn)移酶、外切糖苷酶或內(nèi)切糖苷酶。通過以下的詳細(xì)說明，本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點(diǎn)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。
在另一個示例性實(shí)施方案中，所述方法包括(a)使包括選自以下的糖基基團(tuán)的肽

以及
其中a為0到10的整數(shù)，與下式的被修飾的糖
以及將糖基連接基團(tuán)轉(zhuǎn)移到所述糖基基團(tuán)的選自GalNAc、Gal和Sia的成員上的適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)移酶在適合于所述轉(zhuǎn)移的條件下接觸。示例性的被修飾的糖為通過連接體部分用聚合物修飾的CMP-唾液酸，所述聚合物為例如直鏈或支化聚(乙二醇)部分。上式中的基團(tuán)與上文中的相同式中發(fā)現(xiàn)的那些實(shí)質(zhì)上相同。
所述肽可以從基本上任何來源獲得，然而，在一個實(shí)施方案中，在如上所述進(jìn)行修飾之前，所述肽在適合的宿主中進(jìn)行表達(dá)。哺乳動物細(xì)胞(例如，BHK、CHO)、細(xì)菌細(xì)胞(例如，大腸埃希桿菌(E.coli))和昆蟲細(xì)胞(例如，Sf-9)是提供可用于本文所述組合物和方法中的肽的示例性表達(dá)系統(tǒng)。
根據(jù)以下的詳細(xì)說明，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點(diǎn)是顯而易見的。



圖1說明CMP-唾液酸-甘油PEG 40kD的制備。
圖2說明用于制備CMP-唾液酸-甘油PEG 40kD的反應(yīng)條件。
圖3說明用于純化CMP-唾液酸-甘油PEG 40kD的方法。
圖4說明用于CMP-唾液酸-甘油PEG 40kD的牽涉Q-瓊脂糖的純化方法。
圖5是CMP-唾液酸-甘油PEG 40kD的1H NMR光譜。
圖6是提供了可用于形成本發(fā)明的糖綴合物的示例性唾液酸轉(zhuǎn)移酶的表格，例如獲得帶有被修飾的唾液酸的糖PEG化肽。
圖7是可以被連接上一個或多個糖基連接基團(tuán)以提供本發(fā)明的肽綴合物的肽的表格。
發(fā)明的詳細(xì)說明和優(yōu)選實(shí)施方案 縮寫 PEG，聚(乙二醇)；PPG，聚(丙二醇)；Ara，阿拉伯糖基；Fru，果糖基；Fuc，巖藻糖基；Gal，半乳糖基；GalNAc，N-乙?；肴樘前坊籊lc，葡萄糖基；GlcNAc，N-乙?；咸前坊?；Man，甘露糖基；ManAc，乙酸甘露糖胺基；Xyl，木糖基；NeuAc，唾液酸基或N-乙酰基神經(jīng)氨?；?；Sia，唾液酸基或N-乙酰基神經(jīng)氨?；?；及其衍生物和類似物。
定義 除非另有說明，否則本文使用的全部的科學(xué)術(shù)語和技術(shù)術(shù)語通常具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員常規(guī)理解的相同含義。通常，本文使用的命名法以及在細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、有機(jī)化學(xué)和核酸化學(xué)及雜交中的實(shí)驗(yàn)室方法是本領(lǐng)域公知的和常用的。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于核酸和肽的合成。通常，根據(jù)本領(lǐng)域的常規(guī)方法和各種一般參考文獻(xiàn)實(shí)施所述技術(shù)和程序(一般參見，Sambrook等人，MOLECULARCLONINGA LABORATORY MANUAL，第2版(1989)Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，其作為參考被并入本文)，其在本文中通篇中被提供。本文使用的命名法以及在分析化學(xué)中的實(shí)驗(yàn)室方法以及如下所述的有機(jī)合成是本領(lǐng)域公知的和常用的那些。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)或其改進(jìn)用于化學(xué)合成和化學(xué)分析。
本文所述的所有的寡糖如下進(jìn)行描述非還原糖類的名稱或縮寫(即Gal)，接著是糖苷鍵的構(gòu)型(α或β)、環(huán)鍵(1或2)、牽涉鍵的還原糖類的環(huán)位置(2、3、4、6或8)，然后是還原糖類的名稱或縮寫(即GlcNAc)。每種糖類優(yōu)選是吡喃糖類。對于標(biāo)準(zhǔn)的糖生物學(xué)命名法的綜述請參見Essentials of Glycobiology，Varki等人編，CSHL Press(1999)。
寡糖被認(rèn)為具有還原端和非還原端，無論在還原端處的糖類是否實(shí)際上是還原糖。根據(jù)被認(rèn)可的命名法，寡糖在本文中被描述為在左側(cè)為非還原端和在右側(cè)為還原端。
術(shù)語“唾液酸”或“唾液酸基”是指九碳羧基化糖家族的任何成員。唾液酸家族的最常見成員是N-乙?；?神經(jīng)氨酸(2-酮-5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-D-甘油-D-半乳糖九碳(nonulo)吡喃糖-1-糖酸(經(jīng)?？s寫為Neu5Ac、NeuAc或NANA)。該家族的第二個成員是N-羥乙酰-神經(jīng)氨酸(Neu5Gc或NeuGc)，其中NeuAc的N-乙?；鶊F(tuán)被羥基化。該家族的第三個成員是2-酮-3-脫氧-九碳糖酸(nonulosonicacid)(KDN)(Nadano等人(1986)J.Biol.Chem.26111550-11557；Kanamori等人，J.Biol.Chem.26521811-21819(1990))。還包括9-取代的唾液酸，諸如9-O-C1-C6?；?Neu5Ac如9-O-乳?；?Neu5Ac或9-O-乙酰基-Neu5Ac、9-脫氧-9-氟-Neu5Ac和9-疊氮-9-脫氧-Neu5Ac。關(guān)于唾液酸家族的綜述，例如，參見Varki，Glycobiology 225-40(1992)；Sialic AcidsChemistry，Metabolism and Function，R.Schauer，Ed.(Springer-Verlag，New York(1992))。在唾液酸化程序中的唾液酸化合物的合成和使用在1992年10月1日公布的國際申請WO 92/16640中公開。
“肽”是指其中單體是氨基酸并通過酰胺鍵連在一起的聚合物，或者被稱為多肽。另外，還包括非天然氨基酸，例如β-丙氨酸、苯基甘氨酸和高精氨酸。未進(jìn)行基因編碼的氨基酸也可用于本發(fā)明中。另外，已經(jīng)過修飾從而包含反應(yīng)性基團(tuán)、糖基化位點(diǎn)、聚合物、治療性部分、生物分子等的氨基酸也可用于本發(fā)明。用于本發(fā)明中的所有的氨基酸可以是D-或者L-異構(gòu)體。L-異構(gòu)體通常是優(yōu)選的。另外，其它的肽擬似物(peptidomimetics)也可用于本發(fā)明。本文使用的“肽”既指糖基化肽也指非糖基化肽。還包括這樣的肽，該肽被表達(dá)其的系統(tǒng)不完全糖基化。關(guān)于一般性綜述，參見，Spatola，A.F.，，CHEMISTRY ANDBIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS，PEPTIDES AND PROTEINS，B.Weinstein，eds.，Marcel Dekker，New York，p.267(1983)。本發(fā)明的一些肽的列表在圖7中被提供。
術(shù)語“肽綴合物”是指其中如本文所闡述的那樣肽與被修飾的糖綴合的本發(fā)明的物質(zhì)。
術(shù)語“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以類似于天然存在的氨基酸的方式發(fā)揮作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼編碼的那些氨基酸，以及在后期被修飾的那些氨基酸，例如羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物是指具有與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，即，與氫結(jié)合的α碳、羧基、氨基和R基團(tuán)，例如，高絲氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亞砜、蛋氨酸甲基锍。這些類似物具有被修飾的R基團(tuán)(例如正亮氨酸)或被修飾的肽骨架，但是仍保持與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物是指具有與氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)的化學(xué)化合物，但是其以類似于天然存在的氨基酸的方式發(fā)揮作用。
本文使用的術(shù)語“被修飾的糖”或“被修飾的糖殘基”是指在本發(fā)明的方法中被酶促附加到肽的氨基酸或糖基殘基上的天然存在的或非天然存在的碳水化合物。被修飾的糖選自包括但不限于以下的酶底物糖核苷酸類(一、二和三磷酸類)，被活化的糖(例如，糖基鹵化物、糖基甲磺酸化物)和既未活化又不是核苷酸類的糖?！氨恍揎椀奶恰庇谩靶揎椈鶊F(tuán)”進(jìn)行共價官能化。有用的修飾基團(tuán)包括但不限于PEG部分、治療性部分、診斷性部分、生物分子等等。修飾基團(tuán)優(yōu)選不是天然存在的碳水化合物或未被修飾的碳水化合物。選擇用修飾基團(tuán)進(jìn)行官能化的位置，以便其不妨礙“被修飾的糖”被酶促附加到肽上。
本文使用的術(shù)語“聚合物部分”是指水溶性的或非水溶性的聚合物。術(shù)語“水溶性的”是指在水中具有一定的可檢測程度的溶解度的部分。用于檢測和/或定量水溶性的方法是本領(lǐng)域公知的。示例性的水溶性聚合物包括肽、糖類、聚醚、聚胺、聚羧酸等等。肽可以具有由單一氨基酸組成的混合序列例如聚賴氨酸。示例性的多糖是多聚唾液酸。示例性的聚醚是聚乙二醇。聚乙烯亞胺是示例性的聚胺，和聚丙烯酸是代表性的聚羧酸。優(yōu)選的水溶性聚合物基本上是非熒光的，或者放射如此極微量的熒光從而使得它們在試驗(yàn)中不適合用作熒光標(biāo)記物。可使用不屬于天然存在的糖的聚合物。另外，還涵蓋了使用通過共價連接另外的實(shí)體(例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚天冬氨酸、生物分子、治療性部分、診斷性部分等等)進(jìn)行修飾的其它天然存在的糖。術(shù)語“水溶性聚合物”還包括諸如以下的物質(zhì)糖類(例如右旋糖酐、直鏈淀粉、透明質(zhì)酸、多聚唾液酸、乙酰肝素、肝素等等)；聚氨基酸，例如聚谷氨酸；核酸；合成聚合物(例如聚丙烯酸、聚醚例如聚乙二醇)；肽，蛋白質(zhì)，等等。代表性的非水溶性的聚合物包括但不限于聚磷嗪、聚乙烯醇、聚酰胺、聚碳酸酯、聚烯烴(polyalkylene)、聚丙烯酰胺、聚亞烷基二醇、聚氧化烯烴、聚亞烷基對苯二甲酸酯、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯鹵化物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙交酯類、聚硅氧烷、聚氨酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚甲基丙烯酸丁酯、聚甲基丙烯酸異丁酯、聚甲基丙烯酸己酯、聚甲基丙烯酸異癸酯、聚甲基丙烯酸月桂酯、聚甲基丙烯酸苯酯、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸異丙酯、聚丙烯酸酸異丁酯、聚丙烯酸十八烷基酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙二醇、聚氧化乙烯、聚對苯二甲酸乙二酯、聚乙酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯基吡咯烷酮、普盧蘭尼克(pluronics)和聚乙烯基苯酚，及其共聚物。另外，還涵蓋了使用通過共價連接另外的實(shí)體(例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚天冬氨酸、生物分子、治療性部分、診斷性部分等等)進(jìn)行修飾的其它天然存在的糖。在本申請中描述了水溶性的和非水溶性的聚合物的附加實(shí)例。
水溶性聚合物的聚合物骨架可以是聚乙二醇(即PEG)。然而，可以理解的是，其它相關(guān)聚合物也適用于本發(fā)明的實(shí)踐中并且術(shù)語PEG或聚乙二醇在這方面的使用被認(rèn)為是包含性的而非排它性的。術(shù)語PEG包括任何其形式的聚乙二醇，包括烷氧基PEG，雙官能PEG，多臂PEG，叉形PEG，支化PEG，有側(cè)鏈的PEG(即，PEG或相關(guān)聚合物具有一個或多個懸垂在聚合物骨架上的官能團(tuán))，或其中具有可降解鍵的PEG。
聚合物可以是線性的或支化的。支化聚合物通常是本領(lǐng)域已知的。代表性地，支化聚合物具有中央的分支核心部分和許多與該中央分支核心相連的線性或支化聚合物鏈。PEG通常以支化形式被使用，該支化形式可以通過將氧化乙烯附加到各種多元醇諸如甘油、季戊四醇和山梨醇而制備。中央分支部分還可得自若干種氨基酸諸如賴氨酸。支化聚乙二醇可用通式R(-PEG-OH)m表示，其中R代表核心部分諸如甘油或季戊四醇，和m代表臂的數(shù)目。多臂型PEG分子諸如在美國專利No.5,932,462(其全文并入本文作為參考)中所述的那些也可用作聚合物骨架。在示例性實(shí)施方案中，支化聚合物自身連接于分支部分(例如半胱氨酸、絲氨酸、賴氨酸和賴氨酸的低聚物)。
許多其它的聚合物也可適用于本發(fā)明。非肽的和水溶性的、具有約2到約300個連接位點(diǎn)的聚合物骨架特別用于本發(fā)明。適當(dāng)?shù)木酆衔锏膶?shí)例包括但不限于其他的聚亞烷基二醇諸如聚丙二醇(“PPG”)、乙二醇和丙二醇的共聚物等，聚氧乙基化多元醇，聚烯醇，聚乙烯基吡咯烷酮，聚羥丙基甲基丙烯酰胺，聚α-羥酸，聚乙烯醇，聚磷腈，聚噁唑啉，聚N-丙烯?；鶈徇?，諸如在美國專利No.5,629,384(其全文并入本文作為參考)中描述的那些，及其共聚物、三元共聚物和混合物。盡管聚合物骨架的每條鏈的分子量可以改變，但是其代表性的范圍為約100Da到約100,000Da，通常為約6,000Da到約80,000Da。
在對患者給予肽藥物的背景下，本文使用的“曲線下面積”或“AUC”被定義為是描述在患者體循環(huán)中的藥物濃度作為時間(從零到無限大)的函數(shù)的曲線下的總面積。
在對患者給予肽藥物的背景下，本文使用的術(shù)語“半衰期”或“t1/2”被定義為是在患者中藥物的血漿濃度減少一半時所需的時間。根據(jù)多清除機(jī)制、再分布和本領(lǐng)域公知的其它機(jī)制而異，存在與肽藥物有關(guān)的超過一種的半衰期。通常，定義α和β半衰期，使得α相與再分布有關(guān)且β相與清除有關(guān)。然而，對于在很大程度上被限制在血流中的蛋白藥物而言，可存在至少兩個清除半衰期。對于一些糖基化肽，快速β相清除可以通過識別末端半乳糖、N-乙酰基半乳糖胺、N-乙酰基葡糖胺、甘露糖或巖藻糖的巨噬細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞上的受體來介導(dǎo)。更慢的β相清除可借助腎對有效半徑＜2納米的分子(約68kD)的腎小球?yàn)V過作用和/或在組織內(nèi)的特異性的或非特異性的攝取和代謝而發(fā)生。糖PEG化可以封閉末端糖(例如半乳糖或N-乙?；肴樘前?并從而借助于識別這些糖的受體阻斷快速α相清除。其還可賦予更大的有效半徑并從而降低分布體積和組織攝取，從而延長后面的β相。因此，糖PEG化對α相和β相半衰期的精確影響可以根據(jù)大小、糖基化狀態(tài)和本領(lǐng)域公知的其它參數(shù)的不同而異。“半衰期”的另外的解釋說明參見Pharmaceutical Biotechnology(1997，DFA Crommelin和RDSindelar編輯，Harwood Publishers，Amsterdam，pp 101-120)。
本文使用的術(shù)語“糖綴合”是指被修飾的糖物質(zhì)與多肽如本發(fā)明的G-CSF肽的氨基酸或糖基殘基的由酶促介導(dǎo)的綴合?！疤蔷Y合”的下位概念是“糖-PEG化”，其中被修飾的糖的修飾基團(tuán)是聚乙二醇、及其烷基衍生物(例如，m-PEG)或反應(yīng)性衍生物(例如，H2N-PEG、HOOC-PEG)。
術(shù)語“大規(guī)?！焙汀肮I(yè)規(guī)?！笨苫Q使用并且是指在單個反應(yīng)周期完成時產(chǎn)生至少約250毫克，優(yōu)選至少約500毫克和更優(yōu)選至少約1克的糖綴合物的反應(yīng)周期。
本文使用的術(shù)語“糖基連接基團(tuán)”是指共價連接有修飾基團(tuán)(例如，PEG部分、治療性部分、生物分子)的糖基殘基；糖基連接基團(tuán)使修飾基團(tuán)結(jié)合于綴合物的其余部分。在本發(fā)明的方法中，“糖基連接基團(tuán)”共價連接于糖基化肽或非糖基化肽，從而將試劑連接于肽上的氨基酸和/或糖基殘基上?！疤腔B接基團(tuán)”通常從“被修飾的糖”通過“被修飾的糖”與肽的氨基酸和/或糖基殘基的酶促連接衍生得到。糖基連接基團(tuán)可以是在修飾基團(tuán)-被修飾的糖盒的形成期間(例如氧化→席夫堿形成→還原)發(fā)生降解的糖類衍生結(jié)構(gòu)，或者糖基連接基團(tuán)可以是未經(jīng)修飾的?！巴暾奶腔B接基團(tuán)”是指從其中將修飾基團(tuán)連接于綴合物的其余部分的糖類單體不發(fā)生降解、例如不被例如偏高碘酸鈉氧化的糖基部分衍生得到的連接基團(tuán)。本發(fā)明的“完整的糖基連接基團(tuán)”可從天然存在的寡糖通過附加一個或多個糖基單元或從母體糖類結(jié)構(gòu)中除去一個或多個糖基單元衍生得到。
本文使用的術(shù)語“非糖苷修飾基團(tuán)”是指不包含直接連接于糖基連接基團(tuán)的天然存在的糖的修飾基團(tuán)。
本文使用的術(shù)語“靶向部分”是指選擇性地定位在身體的特定組織或區(qū)域內(nèi)的部分。該定位通過分子決定簇的特異性識別、靶向劑或綴合物的分子大小、離子相互作用、疏水性相互作用等等來介導(dǎo)。使試劑靶向于特定組織或區(qū)域的其它機(jī)制是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。示例性的靶向部分包括抗體、抗體片段、鐵傳遞蛋白、HS-糖蛋白、凝血因子、血清蛋白、β-糖蛋白、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO等等。
本文使用的“治療性部分”是指任何可用于治療的試劑，包括但不限于，抗生素、抗炎藥、抗腫瘤藥、細(xì)胞毒素和放射性試劑。“治療性部分”包括生物活性試劑的前體藥物，其中超過一種的治療性部分結(jié)合于載體的構(gòu)建體，例如多價試劑。治療性部分也包括蛋白質(zhì)和包含蛋白質(zhì)的構(gòu)建體。示例性的蛋白質(zhì)包括但不限于粒細(xì)胞集落刺激因子(GCSF)，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)，干擾素(例如，干擾素-α、-β、-γ)，白細(xì)胞介素(例如，白細(xì)胞介素II)，血清蛋白(例如凝血因子VII、VIIa、VIII、IX和X)，人絨毛膜促性腺激素(HCG)，促卵泡激素(FSH)和促黃體生成激素(LH)以及抗體融合蛋白(例如腫瘤壞死因子受體((TNFR)/Fc結(jié)構(gòu)域融合蛋白))。
本文使用的“藥學(xué)上可接受的載體”包括任何材料，這些材料當(dāng)與綴合物組合時保持綴合物的活性并且與受試者的免疫系統(tǒng)無反應(yīng)性。其實(shí)例包括但不限于任何的標(biāo)準(zhǔn)藥物載體，諸如磷酸鹽緩沖鹽水溶液、水、乳液諸如油/水乳液，和各種類型的濕潤劑。其它載體還可包括無菌溶液，包括包衣片劑在內(nèi)的片劑以及膠囊。代表性地，這種載體包含賦形劑諸如淀粉、乳、糖、某些類型的粘土、明膠、硬脂酸或其鹽、硬脂酸鎂或硬脂酸鈣、滑石、植物脂肪或油類、樹膠、二醇或其它已知的賦形劑。這種載體還可包括用于味道和顏色的添加劑或其它成分。包括這種載體的組合物通過公知的常規(guī)方法進(jìn)行配制。
本文使用的“給予”是指口服給藥，作為栓劑給藥，局部接觸，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，肌肉內(nèi)，病灶內(nèi)，鼻內(nèi)或皮下給藥，或者植入緩釋裝置如迷你滲透泵到受試者。給藥通過包括腸胃外和經(jīng)粘膜(如經(jīng)口、鼻、陰道、直腸或透皮)在內(nèi)的任何途徑進(jìn)行。腸胃外給藥包括例如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、小動脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、心室內(nèi)和顱內(nèi)給藥。另外，當(dāng)注射用于治療腫瘤如誘導(dǎo)細(xì)胞編程性死亡時，可直接給予到腫瘤內(nèi)和/或腫瘤周圍的組織內(nèi)。其它的遞送方式包括但不限于使用脂質(zhì)體制劑、靜脈內(nèi)輸注、透皮貼劑等等。
術(shù)語“改善”是指在治療包括任何客觀或主觀參數(shù)在內(nèi)的病理癥狀或病況中的任何成功的標(biāo)志，諸如癥狀的減輕、緩和或減弱，或患者身體或精神狀態(tài)的改善。癥狀的改善可以基于客觀的或主觀的參數(shù)；包括身體檢查和/或精神病學(xué)評價的結(jié)果在內(nèi)。
術(shù)語“治療”是指疾病或病況的“治療”，包括預(yù)防疾病或病況在可能傾向于罹患該疾病但是尚未經(jīng)歷或表現(xiàn)出該疾病的癥狀的動物中發(fā)生(預(yù)防性治療)，抑制疾病(減慢或阻止其進(jìn)展)，提供疾病的癥狀或副作用的減輕(包括姑息性治療)，和減輕疾病(引起疾病消退)。
術(shù)語“有效量”或“有效用于...的量”或“治療有效量”或任何在語法上等同的含義的術(shù)語是指當(dāng)被給予到動物用于治療疾病時足以實(shí)現(xiàn)對該疾病的治療的量。
術(shù)語“分離的”是指材料，其實(shí)質(zhì)上或基本上與用于制造材料的組分分開。對于本發(fā)明的肽綴合物而言，術(shù)語“分離的”是指實(shí)質(zhì)上或基本上與在用于制備該肽綴合物的混合物中的常與所述材料伴隨的組分分開的材料。“分離的”和“純的”可互換使用。代表性地，分離的本發(fā)明的肽綴合物具有的純度水平優(yōu)選用范圍來表示。該肽綴合物的純度范圍的下限端值為約60％、約70％或約80％并且該純度范圍的上限端值為約70％、約80％、約90％或高于約90％。
當(dāng)所述肽綴合物具有高于約90％的純度時，它們的純度也優(yōu)選用范圍來表示。該純度范圍的下限端值為約90％、約92％、約94％、約96％或約98％。該純度范圍的上限端值為約92％、約94％、約96％、約98％或約100％純度。
純度通過任何被本領(lǐng)域認(rèn)可的分析方法(例如，在銀染色凝膠上的譜帶強(qiáng)度，聚丙烯酰胺凝膠電泳，HPLC或類似手段)進(jìn)行測定。
本文使用的“群體的基本上每個成員”描述了本發(fā)明的肽綴合物的群體的特征，其中被附加到肽上的被選定百分?jǐn)?shù)的被修飾的糖被附加到肽上的多個相同的接受體部位上。“群體的基本上每個成員”是指與被修飾的糖綴合的肽上的位點(diǎn)的“均一性”并且是指本發(fā)明的具有至少約80％，優(yōu)選至少約90％和更優(yōu)選至少約95％均一性的綴合物。
“均一性”是指綴合有被修飾的糖的接受體部分的群體之間的結(jié)構(gòu)一致性。因此，在本發(fā)明的肽綴合物中，其中每個被修飾的糖部分綴合于接受體部位上，該接受體部位具有與綴合于每個其它被修飾的糖的接受體部位相同的結(jié)構(gòu)，則該肽綴合物被認(rèn)為具有約100％的均一性。均一性代表性用范圍表示。關(guān)于肽綴合物的均一性范圍的下限端值為約60％、約70％或約80％并且該均一性范圍的上限端值為約70％、約80％、約90％或高于約90％。
當(dāng)所述肽綴合物具有高于或等于約90％的均一性時，它們的均一性也優(yōu)選用范圍表示。該均一性范圍的下限端值為約90％、約92％、約94％、約96％或約98％。純度范圍的上限端值為約92％、約94％、約96％、約98％或約100％均一性。肽綴合物的純度典型地通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一種或多種方法例如液相色譜法-質(zhì)譜法(LC-MS)，基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)量飛行時間光譜測定法(MALDITOF)、毛細(xì)管電泳等等來測定。
“實(shí)質(zhì)上均一的糖形式”或“實(shí)質(zhì)上均一的糖基化模式”當(dāng)用來指糖肽物質(zhì)時，是指通過目的糖基轉(zhuǎn)移酶(例如巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)進(jìn)行糖基化的接受體部分的百分?jǐn)?shù)。例如，在α1，2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的情況下，如果實(shí)質(zhì)上全部的(如下文所定義)的Gal β1，4-GlcNAc-R及其唾液酸化類似物在本發(fā)明的肽綴合物中被巖藻糖基化時，則存在實(shí)質(zhì)上均一的巖藻糖基化模式。在本文中所述的巖藻糖基化結(jié)構(gòu)中，F(xiàn)uc-GlcNAc連接通常是α1，6或α1，3連接，通常優(yōu)選α1，6連接。本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解的是，原料可包含糖基化接受體部分(例如巖藻糖基化Galβ1，4-GlcNAc-R部分)。因此，計算的百分?jǐn)?shù)糖基化將包括通過本發(fā)明方法被糖基化的接受體部分，以及在原料中已發(fā)生糖基化的那些接受體部分。
在上述定義“實(shí)質(zhì)上均一的”中的術(shù)語“實(shí)質(zhì)上”一般是指對于特定的糖基轉(zhuǎn)移酶而言至少約40％、至少約70％、至少約80％或更優(yōu)選至少約90％、仍更優(yōu)選至少約95％的接受體部分被糖基化。
當(dāng)取代基團(tuán)用其常規(guī)的從左至右書寫的化學(xué)式進(jìn)行說明時，它們同樣地包括在化學(xué)上相同的可從將所述結(jié)構(gòu)從右至左書寫而產(chǎn)生的取代基，例如-CH2O-也意在描述-OCH2-。
術(shù)語“烷基”，其本身或作為另一個取代基的一部分，除非另有說明，是指直鏈或支鏈或環(huán)狀的烴基團(tuán)或其組合，其可以是全飽和的、單不飽和的或多不飽和的并且可包括二價或多價基團(tuán)，具有指定的碳原子數(shù)(即，C1-C10是指1-10個碳)。飽和烴基團(tuán)的實(shí)例包括但不限于諸如以下的基團(tuán)甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基、仲丁基、環(huán)己基、(環(huán)己基)甲基、環(huán)丙基甲基，其同系物和異構(gòu)體，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等等。不飽和烷基是具有一個或多個雙鍵或三鍵的基團(tuán)。不飽和烷基的實(shí)例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-異戊烯、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基，及其高級同系物和異構(gòu)體。除非另作說明，否則術(shù)語“烷基”還意在包括在下文中更詳細(xì)定義的烷基的那些衍生物，諸如“雜烷基”。局限于烴基團(tuán)的烷基被成為“同型烷基(homoalkyl)”。
術(shù)語“亞烷基”，其本身或作為另一個取代基的一部分，是指從烷烴得到的二價基，例如，但不限于-CH2CH2CH2CH2-，并且另外包括在下文中被描述為是“雜亞烷基”的那些基團(tuán)。代表性地，烷基(或亞烷基)基團(tuán)含1-24個碳原子，在本發(fā)明中優(yōu)選含10個或更少碳原子的所述基團(tuán)。“低級烷基”或“低級亞烷基”是指具有更短鏈的烷基或亞烷基，通常具有8個或更少的碳原子。
術(shù)語“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷基硫基”(或硫基烷氧基)以其常規(guī)含義被使用，并且是指分別借助于氧原子、氨基或硫原子連接于分子的其余部分的那些烷基。
術(shù)語“雜烷基”，其單獨(dú)地或與另外的術(shù)語組合時，除非另有說明，是指穩(wěn)定的直鏈或支鏈或環(huán)狀的烴基團(tuán)或其組合，由指定數(shù)目的碳原子和至少一個選自O(shè)、N、Si和S的雜原子組成，并且其中氮和硫原子可任選被氧化并且氮雜原子可任選被季銨化。一個或多個雜原子O、N和S和Si可位于雜烷基基團(tuán)的任何內(nèi)部位置處或位于烷基與分子其余部分連接的位置處。實(shí)例包括但不限于，-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。最多兩個雜原子可以是相鄰的，諸如，例如，-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。類似地，術(shù)語“雜亞烷基”，其本身或作為另一個取代基的一部分時，是指由雜烷基得到的二價基，例如，但不限于-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。對于雜亞烷基基團(tuán)，雜原子還可占據(jù)鏈的任一終點(diǎn)或兩個終點(diǎn)(例如，亞烷基氧基，亞烷基二氧基，亞烷基氨基，亞烷基二氨基等等)。另外，對于亞烷基和雜亞烷基連接基團(tuán)，其中被書寫的連接基團(tuán)的式子的方向并不暗示連接基團(tuán)的取向。例如，式-C(O)2R’-既代表-C(O)2R’-又代表-R’C(O)2-。
術(shù)語“環(huán)烷基”和“雜環(huán)烷基”，其本身或與其它術(shù)語組合時，除非另有說明，分別代表環(huán)狀形式的“烷基”和“雜烷基”。另外，對于雜環(huán)烷基，雜原子可以占據(jù)雜環(huán)與分子其余部分連接的位置。環(huán)烷基的實(shí)例包括但不限于環(huán)戊基、環(huán)己基、1-環(huán)己烯基、3-環(huán)己烯基、環(huán)庚基等等。雜環(huán)烷基的實(shí)例包括但不限于，1-(1，2，5，6-四氫吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-嗎啉基、3-嗎啉基、四氫呋喃-2-基、四氫呋喃-3-基、四氫噻吩-2-基、四氫噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等等。
術(shù)語“鹵基”或“鹵素”，其本身或作為另一個取代基的一部分時，除非另有說明，是指氟、氯、溴或碘原子。另外，術(shù)語諸如“鹵代烷基”意在包括單鹵代烷基和多鹵代烷基。例如，術(shù)語“鹵代(C1-C4)烷基”意指包括但不限于三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等等。
術(shù)語“芳基”，除非另有說明，是指多不飽和的、芳香族的取代基，其可以是單環(huán)或稠合在一起或共價連接的多環(huán)(優(yōu)選1-3個環(huán))。術(shù)語“雜芳基”是指包含1-4個選自N、O和S的雜原子的芳基基團(tuán)(或環(huán))，其中氮和硫原子任選被氧化并且一個或多個氮原子任選被季銨化。雜芳基可通過雜原子連接于分子的其余部分。芳基和雜芳基的非限制性實(shí)例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-聯(lián)苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-異噁唑基、4-異噁唑基、5-異噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-異喹啉基、5-異喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基、四唑基、苯并[b]呋喃基、苯并[b]噻吩基、2，3-二氫苯并[1，4]二氧雜芑(dioxin)-6-基、苯并[1，3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基和6-喹啉基。以上所述的每個芳基和雜芳基環(huán)體系的取代基選自如下所述的可接受的取代基。
為了簡便起見，術(shù)語“芳基”當(dāng)與其它術(shù)語組合使用時(例如芳基氧基、芳基硫氧基(thioxy)、芳基烷基)包括如上定義的芳基環(huán)和雜芳基環(huán)。因此，術(shù)語“芳基烷基”意在包括其中芳基基團(tuán)連接于烷基基團(tuán)的那些基團(tuán)(例如苯甲基、苯乙基、吡啶基甲基等等)，所述烷基基團(tuán)包括其中碳原子(例如亞甲基基團(tuán))已被例如氧原子置換的那些烷基基團(tuán)(例如苯氧基甲基，2-吡啶基氧基甲基，3-(1-萘基氧基)丙基)等等)。
每一上述術(shù)語(例如，“烷基”、“雜烷基”、“芳基”和“雜芳基”)意在包括所指基團(tuán)的被取代形式和未被取代的形式。在下文提供對于每種類型基團(tuán)的優(yōu)選的取代基。
對于烷基和雜烷基基團(tuán)(包括通常被稱為亞烷基、烯基、雜亞烷基、雜烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烯基和雜環(huán)烯基的那些基團(tuán))的取代基被統(tǒng)稱為“烷基基團(tuán)取代基”，并且它們可以是選自但不限于以下多種基團(tuán)中的一種或多種-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-鹵素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R”’)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR”’、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和-NO2，其數(shù)目范圍從零到(2m’+1)，其中m’是在所述基團(tuán)中的碳原子的總數(shù)。R’、R”、R”’和R””各自優(yōu)選獨(dú)立地是指氫、被取代的或未被取代的雜烷基、被取代的或未被取代的芳基例如被1-3個鹵素取代的芳基、被取代的或未被取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基基團(tuán)或芳基烷基基團(tuán)。例如，當(dāng)本發(fā)明的化合物包括超過一個的R基團(tuán)時，獨(dú)立地選擇每個R基團(tuán)，正如當(dāng)存在超過一個的R’、R”、R”’和R””基團(tuán)時獨(dú)立地選擇這些基團(tuán)中的每一個一樣。當(dāng)R’和R”連接于相同的氮原子時，它們可與氮原子組合形成5-、6-或7-元環(huán)。例如，-NR’R”意在包括但不局限于1-吡咯烷基和4-嗎啉基。從上述關(guān)于取代基的討論，本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解，術(shù)語“烷基”意在包括這樣的基團(tuán)，該基團(tuán)包括與氫基團(tuán)以外的基團(tuán)連接的碳原子，諸如鹵代烷基(例如，-CF3和-CH2CF3)和?；?例如，-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等等)。
與關(guān)于烷基基團(tuán)所述的取代基類似，用于芳基和雜芳基基團(tuán)的取代基被統(tǒng)稱為“芳基基團(tuán)取代基”。所述取代基選自例如鹵素、-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、鹵素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R”’)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR”’、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和-NO2、-R’、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基和氟(C1-C4)烷基，數(shù)目范圍從零到芳環(huán)體系上開放價(open valences)的總數(shù)；并且其中R’、R”、R”’和R””優(yōu)選獨(dú)立地選自氫、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的雜烷基、被取代的或未被取代的芳基和被取代的或未被取代的雜芳基。例如，當(dāng)本發(fā)明的化合物包括超過一個的R基團(tuán)時，獨(dú)立地選擇每個R基團(tuán)，正如當(dāng)存在超過一個的R’、R”、R”’和R””基團(tuán)時獨(dú)立地選擇這些基團(tuán)中的每一個一樣。在以下的方案中，符號X代表如上所述的“R”。
芳基或雜芳基環(huán)的相鄰原子上的兩個取代基可以任選地被式-T-C(O)-(CRR’)u-U-的取代基置換，其中T和U獨(dú)立地是-NR-、-O-、-CRR’-或單鍵，并且u是0到3的整數(shù)。作為替代，在芳基或雜芳基環(huán)的相鄰原子上的兩個取代基可以任選地被式-A-(CH2)r-B-的取代基置換，其中A和B獨(dú)立地是-CRR’-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR’-或單鍵，并且r是1到4的整數(shù)。如此形成的新環(huán)的單鍵之一可任選地被雙鍵所替代。作為替代，在芳基或雜芳基環(huán)的相鄰原子上的兩個取代基可以任選地被式-(CRR’)z-X-(CR”R”’)d-的取代基置換，其中z和d獨(dú)立地是0到3的整數(shù)，且X是-O-、-NR’-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-或-S(O)2NR’-。取代基R、R’、R”和R”’優(yōu)選獨(dú)立地選自氫或被取代的或未被取代的(C1-C6)烷基。
本文使用的術(shù)語“雜原子”意在包括氧(O)、氮(N)、硫(S)和硅(Si)。
本文使用的因子VII肽既是指因子VII肽又是指因子VIIa肽。該術(shù)語泛指這些肽的變體和突變體，包括附加、刪除、置換和融合蛋白突變體在內(nèi)。當(dāng)既使用凝血因子VII又使用凝血因子VIIa時，這一使用意在舉例說明“因子VII肽”類別中的兩種物質(zhì)。
本發(fā)明意在包括本發(fā)明化合物的鹽，其根據(jù)本文所述化合物上存在的特定取代基，用相對無毒的酸或堿制備而成。當(dāng)本發(fā)明的化合物包含相對酸性的官能度時，可通過使中性形式的這種化合物與足夠量的所需堿(其不與其它物質(zhì)混合或在適當(dāng)?shù)亩栊匀軇┲?接觸獲得堿加成鹽。堿加成鹽的實(shí)例包括鈉、鉀、鋰、鈣、銨、有機(jī)氨基或鎂的鹽，或類似的鹽。當(dāng)本發(fā)明的化合物包含相對堿性的官能度時，可通過使中性形式的這種化合物與足夠量的所需酸(其不與其它物質(zhì)混合或在適當(dāng)?shù)亩栊匀軇┲?接觸獲得酸加成鹽。酸加成鹽的實(shí)例包括從無機(jī)酸如鹽酸、氫溴酸、硝酸、碳酸、一氫碳酸、磷酸、一氫磷酸、二氫磷酸、硫酸、一氫硫酸、氫碘酸或亞磷酸等得到的鹽以及從相對無毒的有機(jī)酸如乙酸、丙酸、異丁酸、馬來酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富馬酸、乳酸、扁桃酸、酞酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、枸櫞酸、酒石酸、甲磺酸等等得到的鹽。還包括氨基酸的鹽如精氨酸鹽等，和有機(jī)酸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等等的鹽(例如，參見，Berge等人，“Pharmaceutical Salts”，Journal of PharmaceuticalScience 661-19(1977))。本發(fā)明的某些具體化合物既包含堿性官能度又包括酸性官能度，這使得該化合物被轉(zhuǎn)化為堿或酸加成鹽。
優(yōu)選使鹽接觸堿或酸并通過常規(guī)方式分離母體化合物而再生成中性形式的所述化合物。所述化合物的母體形式在某些物理性質(zhì)諸如在極性溶劑中的溶解度方面與各種鹽形式是不同的。
本文使用的“鹽抗衡離子”是指當(dāng)本發(fā)明化合物的部分之一帶負(fù)電荷(如COO-)時與本發(fā)明的化合物結(jié)合的帶正電荷的離子。鹽抗衡離子的實(shí)例包括H+、H3O+、銨、鉀、鈣、鋰、鎂和鈉。
本文使用的術(shù)語“CMP-SA-PEG”是與包括聚乙二醇部分的唾液酸相綴合的胞苷一磷酸分子。如果不具體說明聚乙二醇鏈的長度，則任何PEG鏈長都是可能的(例如1kD、2kD、5kD、10kD、20kD、30kD、40kD)。示例性CMP-SA-PEG是方案1中的化合物5。
I.引言 為了改善用于治療性目的的重組肽的有效性，本發(fā)明提供了糖基化肽和非糖基化肽與修飾基團(tuán)的綴合物。修飾基團(tuán)可以選自聚合物修飾基團(tuán)諸如例如PEG(m-PEG)、PPG(m-PPG)等，治療性部分，診斷性部分，靶向部分等等。肽的修飾，例如用水溶性聚合物修飾基團(tuán)的修飾，可以改善重組肽在患者循環(huán)中的穩(wěn)定性和保留時間和/或降低重組肽的抗原性。
本發(fā)明的肽綴合物可以由被修飾的糖與糖基化肽或非糖基化肽通過酶促連接形成。糖基化位點(diǎn)和/或被修飾的糖基基團(tuán)為攜帶修飾基團(tuán)的被修飾的糖與肽的綴合提供了位點(diǎn)，例如通過糖綴合。
本發(fā)明的方法還使得有可能裝配具有實(shí)質(zhì)上均一的衍生化模式的肽綴合物和糖肽綴合物。用于本發(fā)明的酶通常對于肽的特定氨基酸殘基、氨基酸殘基的組合、特定的糖基殘基或糖基殘基的組合具有選擇性。該方法還可實(shí)際用于肽綴合物的大規(guī)模生產(chǎn)。因此，本發(fā)明的方法提供了大規(guī)模制備具有預(yù)先選定的均一的衍生化模式的肽綴合物的實(shí)用手段。該方法特別好地適合于修飾治療性肽，包括但不限于在細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞(例如，哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞或原核細(xì)胞)或轉(zhuǎn)基因植物或動物中產(chǎn)生期間被不完全糖基化的糖肽。
本發(fā)明還提供了具有增加的治療半衰期的糖基化和非糖基化肽的綴合物，這是由于例如清除速率降低或由免疫或網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)進(jìn)行的攝取速率降低所導(dǎo)致的。另外，本發(fā)明的方法提供了用于掩蔽肽上的抗原決定簇從而降低或消除針對該肽的宿主免疫應(yīng)答的手段。靶向劑的選擇性連接還可用于使肽靶向于對該特定靶向劑特異性的特定的組織或細(xì)胞表面受體。
確定用于制備帶有水溶性聚合物的肽綴合物的最佳條件例如包括優(yōu)化許多參數(shù)，其取決于肽和水溶性聚合物的同一性。例如，當(dāng)聚合物是聚乙二醇如支化聚乙二醇時，優(yōu)選地在反應(yīng)中所用的聚合物的量和反應(yīng)混合物的可歸因于聚合物的存在的粘度之間建立平衡如果聚合物過于高度濃縮，則反應(yīng)混合物變得粘稠，減慢了物質(zhì)轉(zhuǎn)移和反應(yīng)的速率。
另外，盡管直覺上顯然可加入過量的酶，但是本發(fā)明人認(rèn)為，當(dāng)酶存在太過量時，過量的酶變?yōu)槲廴疚?，其除去需要額外的純化步驟和材料并且不必要地增加了最終產(chǎn)物的成本。
另外，通常希望生產(chǎn)出具有受控修飾水平的肽。在有些情況下，希望優(yōu)先附加一種被修飾的糖。在其它情況中，希望優(yōu)先附加兩種被修飾的糖。因此，優(yōu)選控制反應(yīng)條件以影響修飾基團(tuán)與肽的綴合程度。
本發(fā)明提供了使具有所需綴合水平的肽的收率最大化的條件。在本發(fā)明的示例性實(shí)施方案中的條件也考慮了各種試劑和材料的花費(fèi)和純化產(chǎn)物所必需的時間本文所述的反應(yīng)條件被最佳化以提供優(yōu)異收率的所需產(chǎn)物，同時使昂貴試劑的浪費(fèi)最小化。
II.物質(zhì)/肽綴合物的組成 在第一方面，本發(fā)明提供了在被修飾的糖和肽之間的綴合物。本發(fā)明還提供了在修飾基團(tuán)和肽之間的綴合物。肽綴合物可具有若干形式之一。在示例性實(shí)施方案中，肽綴合物可以包括肽和通過糖基連接基團(tuán)與肽的氨基酸連接的修飾基團(tuán)。在另一個示例性實(shí)施方案中，肽綴合物可以包括肽和通過糖基連接基團(tuán)與肽的糖基殘基連接的修飾基團(tuán)。在另一個示例性實(shí)施方案中，肽綴合物可以包括肽和既連接于糖肽碳水化合物又直接連接于肽骨架的氨基酸殘基的糖基連接基團(tuán)。在又一個示例性實(shí)施方案中，肽綴合物可以包括肽和直接連接于肽的氨基酸殘基的修飾基團(tuán)。在這一實(shí)施方案中，肽綴合物可不包括糖基基團(tuán)。在這些實(shí)施方案中的任一方案中，肽可被糖基化或可不被糖基化。
本發(fā)明的綴合物代表性地對應(yīng)于以下通式
其中符號a、b、c、d和s代表正的非零整數(shù)；以及t是0或正整數(shù)?！霸噭被蛐揎椈鶊F(tuán)可以是治療劑，生物活性物質(zhì)，可檢測標(biāo)記物，聚合物修飾基團(tuán)諸如水溶性聚合物(例如，PEG，m-PEG，PPG和m-PPG)等等。“試劑”或修飾基團(tuán)可以是肽，例如酶、抗體、抗原等等。連接體可以是下文所述的廣泛系列連接基團(tuán)中的任一種。作為替代，連接體可以是單鍵或“零級連接體”。
II.A.肽 在肽綴合物中的肽是選自圖7中所示的肽的成員。在這些情況下，在肽綴合物中的肽是選自以下的成員骨形態(tài)發(fā)生蛋白(例如，BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-13、BMP-14、BMP-15)，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白(例如，NT-3、NT-4、NT-5)，生長分化因子(例如，GDF-5)，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系產(chǎn)生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)，腦產(chǎn)生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，神經(jīng)生長因子(NGF)，馮·維勒布蘭德氏因子(vWF)蛋白酶，因子VII，因子VIIa，因子VIII，因子IX，因子X，因子XI，B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII，具有全長因子VIII的vWF-因子VIII融合蛋白，具有B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII的vWF-因子VIII融合蛋白，紅細(xì)胞生成素(EPO)，粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，干擾素α、干擾素β、干擾素γ、α1-抗胰蛋白酶(ATT，或α-1蛋白酶抑制劑，葡糖腦苷脂酶，組織型血纖維蛋白溶解酶原活化劑(TPA)，白細(xì)胞介素-2(IL-2)，尿激酶，人脫氧核糖核酸酶，胰島素，乙型肝炎表面蛋白(HbsAg)，人生長激素，TNF受體-IgG Fc區(qū)域融合蛋白(EnbrelTM)，抗-HER2單克隆抗體(HerceptinTM)，呼吸道合胞病毒的蛋白F的單克隆抗體(SynagisTM)，TNF-α的單克隆抗體(RemicadeTM)，糖蛋白IIb/IIIa的單克隆抗體(ReoproTM)，CD20的單克隆抗體(RituxanTM)，抗凝血酶III(AT III)，人絨毛膜促性腺激素(hCG)，α-半乳糖苷酶(FabrazymeTM)，α-艾杜糖醛酸酶(AldurazymeTM)，促卵泡激素，β-葡糖苷酶，抗-TNF-α單克隆抗體，胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)，胰高血糖素樣肽-2(GLP-2)，β-葡糖苷酶，α-半乳糖苷酶A和成纖維細(xì)胞生長因子。在某些實(shí)施方案中，在肽綴合物中的肽是凝血因子VIII。在其它實(shí)施方案中，在肽綴合物中的肽是干擾素α。
在示例性實(shí)施方案中，聚合物修飾基團(tuán)具有包括下式所示部分的結(jié)構(gòu)
在示例性實(shí)施方案中，m和n是獨(dú)立地選自以下的整數(shù)約1到約5000，優(yōu)選約100到約4000，更優(yōu)選約200到約3000，更優(yōu)選約300到約2000，和更優(yōu)選約400到約1000。在示例性實(shí)施方案中，m和n是獨(dú)立地選自以下的整數(shù)約1到約500。在示例性實(shí)施方案中，m和n是獨(dú)立地選自以下的整數(shù)約1到約70、約70到約150、約150到約250、約250到約375和約375到約500。在示例性實(shí)施方案中，m和n是獨(dú)立地選自以下的整數(shù)約10到約35、約45到約65、約95到約130、約210到約240、約310到約370和約420到約480。在示例性實(shí)施方案中，m和n是選自約15到約30的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，m和n是選自約50到約65的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，m和n是選自約100到約130的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，m和n是選自約210到約240的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，m和n是選自約310到約370的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，m和n是選自約430到約470的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，A1和A2各自是選自-OH和-OCH3的成員。
根據(jù)本實(shí)施方案的示例性的聚合物修飾基團(tuán)包括以下所示部分
在示例性實(shí)施方案中，其中修飾基團(tuán)是支化水溶性聚合物諸如如上所述的那些，通常優(yōu)選唾液酸酶的濃度是反應(yīng)混合物的約1.5到約2.5U/L。更優(yōu)選唾液酸酶的量是約2U/L。
在另一個示例性實(shí)施方案中，約5到約9克的肽底物接觸上述量的唾液酸酶。
被修飾的糖以約1克到約6克，優(yōu)選約3克到約4克的量存在于反應(yīng)混合物中。通常優(yōu)選保持具有支化水溶性聚合物修飾部分例如如上所示部分的被修飾的糖的濃度低于約0.5mM。
在某些實(shí)施方案中，修飾基團(tuán)是支化聚氧化烯烴，例如聚乙二醇，具有的分子量為約20kD到約60kD，更優(yōu)選約30kD到約50kD，和甚至更優(yōu)選約40kD。在其它實(shí)施方案中，修飾基團(tuán)是支化聚氧化烯烴，例如聚乙二醇，具有的分子量為至少約80kD，優(yōu)選至少約100kD，更優(yōu)選至少約120kD，至少約140kD或至少約160kD。在又一個實(shí)施方案中，支化聚氧化烯烴例如聚乙二醇為至少約200kD，諸如至少約80kD到至少約200kD，包括至少約160kD和至少約180kD在內(nèi)。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解的，聚合物的分子量常常是多分散性的，因此，在分子量背景下的措詞“約”優(yōu)選包括在所述數(shù)值左右的一定范圍內(nèi)的值。例如，優(yōu)選的具有約40kD分子量的修飾基團(tuán)是具有約35kD到約45kD的分子量的修飾基團(tuán)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解的是，對如上所述的支化PEG結(jié)構(gòu)的引述僅僅是用于清楚示例的目的，PEG可以被實(shí)質(zhì)上任何聚合物部分所替代，所述任何聚合物部分包括但不限于那些在本文所述的“聚合物部分”的定義中闡述的那些物質(zhì)。
關(guān)于糖基轉(zhuǎn)移酶的濃度，在本發(fā)明的使用如上所述的修飾基團(tuán)的優(yōu)選方案中，糖基轉(zhuǎn)移酶肽的比為約40μg/mL轉(zhuǎn)移酶約200μM肽。
II.B.被修飾的糖 在示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽，諸如凝血因子VIII，干擾素α和圖7中所列舉的肽，與被修飾的糖反應(yīng)，從而形成肽綴合物。被修飾的糖包括“糖供體部分”以及“糖轉(zhuǎn)移部分”。糖供體部分是被修飾的糖的通過糖基部分或氨基酸部分連接于肽以形成本發(fā)明的綴合物的任何部分。糖供體部分包括那些原子，這些原子在其從被修飾的糖轉(zhuǎn)移到肽綴合物的糖基連接基團(tuán)期間發(fā)生化學(xué)變化。糖轉(zhuǎn)移部分是被修飾的糖的不連接于肽形成本發(fā)明的綴合物的任何部分。例如，本發(fā)明的被修飾的糖是PEG化糖核苷酸、PEG-唾液酸CMP。對于PEG-唾液酸CMP，糖供體部分或PEG唾液酸基供體部分包括PEG-唾液酸，而糖轉(zhuǎn)移部分或唾液酸基轉(zhuǎn)移部分包括CMP。
在本發(fā)明的被修飾的糖中，糖基部分優(yōu)選是糖類、脫氧糖類、氨基糖類或N-酰基糖類。術(shù)語“糖類”及其等同術(shù)語“糖基(saccharyl)”、“糖”和“糖基(glycosyl)”是指單體、二聚物、低聚物和聚合物。糖部分還可被修飾基團(tuán)進(jìn)行官能化。修飾基團(tuán)典型地通過與糖上的胺、巰基或羥基部分例如伯羥基部分綴合而綴合于糖基部分上。在示例性實(shí)施方案中，修飾基團(tuán)通過糖上的胺部分例如通過在胺與修飾基團(tuán)的反應(yīng)性衍生物進(jìn)行反應(yīng)期間形成的酰胺、氨基甲酸酯或脲進(jìn)行連接。
任何糖基部分可被用作被修飾的糖的糖供體部分。糖基部分可以是已知的糖例如甘露糖、半乳糖或葡萄糖，或具有已知糖的立體化學(xué)的物質(zhì)。這些被修飾的糖的通式為

