專利名稱：抗淀粉樣蛋白免疫原性組合物、方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及包含AP42的片段和載體(carrier)的免疫原性構
建體、該構建體的產生方法和用途，所述構建體的特征在于，所述片 段位于栽體的活性環(huán)位置(展示位置)內。
背景技術：
淀粉樣蛋白生成性(Amyloidogenic)病癥如阿爾茨海默病(AD) 一直公認為老年人癡呆的主要原因。AD中的認知能力的下降與腦中的 組織病理學變化相關，最相關的是淀粉樣蛋白斑(amyloid plaque) 和神經原纖維纏結(neurofibrilary tangle)的形成。
雖然淀粉樣蛋白斑包含許多蛋白質，但它們的主要成分為淀粉樣 蛋白P (AP)肽。AP肽的形成，和因此AP淀粉樣蛋白斑的形成，是 由于淀粉樣前體蛋白(APP)的異常加工產生的。
目前，已發(fā)展了幾種藥理學方法減緩或逆轉AD的進程。雖然幾 種方法關注于抑制AP肽的代謝產生，但其他方法針對于阻止Ap淀粉 樣蛋白在受AD影響的患者的腦中積聚。
然而，最有前景的方法針對于通過施用能夠產生抗AP的免疫應 答的抗原(主動免疫接種)或針對AP的抗體(被動免疫)增加AP斑的 腦清除。
抗原或免疫原通常是包含不同的抗原位點或"表位"的大分子， 所述抗原位點或"表位"被識別并與免疫系統(tǒng)的不同組分相互作用。 它們通常包括偶聯(lián)至合適的栽體的小分子或"半抗原"，例如短肽。 載體通常是當在體內施用時能夠引起免疫應答的更大分子量的蛋白 質。
在免疫應答中，通過B淋巴細胞與T輔助(TH)細胞協(xié)同作用產
生和分泌抗體。在大多數半抗原-載體系統(tǒng)中，B細胞產生對于半抗原 和載體都是特異性的抗體。在這些情況下，T淋巴細胞將具有對載體 的特異性結合結構域，但不識別單獨的半抗原。在協(xié)同作用的情況下， B和T細胞協(xié)同誘導半抗原特異性抗體反應。
因此，在構建有效的抗原中，恰當的載體和恰當的半抗原的選擇 對于保證強烈的和選擇性免疫原應答是至關重要的?？乖陌踩砸?是至關重要的。例如，對AD患者施用由預集合的AP42和免疫佐劑 QS-21組成的有前景的AN-1792疫苗在大約6%的被治療的受試者中導 致嚴重的腦膜腦炎(meningoencephalitis )。細胞毒性T細胞的中樞 激活作用(central act ivat ion )和自身免疫反應都被認為是毒性的 潛在機制?？箖仍磫误wAP的免疫應答可以是有害的，因為非聚積的A P類型在神經元活動中具有生理作用。
因此，恰當地選擇半抗原和載體以確?？贵w的選擇性針對有害的 A P類型和預防自身免疫毒性是極其重要的。
WO2005058940提出將包含AP肽或其片段的肽免疫原綴合至蛋白 質/多肽載體。
通過化學方法產生免疫原構建體，所述方法包括衍生載體的氨基 酸殘基的官能團，其中通過加帽以阻止它們與其他分子反應來使氨基 酸殘基的任何未綴合的、衍生化的官能團失活。這樣的方法導致其中A P片段結合至栽體的氨基酸側鏈的免疫原。雖然在WO2005058940中提 及幾種不同的載體和半抗原，但未顯示它們在體內的組織病理學功效。
Kim， H. D.等人在Biochem. Biophys， Res. Commun. 第336巻， 第84-92頁提及由A p 1-6的無支撐的ll倍重復組成的抗A P DNA疫苗。
這樣的構建體產生無差別識別單體、寡聚體和原纖維的AP 42類 型的抗體。
總之，到目前為止，還未實現(xiàn)抗A0 42的不同裝配狀態(tài)(單體、 寡聚體或原纖維)的免疫原的選擇性靶向。
基于上述考慮，仍然存在發(fā)展安全和有效的免疫原性構建體的需 要，所述免疫原性構建體可用于預防A P淀粉樣蛋白在受AD或其他淀
粉樣蛋白生成性疾病例如唐氏綜合癥影響的患者的腦中聚積的治療性 疫苗組合物中。
本發(fā)明提供了一種重組免疫原性構建體，其特征在于，A0片段 被置于載體的活性環(huán)位置(展示位置)內而不是結合至栽體的末端。 通過具有AP 42的片段的B細胞表位在栽體優(yōu)選硫氧還蛋白(Trx)的活 性環(huán)位置(展示位置)內的串聯(lián)多聚化來獲得所述肽。
發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的免疫原引發(fā)識別毒害神經的寡聚體類型的A^淀 粉樣蛋白的抗體，最近已表明所述寡聚體類型的AP淀粉樣蛋白為淀 粉才羊蛋白生成性疾病的最可能的致病因子(causative agent)。
該能力與展示載體內的AP淀粉樣蛋白的特征的免疫原的結構相 關。這樣的構型在一定程度上允許免疫原性蛋白的正確折疊和更有效 地將其呈遞至免疫系統(tǒng)。當免疫原具有多于一個AP淀粉樣蛋白片段 和特別地特定數目的所述片段時，免疫原與A0淀粉樣蛋白寡聚體的 相似性據認為進一步提高了其功效和增加了選擇性。
