專利名稱::源自人胚胎干細(xì)胞的胰島細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
:本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué),胚胎干細(xì)胞和細(xì)胞分化。更具體地說,本發(fā)明提供具有胰腺內(nèi)分泌功能的分化細(xì)胞。相關(guān)申請本發(fā)明要求2001年12月7日的美國臨時申請60/338,885的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù):
:美國糖尿病協(xié)會估計,目前全美有5百萬糖尿病患者,l千萬高危人群。該病及其后遺癥對美國經(jīng)濟(jì)的損耗巨大。每年因糖尿病的醫(yī)療支出總計980億美元,約占全美醫(yī)療保健支出的七分之一。每年新增24,000例糖尿病致盲病例。糖尿病是腎衰竭的主要原因,在新增透析患者中占40%。而且,糖尿病還是下肢截肢最常見的原因,每年約56,000人因此喪失下肢。糖尿病人每年的人均醫(yī)療支出為10,071美元,非糖尿病人則僅為2,699美元。重癥1型糖尿病(胰島素依賴型糖尿病)占糖尿病總數(shù)的5-10%。其病理是患者胰腺內(nèi)分泌胰島素的P細(xì)胞被自身免疫反應(yīng)清除。目前的治療手段包括定期注射胰島素,長期的飲食控制,以及持續(xù)監(jiān)測胰島素水平以調(diào)整胰島素劑量。據(jù)估計,到2005年,對重組胰島素的市場需求將達(dá)到40億美元。顯然,胰島素的可得性對于I型糖尿病人來說是性命攸關(guān)的。但是,.糖尿病人必需遵守的每日治療無疑是繁瑣的,而且并非普遍有效。'因此,目前正在進(jìn)行數(shù)項給糖尿病人移植分離自供體胰島的胰島細(xì)胞的臨床試驗。此類試驗的可行性是基于胰島細(xì)胞分離和培養(yǎng)方面的最新進(jìn)展。美國專利4,797,213描述了Langerhans胰島的分離。美國專利4,439,521報道了一種生產(chǎn)自我復(fù)制性胰島樣結(jié)構(gòu)物的方法。美國專利5,919,703報道了胰島的制備和儲存方法。美國專利5,888,816報道了用下丘腦和腦垂體的提取物培養(yǎng)胰島細(xì)胞的方法。WO00/72885報道了在非胰島組織內(nèi)誘導(dǎo)胰腺激素有調(diào)產(chǎn)生的方法。WO00/78929報道了制備胰島細(xì)胞的方法。Kim等(GenesDev.,15:111,2001)論述了調(diào)節(jié)胰腺發(fā)育及其功能的胞內(nèi)信號。Yamaoka等(Int.J.Mol.Med.,3:247,1999)論述了胰島的發(fā)育,并推測了Sonichedgehog和活化素等因子,PDX1和Isll等轉(zhuǎn)錄因子,EGF和HGF等生長因子,胰島素和生長素等激素以及N-CAM和鈣粘素等細(xì)胞粘附分子的推定作用。Peck等(Ann.Med.,33:186,2001)提出將胰干細(xì)胞作為構(gòu)建單元用于構(gòu)建更好的代胰島繼而用于治療I型糖尿病。WO00/47721報道了誘導(dǎo)胰島素陽性祖細(xì)胞的方法。WO01/39784報道了分離自胰島細(xì)胞的nestin陽性胰干細(xì)胞。WO01/77300報道了人胰上皮祖細(xì)胞能夠分化為胰泡細(xì)胞、胰管(ductal)細(xì)胞和胰島細(xì)胞。Deutsch等(Devel叩ment,128:871,2001)描述了胚胎內(nèi)胚層中胰肝雙能前體細(xì)胞群。Zulewski等(Diabetes,50:521,2001)描述了分離自成人胰島的nestin陽性多能干細(xì)胞,它們可分化為內(nèi)分泌、外分泌和肝表型。美國專利6,326,201(Curislnc.)報道了自胰管中解離然后細(xì)胞培養(yǎng)而制得的胰祖細(xì)胞。Bretzel等(Exp.Clin.Endocrinol.Diabetes,190(Suppl.2):S384,200l)和Oberholzer等(Ann.N.Y.Acad.Sci.,875:189,1999)論述了胰島細(xì)胞移植方面的現(xiàn)有臨床經(jīng)驗。