以及
可用于形成本發(fā)明的組分的其它糖基部分包括但不限于巖藻糖和唾液酸，以及氨基糖類例如葡糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺、唾液酸的5-胺類似物等等。糖基部分可以是在自然界中存在的結(jié)構(gòu)或者其可以經(jīng)過修飾以提供用于綴合修飾基團(tuán)的部位。例如，在一個實(shí)施方案中，被修飾的糖提供了其中9-羥基部分被胺置換的唾液酸衍生物。胺容易地被所選擇的修飾基團(tuán)的活化類似物所衍生化。
本發(fā)明的被修飾的糖的實(shí)例在PCT專利申請No.PCT/US05/002522中被描述，其作為參考并入本文。
在另一個示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明采用的被修飾的糖中的6-羥基位置被轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的胺部分，其攜帶如上文所述的那些連接體-修飾基團(tuán)盒?？杀挥米鳛檫@些被修飾的糖的核心的示例性糖基基團(tuán)包括Glu、Gal、GalNAc、Glc、GlcNAc、Fuc、Xyl、Man等等。根據(jù)這一實(shí)施方案的代表性的被修飾的糖如下式所示
其中R11-R14是獨(dú)立地選自H、OH、C(O)CH3、NH和NH C(O)CH3的成員。R10是與另一個糖基殘基(-O-糖基)或與凝血因子VII/凝血因子VIIa肽(-NH-(凝血因子VII/凝血因子VIIa))的氨基酸連接的連接體。R14是OR1、NHR1或NH-L-R1。R1和NH-L-R1的定義如上所述。
II.C.糖基連接基團(tuán) 在示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在本發(fā)明的被修飾的糖與肽之間形成的肽綴合物。在另一個示例性實(shí)施方案中，當(dāng)被修飾的糖上的修飾基團(tuán)包括以下部分時
在肽綴合物中的肽是選自圖7中所示的肽中的成員。在又一個示例性實(shí)施方案中，在肽綴合物中的肽是選自以下的成員骨形態(tài)發(fā)生蛋白(例如，BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-13、BMP-14、BMP-15)，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白(例如，NT-3、NT-4、NT-5)，生長分化因子(例如，GDF-5)，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系產(chǎn)生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)，腦產(chǎn)生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，神經(jīng)生長因子(NGF)，馮·維勒布蘭德氏因子(vWF)蛋白酶，凝血因子VIII，凝血因子VIIa，凝血因子VII，凝血因子IX，凝血因子X，凝血因子XI，B-結(jié)構(gòu)域缺失的凝血因子VIII，具有全長凝血因子VIII的vWF-凝血因子VIII融合蛋白，具有B-結(jié)構(gòu)域缺失的凝血因子VIII的vWF-凝血因子VIII融合蛋白，紅細(xì)胞生成素(EPO)，粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，干擾素α、干擾素β、干擾素γ、α1-抗胰蛋白酶(ATT，或α-1蛋白酶抑制劑，葡糖腦苷脂酶，組織型血纖維蛋白溶解酶原活化劑(TPA)，白細(xì)胞介素-2(IL-2)，尿激酶，人脫氧核糖核酸酶，胰島素，乙型肝炎表面蛋白(HbsAg)，人生長激素，TNF受體-IgG Fc區(qū)域融合蛋白(EnbrelTM)，抗-HER2單克隆抗體(HerceptinTM)，呼吸道合胞病毒的蛋白F的單克隆抗體(SynagisTM)，TNF-α的單克隆抗體(RemicadeTM)，糖蛋白IIb/IIIa的單克隆抗體(ReoproTM)，CD20的單克隆抗體(RituxanTM)，抗凝血酶III(AT III)，人絨毛膜促性腺激素(hCG)，α-半乳糖苷酶(FabrazymeTM)，α-艾杜糖醛酸酶(AldurazymeTM)，促卵泡激素，β-葡糖苷酶，抗-TNF-α單克隆抗體，胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)，胰高血糖素樣肽-2(GLP-2)，β-葡糖苷酶，α-半乳糖苷酶A和成纖維細(xì)胞生長因子。在某些實(shí)施方案中，所述肽是凝血因子VIII或干擾素α。在這一實(shí)施方案中，被修飾的糖的糖供體部分(例如糖基部分和修飾基團(tuán))變成“糖基連接基團(tuán)”?！疤腔B接基團(tuán)”可替代地被稱作糖基部分，其被插入在肽和修飾基團(tuán)之間。
在示例性實(shí)施方案中，聚合物修飾基團(tuán)包括具有下式所示結(jié)構(gòu)的部分
在示例性實(shí)施方案中被修飾的糖上的修飾基團(tuán)包括以下所示部分
在示例性實(shí)施方案中，A1和A2各自是選自-OH和-OCH3的成員。
根據(jù)這一實(shí)施方案的示例性的聚合物修飾基團(tuán)包括以下所示的部分
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易理解的，在上面所示的每一結(jié)構(gòu)中的PEG部分可以被任何其它聚合物部分所代替，所述任何其它聚合物部分包括但不限于在本文中被定義為“聚合物部分”的那些物質(zhì)。
由于可用于附加和/或修飾肽上的糖基殘基的方法的多樣性，糖基連接基團(tuán)可以實(shí)質(zhì)上具有任何結(jié)構(gòu)。在下面的討論中，通過參考被選擇的呋喃糖和吡喃糖的衍生物的使用來對本發(fā)明進(jìn)行說明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，該討論的焦點(diǎn)是用于清楚示例的目的，并且所述的結(jié)構(gòu)和組分通常適用于所有類別的糖基連接基團(tuán)和被修飾的糖。糖基連接基團(tuán)可實(shí)際上包括任何的單糖或寡糖。糖基連接基團(tuán)可以通過側(cè)鏈或者通過肽骨架連接于氨基酸。作為替代，糖基連接基團(tuán)可以通過糖基部分連接于肽。該糖基部分可以是肽上的O-連接的或N-連接的聚糖結(jié)構(gòu)的一部分。
在示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明提供肽綴合物，其包括完整的糖基連接基團(tuán)，該基團(tuán)具有選自以下所示的式子