載體和片段之間的連接體進一步幫助保持肽表位裝配狀態(tài)。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供了包含具有A P 42的免疫顯性B細胞表位的片段和載 體的免疫原性構建體(在下文中也表示為免疫原)，所述構建體的特 征在于，所述片段位于載體的活性環(huán)位置(展示位置)內。載體優(yōu)選 是疏氧還蛋白，然而AP片段有利地是少于30個氨基酸殘基，優(yōu)選少 于20個氨基酸殘基的N端片段，更優(yōu)選是Apl-15。
甚至更優(yōu)選免疫原性構建體具有多于一個片段，優(yōu)選2至16，最 優(yōu)選4個片段。
本發(fā)明還提供了構建所述免疫原的方法，所述方法包括具有AP 42的片段(優(yōu)選少于30個氨基酸殘基的N端片段)的B細胞表位在 載體的展示位置內的連接體輔助的串聯(lián)多聚化。
在另一個方面，本發(fā)明提供了包含用于抗淀粉樣蛋白生成性疾病 的主動免疫接種的所述免疫原的組合物。
在其他方面，本發(fā)明提供了所述免疫原用于發(fā)展用作抗淀粉樣蛋
白生成性疾病的,皮動疫苗(passive vaccine)的抗體(優(yōu)選單克隆抗 體)的用途。
附圖
概述
圖la顯示根據本發(fā)明的Trx(A^ l-15-Gly-Gly-Pro)n構建體。 圖lb顯示通過金屬親和層析將具有1、 4或8個拷貝的Trx展示
的A P 1-15的構建體純化至均一。
圖lc顯示由根據本發(fā)明的實施方案的免疫原引發(fā)的抗AP抗體
的水平。
圖ld顯示根據本發(fā)明的實施方案的Th2極化反應免疫原。
圖2a-b-c顯示用來自用根據本發(fā)明的實施方案的免疫原免疫的
小鼠的血清處理的人腦切片。
圖3顯示AFM的圖像，該圖像顯示根據本發(fā)明的實施方案的免疫
原的優(yōu)選結合。
優(yōu)選實施方案的詳述
本發(fā)明提供了包含具有至少一個A P 42片段的載體的免疫原性構 建體(或免疫原)。所述片段置于在構象上穩(wěn)定其的載體的表面暴露 的區(qū)域(活性環(huán)位置或展示位置)內。
通過凝膠電泳和質語測定法常規(guī)地確定構建體的確切大小和化 學均一性。
可通過分析技術確定構建體的結構；然而優(yōu)選使用核磁共振 (腿)。
栽體優(yōu)選是硫氧還蛋白(Trx) 。Trx因為其小尺寸(109個氨基酸)、 肽展示能力和用作能夠刺激鼠類T細胞增殖的無毒性免疫增強劑的能 力從而是特別合適的載體。然而可使用其他載體。
Ap淀粉樣蛋白片段是N端末端，有利地是具有少于30個氨基酸 殘基，優(yōu)選少于20個氨基酸的N端片段和更優(yōu)選選自下面表l中報導200780006006.8
說明書第5/16頁
的AP1-3、 1-4、 1-5、 l-6、 1-7、 l-8、 l-9、 1-10、 1-11、 1-12、 1-13、 1-14、 1-15的N端片段(根據氨基酸的單字母代碼)。優(yōu)選，AP淀 粉樣蛋白片段是AP 1 -15。
有利地本發(fā)明的免疫原性構建體具有多于一個片段，優(yōu)選2至16 個，更優(yōu)選4個片段。
在優(yōu)選實施方案中，片段通過連接體與載體結合，從而阻止結合 表位(junctional epitope)的形成。所述連接體是短的氨基酸序列， 優(yōu)選連接體由1至5個氨基酸殘基，更優(yōu)選由甘氨酸-甘氨酸-脯氨酸 (Gly-Gly-Pro)組成。然而也可使用其他連接體，例如甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸(Gly-Pro-Gly-Pro-Gly)或絲氨酸-甘氨酸-絲 氨酸-甘氨酸(Ser-Gly-Ser-Gly)。
優(yōu)選免疫原構建體由任選地通過合適的連接體連接至4個AP 1-15片段的硫氧還蛋白組成，在下文中表示為Trx(AP 1 - 15)"
構建所述免疫原的方法是克隆方法，所述方法包括在合適的細菌 中擴增載體，將載體插入合適的基因載體(vector)，所述基因載體 包含用于通過pET系統(tǒng)進行蛋白質表達的T7啟動子；制備A0片段 DNA插入物；限制性酶切和連接運栽體-基因栽體和A P片段DNA插入 物。
優(yōu)選A p片段DNA插入物包含氨基酸連接體。 無論何時制備多聚體，使用過量的AP片段DNA插入物。
表1
描述/
A/31-3DAE
Aj81-4DAEF
Aj8l-5DAEFR
AiSl-6DAEFRH
AjSl-7DAEFRHD
Aj81-8DAEFRHDS
A/31-9DAEFRHDSG
A)31-10DAEFRHDSGY
AjSl-llDAEFRHDSGYE
八/31-12DAEFRHDSGYEV
A/31-13DAEFRHDSGYEVH
A/31-14DAEFRHDSGYEVHH