目前的臨床試驗通常涉及將來自至少兩個胰供體的細(xì)胞融合。既使這種方法被證明有效,目前來源仍無法提供足夠的材料來滿足所有I型糖尿病人治療所需。已有多家研究機(jī)構(gòu)開始致力于研究和開發(fā)胚胎多能干細(xì)胞可分化為其它類型細(xì)胞的能力。據(jù)報道,已從鼠胚胎細(xì)胞獲得了具有胰島細(xì)胞系特征的細(xì)胞。Lumelsky等(Science,292:1389,2001)報道了鼠胚胎細(xì)胞可分化為類似胰島的胰島素分泌結(jié)構(gòu)物。Soria等(Diabetes49:157,2000)報道衍生自鼠胚胎干細(xì)胞的胰島素分泌細(xì)胞令得鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的高血糖恢復(fù)正常。遺憾的是,胚胎千細(xì)胞發(fā)育的小鼠模型只是特例,未能獲得適用其它物種的分化策略。事實上,目前只能從很少的其它哺乳動物中重復(fù)分離得到多能干細(xì)胞。直到最近,Thomson等才從人胚泡中分離獲得了胚胎干細(xì)胞(Sdence,282:114,1998)。同時,Gearhart及其同事由胎性腺組織獲得了人胚生殖(hEG)細(xì)胞系(Shamblott等,Proc.Natal.Acad.Sci.USA,95:13726,1998)。與只要用白血病抑制因子(LIF)即可阻止分化的鼠胚胎干細(xì)脾不同,人胚胎干細(xì)胞必需在非常特殊的條件下才能維持(美國專利6,200,806;WO99/20741;WO01/51616)。所以,必需開發(fā)全新的模型以使人多能細(xì)胞分化為具有完全功能的不同細(xì)胞類型。Jacobson等(Transplant.Proc.,33:674,2001)報道了恒河猴胚胎干細(xì)胞向小腸和胰腺內(nèi)胚層的分化。Assady等(Diabetes,50:1691,2001)通過對培養(yǎng)基的免疫組織化學(xué)和酶聯(lián)免疫試驗鑒定到人胚胎干細(xì)胞分化為胚狀體后的胰島素產(chǎn)生。當(dāng)然,胚狀體包含了多種不同的細(xì)胞類型(W001/51616),而Assady沒有試圖分離分泌胰島素的細(xì)胞,也沒有試圖確定可富集細(xì)胞群的分化條件。要使胚胎干細(xì)胞衍生的胰島細(xì)胞滿足產(chǎn)業(yè)應(yīng)用的要求,仍需要開發(fā)新的方法以獲得高純度的胰島細(xì)胞群。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種生產(chǎn)靈長動物細(xì)胞的系統(tǒng),所述細(xì)胞是由多能細(xì)胞分化得到的胰島細(xì)胞系細(xì)胞。本發(fā)明獲得了具有相當(dāng)富集程度的胰島祖細(xì)胞群。然后,胰島祖細(xì)胞進(jìn)一步分化為分別分泌胰島素、胰高血糖素、抑生長素或以上三者的細(xì)胞集落。所以,本發(fā)明實施方式之一是一種令靈長動物多能干細(xì)胞(pPS)(例如胚胎干細(xì)胞)分化而獲得的細(xì)胞群,其中至少5%的細(xì)胞分泌以下內(nèi)源基因編碼的4種胰島細(xì)胞蛋白中的至少一種胰島素,胰高血糖素,抑生長素和看似惰性的被稱為胰多肽的產(chǎn)物。這些細(xì)胞可以呈細(xì)胞簇,其中包含分泌以上三種激素中任一種的細(xì)胞,并可以經(jīng)加工而盡可能去除其它細(xì)胞類型。本發(fā)明的細(xì)胞可根據(jù)后文所述的表型標(biāo)記來鑒定。功能和效果可根據(jù)給予高血糖癥患者后空腹血糖水平的改善來確認(rèn)。本發(fā)明的另一實施方式是一種能夠自我更新并能夠產(chǎn)生成熟胰島細(xì)胞后代的分化細(xì)胞群。這表示,此類細(xì)胞不再是多能的,但它們保留了通過增殖形成胰島細(xì)胞的能力。該細(xì)胞群內(nèi)中未分化多能細(xì)胞應(yīng)盡可能少,既使殘留也不應(yīng)是通過進(jìn)一步增殖可形成胰島細(xì)胞的那些??