專利名稱：抗淀粉樣蛋白免疫原性組合物、方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含Αβ 42肽片段的串聯(lián)陣列的多肽構(gòu)建體及其在生產(chǎn)用于治療如 阿爾茨海默氏病這樣的醫(yī)學(xué)疾病的抗體和疫苗中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
淀粉樣蛋白形成狀態(tài)疾病，如阿爾茨海默氏病(AD)已經(jīng)被視為中老年人癡呆的 主要原因。AD中認(rèn)知能力的下降與腦中組織病理學(xué)變化相關(guān)，最相關(guān)的是形成淀粉質(zhì)斑塊 和神經(jīng)原纖維纏結(jié)。盡管淀粉質(zhì)斑塊包含許多蛋白質(zhì)，但是它們具有淀粉樣蛋白(Αβ)肽作為其 主要成分。Αβ肽形成和由此Αβ淀粉質(zhì)斑塊形成因淀粉樣前體蛋白(APP)的異常加工產(chǎn)生。目前，已經(jīng)研發(fā)了幾種藥理學(xué)手段以減緩或逆轉(zhuǎn)AD的發(fā)展。盡管幾種手段涉及抑 制Αβ肽的代謝生成，但是其他手段涉及預(yù)防AD侵害患者腦中Aβ淀粉樣蛋白的聚集。然而，最富有希望的手段涉及通過給予能夠生成針對A β的免疫應(yīng)答的抗原(主 動免疫)或針對Aβ的抗體(被動免疫)增加Aβ斑塊的腦清除率?？乖蛎庖咴ǔＪ前煌乖稽c或“表位”的大分子，所述抗原位點或“表 位”被識別并且與免疫系統(tǒng)的不同成分發(fā)生相互作用。它們通常包含小分子或“半抗原”， 如短肽，其與適合的載體、典型地是高分子量蛋白質(zhì)偶聯(lián)。在免疫應(yīng)答中，B-淋巴細(xì)胞與T-輔助(TH)細(xì)胞一起產(chǎn)生和分泌抗體。在大多數(shù) 半抗原-載體系統(tǒng)中，B細(xì)胞產(chǎn)生對半抗原和載體具有特異性的抗體。在這些情況下，T淋 巴細(xì)胞具有載體上的特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域，但無法單獨識別半抗原。在一類協(xié)同作用中，B和 T細(xì)胞合作誘導(dǎo)半抗原-特異性抗體應(yīng)答。因此，在構(gòu)建有效抗原中，選擇適合的載體和適合的半抗原對確保穩(wěn)定和選擇性 免疫原性應(yīng)答而言是關(guān)鍵的?？乖陌踩砸簿哂嘘P(guān)鍵的重要性。例如，對阿爾茨海默氏 病患者給予富有希望的由預(yù)聚集A β 42和免疫佐劑QS-21構(gòu)成的ΑΝ-1792疫苗導(dǎo)致約6% 的治療受試者的嚴(yán)重腦膜腦炎發(fā)生率(Steinberg, D. 2002，Scientist 16 :22)。提出中樞 活化細(xì)胞毒性T細(xì)胞和自身免疫反應(yīng)作為毒性的潛在機(jī)制。對內(nèi)源性單體Αβ的免疫應(yīng)答 可能有害，因為未聚集的A β種類在神經(jīng)元活動中具有生理作用。因此，選擇半抗原和載體是極為重要的，以確保針對有害Αβ種類的抗體選擇性 和預(yù)防自身免疫毒性。102005/058940提出將包含4 0肽或其片段的肽免疫原與蛋白質(zhì)/多肽載體綴合。 通過化學(xué)方法生產(chǎn)免疫原性構(gòu)建體，該方法包括衍生載體氨基酸殘基的官能團(tuán)，其中任何 未綴合的衍生的氨基酸殘基官能團(tuán)通過封端以阻止它們與其他分子反應(yīng)而被失活。這種方 法產(chǎn)生免疫原，其中Αβ片段與載體氨基酸側(cè)鏈結(jié)合。盡管在WO 2005/058940中，已經(jīng)提 出了幾種不同載體和半抗原，但是其在體內(nèi)的組織病理學(xué)功效尚未顯示。Kim, H. D.等人在 Biochem. Biophys，Res. Commun. Volume 336，84—92 頁中提出由 無骨架的Αβ 1-6的11-折疊重復(fù)組成的抗Αβ DNA疫苗。