A/31-15DAEFRHDSGYEVHHQ
本發(fā)明的優(yōu)選免疫原性構建體，在已誘導了腦p淀粉樣蛋白病狀
的轉基因小鼠中每月一次的注射進行4個月后，顯示減少了海馬和大 腦皮層中AP蛋白斑的數目和大小。此外，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的優(yōu)選免疫原 性構建體引發(fā)識別確定類型的AP 42的抗體。
在海馬內注射后，所述抗體能夠清除轉基因小鼠的海馬和皮層中 的A^42陽性斑，所述清除效果對于寡聚性Ap類型是特別明顯的。 還發(fā)現(xiàn)所述抗體強烈地改善A P相關的星形膠質細胞增生(實施例2)。
因此，本發(fā)明的免疫原性構建體可形成用作抗淀粉樣蛋白生成性 疾病的主動疫苗和纟皮動疫苗的組合物。
對于主動免疫接種，有利地將包含本發(fā)明的免疫原性構建體的藥 物組合物與佐劑一起施用。
佐劑和/或栽體的選擇取決于包含佐劑的疫苗的穩(wěn)定性、施用途 徑、給藥方案、用于被接種的物種的佐劑的功效，在人中，藥學上可 接受的佐劑是由相關控制單位(pertinent regulatory body)已批準 的或可批準用于人施用的佐劑。例如，完全佛氏左劑不適合于人施用。 合適的佐劑包括3 De-O-酰基化的單磷酰脂質A (MPL)、胞壁酰-二-肽和皂苷例如QS21和Quil A。
優(yōu)選類型的佐劑是鋁鹽(明礬)，例如氬氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁。
其他佐劑包括細胞因子例如白細胞介素(IL-1、 IL-2、和IL-12)、巨 噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)。
可將佐劑和免疫原一起作為單一組合物一起施用，或可在施用免 疫原之前、同時或之后施用佐劑。任意地，可同時使用2種或更多種 不同的佐劑。
可以在同一小瓶中包裝和提供免疫原和佐劑或在分開的小瓶包 裝和提供免疫原和佐劑且在使用前混合。
包含本發(fā)明的免疫原性構建體的藥物組合物還可包括含多種其 他藥學上可接受的組分。參見Remington'sPha簡ceutical Science (第15版，Mack Publishing Company, Easton， Pennsylvania, 1980)。
優(yōu)選藥物形式取決于希望的施用和治療應用的模式。取決于希望 的制劑，組合物還可包含藥學上可接受的、無毒性的栽體或稀釋劑， 所述載體或稀釋劑被定義為常用于配制用于動物或人施用的藥物組合 物的媒介物。
選擇稀釋劑以不影響組合物的生物學活性。此類稀釋劑的實例是 蒸餾水、生理磷酸緩沖鹽溶液、林格氏溶液、葡萄糖溶液和Hank's 溶液。
對于胃腸外施用，可以以可注射劑量的具有藥學載體的生理可接 受的稀釋劑中的物質的溶液或懸浮液的形式施用本發(fā)明的免疫原性構 建體，所述稀釋劑可以是無菌液體例如水化油(water oils)、鹽水、 甘油或乙醇。
此外，輔助物質例如濕潤劑、乳化劑、表面活性劑、pH緩沖物質 等可以存在于組合物中。
本發(fā)明的組合物可制備為可注射的液體溶液或懸浮液；還可制備 適合于在注射之前用于液體媒介物中的溶液或懸浮液的固體形式。
還可以以積、存注射(depot injection)或植入制劑(implant preparation)的形式施用本發(fā)明的免疫原性構建體，可以以這樣的方 式如允許活性成分的持續(xù)釋放的形式配制所述制劑。
適合于其他施用方式的另外的制劑包括口服、鼻內和肺制劑、栓
劑和透皮制劑。
對于被動免疫接種，將組合物注射入哺乳動物例如豚鼠或其他動 物物種，然后純化所得的抗體，隨后將其注射入人。
優(yōu)選抗體是單克隆抗體，通過用Trx(ABl-15)4免疫原性構建體 免疫哺乳動物來產生所述抗體。所述抗體用于預防和治療淀粉樣蛋白 生成性疾病，特別是阿爾茨海默病。
實施例1
不同TrxA0免疫原性構建體的制備和不同的抗TrxA&抗體的效 應的離體評估
使用克隆策略進行Trx(A0 l-15)n的構建(圖la)，所述克隆策略 依賴于與具有在噬菌體T7啟動子的控制之下的Trx編碼序列的經改造 的接受體基因栽體相比，過量的AP1-15 DNA插入物的使用。分離具 有l(wèi)、 4或8個拷貝的Trx展示的AP1-15的構建體，并且將其用于表 達相應的肽，然后通過金屬親和層析將所述肽純化至均一 (圖lb)。
有助于產生正確裝配的A P 1-15多聚體的是存在于Trx序列內的 唯一的。( /位點(核苷酸位置99-105，相應于氨基酸殘基34-35，鑒 定為... CG/GT (A) CCG... 30的定向和按讀框融合的能力以及編碼 間插Gly-Gly-Pro連接體的末端序列并入至A P 1-15 DM內的整合， 從而也防止連接表位的形成。