蛇x的是,可通過提高端粒末端轉(zhuǎn)移酶的活性來提高干細(xì)胞的復(fù)制能力。本發(fā)明的另一實施方式是一種獲得分泌多肽的細(xì)胞的方法,其中,通過例如形成含內(nèi)胚層的胚狀體或其它形式引發(fā)pPS細(xì)胞的分化。然后,將細(xì)胞培養(yǎng)在多種分化因子的混合物中,所述分化因子例如TGF-(3拮抗劑樣的Noggin,活化素A,正丁酸鹽,或后文其它因子。此外,或作為這一步驟的替代,可對細(xì)胞進(jìn)行遺傳改造使之表達(dá)某種胰轉(zhuǎn)錄因子,例如神經(jīng)生成素3。本發(fā)明的另一實施方式是一種利用本發(fā)明細(xì)胞組合物來篩選能夠調(diào)節(jié)胰島細(xì)胞功能的化合物的方法。本發(fā)明的另一實施方式是一種通過培養(yǎng)本發(fā)明胰島細(xì)胞來生產(chǎn)胰島素、胰高血糖素或抑生長素的方法。本發(fā)明還包括包含本發(fā)明細(xì)胞的藥物組合物和裝置。本發(fā)明細(xì)胞、組合物和裝置可用于在個體,尤其是但不限于I型糖尿病人中恢復(fù)胰島細(xì)胞功能。以下是對本發(fā)明上述及其它實施方式的詳細(xì)描述。圖l:分化和成熟過程中的hES衍生的肝細(xì)胞(10X,40X)。A行顯示在含5mM正丁酸鈉的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天后的細(xì)胞。培養(yǎng)物中80%以上的細(xì)胞含有大細(xì)胞核和粒狀細(xì)胞質(zhì)。將這些細(xì)胞轉(zhuǎn)移到特化肝細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-4天(B行和C行)。此時,多的是多核多邊形細(xì)胞。ES衍生的肝細(xì)胞與新鮮分離的成人肝細(xì)胞(D行)和胎肝細(xì)胞(E行)具有相同的形態(tài)學(xué)特征。圖2:表達(dá)胰島素的hES衍生的細(xì)胞。分化策略基于假設(shè)肝細(xì)胞和胰細(xì)胞具有相同的早期祖細(xì)胞。早期分化與肝細(xì)胞相似,區(qū)別僅在于培養(yǎng)基中加有環(huán)杷明。接著,用胰島分化因子活化素A、煙酰胺、環(huán)杷明和低濃度正丁酸鹽培養(yǎng)細(xì)胞。最后,細(xì)胞在活化素A、(3-動物纖維素、煙酰胺和IGF-1中培養(yǎng)11天以促進(jìn)胰島細(xì)胞長出。上圖顯示DAPI染色的細(xì)胞核。下圖中的相應(yīng)區(qū)域顯示胰島素的迷散性紅色抗體染色。圖3:沿胰島細(xì)胞個體發(fā)育路徑逐步引導(dǎo)hSE細(xì)胞分化的結(jié)果。在mRNA水平分析三種腸道內(nèi)胚層標(biāo)記的表達(dá),并相對胰腺內(nèi)的水平進(jìn)行歸一化。未分化細(xì)胞和非特異性分化細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平很低,但是正丁酸鹽和活化素聯(lián)用造成了向具有腸道內(nèi)胚層特征的細(xì)胞的分化或選擇。圖4:hSE細(xì)胞先在過渡培養(yǎng)基中長時間聚集培養(yǎng),然后在含有促分裂素和胰.島細(xì)胞分化因子Noggin的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的結(jié)果。上圖和中圖分別為低倍放大和高倍放大的胰島素c-肽染色情況,顯示有陳述的胰腺(5細(xì)胞簇。下圖顯示抑生長素,一種5細(xì)胞標(biāo)記的染色情況。圖5:—例胰島細(xì)胞分化試驗中的細(xì)胞,以含轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑基因神經(jīng)生成素3(Neurogenin3)的載體轉(zhuǎn)染后9天。據(jù)抗體測定,這些細(xì)胞表現(xiàn)出高水平的胰高血糖素表達(dá)。圖6(A)和(B)顯示神經(jīng)生成素3轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)(實心柱)的mRNA表達(dá)水平,與陰性對照(陰影柱)相比。