以及
在式I和Ia中，R2是H、CH2OR7、COOR7或OR7，其中R7代表H、被取代的或未被取代的烷基或被取代的或未被取代的雜烷基。當(dāng)COOR7是羧酸或羧酸根時，兩種形式都由單個結(jié)構(gòu)COO-或COOH的命名來表示。在式I、Ia、II或IIa中，符號R3、R4、R5、R6和R6’獨(dú)立地表示H、被取代的或未被取代的烷基、OR8、NHC(O)R9。下標(biāo)d是0或1。R8和R9獨(dú)立地選自H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的雜烷基、唾液酸或多聚唾液酸。R3、R4、R5、R6或R6’中至少之一包括修飾基團(tuán)。該修飾基團(tuán)可以是聚合物修飾部分，例如通過鍵或連接基團(tuán)連接的PEG。在示例性實(shí)施方案中，R6和R6’與它們所連接的碳一起是唾液酸的pyruvyl側(cè)鏈的組分。在另一個示例性實(shí)施方案中，pyruvyl側(cè)鏈被聚合物修飾基團(tuán)官能化。在另一個示例性實(shí)施方案中，R6和R6’與它們所連接的碳一起是唾液酸的側(cè)鏈的組分并且聚合物修飾基團(tuán)是R5的部分。
在示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明采用了下式所示的糖基連接基團(tuán)
其中J是糖基部分，L是鍵或連接體和R1是修飾基團(tuán)，例如聚合物修飾基團(tuán)。示例性的鍵是在糖基部分上的NH2部分與修飾基團(tuán)上的具有互補(bǔ)反應(yīng)活性的基團(tuán)之間形成的那些。例如，當(dāng)R1包括羧酸部分時，該部分可被活化并與糖基殘基上的NH2部分連接，產(chǎn)生具有結(jié)構(gòu)NHC(O)R1的鍵。J優(yōu)選是這樣的糖基部分，該糖基部分是“完整的”，沒有因?yàn)楸┞队谑惯拎腔蜻秽墙Y(jié)構(gòu)裂解的條件下例如氧化條件例如高碘酸鈉條件下而發(fā)生降解。
示例性的連接體包括烷基和雜烷基部分。連接體包括連接基團(tuán)，例如基于?；倪B接基團(tuán)，例如，-C(O)NH-、-OC(O)NH-等等。連接基團(tuán)是在本發(fā)明的物質(zhì)的組分之間形成的鍵，例如在糖基部分和連接體(L)之間或在連接體和修飾基團(tuán)(R1)之間形成的鍵。其它示例性的連接基團(tuán)是醚、硫醚和胺。例如，在一個實(shí)施方案中，連接體是氨基酸殘基，諸如甘氨酸殘基。甘氨酸的羧酸部分通過與糖基殘基上的胺反應(yīng)被轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酰胺，并且甘氨酸的胺通過與修飾基團(tuán)的被活化的羧酸或碳酸酯反應(yīng)被轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酰胺或氨基甲酸酯。
NH-L-R1的示例性物質(zhì)具有下式 -NH{C(O)(CH2)aNH}s{C(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNH}tR1，其中下標(biāo)s和t獨(dú)立地是0或1。下標(biāo)a、b和d獨(dú)立地是0到20的整數(shù)，和c是1到2500的整數(shù)。其它類似的連接體基于其中-NH部分被另一個基團(tuán)例如-S、-O或-CH2替代的物質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解的是，對應(yīng)于下標(biāo)s和t的括號內(nèi)部分中的一種或多種可被替換為被取代的或未被取代的烷基或雜烷基部分。
更具體地說，本發(fā)明采用了其中NH-L-R1是以下結(jié)構(gòu)的化合物NHC(O)(CH2)aNHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1、NHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1、NHC(O)O(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1、NH(CH2)aNHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1、NHC(O)(CH2)aNHR1、NH(CH2)aNHR1和NHR1。在這些式中，下標(biāo)a、b和d獨(dú)立地選自0到20，優(yōu)選1到5的整數(shù)。下標(biāo)c是1到約2500的整數(shù)。
在示例性實(shí)施方案中，選擇c從而使得PEG部分的分子量為約1kD、5kD、10kD、15kD、20kD、25kD、30kD、35kD、40kD或45kD。
為了方便目的，在本節(jié)其余處的糖基連接基團(tuán)基于唾液酸基部分。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解其它的糖基部分例如甘露糖基、半乳糖苷、葡糖基或藻巖糖基可代替唾液酸基部分被使用。
在示例性實(shí)施方案中，糖基連接基團(tuán)是完整的糖基連接基團(tuán)，其中形成連接基團(tuán)的一個或多個糖基部分不被化學(xué)(例如，偏高碘酸鈉)或酶促(例如，氧化酶)過程所降解。被選擇的本發(fā)明的綴合物包括連接于氨基糖類例如甘露糖胺、葡糖胺、半乳糖胺、唾液酸等的胺部分的修飾基團(tuán)。根據(jù)該模體的示例性的修飾基團(tuán)-完整的糖基連接基團(tuán)盒基于唾液酸結(jié)構(gòu)，諸如具有下式的那些

以及
在上式中，R1和L的定義如上所述。關(guān)于示例性的R1基團(tuán)的結(jié)構(gòu)的另外的細(xì)節(jié)在下文被提供。
在又一個示例性的實(shí)施方案中，綴合物在肽和被修飾的糖之間形成，其中修飾基團(tuán)通過在被修飾的糖的6-碳位置處的連接體進(jìn)行連接。因此，根據(jù)這一實(shí)施方案的示例性的糖基連接基團(tuán)具有下式
其中各基團(tuán)如上文所討論。糖基連接基團(tuán)包括但不限于葡萄糖、葡糖胺、N-乙酰基-葡糖胺、半乳糖、半乳糖胺、N-乙?；?半乳糖胺、甘露糖、甘露糖胺、N-乙酰基-甘露糖胺等等。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括以下糖基連接基團(tuán)的肽綴合物
其中D是選自-OH和R1-L-HN-的成員；G是選自H和R1-L-和-C(O)(C1-C6)烷基的成員；R1是包括直鏈或支化聚乙二醇?xì)埢牟糠?；以及L是連接體，例如鍵(“零級”)、被取代的或未被取代的烷基和被取代的或未被取代的雜烷基。在示例性實(shí)施方案中，當(dāng)D是OH時G是R1-L-，和當(dāng)G是-C(O)(C1-C6)烷基時，D是R1-L-NH-。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括以下糖基連接基團(tuán)的肽綴合物
D是選自-OH和R1-L-HN-的成員；G是選自R1-L-和-C(O)(C1-C6)烷基-R1的成員；R1是包括選自直鏈聚乙二醇?xì)埢椭Щ垡叶細(xì)埢某蓡T的部分；以及M是選自H、鹽抗衡離子和單個負(fù)電荷的成員；L是連接體，其是選自鍵、被取代的或未被取代的烷基和被取代的或未被取代的雜烷基的成員。在示例性實(shí)施方案中，當(dāng)D是OH時，G是R1-L-。在另一個示例性實(shí)施方案中，當(dāng)G是-C(O)(C1-C6)烷基時，D是R1-L-NH-。
在本發(fā)明的任何化合物中，COOH基團(tuán)可以替代地是COOM，其中M是選自H、負(fù)電荷和鹽抗衡離子的成員。
本發(fā)明提供了包括下式的糖基連接基團(tuán)的肽綴合物
其中D和G的定義如上所述。
在其它實(shí)施方案中，糖基連接基團(tuán)如下式所示
其中D和G如上所述且下標(biāo)t是0或1。
在又一個示例性實(shí)施方案中，糖基連接基團(tuán)如下式所示
其中D和G如上所述且下標(biāo)t是0或1。
在又一個實(shí)施方案中，糖基連接基團(tuán)如下式所示
其中D和G如上所述且下標(biāo)p代表1到10的整數(shù)；以及a是0或1。
在另一個示例性實(shí)施方案中，肽綴合物包括選自下式所示的糖基部分














以及
其中下標(biāo)a和連接體La如上文所討論。下標(biāo)p是1到10的整數(shù)。下標(biāo)t和a獨(dú)立地選自0或1。這些基團(tuán)中的每一個可以作為如上所述的單-、二-、三-和四-觸角糖類結(jié)構(gòu)的組分被包括。AA是肽的氨基酸殘基。本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解的在這些式中的PEG部分可以被其它的無反應(yīng)性基團(tuán)和聚合物部分所替代。示例性的聚合物包括聚氧化烯烴家族的那些。無反應(yīng)性基團(tuán)包括被認(rèn)為在生理學(xué)pH條件下基本上是無反應(yīng)性的、中性的和/或穩(wěn)定的的那些基團(tuán)，例如為H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的雜烷基等等。示例性的聚合物部分包括在下式IIIa及其示例中所示的支化結(jié)構(gòu)。
在示例性實(shí)施方案中，PEG部分的分子量為約20kD。在另一個示例性實(shí)施方案中，PEG部分的分子量為約5kD。在另一個示例性實(shí)施方案中，PEG部分的分子量為約10kD。在另一個示例性實(shí)施方案中，PEG部分的分子量為約40kD。在其它實(shí)施方案中，修飾基團(tuán)是支化聚氧化烯烴，例如聚乙二醇，具有的分子量為至少約80kD，優(yōu)選至少約100kD，更優(yōu)選至少約120kD、至少約140kD或至少約160kD。在又一個實(shí)施方案中，支化聚氧化烯烴，例如聚乙二醇具有的分子量為至少約200kD，諸如至少約80kD到至少約200kD，包括至少約160kD和至少約180kD。在示例性實(shí)施方案中，支化聚合物自身連接于支化部分(例如，半胱氨酸、絲氨酸、賴氨酸和賴氨酸的低聚物)。
在示例性實(shí)施方案中，糖基連接基團(tuán)是基于半胱氨酸殘基的支化SA-PEG-10kD部分，并且這些糖基連接基團(tuán)中的一個或兩個共價連接于肽。在另一個示例性實(shí)施方案中，糖基連接基團(tuán)是基于賴氨酸殘基的支化SA-PEG-10kD部分，并且這些糖基連接基團(tuán)中的一個或兩個共價連接于肽。在示例性實(shí)施方案中，糖基連接基團(tuán)是基于半胱氨酸殘基的支化SA-PEG-10kD部分，并且這些糖基連接基團(tuán)中的一個或兩個共價連接于肽。在示例性實(shí)施方案中，糖基連接基團(tuán)是基于賴氨酸殘基的支化SA-PEG-10kD部分，并且這些糖基連接基團(tuán)中的一個或兩個共價連接于肽。在示例性實(shí)施方案中，糖基連接基團(tuán)是基于半胱氨酸殘基的支化SA-PEG-5kD部分，并且這些糖基連接基團(tuán)中的一個、兩個或三個共價連接于肽。在示例性實(shí)施方案中，糖基連接基團(tuán)是基于賴氨酸殘基的支化SA-PEG-5kD部分，并且這些糖基連接基團(tuán)中的一個、兩個或三個共價連接于肽。在示例性實(shí)施方案中，糖基連接基團(tuán)是基于半胱氨酸殘基的支化SA-PEG-40kD部分，并且這些糖基連接基團(tuán)中的一個或兩個共價連接于肽。在示例性實(shí)施方案中，糖基連接基團(tuán)是基于賴氨酸殘基的支化SA-PEG-40kD部分，并且這些糖基連接基團(tuán)中的一個或兩個共價連接于肽。
在另一個示例性實(shí)施方案中，肽綴合物包括選自下式所示的糖基部分


以及
其中R2、R3、R4、R5或R6中至少之一具有作為選自以下的成員的結(jié)構(gòu)
其中各變量的定義如上所述。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，如上所述的支化PEG結(jié)構(gòu)僅僅用于清楚示例的目的，PEG可以實(shí)質(zhì)上被任何聚合物部分所替代，所述任何聚合物部分包括但不限于在本文的“聚合物部分”的定義中所述的那些物質(zhì)。
在示例性實(shí)施方案中，R2、R3、R4、R5或R6中至少之一具有下式所示的結(jié)構(gòu)
在示例性實(shí)施方案中，A1和A2各自選自-OH和-OCH3。
根據(jù)這一實(shí)施方案的示例性的聚合物修飾基團(tuán)包括
在示例性實(shí)施方案中，R2、R3、R4、R5或R6中僅有一個具有包括如上描述的修飾基團(tuán)的結(jié)構(gòu)。
在另一個示例性實(shí)施方案中，肽綴合物包括選自下式所示的糖基部分


以及
其中R2、R3、R4、R5或R6的定義如上所述。
在另一個示例性實(shí)施方案中，肽綴合物包括選自下式所示的糖基部分


以及
其中L-(R1)w是選自以下的成員
其中各變量的定義如上所述。
在示例性實(shí)施方案中，L-(R1)w具有下式所示結(jié)構(gòu)
在示例性實(shí)施方案中，A1和A2各自選自-OH和-OCH3。
根據(jù)這一實(shí)施方案的示例性的聚合物修飾基團(tuán)包括
在示例性實(shí)施方案中，m和n是獨(dú)立地選自約1到約1000的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，m和n是獨(dú)立地選自約1到約500的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，m和n是獨(dú)立地選自約1到約70、約70到約150、約150到約250、約250到約375和約375到約500的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，m和n是獨(dú)立地選自約10到約35、約45到約65、約95到約130、約210到約240、約310到約370和約420到約480的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，m和n是選自約15到約30的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，m和n是選自約50到約65的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，m和n是選自約100到約130的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，m和n是選自約210到約240的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，m和n是選自約310到約370的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，m和n是選自約430到約470的整數(shù)。
在另一個示例性實(shí)施方案中，肽綴合物包括選自下式所示的糖基部分


以及
其中各變量的定義如上所述。
在另一個示例性實(shí)施方案中，根據(jù)這一實(shí)施方案的物質(zhì)包括



以及
其中各變量如上文所討論。
在示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明的糖PEG化肽綴合物選自下式

以及
其中各變量的定義如上所述。
在上式中，下標(biāo)t是0到1的整數(shù)，和下標(biāo)p是1到10的整數(shù)。符號R15’表示H，OH(例如，Gal-OH)，唾液酸基部分，唾液酸基連接基團(tuán)(即，唾液酸基連接基團(tuán)-聚合物修飾基團(tuán)(Sia-L-R1)，或連接有聚合物修飾的唾液酸基部分的唾液酸基部分(例如，Sia-Sia-L-R1)(“Sia-Siap”))，半乳糖基部分，半乳糖基連接基團(tuán)(即，半乳糖基連接基團(tuán)-聚合物修飾基團(tuán)(Gal-L-R1)，或連接有聚合物修飾的半乳糖基部分的唾液酸基部分(例如，Sia-Gal-L-R1)(“Sia-Galp”))，半乳糖胺基部分，半乳糖胺基連接基團(tuán)(即，半乳糖胺基連接基團(tuán)-聚合物修飾基團(tuán)(GalNAc-L-R1)，或連接有聚合物修飾的半乳糖胺基部分的唾液酸基部分(例如，Sia-GalNAc-L-R1)(“Sia-GalNAcp”))，葡萄糖基部分，葡萄糖基連接基團(tuán)(即，葡萄糖基連接基團(tuán)-聚合物修飾基團(tuán)(Glc-L-R1)，或連接有聚合物修飾的葡萄糖基部分的唾液酸基部分(例如，Sia-Glc-L-R1)(“Sia-Glcp”))，葡糖胺基部分，葡糖胺基連接基團(tuán)(即，葡糖胺基連接基團(tuán)-聚合物修飾基團(tuán)(GlcNAc-L-R1)，或連接有聚合物修飾的葡糖胺基部分的唾液酸基部分(例如，Sia-GlcNAc-L-R1)(“Sia-GlcNAcp”))，甘露糖基部分，甘露糖基連接基團(tuán)(即，甘露糖基連接基團(tuán)-聚合物修飾基團(tuán)(Man-L-R1)，或連接有聚合物修飾的甘露糖基部分的唾液酸基部分(例如，Sia-Man-L-R1)(“Sia-Manp”))，巖藻糖基部分，巖藻糖基連接基團(tuán)(即，巖藻糖基連接基團(tuán)-聚合物修飾基團(tuán)(Fuc-L-R1)，或連接有聚合物修飾的巖藻糖基部分的唾液酸基部分(例如，Sia-Fuc-L-R1)(“Sia-Fucp”))。示例性的聚合物修飾的糖基部分具有式I、Ia、II或IIa所示的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的示例性的肽綴合物包括至少一個聚糖，該聚糖具有R15’，R15’包括式I、Ia、II和IIa所示的結(jié)構(gòu)。式I、Ia、II或IIa的具有開放價的氧優(yōu)選通過糖苷鍵連接于Gal或GalNAc部分的碳上。在另一個示例性實(shí)施方案中，氧連接于在半乳糖殘基的3位處的碳上。在示例性實(shí)施方案中，被修飾的唾液酸以α2，3-連接于半乳糖殘基上。在另一個示例性實(shí)施方案中，唾液酸以α2，6-連接于半乳糖殘基上。
在示例性實(shí)施方案中，唾液酸基連接基團(tuán)是連接有聚合物修飾的唾液酸基部分的唾液酸基部分(例如，Sia-Sia-L-R1)(“Sia-Siap”)。這里，糖基連接基團(tuán)通過唾液酸基部分連接于半乳糖基部分
根據(jù)這一模體的示例性物質(zhì)通過采用形成Sia-Sia鍵的酶例如CST-II、ST8Sia-II、ST8Sia-III和ST8Sia-IV將Sia-L-R1綴合于聚糖的末端唾液酸上而制備。
在另一個示例性實(shí)施方案中，肽綴合物上的聚糖具有選自以下所述的式結(jié)構(gòu)

以及
及其組合。
在上式各式中，R15’如上文所討論。另外，本發(fā)明的示例性的肽綴合物包括至少一個聚糖，該聚糖具有R15部分，該R15部分具有式I、Ia、II或IIa所示的結(jié)構(gòu)。
在另一個示例性實(shí)施方案中，糖基連接基團(tuán)包括至少一個下式所示的糖基連接基團(tuán)

以及
其中R15是所述的唾液酸基連接基團(tuán)；以及下標(biāo)p是選自1到10的整數(shù)。
在示例性實(shí)施方案中，糖基連接部分具有下式結(jié)構(gòu)
其中b是0-1的整數(shù)。下標(biāo)s表示1-10的整數(shù)；以及下標(biāo)f表示1到2500的整數(shù)。
在示例性實(shí)施方案中，聚合物修飾基團(tuán)是PEG。在另一個示例性實(shí)施方案中，PEG部分的分子量為約20kD。在另一個示例性實(shí)施方案中，PEG部分的分子量為約5kD。在另一個示例性實(shí)施方案中，PEG部分的分子量為約10kD。在另一個示例性實(shí)施方案中，PEG部分的分子量為約40kD。在另外的實(shí)施方案中，修飾基團(tuán)是支化聚氧化烯烴，例如聚乙二醇，具有的分子量為至少約80kD，優(yōu)選至少約100kD，更優(yōu)選至少約120kD、至少約140kD或至少約160kD。在又一個實(shí)施方案中，支化聚氧化烯烴，例如聚乙二醇具有的分子量為至少約200kD，例如至少約80kD到至少約200kD，包括至少約160kD和至少約180kD。
在示例性實(shí)施方案中，糖基連接基團(tuán)是線性SA-PEG-10kD部分，并且這些糖基連接基團(tuán)中的一個或兩個共價連接于肽。在另一個示例性實(shí)施方案中，糖基連接基團(tuán)是線性SA-PEG-20kD部分，并且這些糖基連接基團(tuán)中的一個或兩個共價連接于肽。在示例性實(shí)施方案中，糖基連接基團(tuán)是線性SA-PEG-5kD部分，并且這些糖基連接基團(tuán)中的一個、兩個或三個共價連接于肽。在示例性實(shí)施方案中，糖基連接基團(tuán)是線性SA-PEG-40kD部分，并且這些糖基連接基團(tuán)中的一個或兩個共價連接于肽。
在另一個示例性實(shí)施方案中，糖基連接基團(tuán)是具有下式的唾液酸基連接基團(tuán)
在另一個示例性實(shí)施方案中，Q是選自H和CH3的成員。在另一個示例性實(shí)施方案中，其中所述糖基連接基團(tuán)具有下述結(jié)構(gòu)

以及
其中R15是所述的唾液酸基連接基團(tuán)；以及下標(biāo)p是選自1到10的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，糖基連接基團(tuán)包括下式結(jié)構(gòu)
其中下標(biāo)b是選自0和1的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，下標(biāo)s是1；以及下標(biāo)f是選自約200到約300的整數(shù)。
II.D.修飾基團(tuán) 本發(fā)明的肽綴合物包括修飾基團(tuán)。該基團(tuán)可以通過氨基酸或糖基連接基團(tuán)共價連接于肽。在另一個示例性實(shí)施方案中，當(dāng)修飾基團(tuán)包括以下所示的部分時
在肽綴合物中的肽是選自圖7中所示的肽中的成員。在另一個示例性實(shí)施方案中，在肽綴合物中的肽是選自如下物質(zhì)的成員骨形態(tài)發(fā)生蛋白(例如，BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-13、BMP-14、BMP-15)，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白(例如，NT-3、NT-4、NT-5)，生長分化因子(例如，GDF-5)，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系產(chǎn)生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)，腦產(chǎn)生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，神經(jīng)生長因子(NGF)，馮·維勒布蘭德氏因子(vWF)蛋白酶，因子VII，因子VIIa，因子VIII，因子IX，因子X，因子XI，B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII，具有全長因子VIII的vWF-因子VIII融合蛋白，具有B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII的vWF-因子VIII融合蛋白，紅細(xì)胞生成素(EPO)，粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，干擾素α、干擾素β、干擾素γ、α1-抗胰蛋白酶(ATT，或α-1蛋白酶抑制劑)，葡糖腦苷脂酶，組織型血纖維蛋白溶解酶原活化劑(TPA)，白細(xì)胞介素-2(IL-2)，尿激酶，人脫氧核糖核酸酶，胰島素，乙型肝炎表面蛋白(HbsAg)，人生長激素，TNF受體-IgG Fc區(qū)域融合蛋白(EnbrelTM)，抗-HER2單克隆抗體(HerceptinTM)，呼吸道合胞病毒的蛋白F的單克隆抗體(SynagisTM)，TNF-α的單克隆抗體(RemicadeTM)，糖蛋白IIb/IIIa的單克隆抗體(ReoproTM)，CD20的單克隆抗體(RituxanTM)，抗凝血酶III(AT III)，人絨毛膜促性腺激素(hCG)，α-半乳糖苷酶(FabrazymeTM)，α-艾杜糖醛酸酶(AldurazymeTM)，促卵泡激素，β-葡糖苷酶，抗-TNF-α單克隆抗體，胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)，胰高血糖素樣肽-2(GLP-2)，β-葡糖苷酶，α-半乳糖苷酶A和成纖維細(xì)胞生長因子?！靶揎椈鶊F(tuán)”可以包括許多結(jié)構(gòu)，包括靶向部分、治療性部分、生物分子在內(nèi)。另外，“修飾基團(tuán)”包括聚合物修飾基團(tuán)，其是可以改變肽的性質(zhì)例如改變其生物利用度或其體內(nèi)半衰期的聚合物。
在示例性實(shí)施方案中，聚合物修飾基團(tuán)具有包括下式所示的部分的結(jié)構(gòu)
在根據(jù)上式的另一個示例性實(shí)施方案中，聚合物修飾基團(tuán)包括下式所示的部分
在示例性實(shí)施方案中，A1和A2各自是選自-OH和-OCH3的成員。
根據(jù)這個實(shí)施方案的示例性的聚合物修飾基團(tuán)包括以下部分
為了方便起見，在本節(jié)其余處的修飾基團(tuán)將主要地基于聚合物修飾基團(tuán)例如水溶性聚合物和非水溶性聚合物。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，其它修飾基團(tuán)，例如靶向部分、治療性部分和生物分子，可代替聚合物修飾基團(tuán)被使用。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，如上所述的支化PEG結(jié)構(gòu)僅僅用于清楚示例的目的，PEG可以實(shí)質(zhì)上被任何聚合物部分所替代，所述任何聚合物部分包括但不限于在本文的“聚合物”的定義中所述的那些部分。
II.D.i.修飾基團(tuán)的連接體 修飾基團(tuán)的連接體用來將修飾基團(tuán)(即，聚合物修飾基團(tuán)、靶向部分、治療性部分和生物分子)連接到肽。在示例性實(shí)施方案中，聚合物修飾基團(tuán)連接于糖基連接基團(tuán)，通常通過核心上的雜原子例如氮通過連接體L進(jìn)行連接，如下所示
R1是聚合物部分和L選自鍵和連接基團(tuán)。下標(biāo)w代表選自1-6，優(yōu)選1-3和更優(yōu)選1-2的整數(shù)。示例性的連接基團(tuán)包括被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的雜烷基部分和唾液酸。連接體的示例性組成部分是?；糠?。
本發(fā)明的示例性化合物具有以上式I、Ia、II或IIa的結(jié)構(gòu)，其中R2、R3、R4、R5、R6或R6’中的至少一個具有下式結(jié)構(gòu)
在根據(jù)這一實(shí)施方案的另一個實(shí)施例中，R2、R3、R4、R5、R6或R6’中的至少一個具有下式結(jié)構(gòu)
其中s是0到20的整數(shù)和R1是線性聚合物修飾部分。
在示例性實(shí)施方案中，聚合物修飾基團(tuán)-連接體構(gòu)建體是支化結(jié)構(gòu)，其包括連接于中央部分的兩個或更多個聚合物鏈。在這一實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體具有下式結(jié)構(gòu)
其中R1和L如上文所討論，并且w’是2到6，優(yōu)選2到4和更優(yōu)選2到3的整數(shù)。
當(dāng)L是鍵時，該鍵在R1的前體上的反應(yīng)性官能團(tuán)與糖基核心上的具有互補(bǔ)反應(yīng)活性的反應(yīng)性官能團(tuán)之間形成。當(dāng)L是非零級連接體時，在與R1前體反應(yīng)之前L的前體可以位于糖基部分上?；蛘撸琑1和L的前體可以被合并成預(yù)先形成的盒，該預(yù)先形成的盒隨后連接于糖基部分。如本文所述的，具有適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)性官能團(tuán)的前體的選擇和制備在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。另外，前體的偶聯(lián)通過本領(lǐng)域公知的化學(xué)法進(jìn)行。
在示例性實(shí)施方案中，L是從提供被修飾的糖的氨基酸或小肽(例如，1-4個氨基酸殘基)形成的連接基團(tuán)，其中聚合物修飾基團(tuán)通過被取代的烷基連接體連接。示例性的連接體包括甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸和半胱氨酸，PEG部分可以通過酰胺或氨基甲酸酯鍵連接于連接體的胺部分。PEG分別通過硫醚鍵或醚鍵連接于半胱氨酸和絲氨酸的硫或氧原子。
在示例性實(shí)施方案中，R5包括聚合物修飾基團(tuán)。在另一個示例性實(shí)施方案中，R5既包括聚合物修飾基團(tuán)又包括將修飾基團(tuán)連接于分子的其余部分的連接體L。如上文所討論，L可以是線性或支化結(jié)構(gòu)。類似地，聚合物修飾基團(tuán)可以是支化的或線性的。
II.D.ii.水溶性聚合物 許多水溶性聚合物是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的那些并且可用于實(shí)踐本發(fā)明。術(shù)語水溶性聚合物包括諸如以下的物質(zhì)糖類(例如，右旋糖酐、直鏈淀粉、透明質(zhì)酸、多聚唾液酸、乙酰肝素、肝素等等)；聚氨基酸，例如聚天冬氨酸和聚谷氨酸；核酸；合成聚合物(例如，聚丙烯酸、聚醚例如聚乙二醇；肽，蛋白質(zhì)等等。本發(fā)明可使用具有唯一限制的任何水溶性聚合物進(jìn)行實(shí)踐，所述限制是該聚合物必須包括點(diǎn)，在該點(diǎn)處可以連接綴合物的其余部分。
用于聚合物活化的方法還可見于WO 94/17039，美國專利No.5,324,844，WO 94/18247，WO 94/04193，美國專利No.5,219,564，美國專利No.5,122,614，WO 90/13540，美國專利No.5,281,698，還有WO 93/15189，用于在被活化的聚合物與肽之間進(jìn)行綴合的方法，例如凝血因子VIII(WO 94/15625)、血紅蛋白(WO 94/09027)、攜氧分子(美國專利No.4,412,989)、核糖核酸酶和過氧化物歧化酶(Veronese等人，App.Biochem.Biotech.11141-45(1985))。
示例性的水溶性聚合物是其中在聚合物樣品中相當(dāng)比例的聚合物分子具有大約相同的分子量的那些；這種聚合物是“均一分散”的。
另外參考聚乙二醇綴合物舉例說明本發(fā)明。可以獲得關(guān)于PEG的官能化和綴合的幾篇綜述和專題論文。例如，參見，Harris，Macronol.Chem.Phys.C25325-373(1985)；Scouten，Methods in Enzymology13530-65(1987)；Wong等人，Enzyme Microb.Technol.14866-874(1992)；Delgado等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug CarrierSystems 9249-304(1992)；Zalipsky，Bioconjugate Chem.6150-165(1995)；以及Bhadra，等人，Pharmazie，575-29(2002)。制備反應(yīng)性PEG分子和使用該反應(yīng)性分子形成綴合物的路線是本領(lǐng)域是已知的。例如，美國專利No.5,672,662公開了選自線性的或支化的聚氧化烯烴、聚氧乙基化多元醇、聚烯醇和聚丙烯酰基嗎啉的聚合物酸的活性酯的水溶性的和可分離的綴合物。
美國專利No.6,376,604闡述了用于制備水溶性的非肽聚合物的水溶性的1-苯并三唑基碳酸酯的方法，通過在有機(jī)溶劑中使聚合物的末端羥基與二(1-苯并三唑基)碳酸酯反應(yīng)進(jìn)行。該活性酯用于與生物活性劑例如蛋白質(zhì)或肽形成綴合物。
WO 99/45964描述了包括生物活性劑和被活化的水溶性聚合物的綴合物，所述活化的水溶性聚合物包括具有至少一個末端的聚合物骨架，所述端點(diǎn)通過穩(wěn)定的鍵與聚合物骨架連接，其中的至少一個末端包括支化部分，該支化部分具有與支化部分連接的近端活性基團(tuán)，其中生物活性劑連接于近端活性基團(tuán)中的至少一個上。其它的支化聚乙二醇描述在WO 96/21469中，美國專利No.5,932,462描述了與支化PEG分子形成的綴合物，所述支化PEG分子包括包含反應(yīng)性官能團(tuán)的支化末端。游離的活性基團(tuán)可以用來與生物學(xué)活性物質(zhì)諸如蛋白質(zhì)或肽反應(yīng)，在聚乙二醇與生物學(xué)活性物質(zhì)之間形成綴合物。美國專利No.5,446,090描述了雙官能PEG連接體及其在形成在每一PEG連接體末端具有肽的綴合物中的用途。
包括可降解型PEG鍵的綴合物描述在WO 99/34833中；以及WO99/14259以及美國專利No.6,348,558中。這種可降解的鍵適用于本發(fā)明。
如上所述的本領(lǐng)域公認(rèn)的聚合物活化方法在本發(fā)明的背景下用于本文所述的支化聚合物的形成以及用于這些支化聚合物與其它物質(zhì)如糖、糖核苷酸等等的綴合。
示例性的水溶性聚合物是聚乙二醇，例如甲氧基-聚乙二醇。用于本發(fā)明的聚乙二醇不受限于任何特定形式或分子量范圍限制。對于非分支聚乙二醇分子而言，分子量優(yōu)選為500到100,000。優(yōu)選使用2000-60,000的分子量，優(yōu)選約5,000到約40,000的分子量。
II.D.iii.支化水溶性聚合物 在另一個實(shí)施方案中，聚合物修飾部分是支化PEG結(jié)構(gòu)，其具有超過一個的被連接的線性或支化的PEG部分。支化PEG的實(shí)例描述在以下文獻(xiàn)中美國專利No.5,932,462；美國專利No.5,342,940；美國專利No.5,643,575；美國專利No.5,919,455；美國專利No.6,113,906；美國專利No.5,183,660；WO 02/09766；Kodera Y.，BioconjugateChemistry 5283-288(1994)；以及Yamasaki等人，Agric.Biol.Chem.，522125-2127，1998。
代表性的聚合物修飾部分包括基于包含側(cè)鏈的氨基酸例如絲氨酸、半胱氨酸、賴氨酸和小肽例如lys-lys的結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，聚合物修飾部分是基于寡肽例如三賴氨酸肽的支化PEG部分。適合使用的示例性氨基酸包括賴氨酸、半胱氨酸和絲氨酸。在這種實(shí)施方案中，連接于肽結(jié)構(gòu)的每個聚合物亞單元可以是線性PEG部分或支化PEG部分。例如，三賴氨酸可以是用線性PEG部分、支化PEG部分或線性和支化PEG部分的組合進(jìn)行單-、二-、三-或四-PEG化。示例性的支化結(jié)構(gòu)包括以下部分