以相似的方式制備具有單拷貝的全長A0 42肽的第四構建體 (TrxAp42)。雖然不顧A P 1-15的多倍性，所有Trx (A P 1-15) n多肽 都是可溶性的，但大多數TrxA0 42蛋白是以不溶性形式包含在內含 體內的(未顯示)。因此，即使當融合至異源細菌細胞背景中的Trx， AP 42仍表現(xiàn)出很弱的可溶性。
用10 nmol的上述Trx(Aei5)n多肽或用當量的預集合的合成的 42或TrxA0 42 (全都補充以明礬，經批準用于人用途的佐劑)處 理5組10只雄性BALB/c小鼠(圖lc)。
用單獨的緩沖液(PBS)或用不含明礬的A0 42注射的另外兩組
用作陰性對照。在第四次注射后2周收集血清，隨機成對地混合，使 用集合的A042作為耙抗原，通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)分析血 清。如圖lc中所示，由Trx(Api-15)4和Trx(Api-15)s但非由TrxA P 1-15引發(fā)的平均抗AP抗體的水平顯著比模擬物處理的對照的水平 更高(P〈0. 05;)，與42處理組的水平相似，其中TrxAP42的表現(xiàn) 與游離的AP 42 —樣。
P是與關于對數轉化的對照和實驗數據的t檢驗相關的p值，使 用貝葉斯或規(guī)貝'H匕才示準差(regularized standard deviation) ; P 表示在統(tǒng)計檢驗中獲得的結果歸因于偶然性而非真正的測量之間的相 關性的概率。
通過同種型特征鐠(圖ld)顯示明礬佐劑的常見的強抗炎性Th2 極化反應。雖然對于所有抗原觀察到類型G和亞類1 (IgGl)的免疫球 蛋白占主體，但可再現(xiàn)地，對于多聚化的Trx(AP l-15h和TrxAP 42 免疫綴合物，IgGl/IgG2 (類型G和亞類2的免疫球蛋白)的比率比對 于未綴合的A 0 42的所述比率更高(代O. 05)。
然后研究響應Trx(A0 l-15)n而產生的抗血清結合淀粉樣蛋白斑 的能力。該性質(目前被認為是體內抗AP抗體的功效的最佳預后指 標)不是與所有之前描述的抗Ap抗血清(例如，m266和靶向A042 的C端部分的其他抗體)共有的性質。
如圖2a-b所示，來自用Trx(APl-15)。的四聚體或八聚體形式免 疫的小鼠的血清與淀粉樣蛋白斑結合，直至1/1000的稀釋度。
用抗多聚化Trx(AP l-15)n抗體標記大神經斑以及成熟的和未成 熟的斑。使用在兔子中產生(使用AP40作為抗原)的陽性對照抗Pan &淀粉樣蛋白抗血清觀察到更廣泛的免疫染色，特別是在老年斑核心 內的免疫染色(未顯示)。通過比較，使用來自模擬物處理的動物(未 顯示)的血清或使用來自用單體TrxApl-15 (圖2c)免疫的小鼠的血 清未檢測到斑。
最后，使用免疫印跡法評估不同的抗Trx(AP l-15)n抗體抗在之 前確定的條件下體外產生的和通過原子力顯微鏡(AFM)驗證的AP 42
的不同裝配狀態(tài)(單體、寡聚體和原纖維)的能力。該分析的結果示于
圖3中，該圖顯示抗Trx(AP 1-15)8抗體結合所有3種A042類型， 然而Trx(A0 1-15)4抗體優(yōu)選結合可溶性寡聚體和原纖維，但不結合A p42單體。強烈相反地，用單體TrxAP 1-15抗原產生的抗體顯示不 結合Ap42原纖維以及不識別A0 42原纖維。后一觀察與這些抗體在 ELISA中不能識別高級AP42集合體以及不能識別AD斑中的Ap原纖 維一致(參見圖lc和2c)。然而，有趣地，抗單體TrxAP 1-15抗體結 合A0 42單體和寡聚體(圖3)。因此即使使用中等強度的佐劑例如明 礬、A1(0H)3配制時，Trx(Ap 1-15)4仍是可溶性的、具有良好免疫原 活性的缺乏T細胞表位的淀粉樣蛋白P衍生物。Trx(Api-15)4產生 結合突觸毒性的(synaptotoxic) A 0 42寡聚體和原纖維但不結合假 定的生理單體A p類型的抗體的能力也是顯著的。
與其他肽免疫策略相比，Trx-dPI的主要有利方面是其時間和成 本效果、細胞毒性的缺乏和化學上均一的免疫綴合物的產生、易于驗 證的批與批之間的一致性。此外， 一旦鑒定了 "前導抗原(lead antigen)",其可容易地進行進一步修飾，包括另外的肽表位的整合 和用于DNA接種目的的基因載體替換。
TrxAP構建體。使用經設計提供限制性位點y^e/ e化/z^/的引 物1和2 (表2)通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增編碼大腸桿菌硫氧 還蛋白的序列。用A^e/eAs/z7)7/限制性內切酶對擴增的片段進行雙酶 切，然后將其連接至用相同的兩種酶消化的pET28b (Novagen);所得 的基因栽體(稱為pT7Kan-Trx)具有細菌疏氧還蛋白的N端和C末端 His6標記形式和卡那霉素抗性標記。