這樣的構(gòu)建體產(chǎn)生無差別識別單體、寡聚體和原纖維的A β 42種類的抗體。WO 2007/096076公開了基于摻入細(xì)菌硫氧還蛋白載體活性位點內(nèi)的Aβ 42片段 的富有希望的免疫原性構(gòu)建體。Αβ 1-15片段的串聯(lián)多聚體插入這一位點導(dǎo)致多肽類產(chǎn)生， 這些多肽類能夠引起選擇性識別Aβ 42原纖維和寡聚體的抗體，而非單體。使用串聯(lián)排列 的Αβ 1-15肽的4個拷貝得到的最佳結(jié)果。本發(fā)明提供了包含Αβ 1-7肽類串聯(lián)陣列的可替代選擇的重組免疫原性構(gòu)建體， 其是安全的并且有效用于預(yù)防或治療疫苗接種，以預(yù)防被阿爾茨海默氏病或其他淀粉樣蛋 白形成狀態(tài)疾病如唐氏綜合征侵害的患者腦中Αβ淀粉樣蛋白聚集。發(fā)明概述本發(fā)明提供了包含肽序列串聯(lián)陣列的多肽分子，各肽序列(單體)由Αβ42的 N-末端7個氨基酸組成，即DAEFRHD(SEQ ID NO :1)，也可以可互換地稱作(Αβ1_7)η，其中 η是串聯(lián)陣列中肽序列的數(shù)量(單體)。優(yōu)選串聯(lián)陣列與載體分子細(xì)菌硫氧還蛋白偶聯(lián)。本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸和這種多核苷酸的制備方法。優(yōu)選多 核苷酸是DNA表達(dá)載體。在另一個方面中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的多肽在制備用于預(yù)防或治療淀粉樣蛋白 形成狀態(tài)疾病例如阿爾茨海默氏病的疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明在另一個方面中提供了編碼本發(fā)明多肽的DNA表達(dá)載體作為DNA疫苗在預(yù) 防或治療淀粉樣蛋白形成狀態(tài)疾病如阿爾茨海默氏病中的應(yīng)用。本發(fā)明在另一個方面中提供了針對本發(fā)明多肽增加的抗體，優(yōu)選單克隆抗體，及 其在預(yù)防或治療或診斷淀粉樣蛋白形成狀態(tài)疾病中的應(yīng)用。本發(fā)明在另一個方面中提供了藥物組合物，其包含本發(fā)明的多肽或多核苷酸和一 種或多種藥學(xué)可接受的賦形劑。本發(fā)明在另一個方面中提供了易感個體中淀粉樣蛋白形成狀態(tài)疾病的預(yù)防或治 療方法，包括給予有效量的本發(fā)明多肽或多核苷酸或治療抗體。附圖
簡述附圖顯示了 ELISA測定結(jié)果，該測定法測定了來自免疫接種所示的全部用明礬佐 劑化的Trx(Αβ 1_7) 多肽類、Trx(硫氧還蛋白)或參比抗原Trx(Αβ 1_15)4的小鼠血清的 抗Αβ42反應(yīng)性。優(yōu)選實施方案的詳細(xì)描述本發(fā)明提供了包含阿爾茨海默淀粉樣蛋白肽的N-末端片段的多單體串聯(lián)陣 列的免疫原性構(gòu)建體(或免疫原)。所述單體優(yōu)選位于載體多肽的表面暴露的區(qū)域內(nèi)(活 性環(huán)位點或展示位點)。目前已經(jīng)證實針對這些構(gòu)建體增加的抗體具有對肽Αβ 42的強(qiáng)和 特異性親和力。本文所用的術(shù)語“肽”和“多肽”意指通過肽鍵連接的氨基酸從哪幾的單鏈構(gòu)成的 化合物。術(shù)語“串聯(lián)陣列”意指緊密相鄰、優(yōu)選間隔不超過10個以上氨基酸的一組多個線 性肽序列重復(fù)(單體)。本文所用的術(shù)語“免疫原”涉及對哺乳動物給予時能夠誘導(dǎo)對所給予的多肽或DNA 疫苗編碼的多肽的免疫應(yīng)答的多肽或DNA疫苗?？梢詫ⅰ懊庖邞?yīng)答”定義為定向于抗原或免疫原發(fā)生的體液(抗體介導(dǎo)的)和/或細(xì)胞(抗原-特異性T細(xì)胞或其分泌產(chǎn)物介導(dǎo)的)應(yīng)答。