轉(zhuǎn)染基因早在第2天起就表現(xiàn)出上調(diào)下游基因NeuroDl和Nkx2.2的表達(dá),由此提高了胰島素和胰高血糖素的表達(dá)。詳細(xì)描述本發(fā)明從多能干細(xì)胞進(jìn)行分化解決了大量生產(chǎn)人胰島細(xì)胞的問題。已發(fā)現(xiàn),可以誘導(dǎo)干細(xì)胞沿胰島細(xì)胞分化路徑分化,即引發(fā)向內(nèi)胚層細(xì)胞系的分化,并通過在促進(jìn)胰島細(xì)胞長出的因子存在下的培養(yǎng)實現(xiàn)分化過程的聚焦。本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)富集多能胰島細(xì)胞祖細(xì)胞的細(xì)胞群的方法,由此能夠形成成熟的胰島。根據(jù)需要,分化過程可繼續(xù),從而維持成熟的激素分泌細(xì)胞。為了以至于該分化過程的優(yōu)化,本發(fā)明提供了一種將給分化路徑解析為一系列后續(xù)階段進(jìn)行的策略。由此,可鑒定在分化路徑各個階段推動細(xì)胞分化的因子。在實施例5中,分化過程如下。l期,誘導(dǎo)來自無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物的未分化人胚胎干細(xì)胞的分化,從而在懸浮培養(yǎng)物中形成含內(nèi)胚層細(xì)胞的混合細(xì)胞聚集體。用維甲酸作為初始分化劑,與之聯(lián)用的是富集因子硒和T3。2期,在含有Noggin(200ng/ml),EGF(20ng/ml)和bEGF(2ng/ml)的培養(yǎng)基中培養(yǎng),誘導(dǎo)向胰祖細(xì)胞的分化。3期清除Noggin、EGF和bEGF培養(yǎng)基代之以在10mM煙酰胺存在下培養(yǎng),從而誘導(dǎo)向終期胰島細(xì)胞分化。如圖4所示,獲得了合成胰島素c-肽和抑生長素的細(xì)胞簇,產(chǎn)物達(dá)到可用抗體檢測的水平。由pPS細(xì)胞生產(chǎn)胰島干細(xì)胞的方法意義重大,因為pPS細(xì)胞可無限增殖。本發(fā)明提供了一種可用于產(chǎn)生無限量胰島祖細(xì)胞及其后代定向發(fā)育為成熟胰島細(xì)胞的系統(tǒng)。后文進(jìn)一步描述本發(fā)明胰島細(xì)胞的生產(chǎn)和鑒定,并且,廣泛論述了這些細(xì)胞如何用于研究、藥物研發(fā)和胰島細(xì)胞功能紊亂相關(guān)病癥的治療。定義就本發(fā)明而言,"胰島細(xì)胞"指分化末期的分泌胰島素的細(xì)胞,以及定向形成一般稱為胰腺的后代的各種前體細(xì)胞。胰島細(xì)胞表現(xiàn)出某些公認(rèn)為胰島細(xì)胞系所特有的形態(tài)特征和表型標(biāo)記(見后文舉例)。成熟a細(xì)胞分泌胰高血糖素;成熟(3細(xì)胞分泌胰島素;成熟5細(xì)胞分泌抑生長素;PP細(xì)胞分泌胰多肽。"胰島祖細(xì)胞"、"胰島前體細(xì)胞"或"胰島干細(xì)胞"指基本上不內(nèi)分泌但保留了增殖能力并能夠產(chǎn)生最終分化細(xì)胞的胰島細(xì)胞,可能還具有自我更新能力。早期胰島祖細(xì)胞具有多能性,即能夠形成至少兩種或全部四種成熟胰島細(xì)胞類型。"胰祖細(xì)胞"、前體或肝細(xì)胞即能夠形成胰內(nèi)分泌細(xì)胞也能夠形成胰外分泌細(xì)胞。討論細(xì)胞的個體發(fā)育時,定語"分化"是相對而言的。"分化細(xì)胞"與對照細(xì)胞相比,已進(jìn)行到了發(fā)育路徑的較下游階段。本發(fā)明假設(shè)正常個體發(fā)育過程中的多能胚胎干細(xì)胞首先分化為能夠形成胰細(xì)胞的內(nèi)胚層細(xì)胞和其它內(nèi)胚層細(xì)胞類型。進(jìn)一步的分化進(jìn)入胰細(xì)胞路徑,其中,約98%的細(xì)胞成為外分泌管細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞,約2%成為內(nèi)分泌細(xì)胞。