將Trx編碼序列內的唯一的C/ o/位點(核苷酸位點99-105，相應 于氨基酸殘基34-35，鑒定為5'.,.CG/GT(A)CCG... 3')用作克隆位 點。
唯一的CpoI位點的定向和按讀框整合的能力有助于多聚體的產生。
pT7Kan-TrxA P 1-15。已通過使磷酸化的寡核苷酸退火獲得編碼A
0 1-15肽、淀粉樣蛋白^肽AP42的N端片段的序列，所述寡核苷酸 是
5'-
GTCCGATGGATGCAGAATTCCGACATGACTCAGGATATGAAGTT CATCATCAAGGCG-3'(正向) 3'-
GCTACCTACGTCTTAAGGCTGTACTGAGTCCTATACTTCAAGTAG TAGTTCCGCCAG-5'(反向)
具有末端。0/識別序列。已以1 /10的基因栽體/插入物摩爾比將5 7 bp (5' 突出。oi)的DNA插入物與C/70/-消化的pT7Kan-Trx連接。
N-n4-6xHi s-nlO-TRX(1-33)GPMDAEFRHDSGYEVHHQGGPTRX (36-109) -nl5-6xHis-C
完整序列是
mgssbbhhhbssglvprgshMGDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDF WAEWCGPMDAEFRHDSGYEV冊QGGPC認IAPILDEIADEYQGKL TVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQL KEFLDANLRdpnsssvdklaaalehhhhhb
TrxA 3 1-15構建體的主要特征在于，在A P 1-15肽的N端上存 在Met殘基(M) 、 A P 1-15肽的C端上存在Gly-Gly-Pro連接體以及存 在編碼細菌石克氧還蛋白的N端和C端His6標記的形式的序列。
pT7Kan-Trx (AP 1-15)4 e pT7Kan-Trx (A卩卜15) 8。已以相似的方 式，但以1/100的基因載體/插入物摩爾比獲得具有更多拷貝的AP 1-15肽的構建體。通過限制性內切酶消化/凝膠電泳篩選重組克隆， 將它們中的具有4或8個拷貝的A P 1-15序列的兩個克隆用于表達和 純化相應的重組蛋白Trx (A P 1-15) 4和Trx (A P 1-15) 8。
兩個His6標簽的存在有助于純化步驟且可增^免疫原性，如在 賴氨酸殘基的串聯(lián)重復的情況下。
表2
N° 引物名稱 序列 L
1 Nde-Trx-PLUS Cgcatatgggcgataaaattattcacc 602 Bam—Trx-MINUS Cgggatcccgccaggttagcgtcgag 60
Trx A0多肽的表達和純化。通過向用上述各構建體轉化的大腸 桿菌BL21Star (DE3)細胞(Invi trogen)中加入1 mM異丙基- P -D-硫代 半乳糖苷(IPTG)，并讓其在37C下進行2小時，以誘導表達。將不同 的大腸桿菌林系(Origami-DE3; Novagen)和改良的表達條件 (pT7-Amp-Trx基因載體；在30C進行5小時)用于Trx A P 42 (其在 別的條件下是完全不溶的)的表達。在細胞裂解后，將His6標記的 Trx 多肽與金屬親和樹脂(Talon; Clontech)結合，按照廠商說明 書進行純化，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)進行充分透析。使用考馬斯 染色法(Bio-Rad)和通過UV吸收確定蛋白質的濃度。通過在11%的聚 丙烯酰胺SDS凝膠上的凝膠電泳和MALDI-TOF分析(MassLynx 4.0， Waters)來評估個體多肽的組成和純度。
免疫方案。對重組Trx A0多肽(2 mg/ml于PBS中)進行過濾滅 菌，在即將使用前，將各等分(10nmol)與1 mg明礬(Sigma-Aldrich) 混合在400 ju 1的終體積中。將A0 42 (Sigma-Aldrich)溶解在PBS (2 mg/ml)中，在免疫前在37t:集合過夜。如圖lc中所說明的，在第1、 15、 30和60天，用上述抗原皮下注射5組隨機組合的1月齡的雄性 BALB/c小鼠(Charles River Laboratories;每纟且10只動物)。對照使用PBS和集合的Ap42 (兩者都不含明礬)注射的兩個陰性對照組使 用相同的處理。在最后一次增強后2周收集血清，將血清成對隨機混 合。
抗Ap42抗體的檢測。以固定的1/200的稀釋度，使用集合的A (0.5 jug/孔)作為靼抗原23，通過ELISA檢測總的抗A042抗 體。在溫育、洗滌以及加入辣根過氧化物酶(HRP)綴合的抗小鼠免疫球 蛋白(1/5000; Sigma-Aldrich)和顯色底物鄰苯二胺(Sigma-Aldrich) 后，在450 nm處通過分光光度測量讀板。以固定的1/200的稀釋度， 使用大鼠抗小鼠Ig亞類特異性的、HRP綴合的二抗(TechniPharm)進 行免疫球蛋白同種型的確定。以一式三份對5對來自各組的血清進行