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，在二賴氨酸結(jié)構(gòu)中的游離胺還可通過酰胺或氨基甲酸酯鍵用線性PEG部分或者支化PEG部分進(jìn)行PEG化。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，除了上面所示的線性PEG結(jié)構(gòu)之外，在前述章節(jié)中示例說明的支化聚合物還可連接于支化部分(例如，半胱氨酸、絲氨酸、賴氨酸和賴氨酸的低聚物)上而不是連接于一個或多個線性PEG結(jié)構(gòu)上。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，如上所述的PEG結(jié)構(gòu)僅僅用于清楚示例的目的，PEG可以實(shí)質(zhì)上被任何聚合物部分所替代，所述任何聚合物部分包括但不限于在本文的“聚合物部分”的定義中所述的那些部分。
具有任何分子量例如1kD、2kD、5kD、10kD、15kD、20kD、25kD、30kD、35kD、40kD和45kD的PEG可用于本發(fā)明。具有更大分子量的PEG也可用于本發(fā)明，所述更大分子量包括最高約200kD，例如至少約180kD、約160kD、約140kD、約120kD、約100kD、約90kD、約80kD和約70kD。在某些實(shí)施方案中，PEG的分子量為約80kD。在另外的實(shí)施方案中，PEG的分子量為至少約200kD、至少約180kD、至少約160kD或至少約140kD。
支化聚合物修飾部分的每個PEG部分可具有如上定義的分子量，或者聚合物修飾部分中所有PEG部分的總的分子量可以如上定義。例如，在某些實(shí)施方案中，支化聚合物修飾部分的每個PEG部分的分子量可為約80kD或聚合物修飾部分中所有PEG部分的總的分子量可為約80kD。同樣地，在某些實(shí)施方案中，支化聚合物修飾部分的每個PEG部分的分子量可為約200kD或聚合物修飾部分中所有PEG部分的總的分子量可為約200kD。
根據(jù)這一實(shí)施方案的示例性物質(zhì)具有下式結(jié)構(gòu)

以及
其中下標(biāo)e、f和f’獨(dú)立地選自1到2500的整數(shù)；以及下標(biāo)q、q’和q”獨(dú)立地選自1到20的整數(shù)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解的是，可用于本發(fā)明的支化聚合物包括對上述主題進(jìn)行的各種變化。例如，如上所示的二賴氨酸-PEG綴合物可以包括三種聚合物亞單元，鍵合于α-胺的在上述結(jié)構(gòu)中顯示為未經(jīng)修飾的第三種。類似地，以所需方式用聚合物修飾部分標(biāo)記的三種或四種聚合物亞單元進(jìn)行官能化的三賴氨酸的使用也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
正如本文的討論，在本發(fā)明的綴合物中使用的PEG可以是線性的或支化的。用于形成根據(jù)本發(fā)明這一實(shí)施方案的包含支化PEG的肽綴合物的示例性前體具有下式結(jié)構(gòu)
用于形成根據(jù)本發(fā)明這一實(shí)施方案的包含支化PEG的肽綴合物的另一個示例性前體具有下式結(jié)構(gòu)
根據(jù)該式的支化聚合物物質(zhì)是基本上純的水溶性聚合物。X3’是包括可電離的官能團(tuán)(例如，OH、COOH、H2PO4、HSO3、HPO3，及其鹽等等)或其它反應(yīng)性官能團(tuán)的部分，例如下文所述。C是碳。X5、R16和R17獨(dú)立地選自非反應(yīng)性基團(tuán)和聚合物部分(例如聚氧化烯烴，例如PEG)。非反應(yīng)性基團(tuán)包括被認(rèn)為是在生理學(xué)pH條件下基本上不起反應(yīng)的、中性的和/或穩(wěn)定的基團(tuán)，例如，H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的雜烷基等等。示例性的聚合物部分包括以下式IIIa及其示例中所示的支化結(jié)構(gòu)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，在這些式中的PEG部分可以被其它聚合物所替代。示例性的聚合物包括聚氧化烯烴家族中的那些。(例如，H、未被取代的烷基、未被取代的雜烷基)和聚合物臂(例如，PEG)。X2和X4是優(yōu)選在生理學(xué)條件下基本上無反應(yīng)性的連接片段，其可相同或不同。示例性的連接體既不包括芳族部分又不包括酯部分。替代地，這些連接可以包括被設(shè)計為在生理學(xué)相關(guān)條件下降解的一個或多個部分，例如，酯、二硫化物等等。X2和X4將聚合物臂R16和R17連接到C。當(dāng)X3’與連接體、糖或連接體-糖盒上的具有互補(bǔ)反應(yīng)活性的反應(yīng)性官能團(tuán)反應(yīng)時，則X3’被轉(zhuǎn)化為連接片段X3的組分。
關(guān)于X2、X3和X4的示例性的連接片段獨(dú)立地選自并包括S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、(O)CNH和NHC(O)O和OC(O)NH、CH2S、CH2O、CH2CH2O、CH2CH2S、(CH2)oO、(CH2)oS或(CH2)oY’-PEG，其中Y’是S、NH、NHC(O)、C(O)NH、NHC(O)O、OC(O)NH或O和o是1-50的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，連接片段X2和X4是不同的連接片段。
在示例性實(shí)施方案中，前體(式III)或其被活化的衍生物，與糖、被活化的糖或糖核苷酸反應(yīng)并從而與之結(jié)合，所述反應(yīng)通過在X3’和糖部分上的具有互補(bǔ)反應(yīng)活性的基團(tuán)如胺之間的反應(yīng)進(jìn)行。替代地，X3’與連接體L的前體上的反應(yīng)性官能團(tuán)反應(yīng)。式I、Ia、II或IIa的R2、R3、R4、R5、R6或R6’中的一個或多個可以包括支化聚合物修飾部分或者通過L連接的這一部分。
在示例性實(shí)施方案中，聚合物修飾基團(tuán)具有包括下式所示的部分的結(jié)構(gòu)
在根據(jù)上式的另一個示例性實(shí)施方案中，支化聚合物具有下式所示的結(jié)構(gòu)
在示例性實(shí)施方案中，A1和A2各自選自-OH和-OCH3。
根據(jù)這個實(shí)施方案的示例性的聚合物修飾基團(tuán)包括以下部分
在示例性實(shí)施方案中，以下部分
是連接體臂L。在該實(shí)施方案中，示例性的連接體來自天然的或非天然的氨基酸、氨基酸類似物或氨基酸模擬物，或由一種或多種這些物質(zhì)形成的小肽。例如，在本發(fā)明的化合物中發(fā)現(xiàn)的某些支化聚合物具有下式結(jié)構(gòu)
Xa是連接片段，該連接片段由支化聚合物修飾部分的前體上的反應(yīng)性官能團(tuán)例如X3’與糖部分上的反應(yīng)性官能團(tuán)的反應(yīng)形成的，或者是連接體的前體。例如，當(dāng)X3’是羧酸時，其可被活化并直接與懸垂在氨基糖類(例如，Sia、GalNH2、GlcNH2、ManNH2等等)上的胺基結(jié)合，形成作為酰胺的Xa。另外的示例性的反應(yīng)性官能團(tuán)和被活化的前體在下文中描述。下標(biāo)c代表1到10的整數(shù)。其它符號具有與上面討論的相同含義。
在另一個示例性實(shí)施方案中，Xa是與另一個連接體形成的連接部分
其中Xb是第二連接片段并且獨(dú)立地選自關(guān)于Xa所述的那些基團(tuán)，并且與L類似地是，L1是鍵、被取代的或未被取代的烷基或被取代的或未被取代的雜烷基。
關(guān)于Xa和Xb的示例性基團(tuán)包括S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、C(O)NH和NHC(O)O和OC(O)NH。
在另一個示例性實(shí)施方案中，X4是與R17連接的肽，其是氨基酸、二肽(例如，Lys-Lys)或三肽(例如，Lys-Lys-Lys)，其中一個或多個α-胺部分和/或一個或多個側(cè)鏈雜原子用聚合物修飾部分修飾。
在另一個示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽綴合物包括例如R15部分的部分，其具有選自下式的結(jié)構(gòu)

其中由各種符號表示的基團(tuán)的含義與在上文中討論的含義相同。如上關(guān)于L和L1所討論的，La是鍵或連接體，例如，是被取代的或未被取代的烷基或被取代的或未被取代的雜烷基部分。在示例性實(shí)施方案中，La是用所述聚合物修飾部分進(jìn)行官能化的唾液酸的側(cè)鏈的部分。示例性的La部分包括被取代的或未被取代的烷基鏈，其包括一個或多個OH或NH2。
在又一個示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有下式所示部分例如R15部分的肽綴合物

以及
其中由各種符號表示的基團(tuán)的含義與在上文中討論的含義相同。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，在式VIII和IX中的連接體臂同樣適用于本文所述的其它被修飾的糖。在示例性實(shí)施方案中，式VIII和IX的部分是連接于本文所述的聚糖結(jié)構(gòu)的R15部分。
在又一個示例性實(shí)施方案中，肽綴合物包括具有作為選自以下成員的式結(jié)構(gòu)的R15部分

以及
其中基團(tuán)的含義如上文所討論。關(guān)于La的示例性基團(tuán)是-(CH2)jC(O)NH(CH2)hC(O)NH-，其中下標(biāo)h和j獨(dú)立地選自0到10的整數(shù)。另一個示例性的基團(tuán)是-C(O)NH-。下標(biāo)m和n是獨(dú)立地選自0到5000的整數(shù)。A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10和A11是獨(dú)立地選自以下的成員H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的雜烷基、被取代的或未被取代的環(huán)烷基、被取代的或未被取代的雜環(huán)烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的雜芳基、-NA12A13、-OA12和-SiA12A13。A12和A13是獨(dú)立地選自以下的成員被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的雜烷基、被取代的或未被取代的環(huán)烷基、被取代的或未被取代的雜環(huán)烷基、被取代的或未被取代的芳基和被取代的或未被取代的雜芳基。
如上所述的本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)一步參考其中聚合物是水溶性聚合物特別是聚乙二醇(“PEG”)例如甲氧基-聚乙二醇進(jìn)一步進(jìn)行示例說明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，下面章節(jié)的焦點(diǎn)是用于清楚示例的目的并且使用PEG作為示例性聚合物進(jìn)行闡述的多種模體同樣適用于其中采用不是PEG的聚合物的物質(zhì)。
在示例性實(shí)施方案中，R15部分具有的式結(jié)構(gòu)是選自以下的成員


以及
在每一上述結(jié)構(gòu)中，連接體片段-NH(CH2)a-可存在或不存在。
在其它的示例性實(shí)施方案中，肽綴合物包括選自以下的R15部分
以及
在上式各式中，下標(biāo)e和f獨(dú)立地選自1到2500的整數(shù)。在另一個示例性實(shí)施方案中，選擇e和f以提供約1kD、2kD、5kD、10kD、15kD、20kD、25kD、30kD、35kD、40kD和45kD的PEG部分。具有更大分子量的PEG也可用于本發(fā)明，包括最高約200kD，例如至少約180kD、約160kD、約140kD、約120kD、約100kD、約90kD、約80kD和約70kD。在某些實(shí)施方案中，PEG的分子量為約80kD。在另外的實(shí)施方案中，PEG的分子量為至少約200kD、至少約180kD、至少約160kD或至少約140kD。符號Q代表被取代的或未被取代的烷基(例如，C1-C6烷基，例如甲基)、被取代的或未被取代的雜烷基或H。
其它支化聚合物具有基于二賴氨酸(Lys-Lys)肽的結(jié)構(gòu)，例如


以及
和基于三賴氨酸肽(Lys-Lys-Lys)的結(jié)構(gòu)，例如

以及
在上式各式中，下標(biāo)e、f、f’和f”代表獨(dú)立地選自1到2500的整數(shù)。下標(biāo)q、q’和q”代表獨(dú)立地選自1到20的整數(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，除了上面所示的線性PEG結(jié)構(gòu)之外，在前述章節(jié)中示例說明的支化聚合物還可連接于支化部分(例如，賴氨酸和賴氨酸的低聚物)上而不是連接于一個或多個線性PEG結(jié)構(gòu)上。
在另一個示例性實(shí)施方案中，修飾基因
具有作為選自以下成員的式結(jié)構(gòu)


以及
其中Q是選自H和被取代的或未被取代的C1-C6烷基的成員。下標(biāo)e和f是獨(dú)立地選自1到2500的整數(shù)，和下標(biāo)q是選自0到20的整數(shù)。
在另一個示例性實(shí)施方案中，修飾基團(tuán)
具有作為選自以下成員的式結(jié)構(gòu)


以及
其中Q是選自H和被取代的或未被取代的C1-C6烷基的成員。下標(biāo)e、f和f’是獨(dú)立地選自1到2500的整數(shù)，以及q和q’是獨(dú)立地選自1到20的整數(shù)。
在另一個示例性實(shí)施方案中，支化聚合物具有包括下式所示部分的結(jié)構(gòu)
其中下標(biāo)m和n是獨(dú)立地選自0到5000的整數(shù)。A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10和A11是獨(dú)立地選自以下的成員H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的雜烷基、被取代的或未被取代的環(huán)烷基、被取代的或未被取代的雜環(huán)烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的雜芳基、-NA12A13、-OA12和-SiA12A13。A12和A13是獨(dú)立地選自以下的成員被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的雜烷基、被取代的或未被取代的環(huán)烷基、被取代的或未被取代的雜環(huán)烷基、被取代的或未被取代的芳基和被取代的或未被取代的雜芳基。
式IIIa是式III的子集。由式IIIa描述的結(jié)構(gòu)也被式III所包含。
在示例性實(shí)施方案中，聚合物修飾基團(tuán)具有包括下式所示部分的結(jié)構(gòu)

以及
在根據(jù)上式的另一個示例性實(shí)施方案中，支化聚合物具有包括下式所示部分的結(jié)構(gòu)
在示例性實(shí)施方案中，A1和A2是獨(dú)立地選自-OH和-OCH3的成員。
根據(jù)這個實(shí)施方案的示例性的聚合物修飾基團(tuán)包括以下部分
其中各變量的定義如上所述。
在示例性實(shí)施方案中，被修飾的糖是唾液酸并且所選擇的用于本發(fā)明的被修飾的糖化合物具有下式結(jié)構(gòu)
下標(biāo)a、b和d是0到20的整數(shù)。下標(biāo)c是1到2500的整數(shù)。如上所述結(jié)構(gòu)可以是R15的組成部分， 在另一個示例性實(shí)施方案中，糖的伯羥基部分被修飾基團(tuán)官能化。例如，唾液酸的9-羥基可以被轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的胺并被官能化以提供本發(fā)明的化合物。根據(jù)這一實(shí)施方案的式包括
如上所述結(jié)構(gòu)可以是R15的組成部分。
盡管在前述章節(jié)中參考PEG示例說明了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，一系列的聚合物修飾部分可用于本文所述的化合物和方法中。
在被選擇的實(shí)施方案中，R1或L-R1是支化PEG，例如上述物質(zhì)之一。在示例性實(shí)施方案中，支化PEG結(jié)構(gòu)基于半胱氨酸肽。根據(jù)這一實(shí)施方案的示例性的被修飾的糖包括
其中X4是鍵或O。在每一上述結(jié)構(gòu)中，烷基胺連接體-(CH2)aNH-可存在或不存在。如上所述的結(jié)構(gòu)可以是R15/R15’的組成部分。
正如本文的討論，用于本發(fā)明的被聚合物修飾的唾液酸還可是線性結(jié)構(gòu)。因此，本發(fā)明提供了包括來自諸如以下結(jié)構(gòu)的唾液酸部分的綴合物
其中下標(biāo)q和e如上文所討論。
示例性的被修飾的糖用水溶性聚合物或非水溶性聚合物修飾。有用的聚合物的示例進(jìn)一步示例說明如下。
在另一個示例性實(shí)施方案中，肽來自昆蟲細(xì)胞，通過將GlcNAc和Gal附加到甘露糖核心進(jìn)行重建以及使用攜帶線性PEG部分的唾液酸進(jìn)行糖PEG化，得到包括至少一個具有下式的部分的肽
其中下標(biāo)t是0到1的整數(shù)；下標(biāo)s代表1到10的整數(shù)；以及下標(biāo)f代表1到2500的整數(shù)。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括以下的糖基連接基團(tuán)的肽綴合物
D是選自-OH和R1-L-HN-的成員；G是選自R1-L-和-C(O)(C1-C6)烷基-R1的成員；R1是包括選自直鏈聚乙二醇?xì)埢椭Щ垡叶細(xì)埢某蓡T的部分；以及 M是選自以下的成員H、鹽抗衡離子和單個負(fù)電荷；L是連接體，其是選自以下的成員鍵、被取代的或未被取代的烷基和被取代的或未被取代的雜烷基。在示例性實(shí)施方案中，當(dāng)D是OH時，則G是R1-L-。在另一個示例性實(shí)施方案中，當(dāng)G是-C(O)(C1-C6)烷基時，D是R1-L-NH-。
在示例性實(shí)施方案中，L-R1具有下式結(jié)構(gòu)
其中a是選自0到20的整數(shù)。
在示例性實(shí)施方案中，R1具有包括選自以下的部分的結(jié)構(gòu)


以及
其中e、f、m和n是獨(dú)立地選自1到2500的整數(shù)；以及q是選自0到20的整數(shù)。
在示例性實(shí)施方案中，R1具有作為選自以下成員的結(jié)構(gòu)


以及
其中e、f和f’是獨(dú)立地選自1到2500的整數(shù)；以及q和q’是獨(dú)立地選自1到20的整數(shù)。
在另一個示例性實(shí)施方案中，R1具有作為選自以下成員的結(jié)構(gòu)

以及
其中e、f和f’是獨(dú)立地選自1到2500的整數(shù)；以及q和q’是獨(dú)立地選自1到20的整數(shù)。
在另一個示例性實(shí)施方案中，R1具有作為選自以下成員的結(jié)構(gòu)

以及
其中e和f是獨(dú)立地選自1到2500的整數(shù)。
在另一個示例性實(shí)施方案中，糖基連接體具有下述結(jié)構(gòu)
其中各變量的定義如上所述。
在另一個示例性實(shí)施方案中，肽綴合物包括至少一個選自下式的所述糖基連接體

以及
其中D和G如上所述，AA是所述肽綴合物的氨基酸殘基和t是選自0和1的整數(shù)。
在另一個示例性實(shí)施方案中，肽綴合物包括至少一個所述糖基連接體，其中每一所述糖基連接體具有作為獨(dú)立地選自下式成員的結(jié)構(gòu)

其中D和G如上所述，AA是所述肽綴合物的氨基酸殘基，和t是選自0和1的整數(shù)。
在另一個示例性實(shí)施方案中，肽綴合物包括至少一個選自下式的所述糖基連接體

其中D和G如上所述，AA是所述肽綴合物的氨基酸殘基，和t是選自0和1的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，不存在選自0和2個不包括G的唾液酸基部分的成員。在示例性實(shí)施方案中，不存在選自1和2個不包括G的唾液酸基部分的成員。
在另一個示例性實(shí)施方案中，肽綴合物包括至少一個選自下式的所述糖基連接體

其中D和G如上所述，AA是所述肽綴合物的氨基酸殘基和t是選自0和1的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，不存在選自0和2個不包括G的唾液酸基部分的成員。在示例性實(shí)施方案中，不存在選自1和2個不包括G的唾液酸基部分的成員。
在另一個示例性實(shí)施方案中，肽綴合物包括至少一個選自下式的所述糖基連接體

其中D和G如上所述，AA是所述肽綴合物的氨基酸殘基和t是選自0和1的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，不存在選自0和2個不包括G的唾液酸基部分的成員。在示例性實(shí)施方案中，不存在選自1和2個不包括G的唾液酸基部分的成員。
在另一個示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在適合的宿主中產(chǎn)生的肽。本發(fā)明還提供了表達(dá)這種肽的方法。在另一個示例性實(shí)施方案中，宿主是哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)。
在另一個示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療有其需要的受試者的病況的方法，所述病況的特征在于所述受試者的凝血效力受損，所述方法包括對所述受試者給予有效改善所述受試者的所述狀況的量的本發(fā)明的肽綴合物的步驟。在另一個示例性實(shí)施方案中，所述方法包括對所述哺乳動物給予一定量的根據(jù)本文所述方法制備的肽綴合物。
在另一個方面，本發(fā)明提供了制備本文所述的包括糖基連接體的肽綴合物的方法。所述方法包括(a)使包括如下糖基部分的肽
與本文所述的PEG化核苷酸類糖以及將PEG化糖轉(zhuǎn)移到所述糖基部分的Gal上的酶在適合于所述轉(zhuǎn)移的條件下接觸。
在另一個示例性實(shí)施方案中，以下部分
具有作為選自以下成員的式結(jié)構(gòu)
其中e、f、m和n是獨(dú)立地選自1到2500的整數(shù)；以及q是選自0到20的整數(shù)。
在另一個示例性實(shí)施方案中，以下部分
具有作為選自以下成員的式結(jié)構(gòu)


以及
其中e、f和f’是獨(dú)立地選自1到2500的整數(shù)；以及q和q’是獨(dú)立地選自1到20的整數(shù)。
在另一個示例性實(shí)施方案中，糖基連接體包括下式結(jié)構(gòu)
在另一個示例性實(shí)施方案中，肽綴合物包括至少一個具有下式結(jié)構(gòu)的糖基連接體。



以及
其中AA是所述肽的氨基酸殘基；t是選自0和1的整數(shù)；以及R15是被修飾的唾液酸基部分。
在另一個示例性實(shí)施方案中，所述方法包括在步驟(a)之前(b)在適合的宿主中表達(dá)所述肽。
II.D.iv.非水溶性聚合物 在另一個實(shí)施方案中，類似于上面討論的那些，被修飾的糖包括非水溶性聚合物而不是水溶性聚合物。本發(fā)明的綴合物還可包括一種或多種非水溶性聚合物。通過采用綴合物作為介質(zhì)來說明本發(fā)明的這一實(shí)施方案，使用該介質(zhì)來以受控方式遞送治療性肽。聚合物藥物遞送系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的。例如，參見，Dunn等人編輯，POLYMERICDRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，ACS Symposium Series Vol.469，American Chemical Society，Washington，D.C.1991。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解實(shí)質(zhì)上任何已知的藥物遞送系統(tǒng)適用于本發(fā)明的綴合物。
如上關(guān)于R1、L-R1、R15、R15’和其它基團(tuán)所述的模體同樣適用于非水溶性聚合物，其可被并入線性和支化結(jié)構(gòu)，不限于采用本領(lǐng)域技術(shù)人員容易獲得的化學(xué)。
代表性的非水溶性聚合物包括但不限于聚膦嗪，聚乙烯醇，聚酰胺，聚碳酸酯，聚烯烴，聚丙烯酰胺，聚亞烷基二醇，聚氧化烯烴，聚亞烷基對苯二甲酸酯，聚乙烯醚，聚乙烯酯，聚乙烯基鹵化物，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙交酯，聚硅氧烷，聚氨酯，聚甲基丙烯酸甲酯，聚甲基丙烯酸乙酯，聚甲基丙烯酸丁酯，聚甲基丙烯酸異丁酯，聚甲基丙烯酸己酯，聚甲基丙烯酸異癸酯，聚甲基丙烯酸月桂酯，聚甲基丙烯酸苯基酯，聚丙烯酸甲酯，聚丙烯酸異丙酯，聚丙烯酸酸異丁酯，聚丙烯酸十八烷基酯，聚乙烯，聚丙烯，聚乙二醇，聚環(huán)氧乙烷，聚對苯二甲酸乙二酯，聚乙酸乙烯酯，聚氯乙烯，聚苯乙烯，聚乙烯基吡咯烷酮，普盧蘭尼克和聚乙烯基苯酚，及其共聚物。
可用于本發(fā)明綴合物中的合成的改性天然聚合物包括但不限于烷基纖維素，羥烷基纖維素，纖維素醚，纖維素酯和硝化纖維素。寬泛類別的合成的改性天然聚合物的特別優(yōu)選的成員包括但不限于甲基纖維素，乙基纖維素，羥基丙基纖維素，羥丙基甲基纖維素，羥丁基甲基纖維素，醋酸纖維素，丙酸纖維素，醋酸丁酸纖維素，醋酞纖維素，羧甲基纖維素，三乙酸纖維素，纖維素硫酸酯鈉鹽，和丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯和海藻酸的聚合物。
本文討論的這些聚合物和其它聚合物可以容易地得自商業(yè)來源，諸如Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO.)，Polysciences(Warrenton，PA.)，Aldrich(Milwaukee，WI.)，F(xiàn)luka(Ronkonkoma，NY)和BioRad(Richmond，CA)，或者另外從這些供應(yīng)商獲得的單體使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行合成。
可用于本發(fā)明綴合物中的代表性的可生物降解型聚合物包括但不限于聚丙交酯，聚乙交酯及其共聚物，聚對苯二甲酸乙二酯，聚丁酸，聚戊酸，聚(丙交酯-共-己內(nèi)酯)，聚(丙交酯-共-乙交酯)，聚酐，聚原酸酯，及其共混物和共聚物。特別使用的是形成凝膠的組合物，諸如包括膠原蛋白、普盧蘭尼克等等的那些。
用于本發(fā)明的聚合物包括“雜化”聚合物，其包括非水溶性材料，該非水溶性材料在其結(jié)構(gòu)的至少一部分內(nèi)包括生物可吸收的分子。這種聚合物的實(shí)例是包含非水溶性共聚物的聚合物，該非水溶性共聚物在每個聚合物鏈內(nèi)具有生物可吸收區(qū)域、親水區(qū)域和多個可交聯(lián)的官能團(tuán)。
為了本發(fā)明的目的，“非水溶性材料”包括在水或含水環(huán)境中實(shí)質(zhì)上不溶的材料。因此，盡管共聚物的某些區(qū)域或片段可能是親水的或甚至是溶于水的，但是聚合物分子作為一個整體在水中沒有任何實(shí)質(zhì)可測量的溶解。
為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“生物可吸收的分子”包括這樣的區(qū)域，該區(qū)域能夠通過正常排泄途徑被機(jī)體代謝或分解和再吸收和/或消除。這種代謝物或分解產(chǎn)物優(yōu)選對身體是實(shí)質(zhì)上無毒的。
生物可吸收區(qū)域可以是疏水性的或親水性的，只要該共聚物組分作為一個整體不表現(xiàn)水溶性即可。因此，基于聚合物作為一個整體保持水不溶性的優(yōu)先性來選擇生物可吸收區(qū)域。因此，對相對性質(zhì)，即，由生物可吸收區(qū)域所包含的官能團(tuán)的種類，和生物可吸收區(qū)域的相對比例，以及親水性區(qū)域進(jìn)行選擇，從而確保有用的生物可吸收的組分保持非水溶性。
示例性的可再吸收型聚合物包括，例如，合成制備的聚(α-羥基-羧酸)/聚(氧化烯烴)的可再吸收型嵌段共聚物(參見，Cohn等人，美國專利No.4,826,945)。這些共聚物不是交聯(lián)的并且是可溶于水的，從而身體可以排泄被降解的嵌段共聚物組分。參見，Younes等人，JBiomed.Mater.Res.211301-1316(1987)；以及Cohn et al.，J Biomed.Mater.Res.22993-1009(1988)。
本發(fā)明優(yōu)選的生物可吸收的聚合物包括選自以下的一種或多種組分聚酯，聚羥基酸，聚內(nèi)酯，聚酰胺，聚酯-酰胺，聚氨基酸，聚酐，聚原酸酯，聚碳酸酯，聚膦嗪，聚磷酸酯，聚硫酯，多糖，及其混合物。仍更優(yōu)選地是，生物可吸收的聚合物包括聚羥基酸組分。在聚羥基酸類中優(yōu)選聚乳酸，聚乙醇酸，聚己酸，聚丁酸，聚戊酸，及其共聚物和混合物。
除了形成在體內(nèi)被吸收的片段(“生物可吸收的”)之外，用于本發(fā)明方法中的優(yōu)選的聚合物涂層還可形成可排泄和/或可代謝的片段。
在本發(fā)明中還可使用更高級共聚物。例如，Casey等人的美國專利No.4,438,253，其在1984年3月20日被授權(quán)，公開了由聚羥基乙酸和被羥基封端的聚亞烷基二醇進(jìn)行酯交換所得的三嵌段共聚物。這類組分被公開用作可再吸收型單絲縫線。這類組分的撓性通過并入芳族原碳酸酯例如原碳酸四對甲苯基酯到所述共聚物共結(jié)構(gòu)內(nèi)來進(jìn)行控制。
還可使用基于乳酸和/或羥基乙酸的其它聚合物。例如，Spinu的美國專利5,202,413，其在1993年4月13日被授權(quán)，公開了可生物降解型多嵌段共聚物，該多嵌段共聚物通過丙交酯和/或乙交酯在低聚二醇或二胺殘基上開環(huán)聚合，然后使用二官能化合物例如二異氰酸酯、二?；然蚨燃坠柰檫M(jìn)行鏈延長而制備的具有按序排列的聚丙交酯和/或聚乙交酯的嵌段。
可用于本發(fā)明的涂層的生物可吸收區(qū)域可被設(shè)計為可水解裂解的和/或可酶促裂解的。為了本發(fā)明的目的，“可水解裂解的”是指共聚物，特別是生物可吸收區(qū)域在水或含水環(huán)境中對水解的敏感性。類似，本文中使用的“可酶促裂解的”是指共聚物，特別是生物可吸收區(qū)域?qū)?nèi)源性或外源性酶的裂解的敏感性。
當(dāng)置于體內(nèi)時，親水性區(qū)域可被加工為可排泄的和/或可代謝的片段。因此，親水性區(qū)域可以包括，例如，聚醚，聚氧化烯烴，多元醇，聚乙烯基吡咯烷，聚乙烯醇，聚烷基噁唑啉，多糖，碳水化合物，肽，蛋白質(zhì)，及其共聚物和混合物。另外，親水性區(qū)域還可以是，例如，聚氧化烯烴。這種聚氧化烯烴可以包括，例如，聚氧化乙烯，聚氧化丙烯，及其混合物和共聚物。
作為水凝膠的組分的聚合物也可用于本發(fā)明。水凝膠是能夠吸收相對大量水的聚合物材料。形成水凝膠的化合物的實(shí)例包括但不限于聚丙烯酸，羧甲基纖維素鈉，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷，明膠，角叉藻聚糖和其它多糖，羥基乙烯甲基丙烯酸(HEMA)，及其衍生物等等。水凝膠可被制備為是穩(wěn)定的、生物可降解的和生物可吸收的。另外，水凝膠組合物可包括表現(xiàn)出這些性質(zhì)中的一種或多種的亞單元。
其完整性可以通過交聯(lián)進(jìn)行控制的生物相容性水凝膠組合物是已知的并且在本發(fā)明中優(yōu)選用于本發(fā)明的方法中。例如，Hubbell等人的美國專利Nos.5,410,016，其在1995年4月25日被授權(quán)，和5,529,914，其在1996年6月25日被授權(quán)，公開了水溶性系統(tǒng)，其是交聯(lián)的嵌段共聚物，具有夾在兩個對水解不穩(wěn)定的伸長段之間的水溶性中央嵌段片段。這種共聚物進(jìn)一步用可進(jìn)行光聚合的丙烯酸酯官能團(tuán)進(jìn)行末端封端。當(dāng)交聯(lián)時，這些系統(tǒng)變成水凝膠。這種共聚物的水溶性中央嵌段可以包括聚乙二醇；而對水解不穩(wěn)定的伸長段可以是聚(α-羥基酸)，例如聚乙醇酸或聚乳酸。參見，Sawhney等人，Macromolecules 26581-587(1993)。
在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，凝膠是熱致可逆凝膠。包括諸如普盧蘭尼克、膠原蛋白、明膠、透明質(zhì)酸、多糖、聚氨酯水凝膠、聚氨酯-脲水凝膠及其組合的組分的熱致可逆凝膠在本發(fā)明中是優(yōu)選的。
在又一個示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明的綴合物包括脂質(zhì)體的組分。脂質(zhì)體可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備，例如，根據(jù)Eppstein等人的美國專利No.4,522,811中所述方法制備。例如，脂質(zhì)體制劑可以通過將適當(dāng)?shù)囊环N或多種脂質(zhì)(例如硬脂酰磷脂酰乙醇胺，硬脂酰磷脂酰膽堿，花生四烯酰(arachadoyl)磷脂酰膽堿和膽固醇)溶解在無機(jī)溶劑中然后進(jìn)行蒸發(fā)，在容器的表面上留下干燥的脂質(zhì)薄膜進(jìn)行制備?；钚曰衔锘蚱渌帉W(xué)上可接受的鹽的水溶液然后被引入到容器中。然后用手將容器渦旋以從容器側(cè)面釋放脂質(zhì)材料和使脂質(zhì)聚集體分散，從而形成脂質(zhì)體懸浮液。
上述的微粒和制備微粒的方法通過示例方式被提供并且這些示例不意在限制在本發(fā)明中所使用的微粒的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，通過不同方法制造的一系列微粒可用于本發(fā)明中。
在水溶性聚合物背景下如上討論的結(jié)構(gòu)形式，無論是直鏈的還是支化的，通常對于非水溶性聚合物也是適合的。因此，例如，半胱氨酸、絲氨酸、二賴氨酸和三賴氨酸支化核心可以被兩個非水溶性聚合物部分進(jìn)行官能化。用于制備這些物質(zhì)的方法通常與用于制備水溶性聚合物的那些方法密切地相似。
II.D.v.制備聚合物修飾基團(tuán)的方法 聚合物修飾基團(tuán)可以進(jìn)行活化用于與糖基或糖基部分或氨基酸部分反應(yīng)。被活化的物質(zhì)(例如碳酸酯和活性酯)的示例性結(jié)構(gòu)包括