早期內(nèi)分泌細(xì)胞即胰島祖細(xì)胞,可進(jìn)一步分化為專職分泌胰島素、胰高血糖素、押ft長素或胰多肽的功能性內(nèi)分泌細(xì)胞。"分化劑"在本文中指用于本發(fā)明培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)生屬于胰島細(xì)胞系的分化細(xì)胞(包括前體細(xì)胞和最終分化細(xì)胞)的化合物。對此類化合物的作用方式?jīng)]有限定。例如,所述分化劑輔助分化的機(jī)理可以是通過誘導(dǎo)或輔助表型改變、促進(jìn)特定表型的細(xì)胞生長或抑制其它細(xì)胞的生長。分化劑還可以是其它因子的抑制劑,所述其它因子存在于培養(yǎng)基中或由細(xì)胞群合成,如果不被抑制則可能將分化引向非期望的細(xì)胞類型。原型"靈長動物多能干細(xì)胞"(pPS)是衍生自受精后任何階段的胚前、胚或胎組織的多能細(xì)胞,其特征在于能夠在合適的條件下產(chǎn)生衍生自全部三個胚層(內(nèi)胚層、中胚層、外胚層)的數(shù)種不同細(xì)胞類型的后代,這可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)試驗例如在8-12周齡SCID小鼠內(nèi)形成畸胎瘤的能力來確定。該術(shù)語包括已確立的各種類型的干細(xì)胞系和根據(jù)上述方式確認(rèn)為多能的由原代(primary)組織獲得的細(xì)胞。pPS細(xì)胞的定義包括各種類型的胚胎細(xì)胞,例如人胚胎干細(xì)胞(hES),見Thomson等(Science282:1145,1998);其它靈長動物的胚胎干細(xì)胞,例如恒河猴干細(xì)胞(Thomson等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:7844,1995),絨猴干細(xì)胞(Thomson等,Biol.Reprod.55:254,1996)和人胚胎生殖(hEG)細(xì)胞(Shamblott等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:13726,1998)以及其它類型的多能細(xì)胞。該術(shù)語包括源自所有三胚層、能夠產(chǎn)生后代的靈長動物細(xì)胞,不論它們是來自胚組織、胎組織或是其它來源。pPS細(xì)胞最好不是來自惡性瘤組織。通常期望但非必須,此類細(xì)胞核型正常當(dāng)細(xì)胞群中大部分干細(xì)胞及其后代表現(xiàn)出明顯區(qū)別于胚胎或成人已分化細(xì)胞的未分化細(xì)胞形態(tài)特征時,就稱pPS細(xì)胞培養(yǎng)物為"未分化的"。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難識別未分化pPS細(xì)胞,在二維顯微鏡下,它們表現(xiàn)為高核/質(zhì)比和具有明顯核仁的細(xì)胞集落。一般認(rèn)為,細(xì)胞群內(nèi)未分化細(xì)胞集落通常被臨近的已分化細(xì)胞所包圍。"詞養(yǎng)細(xì)胞"指與另一種細(xì)胞共培養(yǎng),用于為后者提供適宜的生長環(huán)境的細(xì)胞。某些pPS細(xì)胞可用小鼠原代胚胎成纖維細(xì)胞,無限增殖化的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞或hES細(xì)胞分化而成的人成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞來支持。如果自分裂后細(xì)胞已培養(yǎng)了至少一個周期,期間沒有加新鮮飼養(yǎng)細(xì)胞來支持pPS細(xì)胞生長,則稱這樣的pPS細(xì)胞群為"基本無"飼養(yǎng)細(xì)胞。"胚狀體"與"聚集體"同義,指已分化和未分化細(xì)胞的聚集體,出現(xiàn)在pPS細(xì)胞在單層培養(yǎng)物中過度生長或懸浮培養(yǎng)時。胚狀體是不同細(xì)胞類型(通常源自不同胚層)的混合物,可根據(jù)形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)和免疫組織化學(xué)可測細(xì)胞標(biāo)記來鑒別。"