載體多肽優(yōu)選是細(xì)菌硫氧還蛋白，最優(yōu)選大腸桿菌硫氧還蛋白，并且肽類的串聯(lián) 陣列優(yōu)選位于充分表征的殘基Cys33與Cys^5之間載體的活性環(huán)位點內(nèi)(展示位點)。然而， 載體多肽抗原是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何載體，其具有可以插入A β片段單體的適合的 表面暴露的結(jié)構(gòu)域。串聯(lián)陣列與載體多肽框內(nèi)融合。肽單體的串聯(lián)陣列在本文中命名為(Αβ 1-7)η，其中Aβ 1-7是單體序列DAEFRHD， 且“η”是串聯(lián)陣列中單體的數(shù)量，“η”優(yōu)選是2-15，更優(yōu)選3-12。在具體優(yōu)選的實施方案 中，“η”是3、6、9或12。在一個更具體的實施方案中，“η”是9，而在另一個具體的實施方案 中，“η” 是 12。這些優(yōu)選串聯(lián)陣列的相應(yīng)氨基酸序列在表中列出。肽單體優(yōu)選具有同一取向，即從N-到C-末端閱讀DAEFRHD。任選一種或多種肽單 體具有反向取向，即從N-到C-末端的閱讀DHRFEAD (SEQ ID NO :2)。表
權(quán)利要求
1.包含肽序列SEQID NO :1或SEQ ID NO 2的串聯(lián)陣列的多肽，其中η是該陣列中所 述肽序列的數(shù)量且η > 2，且相鄰肽序列彼此被10個或更少的氨基酸殘基隔離開。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，包含在其活性環(huán)位點內(nèi)摻入所述串聯(lián)陣列的細(xì)菌硫氧還蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的多肽，其中η是3和12之間的任何數(shù)字。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的多肽，其中η是3、6、9或12。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的多肽，其中η是9或12。
6.根據(jù)上述任一權(quán)利要求的多肽，其中相鄰肽序列被氨基酸接頭彼此隔離開。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的多肽，其中所述接頭是Gly-Gly-Pro。
8.根據(jù)上述任一權(quán)利要求的多肽，其中所述串聯(lián)陣列通過氨基酸接頭與硫氧還蛋白載 體偶聯(lián)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的多肽，其中所述氨基酸接頭是Gly-Gly-Pro。
10.根據(jù)上述任一權(quán)利要求的多肽，其包含SEQID NO :3至SEQ IDNO :19中的任一個。
11.根據(jù)上述任一權(quán)利要求的多肽，當(dāng)用于免疫接種哺乳動物生物體時，其引起能夠特 異性識別人A β 42肽的抗體的產(chǎn)生。
12.多核苷酸，包含在啟動子控制下編碼權(quán)利要求1-11任一項的多肽表達(dá)的DNA序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的多核苷酸，其是能夠使所述多肽在培養(yǎng)物中的原核或真核細(xì)胞 中表達(dá)的載體。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的多核苷酸，包含適合于所述多肽在哺乳動物中原位表達(dá)的啟動子。
15.根據(jù)權(quán)利要求12-14任一項的多核苷酸，包含SEQID NO 20的序列。