在上式中，q是選自1-40的成員。其它適合于活化在制備本文所述的化合物中使用的線性和支化PEG的活化基團(tuán)或離去基團(tuán)包括但不限于以下物質(zhì)


以及
用這些和其它物質(zhì)活化的PEG分子以及制備活化PEG的方法在WO 04/083259中闡述。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，如上所示的支化聚合物的一個或多個m-PEG臂可以被具有不同端點(diǎn)例如OH、COOH、NH2、C2-C10-烷基等等的PEG部分所替代。另外，上述結(jié)構(gòu)可容易地通過在α-碳原子和氨基酸側(cè)鏈的官能團(tuán)之間插入烷基連接體(或除去碳原子)進(jìn)行修飾。因此，“均”衍生物和高級同系物，以及低級同系物處在可用于本發(fā)明的支化PEG的核心的范圍內(nèi)。
本文所述的支化PEG物質(zhì)容易地通過諸如以下方案中闡述的方法制備
其中Xd是O或S和r是1到5的整數(shù)。下標(biāo)e和f獨(dú)立地選自1到2500的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，這些下標(biāo)之一或二者經(jīng)過選擇從而使得聚合物的分子量為約5kD、10kD、15kD、20kD、25kD、30kD、35kD或40kD。具有更大分子量的PEG也可用于本發(fā)明，包括最高約200kD，例如至少約180kD、約160kD、約140kD、約120kD、約100kD、約90kD、約80kD和約70kD。在某些實(shí)施方案中，PEG的分子量為約80kD。在其它實(shí)施方案中，PEG的分子量為至少約200kD、至少約180kD、至少約160kD或至少約140kD。
因此，根據(jù)這一方案，天然的或非天然氨基酸與被活化的m-PEG衍生物接觸，在該情況，與甲苯磺酸酯接觸，通過使側(cè)鏈雜原子Xd烷基化形成1。單官能化m-PEG氨基酸與反應(yīng)性m-PEG衍生物經(jīng)歷N-酰基化條件，從而裝配支化m-PEG 2。如本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的，甲苯磺酸酯離去基團(tuán)可以用任何適合的離去基團(tuán)如鹵素、甲磺酸酯、三氟甲磺酸酯等等所替代。類似地，用于使胺進(jìn)行?；姆磻?yīng)性碳酸酯可以用活性酯例如N-羥基琥珀酰亞胺等所替代，或者酸可以使用脫水劑例如二環(huán)己基碳二亞胺、羰二咪唑等等被原地活化。
在其它示例性實(shí)施方案中，脲部分用諸如酰胺的基團(tuán)所替代。
II.E.物質(zhì)的均一分散肽綴合物組合物 除了提供通過化學(xué)或酶促方式附加糖基連接基團(tuán)形成的肽綴合物之外，本發(fā)明提供了包括在其取代模式中是高度均一的肽綴合物的物質(zhì)的組合物。使用本發(fā)明的方法，有可能形成這樣的肽綴合物，在該肽綴合物中，在整個的肽綴合物群體中，相當(dāng)比例的糖基連接基團(tuán)和糖基部分連接于結(jié)構(gòu)相同的氨基酸或糖基殘基上。因此，在第二方面，本發(fā)明提供了這樣的肽綴合物，該肽綴合物具有水溶性聚合物部分的群體，其通過糖基連接基團(tuán)例如完整的糖基連接基團(tuán)與肽共價結(jié)合。在本發(fā)明的示例性的肽綴合物中，水溶性聚合物群體中的基本上每個成員借助于糖基連接基團(tuán)結(jié)合于肽的糖基殘基上，并且肽的連接有糖基連接基團(tuán)的每個糖基殘基具有相同的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明還提供了與上述那些類似的綴合物，其中肽借助于糖基連接基團(tuán)綴合于修飾基團(tuán)，例如治療性部分、診斷性部分、靶向部分、毒素部分等等。每一上述的修飾基團(tuán)可以是小分子、天然聚合物(例如多肽)或合成聚合物。當(dāng)修飾基團(tuán)連接于唾液酸時，通常優(yōu)選所述修飾基團(tuán)實(shí)質(zhì)上無熒光性。
在示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽包括至少一個O-連接的或N-連接的糖基化部位，該部位用包括聚合物修飾基團(tuán)例如PEG部分的被修飾的糖進(jìn)行糖基化。在示例性實(shí)施方案中，PEG借助于完整的糖基連接基團(tuán)或借助于非糖基連接體例如被取代的未被取代的烷基、被取代的或未被取代的雜烷基與肽共價連接。糖基連接基團(tuán)共價連接于肽的氨基酸殘基或糖基殘基上。作為替代地，糖基連接基團(tuán)連接于糖肽的一個或多個糖基單元上。本發(fā)明還提供了其中糖基連接基團(tuán)既連接于氨基酸殘基又連接于糖基殘基上的綴合物。
本發(fā)明的肽上的聚糖通常對應(yīng)于根據(jù)本文所述方法進(jìn)行重制后在由哺乳動物(BHK、CHO)細(xì)胞或昆蟲(例如Sf-9)細(xì)胞產(chǎn)生的肽上所發(fā)現(xiàn)的那些。例如，使用三甘露糖基核心表達(dá)的昆蟲產(chǎn)生的肽隨后接觸GlcNAc供體和GlcNAc轉(zhuǎn)移酶以及Gal供體和Gal轉(zhuǎn)移酶。通過二步驟或單一步驟實(shí)現(xiàn)GlcNAc和Gal附加到三甘露糖基核心上。如本文所討論的那樣將被修飾的唾液酸附加到糖基部分的至少一個分枝上。未用被修飾的唾液酸進(jìn)行官能化的那些Gal部分任選地通過在唾液酸轉(zhuǎn)移酶存在的條件下與唾液酸供體反應(yīng)而被“加帽”。
在示例性實(shí)施方案中，在肽群體中至少60％的末端Gal部分被唾液酸加帽，優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％并且甚至更優(yōu)選至少95％、96％、97％、98％或99％被唾液酸加帽。
II.F.核苷酸糖 在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明還提供了糖核苷酸。根據(jù)這一實(shí)施方案的示例性物質(zhì)包括



以及
其中y是選自0到2的整數(shù)，并且R2、R3、R4、R5或R6中的至少一個具有選自以下成員的結(jié)構(gòu)
其中各變量如上所述。
在示例性實(shí)施方案中，R2、R3、R4、R5或R6中的至少一個具有下式所示的結(jié)構(gòu)
在示例性實(shí)施方案中，A1和A2各自選自-OH和-OCH3。
根據(jù)這一實(shí)施方案的示例性的聚合物修飾基團(tuán)包括以下所示的部分
在示例性實(shí)施方案中，R2、R3、R4、R5或R6中只有一個具有包括如上所述的修飾基團(tuán)的結(jié)構(gòu)。
在另一個示例性實(shí)施方案中，根據(jù)這一實(shí)施方案的物質(zhì)包括



以及
其中各變量如上所述。
在另一個示例性實(shí)施方案中，根據(jù)這一實(shí)施方案的物質(zhì)包括

其中L-(R1)w是選自以下的成員
其中各變量如上所述。
在示例性實(shí)施方案中，L-(R1)w具有下式所示結(jié)構(gòu)
在示例性實(shí)施方案中，A1和A2各自選自-OH和-OCH3。
根據(jù)這一實(shí)施方案的示例性的聚合物修飾基團(tuán)包括以下所示的部分
在示例性實(shí)施方案中，m和n是獨(dú)立地選自約1到約1000的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，m和n是獨(dú)立地選自約1到約500的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，m和n是獨(dú)立地選自約1到約70、約70到約150、約150到約250、約250到約375和約375到約500的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，m和n是獨(dú)立地選自約10到約35、約45到約65、約95到約130、約210到約240、約310到約370和約420到約480的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，m和n是獨(dú)立地選自約15到約30的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，m和n是獨(dú)立地選自約50到約65的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，m和n是獨(dú)立地選自約100到約130的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，m和n是獨(dú)立地選自約210到約240的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，m和n是獨(dú)立地選自約310到約370的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，m和n是獨(dú)立地選自約430到約470的整數(shù)。
在另一個示例性實(shí)施方案中，根據(jù)這一實(shí)施方案的物質(zhì)包括



以及
其中各變量如上所述。
在另一個示例性實(shí)施方案中，根據(jù)這一實(shí)施方案的物質(zhì)包括

以及
其中各變量如上所述。
在另一個示例性實(shí)施方案中，核苷酸糖具有作為選自以下成員的式
其中各變量如上所述。
根據(jù)這一實(shí)施方案的示例性核苷酸糖具有以下結(jié)構(gòu)
其中各變量如上所述。
根據(jù)這一實(shí)施方案的示例性核苷酸糖具有以下結(jié)構(gòu)
其中各變量如上所述。
在另一個示例性實(shí)施方案中，核苷酸糖基于下式
其中R基團(tuán)和L代表如上討論的部分。下標(biāo)“y”是0、1或2。在示例性實(shí)施方案中，L是在NH和R1之間的鍵。堿基是核酸堿基。
在示例性實(shí)施方案中，L-R1是選自以下的成員
其中各變量如上所述。
在示例性實(shí)施方案中，L-R1具有下式所示結(jié)構(gòu)
在示例性實(shí)施方案中，A1和A2各自選自-OH和-OCH3。
III.方法 除了上面討論的綴合物之外，本發(fā)明還提供了用于制備這些綴合物和其它綴合物的方法。另外，本發(fā)明提供了預(yù)防、治療或改善疾病狀態(tài)的方法，通過對處在發(fā)展為所述疾病的危險中的受試者或罹患所述疾病的受試者給予本發(fā)明的綴合物進(jìn)行。
在示例性實(shí)施方案中，在聚合物修飾部分和糖基化肽或非糖基化肽之間形成綴合物。聚合物借助于糖基連接基團(tuán)綴合于肽，所述糖基連接基團(tuán)被插入到肽(或糖基殘基)和修飾基團(tuán)(例如水溶性聚合物)之間并與后二者共價連接。所述方法包括使肽接觸包含被修飾的糖和將被修飾的糖綴合于底物的酶例如糖基轉(zhuǎn)移酶的混合物。該反應(yīng)在適合于在被修飾的糖和肽之間形成共價鍵的條件下進(jìn)行。被修飾的糖的糖部分優(yōu)選選自核苷酸糖。合成肽綴合物的方法包括合并a)唾液酸酶；b)能夠催化糖基連接基團(tuán)轉(zhuǎn)移的酶例如糖基轉(zhuǎn)移酶、外切糖苷酶或內(nèi)切糖苷酶；c)被修飾的糖；d)肽，從而合成肽綴合物。所述反應(yīng)在適合于在被修飾的糖和肽之間形成共價鍵的條件下進(jìn)行。被修飾的糖的糖部分優(yōu)選選自核苷酸糖。
在示例性實(shí)施方案中，被修飾的糖例如如上所述的那些被活化為相應(yīng)的核苷酸糖?？捎糜诒景l(fā)明的示例性的糖核苷酸在其被修飾形式中包括核苷酸類一、二或三磷酸酯或其類似物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，被修飾的糖核苷酸選自UDP-糖苷、CMP-糖苷或GDP-糖苷。甚至更優(yōu)選地，被修飾的糖核苷酸的糖核苷酸部分選自UDP-半乳糖，UDP-半乳糖胺，UDP-葡萄糖，UDP-葡糖胺，GDP-甘露糖，GDP-巖藻糖，CMP-唾液酸，或CMP-NeuAc。在示例性實(shí)施方案中，核苷酸類磷酸酯連接于C-1。
本發(fā)明還提供了在6-碳位置處用L-R1修飾的糖核苷酸的使用。根據(jù)這一實(shí)施方案的示例性物質(zhì)包括
其中R基團(tuán)和L代表如上討論的部分。下標(biāo)“y”是0、1或2。在示例性實(shí)施方案中，L是在NH和R1之間的鍵。堿基是核酸堿基。
用于本發(fā)明的示例性的核苷酸糖如本文所述。在另一個示例性實(shí)施方案中，可用于本發(fā)明的核苷酸糖是其中在6-位置處的碳被包括具有GDP甘露糖立體化學(xué)的物質(zhì)修飾的那些，例如

以及
其中X5是鍵或O并且其余變量如上所述。下標(biāo)i代表0或1。下標(biāo)a代表1到20的整數(shù)。下標(biāo)e和f獨(dú)立地代表1到2500的整數(shù)。Q，如上文所討論，是H或被取代的或未被取代的C1-C6烷基。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，其中S用O所替代的絲氨酸衍生物也落入這一一般主題范圍內(nèi)。
在又一個示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了其中被修飾的糖基于UDP半乳糖的立體化學(xué)的綴合物?？捎糜诒景l(fā)明的示例性的核苷酸糖具有以下所示結(jié)構(gòu)
其中各變量如上所述。
在另一個示例性實(shí)施方案中，核苷酸糖基于葡萄糖的立體化學(xué)。根據(jù)這一實(shí)施方案的示例性物質(zhì)具有下式結(jié)構(gòu)

以及
其中各變量如上所述。
因此，在其中糖基部分是唾液酸的示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法采用了具有下式結(jié)構(gòu)的化合物
其中L-R1如上文所討論并且L1-R1代表與修飾基團(tuán)連接的連接體。與L類似地，根據(jù)L1的示例性連接體物質(zhì)包括鍵、烷基或雜烷基部分。
另外，如上文所討論，本發(fā)明提供了被線性或支化的水溶性聚合物修飾的核苷酸糖的使用。例如，具有下式結(jié)構(gòu)的化合物可用于制備在本發(fā)明范圍內(nèi)的綴合物