ELISA;只將來自組1、 3、 4、 6和7 (圖lc)中的3個最高的應答者 的血清亞群用于同種型確定。使用Analyze-it軟件，通過單因素方差 分析進行組間的比較。
免疫組織化學。根據它們與來自68歲的具有嚴重的阿爾茨海默 病的常見神經病理學和臨床癥狀的患者的人腦切片中的A P斑結合的 能力，篩選來自用3種TrxApi-15多肽的每一個多肽免疫的小鼠的血 清。分析不同稀釋度(1/100-1/1000)的來自組5、 6和7中的3個最高 應答者的混合血清；使用1/500的稀釋度獲得最佳結果。向福爾馬林 固定的、用曱酸(80%， 15分鐘)預處理的顳(temporal)皮層組織的 連續(xù)的8jum腦切片加入血清。來自模擬物處理的(PBS)動物的血清和 商業(yè)抗A P 40多克隆抗體制劑(Anti-Pan P-Amyloid, Biosource)分 別用作陰性和陽性對照。按照廠商說明書，使用En Vision Plus/辣 根過氧化物酶系統(tǒng)(Dako),使用3-3'-二氨基聯(lián)苯作為顯色底物顯示 免疫標記。
用數碼相機以50至400X的放大率獲取圖像。
點印跡測定法和AFM成像。按照本領域內已知的之前的方案(參 見例如Stine，W. B.等人在J. Biol. Chem.第278巻，第11612-11622 頁)制備用于點印變分析的A042類型。簡而言之，將溶解在2MDMS0 (lmM的終濃度)的A0 42用作單體形式的來源；以100 )iM的終濃度 將DMSO原液稀釋入冷Ham's F12 K介質(不含酚紅；Biosource)，然 后在4。C溫育24小時，將所述稀釋液用于制備可溶性寡聚體；將以100 iaM的終濃度稀釋入10mMHCl且在37"€下溫育24小時的相同原液用 于產生AP原纖維。通過AFM驗證不同AP類型的鑒定以及驗證可溶性 寡聚體溶液中不存在原纖維。在這一點上，將上述AP42溶液在20 n 1沉積緩沖液(deposition buffer) (4 mM HEPES pH 7. 4， lOmMNaCl, 7 mMMgCl2)中稀釋l()倍至10 yM的終濃度，并將其在室溫下立即沉 積在新切開的紅云母(ruby mica)上。5分鐘后，用milli-Q級水漂 洗云母片，然后在氮流下逐漸干燥。使用以敲擊模式操作的、使用商 業(yè)跳板(diving board)珪懸臂梁(MikroMasch)的Nanoscope III顯
微鏡(Digital Instruments)收集圖像。使用真空操作的點印器(dot blotter apparatus ) (96孑U Bio—Rad)，將相應于0. 1 pmol或1 pmol 的A p 42肽的固定體積的各A P類型點在用20 mM Tris-HCl， pH 7. 5， 0.8% NaCl (TBS)預濕潤的硝酸纖維素膜(GE Healthcare Life Sciences)上。以每次8張膜的批量制備點印跡，干燥所述點印跡，且 在使用前在4'C下貯存不超過2周。按照廠商說明書，在蛋白A小純 化柱(Diatheva)上親和純化用于點印跡分析的抗血清。在使用考馬斯 染色法確定總的免疫球蛋白濃度后，以0.75 ng/ml的終濃度將純化 的免疫球蛋白用于點印跡分析。在室溫下，在用5%的補充0. 05%Tween 20的TBS(TBST)中的脫脂奶粉封閉后，將印跡與脫脂奶粉-TBST中的3 種Trx AP 1-15—抗中的每一種一起溫育1.5個小時，用TBST洗滌3 次，每次IO分鐘，然后按照廠商的說明，使用SuperSignal West Femto 試劑盒(Pierce)進行小鼠免疫球蛋白的檢測。使用來自各組中的最高 響應混合物的抗血清進行3次獨立的技術重復。
實施例2
抗Trx (A 0 1-15) 4抗體在體內對成年Tg2576轉基因小鼠中的腦0 淀粉樣蛋白病狀的作用的評估
方法
從波士頓大學(Boston University)的阿滋海默病中心的小鼠 群體(Alzheimer's Disease Center's mouse colony)獲得表達人 APP (1)的瑞典突變的雌性轉基因AD(Tg2576)小鼠。由Dr. Karen Hsiao-Ashe (Department of Neurology, University of Minnesota Medical School)提供該群體的建立者。APP Tg2576小鼠早在8個月 的時候發(fā)生行為異常并展示腦AP沉積物(如蛋白斑)連同相關的星 形膠質細胞增生的組織學證據。使用尾部DNA通過標準PCR測定法來 對小鼠進行基因分型，在隨意接觸食物和水的情況下，在標準的條件 下關養(yǎng)小鼠，每籠4只小鼠。將置于12小時光照方案中的6只14月 齡的APP小鼠(每只32-34 g)用于進行手術。通過鹽酸氯氨酮/甲苯蓉