16.藥物組合物，包含權(quán)利要求1-11任一項的多肽或權(quán)利要求14的多核苷酸并且還包 含一種或多種藥學(xué)可接受的賦形劑。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的藥物組合物，包含佐劑。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的藥物組合物，其中所述佐劑選自3脫-0-?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì) A (MPL)、皂苷QS21、胞壁酰-二 -肽類、鋁鹽和CpG模體。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的藥物組合物，其中所述佐劑是選自氫氧化鋁、磷酸鋁和硫酸鋁 的鋁鹽。
20.針對權(quán)利要求1-11任一項的多肽產(chǎn)生的并且能夠特異性識別Aβ 42肽的抗體。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的針對權(quán)利要求5的多肽產(chǎn)生的抗體。
22.特異性識別權(quán)利要求1-11任一項的多肽的單克隆抗體。
23.用于預(yù)防或治療淀粉樣蛋白形成狀態(tài)疾病的治療劑，包含權(quán)利要求22的單克隆抗體。
24.權(quán)利要求23的治療劑，其中所述淀粉樣蛋白形成狀態(tài)疾病是阿爾茨海默氏病。
25.權(quán)利要求20-22任一項的抗體在制備用于診斷人類患者阿爾茨海默氏病或其他淀 粉樣蛋白形成狀態(tài)疾病的診斷劑中的應(yīng)用。
26.根據(jù)權(quán)利要求1-11的多肽或根據(jù)權(quán)利要求14的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求20-22 的抗體，用作藥物。
27.根據(jù)權(quán)利要求1-11的多肽或根據(jù)權(quán)利要求14的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求20-22的抗體在制備用于預(yù)防或治療淀粉樣蛋白形成狀態(tài)疾病或病癥的藥物中的應(yīng)用，所述的疾 病或病癥包括阿爾茨海默氏病、與唐氏綜合征相關(guān)的癡呆、Lewy體癡呆、包涵體肌炎和腦淀 粉樣血管病。
28.根據(jù)權(quán)利要求1-11的多肽或根據(jù)權(quán)利要求14的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求20-22 的抗體，用于預(yù)防或治療淀粉樣蛋白形成狀態(tài)疾病或病癥。
29.預(yù)防或治療易感個體淀粉樣蛋白形成狀態(tài)疾病或病癥的方法，包括給予有效量的 權(quán)利要求1-11的多肽或權(quán)利要求14的多核苷酸或權(quán)利要求20-22的抗體。
30.根據(jù)權(quán)利要求12-15任一項的多核苷酸的制備方法，包括如下步驟(i)制備編碼 (Αβ 1-7)的DNA插入片段；和ii)連接摩爾過量的所述編碼(Αβ 1-7)的DNA插入片段與 包含表達(dá)盒的限制酶切消化的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了基于Aβ42的N-末端7個氨基酸重復(fù)的串聯(lián)陣列的重組多肽，其優(yōu)選位于載體如細(xì)菌硫氧還蛋白(Trx)的活性環(huán)位點內(nèi)。發(fā)現(xiàn)了針對這些重組構(gòu)建體產(chǎn)生的抗體對Aβ42具有極強(qiáng)的親和力，從而開辟了用于診斷和治療阿爾茨海默氏病的可能性。
文檔編號A61K39/395GK102099372SQ200980127355
公開日2011年6月15日 申請日期2009年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月15日
發(fā)明者B·P·艾姆畢姆伯, G·維勒緹, N·莫雷托, S·歐托尼洛 申請人:奇斯藥制品公司