以及
其中X4是O或鍵。
通常，糖部分或糖部分-連接體盒和PEG或PEG-連接體盒基團(tuán)通過采用活性基團(tuán)被連接在一起，活性基團(tuán)通常通過連接方法被轉(zhuǎn)化為新的有機(jī)官能團(tuán)或無反應(yīng)性的物質(zhì)。一個或多個糖反應(yīng)性官能團(tuán)位于糖部分上的任何位置處。可用于實(shí)踐本發(fā)明的活性基團(tuán)和反應(yīng)類型通常是生物綴合化學(xué)領(lǐng)域中公知的那些。目前的可與反應(yīng)性糖部分進(jìn)行的有利的反應(yīng)類型是在相對溫和條件下進(jìn)行的那些。這些反應(yīng)包括但不限于親核取代(例如胺和醇與酰鹵、活性酯的反應(yīng))、親電子取代(例如烯胺反應(yīng))和碳-碳加成和碳-雜原子多重鍵加成(例如，邁克爾加成反應(yīng)，狄爾斯-阿德耳加成)。這些反應(yīng)和其它有用的反應(yīng)在例如以下中討論，March，ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY，3rd Ed.，John Wiley&Sons，New York，1985；Hermanson，BIOCONJUGATE TECHNIQUES，Academic Press，San Diego，1996；以及Feeney等人，MODIFICATION OFPROTEINS；Advances in Chemistry Series，Vol.198，AmericanChemical Society，Washington，D.C.，1982。
作為糖核心或修飾基團(tuán)的側(cè)基的有用的反應(yīng)性官能團(tuán)包括但不限于 (a)羧基及其多種衍生物，包括但不限于，N-羥基琥珀酰亞胺酯，N-羥基苯并三唑酯，酰鹵，酰基咪唑，硫酯，對硝基苯酯，烷基、烯基、炔基和芳族酯； (b)羥基基團(tuán)，其可被轉(zhuǎn)化為例如酯、醚、醛等等。
(c)鹵代烷基基團(tuán)，其中鹵化物可隨后被親核基團(tuán)諸如例如胺、羧酸根陰離子、硫醇陰離子、負(fù)碳離子或烷氧化物離子置換，從而在鹵素原子的官能團(tuán)處產(chǎn)生新基團(tuán)的共價連接； (d)親二烯體基團(tuán)，其能夠參與狄爾斯-阿爾德反應(yīng)，諸如例如馬來酰亞胺基團(tuán)； (e)醛或酮基團(tuán)，從而借助形成羰基衍生物諸如例如亞胺、腙、半卡巴腙或肟，或借助諸如格氏加成或烷基鋰加成的機(jī)制可能隨后進(jìn)行衍生化； (f)磺酰鹵基團(tuán)，用于隨后與例如胺反應(yīng)以形成磺酰胺； (g)硫醇基，其可例如被轉(zhuǎn)化為二硫化物或與酰鹵反應(yīng)； (h)胺或巰基，其可例如被?；?、烷基化或氧化； (i)烯烴，其可經(jīng)歷例如環(huán)加成、酰基化、邁克爾加成等等；以及 (j)環(huán)氧化物，其可與例如胺和羥基化合物反應(yīng)。
反應(yīng)性官能團(tuán)可以進(jìn)行選擇從而使得它們不參與或不干涉裝配反應(yīng)性糖核心或修飾基團(tuán)所需的反應(yīng)。作為替代，反應(yīng)性官能團(tuán)可以通過保護(hù)基的存在而被保護(hù)起來以免參與反應(yīng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解如何保護(hù)特定的官能團(tuán)從而使其不干涉所選擇的反應(yīng)條件設(shè)置。關(guān)于有用的保護(hù)基的實(shí)例例如參見Greene等人的PROTECTIVE GROUPSIN ORGANIC SYNTHESIS，John Wiley&Sons，New York，1991。
在下述的討論中，闡述了可用于實(shí)踐本發(fā)明的被修飾的糖的許多特定實(shí)例。在示例性實(shí)施方案中，唾液酸衍生物被用作連接有修飾基團(tuán)的糖核心。關(guān)于唾液酸衍生物的討論的焦點(diǎn)僅僅用于清楚示例的目的，其不被認(rèn)為限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，許多其它的糖部分以與使用唾液酸作為實(shí)例所闡述的類似方式進(jìn)行活化和衍生化。例如，用于修飾僅以半乳糖、葡萄糖、N-乙酰半乳糖胺和巖藻糖作為幾個糖底物的實(shí)例可采用許多方法，這些糖底物可容易地通過本領(lǐng)域公知方法進(jìn)行修飾。例如，參見，Elhalabi等人，Curr.Med.Chem.693(1999)；and Schafer et al.，J.Org.Chem.6524(2000))。
在示例性實(shí)施方案中，被修飾的糖基于6-氨基-N-乙酰基-糖基部分。
在上述的方案中，下標(biāo)n代表1到2500的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，該下標(biāo)經(jīng)過選擇從而使得聚合物的分子量為約10kD、15kD或20kD。符號“A”代表活化基團(tuán)例如鹵基、活化酯的部分(例如N-羥基琥珀酰亞胺酯)、碳酸酯的部分(例如對硝基苯基碳酸酯)等等。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，其它PEG-酰胺核苷酸糖可容易地通過這一方法和類似方法制備。
肽通常從無到有被合成，或者在原核細(xì)胞(例如細(xì)菌細(xì)胞諸如大腸桿菌)或在真核細(xì)胞諸如哺乳動物、酵母、昆蟲、真菌或植物細(xì)胞中被重組表達(dá)。所述肽可以是全長蛋白質(zhì)或片段。另外，肽可以是野生型肽或者是突變肽。在示例性實(shí)施方案中，所述肽包括突變，所述突變將一個或多個N-或O-連接的糖基化位置附加到肽序列上。
本發(fā)明的方法還提供了對重組產(chǎn)生的不完全糖基化肽的修飾。許多重組產(chǎn)生的糖蛋白是不完全糖基化的，曝露出具有不受歡迎的性質(zhì)(如免疫原性、RES的識別性)的碳水化合物殘基。在本發(fā)明的方法中采用被修飾的糖，肽可以同時地被進(jìn)一步糖基化并且用例如水溶性聚合物、治療劑等等衍生化。被修飾的糖的糖部分可以是適當(dāng)?shù)鼐Y合于完全糖基化肽內(nèi)的受體上的殘基，或者是具有所需性質(zhì)的另一個糖部分。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，本發(fā)明可以采用實(shí)質(zhì)上得自任何來源的任何肽或糖肽進(jìn)行實(shí)踐。可用于實(shí)踐本發(fā)明的示例性肽在WO03/031464及其所引述的參考文獻(xiàn)中闡述。
通過本發(fā)明方法修飾的肽可以是合成肽或野生型肽，或者它們可以是突變肽，通過本領(lǐng)域已知的方法諸如定位誘變產(chǎn)生。肽的糖基化通常是N-連接的或O-連接的。示例性的N-連接是被修飾的糖與天冬酰胺殘基的側(cè)鏈連接。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸，其中X是除了脯氨酸以外的任何氨基酸，是用于碳水化物部分與天冬酰胺側(cè)鏈進(jìn)行酶促連接的識別順序。因此，任何一個這些三肽序列在多肽中的存在產(chǎn)生潛在糖基化位點(diǎn)。O-連接的糖基化是指一種糖(例如N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖、甘露糖、GlcNAc、葡萄糖、巖藻糖或木糖)與羥基氨基酸優(yōu)選絲氨酸或蘇氨酸的羥基側(cè)鏈的連接，盡管還可使用非常見的或非天然的氨基酸，例如5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。
另外，除了肽之外，本發(fā)明的方法還可用其它生物學(xué)結(jié)構(gòu)(例如糖脂、脂質(zhì)、鞘氨基醇、神經(jīng)酰胺、全細(xì)胞等等，其包含糖基化位點(diǎn))進(jìn)行實(shí)踐。
將糖基化位點(diǎn)附加到肽或其它結(jié)構(gòu)上方便地通過改變氨基酸序列從而使得其包含一個或多個糖基化位點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)。所述附加也可通過將一種或多種提供-OH基團(tuán)的物質(zhì)優(yōu)選絲氨酸或蘇氨酸殘基并入到肽的序列內(nèi)(用于O-連接的糖基化位點(diǎn))來進(jìn)行。所述附加可以通過肽的突變或全化學(xué)合成來進(jìn)行。肽氨基酸序列優(yōu)選通過在DNA水平下發(fā)生改變而被改變，特別是通過在預(yù)先選定的堿基下使編碼該肽的DNA發(fā)生突變從而使得產(chǎn)生可被翻譯為所需氨基酸的密碼子。DNA突變優(yōu)選使用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行。
在示例性實(shí)施方案中，糖基化位點(diǎn)通過改組(shuffling)多核苷酸被附加。編碼候選肽的多核苷酸可以用DNA改組規(guī)程進(jìn)行調(diào)節(jié)。DNA改組是遞推式(recursive)重組和突變過程，該過程通過相關(guān)基因池隨機(jī)碎裂成片段、隨后通過類似聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過程將所述片段進(jìn)行重新裝配進(jìn)行。例如，參見Stemmer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9110747-10751(1994)；Stemmer，Nature 370389-391(1994)；以及美國專利Nos.5,605,793、5,837,458、5,830,721和5,811,238。
可用于實(shí)踐本發(fā)明的示例性肽、附加或除去糖基化位點(diǎn)的方法和附加或除去糖基結(jié)構(gòu)或亞結(jié)構(gòu)的方法詳細(xì)描述在WO03/031464和相關(guān)的美國申請和PCT申請中。
本發(fā)明還利用了附加到肽上(或從肽中除去)一個或多個被選擇的糖基殘基，之后將被修飾的糖綴合于肽的至少一個被選擇的糖基殘基上。本發(fā)明的實(shí)施方案可用于，例如，當(dāng)希望將被修飾的糖綴合于被選擇的糖基殘基上時，所述糖基殘基不存在于肽上或不以所需量存在。因此，在將被修飾的糖偶聯(lián)于肽之前，被選擇的糖基殘基通過酶促或化學(xué)偶聯(lián)被綴合于肽上。在另一個實(shí)施方案中，糖肽的糖基化模式在被修飾的糖綴合之前通過從糖肽上除去碳水化合物殘基被改變。例如，參見WO 98/31826。
附加或除去糖肽上存在的任何碳水化合物部分通過化學(xué)或酶促進(jìn)行。通過將多肽變體暴露于化合物三氟甲磺酸或等價化合物下進(jìn)行示例性的化學(xué)去糖基化。這一處理引起除了連接糖(N-乙?；咸前坊騈-乙?；樘前?之外大部分或所有的糖裂解，同時留下完整的肽。化學(xué)去糖基化由Hakimuddin等人，Arch.Biochem.Biophys.25952(1987)和Edge等人，Anal.Biochem.118131(1981)描述。在多肽變體上的碳水化合物部分的酶促裂解可以通過使用由Thotakura等人Meth.Enzymol.138350(1987)所述的內(nèi)切糖苷酶和外切糖苷酶來完成。
在示例性實(shí)施方案中，所述肽在進(jìn)行肽上的糖綴合或重制步驟之前用神經(jīng)氨糖酸苷酶基本上完全脫唾液酸化。在糖綴合或重制之后，所述肽任選地用唾液酸轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行再唾液酸化。在示例性實(shí)施方案中，再唾液酸化發(fā)生在唾液酸基受體的群體中的基本上每個(例如，＞80％，優(yōu)選大于85％，大于90％，優(yōu)選大于95％，和更優(yōu)選大于96％、97％、98％或99％)末端糖基受體處。在優(yōu)選實(shí)施方案中，糖類具有實(shí)質(zhì)上均一的唾液酸化模式(即，實(shí)質(zhì)上均一的糖基化模式)。
糖基部分的化學(xué)附加通過本領(lǐng)域公認(rèn)的方法進(jìn)行。糖部分的酶促附加優(yōu)選使用本文所述方法的改進(jìn)法進(jìn)行，用未經(jīng)修飾的天然糖基單元代替本發(fā)明中使用的被修飾的糖。附加糖部分的其它方法公開在美國專利No.5,876,980、6,030,815、5,728,554和5,922,577中。
用于被選擇的糖基殘基的示例性的連接點(diǎn)包括但不限于(a)用于N-糖基化的被一致認(rèn)可的部位，和用于O-連接的糖基化的位點(diǎn)；(b)作為糖基轉(zhuǎn)移酶的受體的末端糖基部分；(c)精氨酸、天冬酰胺和組氨酸；(d)游離羧基；(e)游離巰基，諸如半胱氨酸的那些；(f)游離羥基，諸如絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸的那些；(g)芳族殘基，諸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些；或(h)谷氨酰胺的酰胺基。用于本發(fā)明的示例性方法描述在1987年9月11日公開的WO 87/05330以及Aplin和Wriston，CRC CRIT.REV.BIOCHEM.，第259-306頁(1981)中。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過連接基團(tuán)連接兩個或更多個肽的方法。連接基團(tuán)具有任何有用的結(jié)構(gòu)并且可選自直鏈和支鏈結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，與肽連接的連接體的每個端點(diǎn)包括被修飾的糖(即，開始形成的完整的糖基連接基團(tuán))。
在本發(fā)明的示例性方法中，兩個肽借助于包括聚合物(例如PEG連接體)的連接體部分被連接在一起。該構(gòu)建體與上式所述的一般結(jié)構(gòu)符合。如本文所述的，本發(fā)明的構(gòu)建體包括兩個完整的糖基連接基團(tuán)(即，s+t＝1)。關(guān)注包括兩個糖基基團(tuán)的PEG連接體是用于清楚示例的目的并且不被解釋為限制了在本發(fā)明的這一實(shí)施方案中可用的連接體臂的同一性。
因此，PEG部分在第一端點(diǎn)被第一糖基單元官能化并在第二端點(diǎn)被第二糖基單元官能化。第一和第二糖基單元優(yōu)選是用于不同的轉(zhuǎn)移酶的底物，允許第一肽和第二肽分別垂直連接于第一糖基單元和第二糖基單元上。在實(shí)踐中，(糖基)1-PEG-(糖基)2連接體與第一肽和以第一糖基單元作為底物的第一轉(zhuǎn)移酶接觸，從而形成(肽)1-(糖基)1-PEG-(糖基)2。轉(zhuǎn)移酶和/或未反應(yīng)的肽然后任選地從反應(yīng)混合物中被除去。第二肽和以第二糖基單元作為底物的第二轉(zhuǎn)移酶被附加到(肽)1-(糖基)1-PEG-(糖基)2綴合物，形成(肽)1-(糖基)1-PEG-(糖基)2-(肽)2；至少一個糖基殘基是直接或間接地O-連接的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，如上所述的方法也適用于在超過兩個肽之間形成綴合物，例如通過使用支化PEG、樹枝型聚合物、聚(氨基酸)、多糖等等進(jìn)行。
在示例性實(shí)施方案中，通過本發(fā)明方法進(jìn)行修飾的肽是糖肽，其在哺乳動物細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)和在轉(zhuǎn)基因動物中產(chǎn)生，并因此包含N-和/或O-連接的寡糖鏈，其是不完全唾液酸化的。缺乏唾液酸且包含末端半乳糖殘基的糖肽的寡糖鏈可以被PEG化、PPG化或者以其它方式用被修飾的唾液酸進(jìn)行修飾。
在方案1中，氨基糖苷1用被保護(hù)的氨基酸(例如甘氨酸)衍生物的活性酯處理，將糖胺殘基轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的被保護(hù)的氨基酸酰胺加合物。所述加合物用醛縮酶處理以形成α-羥基羧酸鹽2?；衔?在CMP-SA合成酶的作用下被轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的CMP衍生物，然后該CMP衍生物進(jìn)行催化氫化得到化合物3。通過甘氨酸加合物的形成而被引入的胺作為通過化合物3與活化的PEG或PPG衍生物(例如PEG-C(O)NHS、PEG-OC(O)O-對硝基苯基)反應(yīng)的PEG連接位點(diǎn)，分別得到諸如4或5的物質(zhì)。
方案1
在示例性實(shí)施方案中，被修飾的糖可以與肽上的O-聚糖結(jié)合位點(diǎn)連接?？捎糜诋a(chǎn)生這一肽綴合物的糖基轉(zhuǎn)移酶包括用于Ser56(-Glc-(Xyl)n-Gal-SA-PEG-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和唾液酸轉(zhuǎn)移酶；用于Ser56-Glc-(Xyl)n-Xyl-PEG-木糖轉(zhuǎn)移酶；以及用于Ser60-Fuc-GlcNAc-(Gal)n-(SA)m-PEG-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶。
III.A.被修飾的糖與肽的綴合 使用適當(dāng)?shù)挠糜诮閷?dǎo)綴合的酶將用PEG修飾的糖綴合于糖基化或非糖基化肽。優(yōu)選地，被修飾的供體糖、酶和受體肽的濃度經(jīng)過選擇從而使得糖基化進(jìn)行直到受體被消耗。在以下討論的需要考慮的事項，盡管在唾液酸轉(zhuǎn)移酶的背景下被闡述，但是其一般適用于其它的糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)。用于本發(fā)明的一系列優(yōu)選的唾液酸轉(zhuǎn)移酶提供于圖6中。
使用糖基轉(zhuǎn)移酶來合成所需的寡糖結(jié)構(gòu)的許多方法是已知的并且一般適用于本發(fā)明。示例性方法描述在例如以下中，WO 96/32491，Ito等人，Pure Appl.Chem.65753(1993)，美國專利Nos.5,352,670，5,374,541，5,545,553，共同擁有的美國專利Nos.6,399,336和6,440,703，和共同擁有的公開的PCT申請WO 03/031464，WO 04/033651，WO04/099231，其作為參考并入本文。
本發(fā)明使用單個的糖基轉(zhuǎn)移酶或糖基轉(zhuǎn)移酶的組合進(jìn)行實(shí)踐。例如，可以采用唾液酸轉(zhuǎn)移酶和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的組合。在那些使用超過一種酶的實(shí)施方案中，酶和底物優(yōu)選在最初的反應(yīng)混合物中混合，或者，當(dāng)?shù)谝幻复俜磻?yīng)完成或幾乎完成時將用于第二酶促反應(yīng)的酶和試劑加入到反應(yīng)介質(zhì)中。通過在單個容器中按照次序進(jìn)行兩個酶促反應(yīng)，在其中中間體物質(zhì)被分離的整個過程中的總回收率得以改善。另外，額外的溶劑和副產(chǎn)物的提純和處理被減少。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，第一酶和第二酶中每一種是糖基轉(zhuǎn)移酶。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，一種酶是內(nèi)切糖苷酶，在另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，使用超過兩種酶來裝配本發(fā)明的被修飾的糖蛋白。所述酶用于在將被修飾的糖附加到肽之前或之后的任一時間點(diǎn)改變肽上的糖類結(jié)構(gòu)。
在另一個實(shí)施方案中，該方法采用一種或多種外切糖苷酶或內(nèi)切糖苷酶。糖苷酶通常是突變體，其經(jīng)過工程化以形成糖基鍵而不是使其破裂。突變聚糖酶通常包括用氨基酸殘基置換活性部位的酸性氨基酸殘基。例如，當(dāng)內(nèi)切聚糖酶是endo-H時，被取代的活性部位殘基典型地是在130位的Asp、在132位的Glu或其組合。氨基酸通常被絲氨酸、丙氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺所替換。
突變酶催化反應(yīng)，通常通過與內(nèi)切聚糖酶水解步驟的逆反應(yīng)類似的合成步驟進(jìn)行。在這些實(shí)施方案中，糖基供體分子(例如，所需的寡糖或單糖結(jié)構(gòu))包含離去基團(tuán)并且反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行從而供體分子被附加到蛋白質(zhì)上的GlcNAc殘基上。例如，離去基團(tuán)可以是鹵素，諸如氟化物。在其它實(shí)施方案中，離去基團(tuán)是Asn或Asn-肽部分。在另一個實(shí)施方案中，在糖基供體分子上的GlcNAc殘基被修飾。例如，GlcNAc殘基可以包括1，2噁唑啉部分。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生本發(fā)明的綴合物的每種酶以催化量存在。特定酶的催化量根據(jù)酶底物的濃度以及反應(yīng)條件諸如溫度、時間和pH值的不同而異。在預(yù)先選定的底物濃度和反應(yīng)條件下測定關(guān)于給定酶的催化量的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
以上過程進(jìn)行的溫度可以僅僅為冰點(diǎn)以上到最敏感的酶發(fā)生變性的溫度。優(yōu)選溫度為約0℃到約55℃，和更優(yōu)選為約20℃到約37℃。在另一個示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明方法的一個或多個組成部分在高溫下使用嗜熱酶進(jìn)行。
反應(yīng)混合物保持使受體足以被糖基化的時段，從而形成所需的綴合物。一些綴合物通常在幾小時后被檢測到，通常在24小時或更短時間內(nèi)獲得可回收的量。本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解的是，反應(yīng)速率根據(jù)多種變化要素(例如，酶濃度、供體濃度、受體濃度、溫度、溶劑體積)的不同而異，其針對被選擇的系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化。
本發(fā)明還提供了被修飾的肽的工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。本文中使用的工業(yè)規(guī)模通常產(chǎn)生至少1克的最終的純化綴合物。
在下述的討論中，本發(fā)明通過被修飾的唾液酸部分與糖基化肽的綴合進(jìn)行示例說明。示例性的被修飾的唾液酸用PEG標(biāo)記。以下關(guān)于使用被PEG修飾的唾液酸和糖基化肽的討論的焦點(diǎn)用于清楚示例的目的并且不意在暗示本發(fā)明限于這兩種配對體的綴合。本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解的是，所述討論一般適用于除了唾液酸之外的被修飾的糖基部分的附加。另外，所述討論同樣適用于用除了包括其它PEG部分治療性部分和生物分子在內(nèi)的PEG之外的試劑進(jìn)行糖基單元的修飾。
可使用酶促手段用于選擇性地引入PEG化或PPG化碳水化合物到肽或糖肽上。所述方法采用了包含PEG、PPG或被掩蔽的反應(yīng)性官能團(tuán)的被修飾的糖，并且結(jié)合適當(dāng)?shù)奶腔D(zhuǎn)移酶或糖合成酶。通過選擇糖基轉(zhuǎn)移酶，該糖基轉(zhuǎn)移酶將產(chǎn)生所需的碳水化合物連接并采用被修飾的糖作為供體底物，可將PEG或PPG直接引入到肽骨架上、到糖肽的已有糖殘基上或到已被附加到肽上的糖殘基上。
在示例性實(shí)施方案中，用于唾液酸轉(zhuǎn)移酶的受體存在于要被修飾的肽上，所述肽是天然存在的結(jié)構(gòu)或者其經(jīng)過重組、酶促或化學(xué)布置。適合的受體包括例如半乳糖基受體諸如Galβ1，4GlcNAc、Galβ1，4GalNAc、Galβ1，3GalNAc、乳-N-四糖、Galβ1，3GlcNAc、Galβ1，3Ara、Galβ1，6GlcNAc、Galβ1，4Glc(乳糖)和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它受體(例如，參見，Paulson等人，J.Biol.Chem.2535617-5624(1978))。示例性的唾液酸轉(zhuǎn)移酶如本文所述。
在一個實(shí)施方案中，唾液酸轉(zhuǎn)移酶的受體存在于當(dāng)在體內(nèi)合成糖肽時要被修飾的糖肽上。這種糖肽可以用本發(fā)明要求保護(hù)的方法進(jìn)行唾液酸化而不用進(jìn)行糖肽的糖基化模式的事先修飾。替代地，本發(fā)明的方法可用于使不包括適合的受體的肽唾液酸化；首先通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法對肽進(jìn)行修飾以包括受體。在示例性實(shí)施方案中，GalNAc殘基在GalNAc轉(zhuǎn)移酶的作用下被附加。
在示例性實(shí)施方案中，半乳糖基受體通過將半乳糖殘基連接到與肽例如GlcNAc連接的適當(dāng)?shù)氖荏w上進(jìn)行裝配。所述方法包括將待修飾的肽與包含適當(dāng)量的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(例如Galβ1，3或Galβ1，4)和適合的半乳糖基供體(例如UDP-半乳糖)的反應(yīng)混合物培養(yǎng)。允許反應(yīng)進(jìn)行到實(shí)質(zhì)上完成，或者，當(dāng)附加預(yù)選定量的半乳糖殘基時使反應(yīng)終止。其它裝配被選擇的糖類受體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的。
在又一個實(shí)施方案中，與糖肽連接的寡糖首先進(jìn)行全部或部分“修剪”以暴露出唾液酸轉(zhuǎn)移酶的受體或可附加一個或多個適當(dāng)?shù)臍埢垣@得適當(dāng)受體的部分。諸如糖基轉(zhuǎn)移酶和內(nèi)切糖苷酶的酶(例如，參見，美國專利No.5,716,812)可用于連接和修剪反應(yīng)。在該方法的另一個實(shí)施方案中，肽的唾液酸部分基本上被完全除去(例如，至少90％、至少95％或至少99％)，暴露出用于被修飾的唾液酸的受體。
在下述的討論中，本發(fā)明的方法通過使用連接有PEG部分的被修飾的糖進(jìn)行示例說明。該討論的焦點(diǎn)用于清楚示例的目的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，該討論同樣適用于其中被修飾的糖攜帶治療性部分、生物分子等等的那些實(shí)施方案。
在本發(fā)明的示例性實(shí)施方案中，其中碳水化合物殘基在附加被修飾的糖之前進(jìn)行“修剪”，高甘露糖被削減到第一代雙觸角(biantennary)結(jié)構(gòu)。攜帶PEG部分的被修飾的糖綴合于一個或多個通過“削減”而暴露的糖殘基上。在一個實(shí)施例中，PEG部分借助于綴合于PEG部分的GlcNAc部分被附加。被修飾的GlcNAc連接于具有雙觸角結(jié)構(gòu)的末端甘露糖殘基的一個或二者上。作為替代，未經(jīng)修飾的GlcNAc可以被附加到支化物質(zhì)的端點(diǎn)的一個或二者上。
在另一個示例性實(shí)施方案中，PEG部分借助于具有半乳糖殘基的被修飾的糖被附加到具有雙觸角結(jié)構(gòu)的末端甘露糖殘基的一個或二者上，所述半乳糖殘基綴合于被附加到末端甘露糖殘基上的GlcNAc殘基上。作為替代，未經(jīng)修飾的Gal可被附加到一個或兩個末端GlcNAc殘基上。
在又一個實(shí)施例中，使用諸如以上討論的那些的被修飾的唾液酸將PEG部分添加到Gal殘基上。
在另一個示例性實(shí)施方案中，高甘露糖結(jié)構(gòu)被“削減”到雙觸角結(jié)構(gòu)發(fā)生支化的甘露糖。在一個實(shí)施例中，PEG部分借助于用聚合物修飾的GlcNAc被附加。作為替代，未經(jīng)修飾的GlcNAc被附加到甘露糖，然后是具有被連接的PEG部分的Gal。在又一個實(shí)施方案中，未經(jīng)修飾的GlcNAc和Gal殘基被順序地附加到甘露糖上，然后是用PEG部分修飾的唾液酸部分。
高甘露糖結(jié)構(gòu)還可被削減到基本的三甘露糖基核心。
在另一個示例性實(shí)施方案中，高甘露糖被“削減”到連接有第一甘露糖的GlcNAc。GlcNAc綴合于攜帶PEG部分的Gal殘基。作為替代，未經(jīng)修飾的Gal被附加到GlcNAc，然后是附加用水溶性糖修飾的唾液酸。在又一個實(shí)施例中，末端GlcNAc與Gal綴合，然后所述GlcNAc用攜帶PEG部分的被修飾的巖藻糖進(jìn)行巖藻糖基化。
高甘露糖還可被削減到連接有肽的Asn的第一GlcNAc。在一個實(shí)施例中，GlcNAc-(Fuc)a殘基的GlcNAc與攜帶水溶性聚合物的GlcNAc綴合。在另一個實(shí)施例中，GlcNAc-(Fuc)a殘基的GlcNAc用Gal修飾，Gal攜帶水溶性聚合物。在又一個實(shí)施方案中，GlcNAc用Gal修飾，隨后綴合于用PEG部分修飾的唾液酸的Gal上。
其它示例性實(shí)施方案在共同擁有的美國專利申請公報中闡述20040132640；20040063911；20040137557；美國專利申請Nos10/369,979；10/410,913；10/360,770；10/410,945和PCT/US02/32263，其各自作為參考并入本文。
如上所述的實(shí)施例提供了本文所述方法的功效的示例說明。使用本文所述的方法，有可能“削減”并裝配具有實(shí)質(zhì)上任何所需結(jié)構(gòu)的碳水化合物殘基。被修飾的糖可被附加到如上所述的碳水化物部分的端點(diǎn)上，或者其可以是處在肽核心和碳水化合物端點(diǎn)之間的中間體。
在示例性實(shí)施方案中，使用唾液酸酶從糖肽中除去已有唾液酸，從而使得所有的或大部分的基礎(chǔ)半乳糖基殘基去屏蔽。作為替代，肽或糖肽用半乳糖殘基或以半乳糖單元作為終點(diǎn)的寡糖殘基標(biāo)記。在暴露或附加半乳糖殘基之后，使用適當(dāng)?shù)耐僖核徂D(zhuǎn)移酶附加被修飾的唾液酸。
在另一個示例性實(shí)施方案中，采用將唾液酸轉(zhuǎn)移到唾液酸上的酶。該方法可進(jìn)行實(shí)踐而不用唾液酸酶處理唾液酸化聚糖以將聚糖殘基暴露在唾液酸之下。示例性的用聚合物修飾的唾液酸是用聚乙二醇修飾的唾液酸。將唾液酸和被修飾的唾液酸部分附加到聚糖(其包括唾液酸殘基或者用聚糖上的已有唾液酸殘基替換這些物質(zhì))的其它示例性酶包括ST3Gal3、CST-II、ST8Sia-II、ST8Sia-III和ST8Sia-IV。
在又一個方法中，被掩蔽的反應(yīng)性官能度存在于唾液酸上。被掩蔽的反應(yīng)性基團(tuán)優(yōu)選不受將被修飾的唾液酸連接于凝血因子VII/凝血因子VIIa肽所用的條件的影響。在被修飾的唾液酸與肽共價連接后，除去掩蔽并且肽與諸如PEG的試劑綴合。所述試劑以特定的方式通過其與被修飾的糖殘基上的去屏蔽的活性基團(tuán)的反應(yīng)而綴合于肽。
任何被修飾的糖可與其適當(dāng)?shù)奶腔D(zhuǎn)移酶使用，根據(jù)糖肽的寡糖側(cè)鏈的末端糖的不同而異。如上文所討論，引入PEG化結(jié)構(gòu)所需的糖肽的末端糖可以在表達(dá)期間自然地被引入或者其可在表達(dá)后使用適當(dāng)?shù)奶擒彰浮⑻腔D(zhuǎn)移酶或糖苷酶和糖基轉(zhuǎn)移酶的混合物產(chǎn)生。
在另一個示例性實(shí)施方案中，UDP-半乳糖-PEG與β1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)，從而將被修飾的半乳糖轉(zhuǎn)移到N-乙?；咸前方Y(jié)構(gòu)的適當(dāng)?shù)哪┒松?。糖肽上的末端GlcNAc殘基可以在表達(dá)期間產(chǎn)生，這可發(fā)生在諸如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌的表達(dá)系統(tǒng)中，而且可以根據(jù)需要通過用唾液酸酶和/或糖苷酶和/或糖基轉(zhuǎn)移酶處理糖肽而產(chǎn)生。
在另一個示例性實(shí)施方案中，GlcNAc轉(zhuǎn)移酶諸如GNT1-5被用于將PEG化-GlcNAc轉(zhuǎn)移到糖肽上的末端甘露糖殘基上。在又一個示例性實(shí)施方案中，N-和/或O-連接的聚糖結(jié)構(gòu)從糖肽上被酶促除去從而暴露出氨基酸或末端糖基殘基，其隨后綴合于被修飾的糖。例如，內(nèi)切聚糖酶用于除去糖肽的N-連接結(jié)構(gòu)以暴露出末端GlcNAc作為糖肽上的與GlcNAc連接的Asn。UDP-Gal-PEG和適當(dāng)?shù)陌肴樘腔D(zhuǎn)移酶用于引入PEG-半乳糖官能度到被暴露的GlcNAc上。
在可供選擇的實(shí)施方案中，被修飾的糖被直接附加到肽骨架上，使用已知將糖殘基轉(zhuǎn)移到肽骨架上的糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行?？捎糜趯?shí)踐本發(fā)明的示例性的糖基轉(zhuǎn)移酶包括但不限于GalNAc轉(zhuǎn)移酶(GalNAcT1-14)、GlcNAc轉(zhuǎn)移酶、藻巖糖基轉(zhuǎn)移酶、葡糖基轉(zhuǎn)移酶、木糖基轉(zhuǎn)移酶、甘露糖基轉(zhuǎn)移酶等等。使用這一方法允許直接附加被修飾的糖到缺乏任何碳水化合物的肽上，或者，作為替代，附加到已有肽上。在兩種情況下，被修飾的糖的附加發(fā)生在肽骨架的特定位置上，所述位置由糖基轉(zhuǎn)移酶的底物特異性進(jìn)行定義，并且不以在使用化學(xué)方法對蛋白質(zhì)的肽骨架進(jìn)行修飾期間發(fā)生的隨機(jī)方式進(jìn)行。一系列試劑可被引入到通過將適當(dāng)?shù)陌被嵝蛄羞M(jìn)行工程化成為多肽鏈而缺乏糖基轉(zhuǎn)移酶底物肽序列的蛋白質(zhì)或糖肽中。
在上述的每一示例性實(shí)施方案中，可在被修飾的糖綴合于肽之后采用一種或多種另外的化學(xué)或酶促修飾步驟。在示例性實(shí)施方案中，使用酶(例如巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)將糖基單元(例如巖藻糖)作為側(cè)基附加到與肽連接的末端被修飾的糖上。在另一個實(shí)施例中，使用酶促反應(yīng)將沒能綴合有被修飾的糖的位置“加帽”。作為替代，采用化學(xué)反應(yīng)來改變已綴合的被修飾的糖的結(jié)構(gòu)。例如，已綴合的被修飾的糖與使其與連接有被修飾的糖的肽組分的連接穩(wěn)定或不穩(wěn)定的試劑反應(yīng)。在另一個實(shí)施例中，被修飾的糖的部分在其綴合于肽之后被脫保護(hù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，在被修飾的糖綴合于肽之后的某一階段，存在一系列可用于本發(fā)明方法的酶促和化學(xué)規(guī)程。對被修飾的糖-肽綴合物的進(jìn)一步的精心制作處在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
用于制備本發(fā)明的綴合物的酶和反應(yīng)條件詳細(xì)地討論在本申請的母申請中以及共同擁有的公開的PCT專利申請WO 03/031464、WO04/033651、WO 04/099231中。
在所選擇的實(shí)施方案中，在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的肽被重制從而使得在被重制的糖肽上的聚糖包括GlcNAc-Gal糖基殘基。GlcNAc和Gal的附加可作為單獨(dú)的反應(yīng)和作為在單個容器中的單個反應(yīng)發(fā)生。在這一實(shí)施例中，使用GlcNAc-轉(zhuǎn)移酶I和Gal-轉(zhuǎn)移酶I。使用ST3Gal-III附加被修飾的唾液酸基部分。
在另一個實(shí)施方案中，GlcNAc、Gal和被修飾的Sia的附加還可發(fā)生在單個反應(yīng)容器中，使用如上所述的酶。每一酶促重制和糖PEG化步驟可分別進(jìn)行。
當(dāng)肽在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)時，使用不同的方法。在一個實(shí)施方案中，肽在綴合之前無需重制而進(jìn)行綴合，通過使所述肽接觸唾液酸轉(zhuǎn)移酶，該唾液酸轉(zhuǎn)移酶將被修飾的唾液酸直接轉(zhuǎn)移到形成Sia-Sia-L-R1的肽上的唾液酸上進(jìn)行，或者將肽上的唾液酸交換為被修飾的唾液酸，形成Sia-L-R1。用于該方法的示例性酶是CST-II。將唾液酸附加到唾液酸的其它酶是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且這種酶的實(shí)例在附圖中闡述。
在制備本發(fā)明綴合物的又一個方法中，在哺乳動物系統(tǒng)中被表達(dá)的肽使用唾液酸酶進(jìn)行脫唾液酸化。使用對于O-連接聚糖是特異性的唾液酸轉(zhuǎn)移酶用被修飾的唾液酸將暴露出的Gal殘基進(jìn)行唾液酸化，提供了具有O-連接的被修飾的聚糖的肽。脫唾液酸化的被修飾的肽任選地通過使用唾液酸轉(zhuǎn)移酶諸如ST3GalIII進(jìn)行部分或全部的再唾液酸化。
在另一個方面，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明的PEG化肽綴合物的方法。所述方法包括(a)使得包括選自以下的糖基基團(tuán)的肽

以及
與具有作為選自以下的成員的式的PEG-唾液酸供體
其中各變量如上所述，和將PEG-唾液酸從所述供體轉(zhuǎn)移到選自所述糖基基團(tuán)的GalNAc、Gal和Sia的成員上的酶，在適合于所述轉(zhuǎn)移的條件下接觸。示例性的被修飾的唾液酸供體是用聚合物例如線性或支化聚乙二醇部分通過連接體部分進(jìn)行修飾的CMP-唾液酸。如本文的討論，所述肽任選地在連接被修飾的糖之前用GalNAc和/或Gal和/或Sia進(jìn)行糖基化(“重制”)。重制步驟可以在相同的容器中按照次序發(fā)生而無需在步驟之間進(jìn)行糖基化肽的純化。作為替代，在一個或多個重制步驟后，糖基化肽可以在使它經(jīng)歷下一個糖基化或糖PEG化步驟之前進(jìn)行純化。在示例性實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括在宿主中表達(dá)肽。在示例性實(shí)施方案中，宿主是哺乳動物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞。在另一個示例性實(shí)施方案中，哺乳動物細(xì)胞是選自BHK細(xì)胞和CHO細(xì)胞的成員，并且昆蟲細(xì)胞是草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細(xì)胞。
正如實(shí)施例中說明的和以下所討論的，用于PEG-糖的受體部分的設(shè)置以任何所需數(shù)目的步驟進(jìn)行。例如，在一個實(shí)施方案中，GalNAc附加到肽上之后可以是第二步驟，在第二步驟中，PEG-糖在相同的反應(yīng)容器中綴合于GalNAc上。作為替代，這兩個步驟可以在單個的容器中大約同時進(jìn)行。
在示例性實(shí)施方案中，PEG-唾液酸供體具有下式結(jié)構(gòu)