嗪腹膜內注射(100mg/kg氯氨酮和10mg/kg甲苯噻嗪；100 ju 1/10 g體重)麻醉小鼠，使用小鼠頭適配器將小鼠置于立體定向儀(Koph)。 使用熱墊使體溫調節(jié)保持在37X:，在整個過程中進行呼吸監(jiān)測。在正 中線上切割頭皮以暴露矢狀縫，確定兩個半球中的立體定位坐標
(stereotaxic coordinate) (2)。 前自用作參照點(2. 0 mm)， 在左 和右沖黃線坐標(lateral coordinate)的接合處(1. 75 mm)在顱蓋上 鉆孔。使用鈍尖的lOjal注射器(Hamilton)將親和純化的抗Trx(A0 l-15)4抗體和來自PBS處理的小鼠的模擬球蛋白(各2 jul)分別立 體定向地注射入左海馬和右海馬(2. 0 mm的腹側(ventral))。在放 置好注射器后，進行2分鐘的停留時間，然后進行4分鐘的注射時間， 在撤出注射器之前停留另外2分鐘。當使用9mm的小手術夾封閉切口 時使用局部抗菌藥。將小鼠保持在溫暖的墊子上直至完全恢復。按照 國立衛(wèi)生研究院關于實驗動物的管理和使用的指南(National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animal)以及得到Veterans Administration和波士動物管理委員會
(Animal Care Committees )的允許進行所有動物實驗。注射后7天， 深度麻醉小鼠，使用2%的緩沖的多聚甲醛(100 ml)經頸動脈對小鼠 進行灌流。將腦固定后(post-fix) 2小時，在分級的系列甘油中進 行冷凍防護，然后進行冷凍切片(50 pm)。針對尼氏物質(Nissl substance)對連續(xù)切片的小鼠組織切片進行染色，用抗A042 (目錄 號344; Biosource International)、抗Ap寡聚體(All ; Biosource International)和膠質細胞原纖維抗原蛋白(glial fibrillary antigen protein) (GFAP; Dako)抗體進行免疫染色，和使用用于鑒 定成熟的AP斑的Ca即bell-Switzer方法進行銀染色。定量分析始于 耳間1.68 mm/前自-2.12 mm至耳間2.16 mm/前自-1.64 mm 的海馬內的連續(xù)切割的Ap42免疫染色冠狀組織切片。使用BioVision (3)和Neurolucida軟件程序(MicroBrightField， Williston， VT)從 抗Trx(A0 1-15)4處理的半球內和對側PBS處理的半球內的相同腦區(qū) 域的高清晰圖象定量A0 42陽性斑。BioVision將斑塊與背景神經氈
區(qū)分開并且對斑塊進行計數，Neurolucida從BioVision圖像提取數 據，并將其輸出至Excel (Microsoft, Redmond, WA)以進行統(tǒng)計分析。
結果
然后通過將該抗體立體定向地注射入14月齡的APP轉基因AD (Tg2576)小鼠來評估抗Trx(AP 1-15)4的免疫治療潛能。注射入對側 半球的來自只用PBS處理的小鼠的模擬免疫球蛋白用作該實驗的內對 照。注射后7天，組織病理學檢查顯示，與模擬物注射的半球相反， 接受抗Trx(AP 1-15)4抗體的小鼠的海馬和重疊新皮層(overriding neocortex)中的A^染色顯著減少。A 0陽性斑不僅不存在于注射位 置，而且在注射半影(注射位置的前/后2 mm)內明顯減少。
這暗示著抗Trx(AP l-15)4抗體在體內不僅乾向原纖維和小寡聚 體，而且靶向更高級的寡聚體。為了驗證這些發(fā)現(xiàn)不是抗Trx(A0 1-15)4和抗AP—抗之間的竟爭的結果，我們通過使用膠質細胞原纖 維抗原蛋白(glial fibrillary antigen protein) (GFAP)免疫染色 和Campbell-Switzer 4艮染檢測星形股質細胞增生(astrogliosis ) 和AP斑來進行可選擇的組織病理學分析。與對側模擬物注射半球相 比，抗Trx(AP 1-15)4抗體注射半影內的星形膠質細胞增生和膠質相 關斑顯著減少。此外，如Campbell-Switzer 4艮染所顯示的，與才莫擬物 注射的半球相比，抗Trx(Ap 1-15)4注射的半球中存在少得多的斑。 兩個觀察都與使用抗AP抗體的檢測獲得的免疫染色數據一致。從定 量的觀點，與PBS處理的半球相比，在抗Trx(AP 1-15)4處理的半球 中，AP42陽性斑的數量顯著減少(PBS處理的半球3. 34xl03 ± 0.58; 抗Trx( 1-15)4處理的半球0.97xl03 ± 0.27， P < 0.01)。
權利要求
1. 包含載體的免疫原性構建體，所述載體在其活性環(huán)位置中具有至少一個Aβ42的片段。