生長環(huán)境"指適宜所需細(xì)胞增殖、分化或成熟的環(huán)境。此類環(huán)境的特征包括用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基,可能存在的生長因子或分化因子,以及可能存在的支持結(jié)構(gòu)(例如固體表面上的基質(zhì))。當(dāng)用合適的人工手段將一段聚核苷酸轉(zhuǎn)移到某細(xì)胞內(nèi)時,或該細(xì)胞是被改造細(xì)胞的后代并繼承了上述聚核苷酸時,則稱這樣的細(xì)胞為經(jīng)"遺傳改造"或"轉(zhuǎn)染"的細(xì)胞。常規(guī)技術(shù)分子遺傳學(xué)和基因工程中的常規(guī)方法可參見"分子克隆實驗室手冊"(Sambrook等,ColdSpringHarbor);"哺乳動物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移載體"(Miller&Calos編)和"現(xiàn)代分子生物學(xué)方法"(F.M.Ausubel等,Wiley&Sons)。細(xì)胞生物學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)和抗體技術(shù)可參見"現(xiàn)代蛋白質(zhì)科學(xué)方法"(J.E.Colligan等,Wiley&Sons);"現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)方法"(J.S.Bonifacino等,Wiley&Sons)和"現(xiàn)代免疫學(xué)方法"(J.E.Colligan等,Wiley&Sons)。試劑、克隆載體和基因操作所用的試劑盒可向例如BioRad、Stratagene、Invitrogen、Clon丁eck和Sigma-AldrichCo.等廠商購買。細(xì)胞培養(yǎng)方法可參見最新版的"動物細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)手冊"(R丄Freshney編,Wiley&Sons);細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)(M.A.Harrison&I.F.Rae.,CambridgeUniv.Press)和"胚胎干細(xì)胞方法和規(guī)范"(K.Turksen等,HumanaPress)。組織培養(yǎng)材料禾卩試齊U可向Gibco/BRL、Nalgene隱NuncInternational,SigmaChemicalCo.禾口Biomedicals等廠商購買。與本發(fā)明相關(guān)的專門著作包括"胰島比較生理學(xué)",J.E.Brinn,Springer-Verlag,1988;"胰島細(xì)胞再生和發(fā)育",E丄Vinlk等,Kluwer,1992;"胰島細(xì)胞的免疫建模"("胰島移植",Vol.2),R.RLanza等編,SpringerVerlag,1994千細(xì)胞來源本發(fā)明可用各種干細(xì)胞來實施。其中,包括衍生自妊娠后形成的組織如胚泡的靈長動物多能干細(xì)胞(pPS),或衍生自妊娠期間胎或胚組織的pPS細(xì)胞。非限定性例子是胚胎干細(xì)胞或胚胎生殖細(xì)胞的原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系,詳見后文。本發(fā)明也可直接用原代胚或胎組織來實施,即直接由能夠產(chǎn)生胰島細(xì)胞的原代細(xì)胞衍生獲得胰島細(xì)胞而不先建立未分化細(xì)胞系。某些情況下,本發(fā)明還可用來自臍帶血或某些成人組織的多能細(xì)胞進(jìn)行。胚胎干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞可自靈長動物的胚泡分離獲得(美國專利5,843,780;Thomson等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:7844,1995)。