其中各變量如上所述。
在另一個示例性實(shí)施方案中，PEG-唾液酸供體具有下式結(jié)構(gòu)
其中各變量如上所述。
在另一個示例性實(shí)施方案中，肽在進(jìn)行糖PEG化或重制之前在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)中被表達(dá)。示例性的表達(dá)系統(tǒng)包括Sf-9/桿狀病毒和中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。
在示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備包括糖基連接體的肽綴合物的方法，所述糖基連接體包括具有下式結(jié)構(gòu)的被修飾的唾液酸基殘基
其中D是選自-OH和R1-L-HN-的成員；G是選自R1-L-和-C(O)(C1-C6)烷基-R1的成員；R1是包括選自直鏈聚乙二醇?xì)埢椭Щ垡叶細(xì)埢某蓡T的部分；M是選自H、金屬和單個負(fù)電荷的成員；L是連接體，其是選自鍵、被取代的或未被取代的烷基和被取代的或未被取代的雜烷基的成員，從而使得當(dāng)D是OH時G是R1-L-，和當(dāng)G是-C(O)(C1-C6)烷基時D是R1-L-NH-， 所述方法包括(a)使包括糖基部分的肽
與具有下式結(jié)構(gòu)的PEG-唾液酸供體部分
其中各變量如上所述，以及將所述PEG-唾液酸轉(zhuǎn)移到所述糖基部分的Gal上的酶，在適合于所述轉(zhuǎn)移的條件下接觸。
在示例性實(shí)施方案中，L-R1具有下式結(jié)構(gòu)
其中a是選自0到20的整數(shù)。
在另一個示例性實(shí)施方案中，R1具有作為選自以下的成員的結(jié)構(gòu)
其中e、f、m和n是獨(dú)立地選自1到2500的整數(shù)；以及q是獨(dú)立地選自0到20的整數(shù)。
通過本文所述的方法可以制備具有大規(guī)模或小規(guī)模的量的肽綴合物。在示例性實(shí)施方案中，肽的量是選自約0.5mg到約100kg的成員。在示例性實(shí)施方案中，肽的量是選自約0.1kg到約1kg的成員。在示例性實(shí)施方案中，肽的量是選自約0.5kg到約10kg的成員。在示例性實(shí)施方案中，肽的量是選自約0.5kg到約3kg。在示例性實(shí)施方案中，肽的量是選自約0.1kg到約5kg的成員。在示例性實(shí)施方案中，肽的量是選自約0.08kg到約0.2kg的成員。在示例性實(shí)施方案中，t肽的量是選自約0.05kg到約0.4kg的成員。在示例性實(shí)施方案中，肽的量是選自約0.1kg到約0.7kg的成員。在示例性實(shí)施方案中，肽的量是選自約0.3kg到約1.75kg的成員。在示例性實(shí)施方案中，肽的量是選自約25kg到約65kg的成員。
在本文所述反應(yīng)中使用的肽的濃度是選自約0.5到約10mg肽/mL反應(yīng)混合物的成員。在示例性實(shí)施方案中，肽濃度是選自約0.5到約1mg肽/mL反應(yīng)混合物的成員。在示例性實(shí)施方案中，肽濃度是選自約0.8到約3mg肽/mL反應(yīng)混合物的成員。在示例性實(shí)施方案中，肽濃度是選自約2到約6mg肽/mL反應(yīng)混合物的成員。在示例性實(shí)施方案中，肽濃度是選自約4到約9mg肽/mL反應(yīng)混合物的成員。在示例性實(shí)施方案中，肽濃度是選自約1.2到約7.8mg肽/mL反應(yīng)混合物的成員。在示例性實(shí)施方案中，肽濃度是選自約6到約9.5mg肽/mL反應(yīng)混合物的成員。
在本文所述反應(yīng)中使用的PEG化核苷酸糖的濃度是選自約0.1到約1.0mM的成員?？稍黾踊驕p少所述濃度的因素包括PEG的大小、培養(yǎng)時間、溫度、緩沖劑組分、以及使用的糖基轉(zhuǎn)移酶的類型和濃度。在示例性實(shí)施方案中，PEG化核苷酸糖濃度是選自約0.1到約1.0mM的成員。在示例性實(shí)施方案中，PEG化核苷酸糖濃度是選自約0.1到約0.5mM的成員。在示例性實(shí)施方案中，PEG化核苷酸糖濃度是選自約0.1到約0.3mM的成員。在示例性實(shí)施方案中，PEG化核苷酸糖濃度是選自約0.2到約0.7mM的成員。在示例性實(shí)施方案中，PEG化核苷酸糖濃度是選自約0.3到約0.5mM的成員。在示例性實(shí)施方案中，PEG化核苷酸糖濃度是選自約0.4到約1.0mM的成員。在示例性實(shí)施方案中，PEG化核苷酸糖濃度是選自約0.5到約0.7mM的成員。在示例性實(shí)施方案中，PEG化核苷酸糖濃度是選自約0.8到約0.95mM的成員。在示例性實(shí)施方案中，PEG化核苷酸糖濃度是選自約0.55到約1.0mM的成員。
可在本文所述反應(yīng)中使用的PEG化核苷酸糖的摩爾當(dāng)量基于可被附加到蛋白質(zhì)上的PEG化糖的理論數(shù)。PEG化糖的理論數(shù)基于蛋白質(zhì)上的糖位置的理論數(shù)以及當(dāng)與MW比較時蛋白質(zhì)的MW以及由此獲得的PEG化核苷酸糖的摩爾數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，PEG化核苷酸糖的摩爾當(dāng)量是選自1到20的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，PEG化核苷酸糖的摩爾當(dāng)量是選自1到20的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，PEG化核苷酸糖的摩爾當(dāng)量是選自2到6的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，PEG化核苷酸糖的摩爾當(dāng)量是選自3到17的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，PEG化核苷酸糖的摩爾當(dāng)量是選自4到11的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，PEG化核苷酸糖的摩爾當(dāng)量是選自5到20的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，PEG化核苷酸糖的摩爾當(dāng)量是選自1到10的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，PEG化核苷酸糖的摩爾當(dāng)量是選自12到20的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，PEG化核苷酸糖的摩爾當(dāng)量是選自14到17的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，PEG化核苷酸糖的摩爾當(dāng)量是選自7到15的整數(shù)。在示例性實(shí)施方案中，PEG化核苷酸糖的摩爾當(dāng)量是選自8到16的整數(shù)。
III.B.同時進(jìn)行脫唾液酸化和糖PEG化 本發(fā)明提供了糖PEG化的“一鍋燴”方法。一鍋燴方法與其它制備肽綴合物的示例性方法不同，所述其它方法順序地采用用唾液酸酶進(jìn)行脫唾液酸化，然后在陰離子交換柱上進(jìn)行唾液酸化肽的純化，然后使用CMP-唾液酸-PEG和糖基轉(zhuǎn)移酶(諸如ST3Gal3)、外切糖苷酶或內(nèi)切糖苷酶進(jìn)行糖PEG化。然后肽綴合物借助于陰離子交換然后借助于空間排阻色譜進(jìn)行純化，以得到經(jīng)過純化的肽綴合物。
一鍋燴方法是制造肽綴合物的改進(jìn)方法。在該方法中，脫唾液酸化和糖PEG化反應(yīng)在一鍋燴反應(yīng)中合并進(jìn)行，其避免了在前述方法中使用第一陰離子交換色譜步驟來純化唾液酸化肽。這一工藝步驟的減少帶來若干優(yōu)點(diǎn)。第一，制備肽綴合物所需的工藝步驟數(shù)目減少了，這又降低了該方法的操作復(fù)雜性。第二，制備肽綴合物所用的加工時間被減少例如4到2天。這使得減少了與加工過程中的控制有關(guān)的原材料需要和質(zhì)量控制成本。第三，相對于所述方法本發(fā)明采用更少的唾液酸酶，例如，使用最多二十分之一的唾液酸酶，例如需要500mU/L來制備肽綴合物。這一唾液酸酶使用的減少顯著減少了反應(yīng)混合物中的雜質(zhì)諸如唾液酸酶的量。
在示例性實(shí)施方案中，肽綴合物通過以下方法制備。在第一步驟中，將肽與唾液酸酶、本發(fā)明的被修飾的糖和能夠催化糖基連接基團(tuán)從被修飾的糖轉(zhuǎn)移到肽的酶合并，從而制備肽綴合物。在該方法中可使用任何唾液酸酶?？捎糜诒景l(fā)明的示例性的唾液酸酶可在CAZY數(shù)據(jù)庫中找到(參見afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/index.html和www.cazy.org/CAZY)。示例性的唾液酸酶可以購自許多來源(QA-Bio，Calbiochem，Marukin，Prozyme等等)。在示例性實(shí)施方案中，唾液酸酶是選自胞漿唾液酸酶、溶酶體唾液酸酶、外切α唾液酸酶和內(nèi)切唾液酸酶。在另一個示例性實(shí)施方案中，使用的唾液酸酶從細(xì)菌諸如產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)或肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)產(chǎn)生?；驈牟《局T如腺病毒產(chǎn)生。在示例性實(shí)施方案中能夠催化糖基連接基團(tuán)從被修飾的糖轉(zhuǎn)移到肽的酶是選自糖基轉(zhuǎn)移酶，諸如唾液酸轉(zhuǎn)移酶和藻巖糖基轉(zhuǎn)移酶以及內(nèi)切糖苷酶和外切糖苷酶的成員。在示例性實(shí)施方案中，所述酶是糖基轉(zhuǎn)移酶，其是ST3Gal3。在另一個示例性實(shí)施方案中，使用的酶從細(xì)菌諸如大腸埃希桿菌(Escherichia Coli)或真菌諸如黑曲霉(Aspergillus niger)產(chǎn)生。在另一個示例性實(shí)施方案中，唾液酸酶在糖基轉(zhuǎn)移酶之前被加入到肽中達(dá)特定時間，允許唾液酸酶反應(yīng)在添加PEG-唾液酸試劑和糖基轉(zhuǎn)移酶開始糖PEG化反應(yīng)之前進(jìn)行。這些實(shí)施例中有許多在本文中被討論。最后，本文所述的任何被修飾的糖可用在這一反應(yīng)中。
在另一個示例性實(shí)施方案中，所述方法另外包括“加帽”步驟。在這一步驟中，另外的非PEG化唾液酸被添加到反應(yīng)混合物中。在示例性實(shí)施方案中，該唾液酸被附加到肽或肽綴合物上從而防止另外地附加PEG-唾液酸。在另一個示例性實(shí)施方案中，該唾液酸阻止了糖基轉(zhuǎn)移酶在反應(yīng)混合物中發(fā)揮作用，有效地停止了糖基連接基團(tuán)對肽或肽綴合物的附加。最重要地是，被添加到反應(yīng)混合物中的唾液酸將非糖PEG化聚糖進(jìn)行加帽，從而提供了具有改善的藥代動力學(xué)的肽綴合物。另外，當(dāng)需要PEG化程度達(dá)到某一量時，該唾液酸酶無需事先純化可被直接添加到糖PEG化反應(yīng)混合物中。
在示例性實(shí)施方案中，在加帽步驟后，肽或肽綴合物上的低于約50％的唾液酸化部位不包括唾液酸基部分。在示例性實(shí)施方案中，在加帽步驟后，肽或肽綴合物上的低于約40％的唾液酸化部位不包括唾液酸基部分。在示例性實(shí)施方案中，在加帽步驟后，肽或肽綴合物上的低于約30％的唾液酸化部位不包括唾液酸基部分。在示例性實(shí)施方案中，在加帽步驟后，肽或肽綴合物上的低于約20％的唾液酸化部位不包括唾液酸基部分。在示例性實(shí)施方案中，在加帽步驟后，肽或肽綴合物上的低于約10％的唾液酸化部位不包括唾液酸基部分。在示例性實(shí)施方案中，肽或肽綴合物上的約20％到約5％之間的唾液酸化部位不包括唾液酸基部分。在示例性實(shí)施方案中，肽或肽綴合物上的約25％到約10％之間的唾液酸化部位不包括唾液酸基部分。在示例性實(shí)施方案中，在加帽步驟后，肽或肽綴合物上的基本上所有的唾液酸化部位包括唾液酸基部分。
III.C.肽的脫唾液酸化和選擇性修飾 在另一個示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了肽的脫唾液酸化的方法。所述方法優(yōu)選提供了肽，該肽的至少約40％，優(yōu)選45％，優(yōu)選約50％，優(yōu)選約55％，優(yōu)選約60％，優(yōu)選約65％，優(yōu)選約70％，優(yōu)選約75％，優(yōu)選約80％，優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少92％，優(yōu)選至少94％，更優(yōu)選至少96％，更優(yōu)選至少98％和更優(yōu)選100％被脫唾液酸化。
所述方法包括使肽接觸唾液酸酶優(yōu)選達(dá)一定時間段。預(yù)先選定的時段足夠使肽脫唾液酸化到所需程度。在優(yōu)選方案中，當(dāng)實(shí)現(xiàn)所需的脫唾液酸化程度時將脫唾液酸化的肽與唾液酸酶分離。示例性的脫唾液酸化反應(yīng)和純化循環(huán)如本文所述。
本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定進(jìn)行脫唾液酸化反應(yīng)的適當(dāng)?shù)念A(yù)先選定的時段。在示例性實(shí)施方案中，所述時段低于24小時，優(yōu)選低于8小時，更優(yōu)選低于6小時，更優(yōu)選低于4小時，更優(yōu)選低于2小時，更優(yōu)選低于1小時。
在另一個示例性實(shí)施方案中，在脫唾液酸化反應(yīng)的結(jié)尾，在肽綴合物制備物中，肽群體中的成員的至少10％僅具有連接其的單個唾液酸，優(yōu)選至少20％，更優(yōu)選至少30％，更優(yōu)選至少40％，更優(yōu)選至少50％和更優(yōu)選至少60％和更優(yōu)選完全被脫唾液酸化。
在又一個示例性實(shí)施方案中，在脫唾液酸化反應(yīng)的結(jié)尾，在制備物中，肽群體的成員的至少10％完全被脫唾液酸化，優(yōu)選至少20％，更優(yōu)選至少30％，更優(yōu)選至少40％，更優(yōu)選至少50％和更優(yōu)選至少60％完全被脫唾液酸化。
在另一個示例性實(shí)施方案中，在脫唾液酸化反應(yīng)的結(jié)尾，在制備物中，肽群體的成員的至少10％、20％、30％、40％、50％或60％僅具有單個唾液酸，并且肽的至少10％、20％、30％、40％、50％或60％完全被脫唾液酸化。
在優(yōu)選方案中，在脫唾液酸化反應(yīng)的結(jié)尾，在制備物中，肽群體的至少50％完全被脫唾液酸化并且肽群體的成員的至少40％僅攜帶單個唾液酸部分。
在脫唾液酸化之后，所述肽任選地與被修飾的糖綴合。示例性的被修飾的糖包括與支化或線性聚乙二醇部分結(jié)合的糖基部分。所述綴合通過將被修飾的糖從被修飾的糖供體轉(zhuǎn)移到肽的氨基酸或糖基殘基上的酶催化。示例性的被修飾的糖供體是攜帶支化或線性聚乙二醇部分的CMP-唾液酸。示例性的聚乙二醇部分的分子量為至少約2kD，更優(yōu)選至少約5kD，更優(yōu)選至少約10kD，優(yōu)選至少約20kD，更優(yōu)選至少約30kD和更優(yōu)選至少約40kD。
在示例性實(shí)施方案中，用于將被修飾的糖部分從被修飾的糖供體轉(zhuǎn)移的酶是糖基轉(zhuǎn)移酶，例如唾液酸轉(zhuǎn)換酶。在本發(fā)明方法中使用的示例性唾液酸轉(zhuǎn)換酶是ST3Gal3。
本發(fā)明的示例性方法得到了攜帶至少一個，優(yōu)選至少兩個，優(yōu)選至少三個修飾基團(tuán)的被修飾的肽。在一個實(shí)施方案中，得到的肽在肽的輕鏈上攜帶單個修飾基團(tuán)。在另一個實(shí)施方案中，所述方法提供了在重鏈上攜帶單個修飾基團(tuán)的被修飾的肽。在又一個實(shí)施方案中，所述方法提供了在輕鏈上攜帶單個修飾基團(tuán)和在重鏈上攜帶單個修飾基團(tuán)的被修飾的肽。
在另一個方面，本發(fā)明提供了制備被修飾的肽的方法。所述方法包括使得肽與攜帶修飾基團(tuán)的被修飾的糖供體以及能夠?qū)⒈恍揎椀奶遣糠謴谋恍揎椀奶枪w轉(zhuǎn)移到肽的氨基酸或糖基殘基上的酶接觸。
在示例性實(shí)施方案中，所述方法提供了被修飾的肽的群體，其中群體成員的至少40％，優(yōu)選至少50％，優(yōu)選至少60％，更優(yōu)選至少70％和甚至更優(yōu)選至少80％單綴合于肽的輕鏈。
在示例性實(shí)施方案中，所述方法提供了被修飾的肽的群體，其中群體成員的至少40％，優(yōu)選至少50％，優(yōu)選至少60％，更優(yōu)選至少70％和甚至更優(yōu)選至少80％二綴合于肽的輕鏈。
在這一方面的示例性實(shí)施方案中，所述方法提供了被修飾的肽的群體，其中群體成員的至多50％，優(yōu)選至多30％，優(yōu)選至多20％，更優(yōu)選至多10％單綴合于肽的重鏈。
在這一方面的示例性實(shí)施方案中，所述方法提供了被修飾的肽的群體，其中群體成員的至多50％，優(yōu)選至多30％，優(yōu)選至多20％，更優(yōu)選至多10％二綴合于肽的重鏈。
所述肽可以在接觸步驟之前經(jīng)歷唾液酸酶的作用，或者所述肽可以無需事先脫唾液酸化即可使用。當(dāng)所述肽接觸唾液酸酶時，其可以基本上完全地脫唾液酸化或僅僅部分地脫唾液酸化。在優(yōu)選方案中，所述肽在接觸步驟之前至少被部分地脫唾液酸化。肽可基本上完全地脫唾液酸化(基本上脫唾液酸)或僅僅部分地脫唾液酸化。在優(yōu)選方案中，脫唾液酸化肽是如上文所述的脫唾液酸化實(shí)施方案中的一種。
III.D.在肽綴合物合成中被添加的另外等分部分試劑 在本文所述的肽綴合物的合成的示例性實(shí)施方案中，在被選擇時間段后將一個或多個另外等分部分的反應(yīng)組分/試劑添加到反應(yīng)混合物中。在示例性實(shí)施方案中，所述肽綴合物是肽綴合物。在另一個示例性實(shí)施方案中，被添加的反應(yīng)組分/試劑是被修飾的糖核苷酸。向反應(yīng)中引入被修飾的糖核苷酸將增加驅(qū)動糖PEG化反應(yīng)達(dá)到完成的可能性。在示例性實(shí)施方案中，核苷酸糖是本文所述的CMP-SA-PEG。在一示例性實(shí)施方案中，被添加的反應(yīng)組分/試劑是唾液酸酶。在一示例性實(shí)施方案中，被添加的反應(yīng)組分/試劑是糖基轉(zhuǎn)移酶。在一示例性實(shí)施方案中，被添加的反應(yīng)組分/試劑是鎂。在示例性實(shí)施方案中，被添加的另外等分部分表示在反應(yīng)開始時被添加的初始量的約10％或20％或30％或40％或50％或60％或70％或80％或90％。在示例性實(shí)施方案中，反應(yīng)組分/試劑在反應(yīng)開始后的約3小時或6小時或8小時或10小時或12小時或18小時或24小時或30小時或36小時被添加到反應(yīng)中。
III.E.肽綴合物的純化 通過上述方法制備的產(chǎn)品可無需純化直接使用。然而，通常優(yōu)選回收產(chǎn)物和一種或多種中間體，例如核苷酸糖、支化和線性PEG物質(zhì)、被修飾的糖和被修飾的核苷酸糖。用于回收糖基化肽的標(biāo)準(zhǔn)的公知技術(shù)如薄層或厚層色譜法、柱色譜法、離子交換色譜法或膜濾法可被使用。優(yōu)選使用膜濾法，更優(yōu)選使用反向滲透膜，或如下文和本文所引述文獻(xiàn)中討論的用于回收的一種或多種柱色譜技術(shù)。例如，可以使用其中膜的分子量截斷值為約3000到約10,000的膜濾法來除去諸如糖基轉(zhuǎn)移酶的蛋白質(zhì)。在某些情況中，在雜質(zhì)和產(chǎn)物之間的分子量截斷值差異將被利用以確保產(chǎn)物純化。例如，為了從未反應(yīng)的CMP-SA-PEG-40kD純化產(chǎn)物肽-SA-PEG-40kD，必需選擇允許例如肽-SA-PEG-40kD保留在滯留物中并同時允許CMP-SA-PEG-40kD流入濾液中的過濾器。然后可使用納米過濾或反滲透以除去鹽和/或純化產(chǎn)物糖類(例如，參見，WO 98/15581)。納米過濾膜是一類反滲透膜，其根據(jù)所用的膜而異，使一價鹽通過但保留多價鹽和大于約100到約2,000道爾頓的不帶電的溶質(zhì)。因此，在典型的應(yīng)用中，通過本發(fā)明方法制備的糖類將保留在膜中而污染性鹽將流過該膜。
如果所述肽在細(xì)胞內(nèi)被制備，作為第一步，除去微粒碎片，其是宿主細(xì)胞片段或細(xì)胞裂解片段。在糖PEG化之后，PEG化肽通過本領(lǐng)域認(rèn)可的方法進(jìn)行純化，所述方法為例如，離心作用或超濾作用；任選地，所述蛋白質(zhì)可使用市售的蛋白濃縮過濾器進(jìn)行濃縮，然后通過選自以下的一個或多個步驟將多肽變體與其它雜質(zhì)分離免疫親和色譜法，離子交換柱分餾法(例如在二乙氨基乙基(DEAE)上或包含羧甲基或磺丙基基團(tuán)的基質(zhì)上)，在藍(lán)色-瓊脂糖上的色譜法，CM藍(lán)色-瓊脂糖，MONO-Q，MONO-S，扁豆外源凝集素-瓊脂糖，WGA-瓊脂糖，Con A-瓊脂糖，醚Toyopearl、丁基Toyopearl、苯基Toyopearl或蛋白A瓊脂糖，SDS-PAGE色譜法，二氧化硅色譜法，層析聚焦法，反相HPLC(例如具有附加脂族基的硅膠)，使用例如Sephadex分子篩或尺寸排阻色譜的凝膠過濾法，在選擇性結(jié)合多肽的柱上的色譜法，和乙醇或硫酸銨沉淀法?？墒褂眉兓^程將以系列的凝血因子VII/凝血因子VIIa肽綴合物與另外的分離，這在本節(jié)中的后面進(jìn)一步有所描述。
在培養(yǎng)基中產(chǎn)生的被修飾的糖肽通常通過最初從細(xì)胞、酶等中分離出，然后進(jìn)行一種或多種濃縮、鹽析、水溶離子交換或尺寸排阻色譜步驟。另外，被修飾的糖蛋白可通過親和色譜法純化。最后，可采用HPLC用于最終的純化步驟。
可將蛋白酶抑制劑包括在任何上述步驟中以抑制蛋白水解作用，并且可包括抗生素或防腐劑以防止外來污染物的生長。用于上述步驟中的蛋白酶抑制劑可以是低分子量抑制劑，包括抗痛素、α-1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶、亮肽素、阿嗎他定、抑凝乳蛋白酶素、芐脒(banzamidin)、以及其它絲氨酸蛋白醇抑制劑(即serpin)。通常，絲氨酸蛋白酶抑制劑的使用濃度應(yīng)為0.5-100μM，盡管在細(xì)胞培養(yǎng)中抑凝乳蛋白酶素可以高達(dá)200μM的濃度被使用。其它絲氨酸蛋白酶抑制劑將包括對糜蛋白酶樣水解酶、枯草桿菌蛋白酶樣水解酶、α/β水解酶或絲氨酸蛋白酶類的信號肽酶超家族是特異性的抑制劑。除了絲氨酸蛋白酶類之外，還可使用其它類型的蛋白酶抑制劑，包括半胱氨酸蛋白酶抑制劑(1-10μM)和天冬氨酸蛋白酶抑制劑(1-5μM)，以及非特異性蛋白酶抑制劑諸如胃酶抑素(.1-5μM)。用于本發(fā)明的蛋白酶抑制劑還可包括天然蛋白酶抑制劑，諸如從水蛭中分離出的水蛭素(hirustasin)抑制劑。在一些實(shí)施方案中，蛋白酶抑制劑將包括能夠特異性結(jié)合到蛋白酶催化部位以使凝血因子VII/凝血因子VIIa穩(wěn)定而不干擾糖PEG化反應(yīng)的合成肽或抗體。
在另一個實(shí)施方案中，將從產(chǎn)生本發(fā)明的被修飾的糖肽的系統(tǒng)中獲得的上清液首先使用市售的蛋白濃縮過濾器例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元進(jìn)行濃縮。在濃縮步驟之后，將濃縮物加載到適當(dāng)?shù)募兓|(zhì)上。例如，適當(dāng)?shù)挠H合性基質(zhì)可包括結(jié)合于適當(dāng)載體的肽、外源凝集素或抗體分子的配體。作為替代，可采用陰離子交換樹脂，例如，具有DEAE側(cè)基的基質(zhì)或底物。適當(dāng)?shù)幕|(zhì)包括丙烯酰胺、瓊脂糖、右旋糖酐、纖維素或在蛋白純化領(lǐng)域中常用的其它類型。作為替代，可采用陽離子交換步驟。適當(dāng)?shù)年栯x子交換劑包括各種包括磺丙基或羧甲基基團(tuán)的非水溶性基質(zhì)?；潜鶊F(tuán)是特別優(yōu)選的。
用于純化的其它方法包括空間排阻色譜法(SEC)，羥磷灰石色譜法，疏水作用色譜法和藍(lán)色瓊脂糖色譜法。這些方法和其它有用的方法在共同轉(zhuǎn)讓的美國臨時專利(代理號40853-01-5168-P1，2005年5月6日提交)中有所說明。
可采用一種或多種RP-HPLC步驟，該步驟采用疏水性RP-HPLC介質(zhì)，例如具有甲基或其它脂族基側(cè)基的硅膠，以另外純化多肽綴合物組合物。上述純化步驟中的一些或全部，以不同組合，還可被使用以提供均勻的或基本上均勻的被修飾的糖蛋白。
得自大規(guī)模發(fā)酵的本發(fā)明的被修飾的糖肽可以通過類似于Urdal等人J.Chromatog.296171(1984)所公開的那些方法進(jìn)行純化。該文獻(xiàn)描述了兩個順序進(jìn)行的RP-HPLC步驟用于在制備性HPLC柱上純化重組人IL-2。作為替代，可采用諸如親和色譜法的技術(shù)以純化被修飾的糖蛋白。
在示例性實(shí)施方案中，所述純化通過在共同擁有、共同轉(zhuǎn)讓的美國臨時專利No.60/665,588(2005年3月24日提交)中所述的方法實(shí)現(xiàn)。
根據(jù)本發(fā)明，借助于順序進(jìn)行的脫唾液酸化或同時進(jìn)行的唾液酸化制備的PEG化肽或肽綴合物可以使用氯化鎂梯度進(jìn)行純化或拆分。
IV.藥物組合物 在另一個方面，本發(fā)明提供了藥物組合物。該藥物組合物包括藥學(xué)上可接受的稀釋劑和在非天然存在PEG部分、治療性部分或生物分子與糖基化的或非糖基化的肽之間的共價綴合物。所述聚合物、治療性部分或生物分子借助于完整的糖基連接基團(tuán)綴合于肽，所述完整的糖基連接基團(tuán)插入到肽與聚合物、治療性部分或生物分子之間并且與之共價連接。
本發(fā)明的藥物組合物適合用在許多藥物遞送系統(tǒng)中。用于本發(fā)明的適當(dāng)?shù)闹苿┰赗emington′s Pharmaceutical Sciences，MacePublishing Company，Philadelphia，PA，17th ed.(1985)中發(fā)現(xiàn)。關(guān)于藥物遞送方法的簡述，參見，Langer，Science 2491527-1533(1990)。
在示例性實(shí)施方案中，藥物制劑包括肽綴合物和藥學(xué)上可接受的稀釋劑，所述藥學(xué)上可接受的稀釋劑是選自以下的成員氯化鈉、二水合氯化鈣、甘氨酰甘氨酸、聚山梨酸酯80和甘露醇。在另一個示例性實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的稀釋劑是氯化鈉和甘氨酰甘氨酸。在另一個示例性實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的稀釋劑是二水合氯化鈣和聚山梨酯80。在另一個示例性實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的稀釋劑是甘露醇。
藥物組合物可被配制成用于任何適當(dāng)?shù)慕o藥方式，包括例如，局部，經(jīng)口，經(jīng)鼻，靜脈內(nèi)，顱內(nèi)，腹膜內(nèi)，皮下或肌肉內(nèi)給藥。對于腸胃外給藥，諸如皮下注射，載體優(yōu)選包括水、鹽水、醇、脂類、蠟或緩沖液。對于口服給藥，可使用上述的任何載體或固體載體，諸如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖和碳酸鎂。生物可降解型微球(例如聚乳酸酯，聚乙醇酸酯)也可用作本發(fā)明的藥物組合物的載體。適當(dāng)?shù)纳锟山到庑臀⑶蚬_在例如美國專利Nos.4,897,268和5,075,109中。
通常，藥物組合物通過腸胃外給藥，例如靜脈內(nèi)給藥。因此，本發(fā)明提供了用于腸胃外給藥的組合物，其包括被溶解或懸浮在可接受的載體中的化合物，所述可接受的載體優(yōu)選是水性載體，例如水、緩沖水、鹽水、PBS等等。組合物可包括根據(jù)需要以接近生理學(xué)條件的藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)，諸如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑，張力調(diào)節(jié)劑，潤濕劑，洗滌劑等等。
這些組合物可通過常規(guī)滅菌技術(shù)進(jìn)行殺菌，或者可進(jìn)行無菌過濾。所得的水性溶液可被包裝以直接使用，或者被凍干，該凍干制劑與無菌水性載體在給藥前被合并。制劑的pH代表性地為3-11，更優(yōu)選為5-9，和最優(yōu)選為7-8。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的糖肽可被并入到由標(biāo)準(zhǔn)的形成囊泡的脂質(zhì)所形成的脂質(zhì)體內(nèi)。用于制備脂質(zhì)體的可獲得方法描述于，例如，Szoka等人，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9467(1980)，美國專利Nos.4,235,871，4,501,728和4,837,028。使用多種靶向劑(例如本發(fā)明的唾液酸基半乳糖苷)的脂質(zhì)體的靶向是本領(lǐng)域公知的(例如，參見，美國專利Nos.4,957,773和4,603,044)。
可使用將靶向劑與脂質(zhì)體結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)方法。這些方法通常包括并入脂質(zhì)組分到脂質(zhì)體中，所述脂質(zhì)組分是諸如可被活化用于連接靶向劑的磷脂酰乙醇胺或者是諸如本發(fā)明的用脂質(zhì)進(jìn)行衍生化的糖肽的衍生化親脂性化合物。
靶向機(jī)制通常要求靶向劑被布置到脂質(zhì)體的表面上，布置方式為使得靶標(biāo)部分可被獲得以用于與靶標(biāo)例如細(xì)胞表面受體相互作用。本發(fā)明的碳水化合物可以在采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法形成脂質(zhì)體之前連接于脂質(zhì)分子上(例如，分別使用長鏈烷基鹵或使用脂肪酸分別將碳水化合物上的羥基進(jìn)行烷基化或?；?。作為替代，脂質(zhì)體的形成方式為首先在膜形成時將連接體部分引入到膜中。連接體部分必需具有親脂性部分，其被穩(wěn)固地包埋和錨定在膜中。其還必須具有反應(yīng)性部分，該反應(yīng)性部分在脂質(zhì)體的水性表面上可被化學(xué)利用。該反應(yīng)性部分經(jīng)過選擇從而使得其在化學(xué)上適合與隨后要附加的靶向劑或碳水化合物形成穩(wěn)定的化學(xué)鍵。在一些情況下，有可能將靶向劑直接附加到連接體分子上，但是在大多數(shù)情況下，更適合使用第三分子來擔(dān)當(dāng)化學(xué)橋，從而將處于膜內(nèi)的連接體分子與在囊泡表面上三維延伸的靶向劑或碳水化合物連接。
通過本發(fā)明方法制備的化合物還可用作診斷試劑。例如，可使用標(biāo)記化合物定位被懷疑罹患炎癥的患者內(nèi)的炎癥或腫瘤轉(zhuǎn)移區(qū)域。對于這一用途，化合物可以用125I、14C或氚標(biāo)記。
可用于制備在本發(fā)明組合物的制備中使用的物質(zhì)的方法通常描述于各種專利公開中，例如，US 20040137557；WO 04/083258；以及WO 04/033651。提供以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明的綴合物和方法，但是其不限制本發(fā)明權(quán)利要求書的保護(hù)范圍。