2. 權利要求1的免疫原性構建體，其中載體是硫氧還蛋白。
3. 權利要求1的免疫原性構建體，其中Ap42片段通過氨基酸 連接體與載體結合。
4. 權利要求2的免疫原性構建體，其中至少一個A042片段是 少于30個氨基酸殘基的N端片段，優(yōu)選選自Api-3、 1-4、 1-5、 l-6、 1-7、 l一8、 l一9、 1-10、 1-11 、 1-12、 1一13、 1-14、 l-15的N端片段。
5. 權利要求4的免疫原性構建體，其中至少一個Ap42片段是A P 1-15。
6. 權利要求5的免疫原性構建體，其中A p 1-15片段通過氨基 酸連接體與硫氧還蛋白結合。
7. 權利要求6的免疫原性構建體，其中氨基酸連接體是 Gly-Gly-Pro。
8. 權利要求5的免疫原性構建體，其中硫氧還蛋白具有多于一 個Apl-15片段。
9. 權利要求8的免疫原性構建體，其中硫氧還蛋白具有4至16 個AP1-15片段。
10. 權利要求9的免疫原性構建體，其中硫氧還蛋白具有4個A P 1-15片段(Trx(AM-15)4)。
11. 權利要求8至10任一項的免疫原性構建體，其中各A P 1-15 片段通過氨基酸連接體與硫氧還蛋白結合。
12. 權利要求11的免疫原性構建體，其中氨基酸連接體是 Gly-Gly-Pro。
13. 用作抗淀粉樣蛋白生成性疾病的治療性疫苗的藥物組合物， 其包含含有栽體的免疫原性構建體，所述載體在其活性環(huán)位置內具有 至少一個A卩42的片段。
14. 權利要求13的組合物，其中載體是硫氧還蛋白。
15. 權利要求14的組合物，其中AP42片段通過氨基酸連接體 與栽體結合。
16. 權利要求14的組合物，其中至少一個A0 42片段是少于30 個氨基酸殘基的N端片段，優(yōu)選選自Api-3、 1-4、 1-5、 1-6、 l-7、 1-8、 1-9、 1-10、 1-11 、 1-12、 1-13、 1-14、 l-15的N端片段。
17. 權利要求16的組合物，其中至少一個A P 42片段是A P 1-15。
18. 權利要求17的組合物，其中AP 1-15片段通過氨基酸連接 體與硫氧還蛋白連接。
19. 權利要求18的組合物，其中氨基酸連接體是Gly-Gly-Pro。
20. 權利要求17的組合物，其中硫氧還蛋白具有多于一個AP 1-15片段。
21. 權利要求20的組合物，其中硫氧還蛋白具有4至16個AP 1-15片段。
22. 權利要求21的組合物，其中硫氧還蛋白具有4個AP 1-15片段。
23. 權利要求22的組合物，其中各Ap 1-15片段通過氨基酸連 接體與硫氧還蛋白結合。
24. 權利要求23的組合物，其中氨基酸連接體是Gly-Gly-Pro。
25. 權利要求13的組合物，其還包含佐劑。
26. 權利要求25的組合物，其中佐劑選自3De-0-酰基化單磷酰 脂質A (MPL)、皂苷QS21、胞壁酰-二-肽或鋁鹽。
27. 權利要求26的組合物，其中鋁鹽選自氫氧化鋁、磷酸鋁和 硫酸鋁。
28. 識別權利要求1至12的免疫原性構建體的單克隆抗體。
29. 權利要求28的抗體，其中免疫原性構建體是Trx(AP 1-15)4。
30. 用于預防或治療淀粉樣蛋白生成性疾病的治療劑，其包含根 據權利要求28或29的單克隆抗體作為活性成分。
31. 權利要求30的治療劑，其中淀粉樣蛋白生成性疾病是阿爾 茨海默氏病。
32. 用于制備包含載體的免疫原性構建體的方法，所述載體在其 活性環(huán)位置內包含至少一個A0 42的片段，所述方法包括i) 在合適的細菌中擴增載體，ii) 將載體插入合適的基因載體，所述基因載體包含用于在整個 pET系統(tǒng)中進行蛋白質表達的T7啟動子；iii) 制備Ap片段DNA插入物；iv) 限制性酶切和連接載體-基因載體和A P片段DNA插入物。
33. 權利要求32的方法，其中載體是硫氧還蛋白。
34. 權利要求32的方法，其中細菌是大腸桿菌。
35. 權利要求32的方法，其中基因載體是pT7Kan-Trx。
36. 通過權利要求32的方法獲得的免疫原性構建體。
全文摘要
本發(fā)明提供了通過具有Aβ42片段的B細胞表位在載體(優(yōu)選細菌硫氧還蛋白(Trx))的活性環(huán)位置(active loop site)(展示位置)內的串聯(lián)多聚化獲得的重組免疫原。構建具有多于一個拷貝的Aβ42片段、優(yōu)選具有間插氨基酸連接體的多肽，并且將所述多肽與佐劑一起注射入小鼠。發(fā)現(xiàn)引發(fā)的抗體選擇性結合神經炎性AD斑內的纖維狀和/或寡聚體Aβ。
文檔編號A61K39/00GK101384279SQ200780006006
公開日2009年3月11日 申請日期2007年2月13日 優(yōu)先權日2006年2月24日
發(fā)明者B·P·愛姆比姆博, G·威爾萊蒂, N·默爾圖, S·奧圖納羅 申請人:奇斯藥制品公司