具體實(shí)施例方式 實(shí)施例1 凝血因子VIIa的制備 在無血清培養(yǎng)基中表達(dá)的凝血因子VIIa，在含血清培養(yǎng)基中產(chǎn)生的凝血因子VIIa，加上三個凝血因子VIIa突變體N145Q、N322Q和類似物DVQ(V158D/E296V/M298Q)。
在酶促脫唾液酸化的制備中，凝血因子VIIa被透析進(jìn)入位于具有10kD MWCO的Snakeskin透析管內(nèi)的在4℃下過夜的MES，150mMNaCl、5mM CaCl2、50mM MES(pH 6)。凝血因子VIIa(1mg/mL)的脫唾液酸化使用得自產(chǎn)脲節(jié)桿菌(Arthrobacterureafaciens)(Calbioehem)的10U/L可溶性唾液酸酶在32℃下在交換的緩沖液中進(jìn)行18小時。
實(shí)施例2 凝血因子VIIa的唾液酸-PEG化。
使用100U/L的ST3Gal-III和200μM的CMP-唾液酸-PEG(40kD、20kD、10kD、5kD和2kD)在32℃在脫唾液酸化緩沖液中進(jìn)行脫唾液酸-凝血因子VIIa(1mg/mL)的唾液酸-PEG化(“糖PEG化”)達(dá)2-6小時。在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)時間已經(jīng)屆滿時，立刻將PEG化樣品進(jìn)行純化以使得另外發(fā)生糖PEG化的程度最小化。
為了使用用唾液酸加帽的樣品對糖PEG化凝血因子VII/凝血因子VIIa進(jìn)行加帽，首先通過如下所示的陰離子交換色譜法從脫唾液酸-凝血因子VIIa除去唾液酸酶。添加過量的CMP-唾液酸(5mM)并且在32℃培養(yǎng)2小時，用唾液酸對糖PEG化凝血因子VIIa進(jìn)行加帽。凝血因子VIIa的唾液酸-PEG化形式通過如Invitrogen所述的非還原性SDS-PAGE(Tris-甘氨酸凝膠和/或NuPAGE凝膠)和膠質(zhì)藍(lán)色染色試劑盒進(jìn)行分析。
實(shí)施例3 PEG化凝血因子VIIa的純化。
凝血因子VIIa的糖PEG化樣品使用改進(jìn)的陰離子交換方法進(jìn)行純化。樣品在5℃進(jìn)行處理。在即將裝柱之前，將每10mL凝血因子VIIa溶液為1克Chelex 100(BioRad)添加到重制樣品中。在攪拌10分鐘后，將懸浮液在醋酸纖維膜(0.2μm)上使用真空系統(tǒng)進(jìn)行過濾。保持在濾波器上的螯合劑樹脂用每10mL體積為1-2mL水洗滌。濾液的電導(dǎo)率被調(diào)節(jié)為在5℃下為10mS/cm，并且，如有必要，調(diào)節(jié)到pH 8.6。
在8-10℃進(jìn)行陰離子交換。在裝柱前通過用1M NaOH(10個柱體積)、水(5個柱體積)、2M NaCl、50mM HOAc，pH 3(10個柱體積)洗滌，并用175mM NaCl、10mM甘氨酰甘氨酸，pH 8.6(10個柱體積)平衡來制備包含Q瓊脂糖FF的柱。對于每個PEG化反應(yīng)，將15-20mg凝血因子VIIa以100cm/h的流速裝載到具有10mL的Q瓊脂糖FF(每毫升樹脂最多2毫克蛋白)的XK16柱上(Amersham Biosciences)。對于2kD的線性PEG，將20mg凝血因子VIIa以100cm/h的流速裝載到具有40mL的Q瓊脂糖FF(每毫升樹脂0.5毫克蛋白)的XK26柱上(Amersham Biosciences)。
在裝載后，將柱用175mM NaCl、10mM甘氨酰甘氨酸，pH 8.6(10個柱體積)和50mM NaCl、10mM甘氨酰甘氨酸，pH 8.6(2個柱體積)洗滌。通過使用50mM NaCl、10mM甘氨酰甘氨酸、15mM CaCl2，pH 8.6(5個柱體積)進(jìn)行15mM CaCl2的階段梯度洗脫。然后將柱用1MNaCl、10mM甘氨酰甘氨酸，pH 8.6(5個柱體積)洗滌。流出物通過在280nm下的吸光度進(jìn)行監(jiān)控。在流過柱子期間和在兩次洗滌期間收集級分(5mL)；在用CaCl2和1M鹽洗脫期間收集2.5mL級分。包含凝血因子VIIa的級分通過非還原性SDS-PAGE(Tris-甘氨酸凝膠和/或NUPAGE凝膠)和膠質(zhì)藍(lán)色染色試劑盒進(jìn)行分析。包含凝血因子VIIa的適當(dāng)?shù)募壏直粎R集，并且用4M HCl調(diào)節(jié)pH到7.2。
凝血因子VIIa-SA-PEG-10kD如上所述進(jìn)行純化，除去具有以下變化之外。將EDTA(10mM)加入到PEG化的凝血因子VIIa溶液中，調(diào)節(jié)pH到6，然后調(diào)節(jié)電導(dǎo)率在5℃下為5mS/cm。將約20mg的凝血因子VIIa-SA-PEG-10kD以100cm/h的流速裝載到具有10mL Poros 50Micron HQ樹脂(每毫升樹脂至多2毫克蛋白)的XK16柱(AmershamBiosciences)上。在裝載后，將柱用175mM NaCl、10mM組氨酸，pH6(10個柱體積)和50mM NaCl、10mM組氨酸，pH 6(2個柱體積)洗滌。使用在50mM NaCl、10mM組氨酸(pH 6)中的20mM CaCl2(5個柱體積)進(jìn)行階段梯度洗脫。然后將柱用1M NaCl、10mM組氨酸，pH 6(5個柱體積)洗滌。
包含凝血因子VIIa-SA-PEG-10kD(25mL)的陰離子交換洗脫物通過使用Amicon Ultra-15 10K離心濾器裝置，根據(jù)該廠家的指導(dǎo)(Millipore)被濃縮到5-7mL。在濃縮后，進(jìn)行空間排阻色譜。將樣品(5-7mL)裝載到對于大部分PEG化變體而言在50mM NaCl、10mM甘氨酰甘氨酸、15mM CaCl2(pH 7.2)中進(jìn)行平衡的包含Superdex 200的柱上(HiLoad 16/60，制備級；Amersham Biosciences)。以1mL/分鐘的流速并在280nm下監(jiān)控吸光度而將凝血因子VIIa-SA-PEG-10kD與未經(jīng)修飾的脫唾液酸-凝血因子VIIa分離。包含凝血因子VIIa的級分(1mL)被收集并通過非還原性SDS-PAGE(Tris-甘氨酸凝膠和/或NuPAGE凝膠)和膠質(zhì)藍(lán)色染色試劑盒進(jìn)行分析。包含被靶向的PEG化同工型并缺乏未經(jīng)修飾的脫唾液酸-凝血因子VIIa的級分被匯集并使用Amicon Ultra-1510K離心濾器裝置被濃縮到1mg/mL。使用1.37(mg/mL)-1cm-1的消光系數(shù)在280納米的吸光度讀數(shù)測定蛋白濃度。
實(shí)施例4 通過反相HPLC分析測定PEG化同工型 PEG化凝血因子VIIa通過在反相柱(Zorbax 300SB-C3，5μm粒度，2.1×150mm)上進(jìn)行HPLC進(jìn)行分析。洗提液是A)0.1TFA，在水中，和B)0.09％TFA，在乙腈中。在214nm下進(jìn)行檢測。梯度、流速和柱溫因PEG長度的不同而異(40kD、20kD和10kD PEG35-65％B，在30分鐘內(nèi)，0.5mL/min，45℃；10kD PEG35-60％B，在30分鐘內(nèi)，0.5mL/min，45℃；5kD40-50％B，在40分鐘內(nèi)，0.5mL/min，45℃；2kD38-43％B，在67分鐘內(nèi)，0.6mL/min，55℃)?；谝韵碌乃念惒煌C據(jù)中的兩種或更多種對每個峰值進(jìn)行歸屬天然凝血因子VIIa的已知保留時間，分離峰的SDS-PAGE移動，分離峰的MALDI-TOF質(zhì)譜，和每個增加數(shù)目的附加PEG的峰的保留時間的順序級數(shù)。
實(shí)施例5 通過反相HPLC測定PEG的連接部位。
凝血因子VIIa和PEG化凝血因子VIIa變體通過將樣品(10μL，在1mg/mL濃度下)與還原緩沖液(40μL，50mM NaCl、10mM甘氨酰甘氨酸、15mM EDTA、8M脲、20mM DTT，pH8.6)混合在室溫下進(jìn)行還原15分鐘。加入水(50μL)并將樣品冷卻到4℃直到注射到HPLC之前(＜12小時)。HPLC柱、洗提液和檢測上述關(guān)于非還原性樣品那樣進(jìn)行。流速是0.5mL/min并且梯度是在90分鐘內(nèi)為30-55％B，然后是短暫的洗滌循環(huán)直到90％B。如實(shí)施例4所述對每個峰進(jìn)行歸屬。
實(shí)施例6 凝血因子VIIa凝固試驗(yàn)。
PEG化樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品以一式兩份進(jìn)行試驗(yàn)，并在100mM NaCl、5mM CaCl2、0.1％BSA(wt/vol)50mM Tris，pH 7.4中被稀釋。標(biāo)準(zhǔn)樣品和樣品在0.1到10ng/mL的范圍內(nèi)進(jìn)行檢測。將相等體積的被稀釋的標(biāo)準(zhǔn)樣品和樣品與缺乏凝血因子VIIa的血漿(Diagnostica Stago)混合，并在冰上保存不大于4小時，然后對其進(jìn)行檢測。
凝血時間使用STart4血凝度計(Diagnostica Stago)進(jìn)行測量。血凝度計測量直到體外血液凝固之前所消釋的時間，由在樣品池中磁性球的溫和的往復(fù)運(yùn)動的停止來顯示。
向每個池中，沉淀有一個磁性球，加上100μL凝血因子VIIa樣品/缺乏凝血因子VIIa的血漿和100μL的被稀釋的大鼠腦腦磷脂溶液(在冰上保存不大于4小時)。每個試劑在每孔之間在5秒內(nèi)被添加，并且最終的混合物在37℃培養(yǎng)300秒。被稀釋的大鼠腦腦磷脂(RBC)溶液由以下組成制成2mL RBC儲備溶液(1小瓶RBC儲備溶液，得自Haemachem，加上10mL的150mM NaCl)和4mL 100mM NaCl、5mM CaCl2、0.1％BSA(wt/vol)、50mM Tris，pH 7.4。
在300秒，通過加入可溶性組織因子(2μg/mL；氨基酸1-209)在100mM NaCl、12.5mM CaCl2、0.1％BSA(wt/vol)、50mM Tris，pH 7.4中的100μL的預(yù)熱(37℃)溶液開始試驗(yàn)。再次，在樣品之前以5秒為間隔添加下一次該溶液。
從被稀釋的標(biāo)準(zhǔn)樣品獲得的凝血時間用于產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線(log凝血時間log凝血因子VIIa濃度)。從該曲線獲得的線性回歸用于測定PEG化變體的相對凝血活性。PEG化凝血因子VIIa變體相對于凝血因子VIIa的等分部分儲備溶液進(jìn)行比較。
實(shí)施例7 在BHK細(xì)胞中產(chǎn)生的重組凝血因子VIIa的糖PEG化。
這一實(shí)施例闡述了在BHK細(xì)胞中產(chǎn)生的重組凝血因子VIIa的PEG化。
脫唾液酸-凝血因子VIIa的制備。在BHK細(xì)胞(小倉鼠腎細(xì)胞)中產(chǎn)生重組凝血因子VIIa。將凝血因子VIIa(14.2mg)以1mg/mL溶解在緩沖溶液中(pH 7.4，0.05M Tris、0.15M NaCl、0.001M CaCl2、0.05％NaN3)并且與300mU/mL唾液酸酶(霍亂弧菌(Vibriocholera))-瓊脂糖綴合物在32℃培養(yǎng)3天。為了監(jiān)控反應(yīng)，將等分部分反應(yīng)物用適當(dāng)?shù)木彌_液稀釋，并根據(jù)Invitrogen程序(圖157)進(jìn)行IEF凝膠法。將混合物在3,500rpm下離心并收集上清液。將樹脂用以上所述的緩沖溶液(pH 7.4，0.05M Tris、0.15M NaCl、0.05％NaN3)洗滌三次(3×2ml)，并將合并的洗液在Centricon-Plus-20中進(jìn)行濃縮。剩余的溶液用0.05M Tris(pH 7.4)、0.15M NaCl、0.05％NaN3進(jìn)行緩沖液交換到14.4mL的最終體積。
凝血因子VIIa-SA-PEG-1kD和凝血因子VIIa-SA-PEG-10kD的制備。將凝血因子VIIa溶液的脫唾液酸化物分成兩份相等的7.2mL樣品。向每個樣品中加入CMP-SA-PEG-1kD(7.4mg)或CMP-SA-PEG-10kD(7.4mg)。ST3Gal3(1.58U)被加入到兩個試管中并將反應(yīng)混合物在32℃培養(yǎng)96小時。通過SDS-PAGE凝膠并使用Invitrogen所述的試劑和條件監(jiān)控反應(yīng)。當(dāng)反應(yīng)完成時，使用TosoHaas TSK-Gel-3000制備柱，使用PBS緩沖液(pH 7.1)并基于UV吸收收集級分對反應(yīng)混合物進(jìn)行純化。被合并的包含產(chǎn)物的級分在4℃下在Centricon-Plus-20離心濾器(Millipore，Bedford，MA)中被濃縮，并且將被濃縮的溶液進(jìn)行重新配制以獲得1.97mg(雙喹啉甲酸蛋白試驗(yàn)，BCA試驗(yàn)，Sigma-Aldrich，St.Louis MO)的凝血因子VIIa-SA-PEG。該反應(yīng)產(chǎn)物使用SDS-PAGE和IEF分析并根據(jù)Invitrogen提供的程序和試劑進(jìn)行分析。樣品相對于水進(jìn)行透析并通過MALDI-TOF進(jìn)行分析。
實(shí)施例8 凝血因子VIIa-SA-PEG-10kD一鍋燴方法 將凝血因子VIIa(5mg，在產(chǎn)物制劑緩沖液中被稀釋到1mg/mL的最終濃度)、CMP-SA-PEG-10kD(10mM，60μL)和黑曲霉酶ST3Gal3(33U/L)以及10mM組氨酸、50mM NaCl、20mM CaCl2與10U/L、1U/L、0.5U/L或0.1U/L的唾液酸酶(CalBiochem)一起合并到反應(yīng)容器中。將各成分混合并在32℃培養(yǎng)。反應(yīng)進(jìn)展通過以30分鐘為間隔在前4小時內(nèi)對等分部分反應(yīng)物進(jìn)行分析來測量。然后在20小時的時間點(diǎn)取出等分部分反應(yīng)物并進(jìn)行SDS-PAGE。通過在1.5、2.5和3.5小時時間點(diǎn)取出1mL并將樣品在Poros 50HQ柱上進(jìn)行純化來測定PEG化程度。
對于包含10U/L的唾液酸酶的反應(yīng)條件而言，沒有形成明顯量的凝血因子VIIa-SA-PEG產(chǎn)物。對于包含1U/L的唾液酸酶的反應(yīng)條件而言，在反應(yīng)混合物中約17.6％的凝血因子VIIa在1.5小時后被單PEG化或雙PEG化。這在2.5小時后增加到29％，和在3.5小時后增加到40.3％。對于包含0.5U/L的唾液酸酶的反應(yīng)條件而言，在反應(yīng)混合物中約44.5％的凝血因子VIIa在3小時后被單PEG化或雙PEG化，并且0.8％被三PEG化或更高PEG化。在20小時后，69.4％被單PEG化或雙PEG化，并且18.3％被三PEG化或更高PEG化。
對于包含0.1U/L的唾液酸酶的反應(yīng)條件而言，在反應(yīng)混合物中約29.6％的凝血因子VIIa在3小時后被單PEG化或雙PEG化。在20小時后，71.3％被單PEG化或雙PEG化，并且15.1％被三PEG化或更高PEG化。
實(shí)施例9 半胱氨酸-PEG2(2)的制備
a.化合物1的合成 氫氧化鉀(84.2mg，1.5mmol，作為粉末)在氬氣下被加入到L-半胱氨酸(93.7mg，0.75mmol)在無水甲醇(20L)中的溶液中?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?0分鐘，然后在2小時內(nèi)分幾部分加入分子量為20千道爾頓的mPEG-O-甲苯磺酸酯(Ts；1.0g，0.05mmol)，混合物在室溫下攪拌5天，并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行濃縮，殘余物用水(30mL)稀釋，并在室溫下攪拌2天以破壞任何過量的20千道爾頓的mPEG-O-甲苯磺酸酯。然后溶液用乙酸中和，調(diào)節(jié)pH到pH 5.0并裝載到反相色譜(C-18二氧化硅)柱上。該柱用甲醇/水梯度洗脫(產(chǎn)物在約70％甲醇處被洗脫)，通過蒸發(fā)光散射監(jiān)控產(chǎn)物洗脫液，并且收集適當(dāng)?shù)募壏植⒂盟?500mL)稀釋。該溶液進(jìn)行色譜分離(離子交換，XK 50Q，BIG珠，300mL，氫氧化物形式；水到水/乙酸-0.75N的梯度)，并且用乙酸將適當(dāng)?shù)募壏值膒H降低到6.0，然后該溶液被裝載到反相柱(C-18二氧化硅)上并用甲醇/水的梯度如上所述進(jìn)行洗脫，產(chǎn)物級分被匯集，濃縮，并再溶解在水中并冷凍干燥，得到453mg(44％)的白色固體(1)。
化合物的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)如下所示1H-NMR(500MHz；D2O)δ2.83(t，2H，O-C-CH2-S)，3.05(q，1H，S-CHH-CHN)，3.18(q，1H，(q，1H，S-CHH-CHN)，3.38(s，3H，CH3O)，3.7(t，OCH2CH2O)，3.95(q，1H，CHN)。產(chǎn)物的純度通過SDS PAGE證實(shí)。
b.半胱氨酸-PEG2(2)的合成 將三乙胺(～0.5mL)滴加到溶解在無水CH2Cl2(30mL)中的化合物1(440mg，22μmol)的溶液中，直到溶液呈堿性。在1小時內(nèi)在室溫下分幾個部分加入20千道爾頓的mPEG-O-對硝基苯基碳酸酯(660mg，33μmol)和N-羥基琥珀酰亞胺(3.6mg，30.8μmol)在CH2Cl2(20mL)中的溶液，反應(yīng)混合物在室溫下攪拌24小時，然后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，將殘余物溶解在水(100mL)中，并用1.0N NaOH調(diào)節(jié)pH到9.5，將堿性溶液在室溫下攪拌2小時然后用乙酸中和到pH 7.0。然后將溶液裝載到反相色譜(C-18二氧化硅)柱上，將該柱用甲醇/水梯度洗脫(產(chǎn)物在約70％甲醇處被洗脫)，通過蒸發(fā)光散射監(jiān)控產(chǎn)物洗脫液，并且收集適當(dāng)?shù)募壏植⒂盟?500mL)稀釋，該溶液進(jìn)行色譜分離(離子交換，XK 50 Q，BIG珠，300mL，氫氧化物形式；從水到水/乙酸-0.75N梯度)，并且用乙酸將適當(dāng)?shù)募壏值膒H降低到6.0，然后將該溶液裝載到反相柱(C-18二氧化硅)上并用甲醇/水如上所述進(jìn)行梯度洗脫。將產(chǎn)物級分匯集，濃縮，再溶解在水中并冷凍干燥，得到575mg(70％)的白色固體(2)。
化合物的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)如下所示1H-NMR(500MHz；D2O)δ2.83(t，2H，O-C-CH2-S)，2.95(t，2H，O-C-CH2-S)，3.12(q，1H，S-CHH-CHN)，3.39(s，3H CH3O)，3.71(t，OCH2CH2O)。產(chǎn)物的純度通過SDSPAGE證實(shí)。
實(shí)施例10 凝血因子VIIa-SA-PEG-40kD 凝血因子VIIa的糖PEG化(帶有加帽的一鍋燴方法)。凝血因子VIIa的糖PEG化以一鍋燴反應(yīng)完成，其中脫唾液酸化和PEG化同時進(jìn)行，然后用唾液酸進(jìn)行加帽。反應(yīng)在通過再循環(huán)水浴鍋被控制在32℃的夾套式玻璃容器中進(jìn)行。首先，將濃縮的經(jīng)0.2μm-過濾的凝血因子VIIa引入到容器中并通過與攪動棒混合被加熱到32℃達(dá)20分鐘。唾液酸酶的溶液由在10mM組氨酸/50mM NaCl/20mM CaCl2，pH 6.0中的在4,000U/L濃度下的干粉組成。當(dāng)凝血因子VIIa達(dá)到32℃時，將唾液酸酶加入到凝血因子VIIa中，反應(yīng)混合約5分鐘以確保之后停止混合后是均勻的溶液。在32℃進(jìn)行脫唾液酸化1.0小時，在脫唾液酸化反應(yīng)期間，將CMP-SA-PEG-40kD溶解在10mM組氨酸/50mM NaCl/20mM CaCl2，pH 6.0的緩沖液中，通過在271nm的UV吸光度測定濃度。在CMP-SA-PEG-40kD溶解后，將CMP-SA-PEG-40kD以及ST3Gal3加入到反應(yīng)中，并且用攪動棒將反應(yīng)混合約15分鐘以確保獲得均勻的溶液。加入另外85mL體積的緩沖液使反應(yīng)達(dá)1.0升。在無攪拌條件下允許反應(yīng)進(jìn)行24小時，然后加入CMP-SA到4.3mM的濃度以將反應(yīng)淬滅，并且用唾液酸將剩余的末端半乳糖殘基進(jìn)行加帽。允許淬滅在32℃下混合30分鐘得以繼續(xù)進(jìn)行。在淬滅前總的反應(yīng)體積是1.0升。在0、4.5、7.5和24小時取得時間點(diǎn)樣品(1毫升)，用CMP-SA淬滅，并通過RP-HPLC和SDS-PAGE進(jìn)行分析。
凝血因子VIIa-SA-PEG-40kD的純化。在加帽后，將溶液用2.0L的10mM組氨酸(pH 6.0)稀釋，其已經(jīng)在4℃下保存過夜，并將樣品通過0.2μm Millipak 60過濾器過濾。得到的裝載體積是3.1升。在20-25℃(周圍室溫下)在Akta Pilot系統(tǒng)上進(jìn)行AEX2色譜分離。在裝柱后，進(jìn)行10個柱體積的平衡緩沖液洗滌，使用10個柱體積梯度的MgCl2將產(chǎn)物從柱上洗脫，其從未PEG化凝血因子VIIa中拆分出PEG化-凝血因子VIIa物質(zhì)。對于該柱裝載量有意地被保持較低，目標(biāo)是＜2mg凝血因子VIIa/mL樹脂。對所選擇的級分進(jìn)行SDS-PAGE凝膠法加上RP-HPLC分析，并且匯集級分以獲得散裝產(chǎn)物匯集物。將匯集的級分用1M NaOH調(diào)節(jié)到pH 6.0并在2-8℃的冷室中保存過夜。
最終濃縮/透析、無菌過濾和分等分部分。將匯集的級分過濾通過Millipak 200.2μm過濾器并在2-80℃下保存過夜。為了進(jìn)行濃縮/透析，在裝有蠕動泵和硅氧烷管的系統(tǒng)中使用Millipore 0.1m2 30kD再生纖維素膜，該系統(tǒng)被裝配并用水齊平，然后用0.1M NaOH消毒至少1小時，然后保存在0.1M NaOH中直到到10mM組氨酸/5mMCaCl2/100 mM NaCl(pH 6.0)透析緩沖液在即將使用前進(jìn)行平衡。將產(chǎn)物濃縮到約400mL然后在恒定體積下用約5透析體積的緩沖液進(jìn)行透析。產(chǎn)物然后被濃縮到約300mL并且在低壓再循環(huán)中恢復(fù)5分鐘，將膜用200mL的透析緩沖液通過再循環(huán)5分鐘進(jìn)行漂洗。收集洗滌液的產(chǎn)物，并將另外50mL的緩沖液再循環(huán)達(dá)另外5分鐘用于最后一次洗滌。所得體積為約510 mL，將其過濾通過裝有0.2μm PES膜(Millipore)的1L真空過濾器，然后將經(jīng)過無菌過濾的體積在50mL無菌falcon管中分成25mL等分部分并在-80℃下冷凍。
通過HPLC分析PEG化反應(yīng)(實(shí)施例10)
在24小時后，大批產(chǎn)物PEG-狀態(tài)分布如下0.7％未PEG化，85.3％單PEG化，11.5％二PEG化，和0.3％三PEG化。柱色譜法在主要通過從單PEG化和二PEG化物質(zhì)中除去未PEG化物質(zhì)而獲得產(chǎn)物分布的過程中是主要步驟。
可以理解的是，本文所述的實(shí)施例和實(shí)施方案僅僅用于示例說明的目的并且根據(jù)其進(jìn)行的各種修改或改變將暗示于本領(lǐng)域技術(shù)人員并且被包含在本申請的精神和范圍權(quán)利要求書的保護(hù)范圍內(nèi)。本說明書中引述的所有的公開、專利和專利申請全文并入本文用于所有目的。
權(quán)利要求
1.肽綴合物，其包含
a)肽，其共價連接于作為選自以下的成員的部分
其中R2是選自H、CH2OR7、COOR7和OR7的成員，
其中R7是選自H、被取代的或未被取代的烷基和被取代的或未被取代的雜烷基的成員；
R3、R4、R5和R6是獨(dú)立地選自H、被取代的或未被取代的烷基、OR8和NHC(O)R9的成員；
其中R8和R9獨(dú)立地選自H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的雜烷基、唾液酸和多聚唾液酸；
并且其中R3、R4、R5、R6中的至少一個包括作為選自以下的成員的部分
其中下標(biāo)m和n是獨(dú)立地選自1到1000的整數(shù)；
A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10和A11是獨(dú)立地選自H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的雜烷基、被取代的或未被取代的環(huán)烷基、被取代的或未被取代的雜環(huán)烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的雜芳基、-NA12A13、-OA12和-SiA12A13的成員；
其中
A12和A13是獨(dú)立地選自被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的雜烷基、被取代的或未被取代的環(huán)烷基、被取代的或未被取代的雜環(huán)烷基、被取代的或未被取代的芳基和被取代的或未被取代的雜芳基的成員。
2.權(quán)利要求1的肽綴合物，其中所述R3、R4、R5、R6中的至少一個包括作為選自以下的成員的部分
3.權(quán)利要求1的肽綴合物，其中所述部分是選自以下的成員
4.權(quán)利要求1的肽綴合物，其中肽綴合物中的所述肽是選自以下的成員骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(BMP-7)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-15(BMP-15)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3(NT-3)、馮·維勒布蘭德氏因子(vWF)蛋白酶、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII、具有全長因子VIII的vWF-因子VIII融合蛋白、具有B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII的vWF-因子VIII融合蛋白、紅細(xì)胞生成素(EPO)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素α、干擾素β、干擾素γ、α1-抗胰蛋白酶(ATT，或α-1蛋白酶抑制劑)、葡糖腦苷脂酶、組織型纖溶酶原激活物(TPA)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、尿激酶、人脫氧核糖核酸酶、胰島素、乙型肝炎表面蛋白(HbsAg)、人生長激素、TNF受體-IgG Fc區(qū)域融合蛋白(EnbrelTM)、抗-HER2單克隆抗體(HerceptinTM)、呼吸道合胞病毒的蛋白F的單克隆抗體(SynagisTM)、TNF-α的單克隆抗體(RemicadeTM)、糖蛋白IIb/IIIa的單克隆抗體(ReoproTM)、CD20的單克隆抗體(RituxanTM)、抗凝血酶III(AT III)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、α-半乳糖苷酶(FabrazymeTM)、α-艾杜糖醛酸酶(AldurazymeTM)、促卵泡激素、β-葡糖苷酶、抗-TNF-α單克隆抗體(MLB5075)、胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、胰高血糖素樣肽-2(GLP-2)、β-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶A和成纖維細(xì)胞生長因子。
全文摘要
本發(fā)明提供了在肽和PEG部分之間通過甘油連接體形成的綴合物。
文檔編號A61K38/16GK101600448SQ200780042865
公開日2009年12月9日 申請日期2007年10月4日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月4日
發(fā)明者S·德弗里斯, 曾孝農(nóng) 申請人:諾和諾德公司