人胚胎干細(xì)胞(hES)可由人胚泡細(xì)胞制得,方法參見Thomson等(美H專利6,200,806;Science282:1145,1998;Curr.Top:Dev.Biol.,38:133ff,1998)和Reubinoff等,NatureBiotch.18:399,2000)。與hES相當(dāng)?shù)募?xì)胞包括它們的多能衍生物,例如原始外胚層樣(EPL)細(xì)胞,參見WO01/51610(B認(rèn)gen)。hES細(xì)胞可由人前植入胚獲得。或者,也可用體外授精(IVF)胚,還可讓人胚胎單細(xì)胞擴(kuò)增到胚泡期(Bongso等,HumReprod4:706,1989)??稍贕1.2和G22.培養(yǎng)基中將胚培養(yǎng)至胚泡期(Gardner等,F(xiàn)ertil.Steril.69:84,1998)。通過與鏈霉蛋白酶(Sigma)的短暫接觸來清除成形胚泡中的透明帶(zonapellucida)。內(nèi)部細(xì)胞通過免疫外科分離獲得,其中,胚泡與兔抗人脾細(xì)胞抗血清的1:50稀釋液接觸30分鐘,然后在DMEM中洗滌三次,每次5分鐘,然后與豚鼠補(bǔ)體的l:5稀釋液接觸3分鐘(Gibco)(Solter等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA72:5099,1975)。DMEM中再洗滌2次后,從完整內(nèi)細(xì)胞塊(ICM)中用移液管小心去除裂解的滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞,然后將ICM平板培養(yǎng)在mEF詞養(yǎng)細(xì)胞層上。9至15天后,通過含lmMEDTA的無鈣無鎂磷酸鹽緩沖液(PBS)處理,或用分散酶或胰蛋白酶處理,或用微量移液管機(jī)械分散,將由內(nèi)部細(xì)胞塊長出的物質(zhì)分散成小塊;然后,重新平板培養(yǎng)在新鮮培養(yǎng)基中的mEF上。用微量移液管挑出具有未分化形態(tài)特征的正在生長的單菌落,機(jī)械分散,再平板培養(yǎng)。ES樣形態(tài)的特征是菌落致密,高核/質(zhì)比,核仁明顯。然后,通過胰蛋白酶簡短消化,Dulbecco'sPBS(含2mMEDTA)處理,IV型膠原酶(約200U/ml,Gibco)處理或用微量移液管進(jìn)行的單菌落挑選,使得所得ES細(xì)胞每隔1至2周分裂一次。最佳菌落塊大小約為50-100細(xì)胞。胚胎生殖細(xì)胞人胚胎生殖細(xì)胞(hEG)可由最后一次月經(jīng)后約8-11周后采集的人胎材料中的原始生殖細(xì)胞來制備。合適的制備方法參見Shambott等,Proc.Nat.Acad.Sci.USA95:13726,1998和美國專利6,090,622。簡而言之,處理性腺嵴,使之形成解聚細(xì)胞。EG生長培養(yǎng)基是DMEM,4500mg/LD-葡萄糖,2200mg/LmMNaHC03;15%ES級(ESqualified)胎牛血清(BRL);2mM谷氨酰胺(BRL);lmM丙酮酸鈉(BRL):000-2000U/ml人重組白血病抑制因子(LIF,Genzyme);l-2ng/ml人重組bFGF(Genzyme)和IO)JVI毛喉萜(10%的DMSO溶液)。96格組織培養(yǎng)板與亞鋪滿的飼養(yǎng)細(xì)胞層(例如STO細(xì)胞,ATCCNo.CRL1503)在無LIF、bFGF和毛喉賠的改良EG生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天,然后用5000rad的Y-輻射滅活。在每格中加入約2ml原代生殖細(xì)胞(PGC)。在EG生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)7-10天后進(jìn)行第一次傳代,將每格中的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到另一24格培養(yǎng)板的格中,后者預(yù)先用輻照過的STO小鼠成纖維細(xì)胞處理過。培養(yǎng)細(xì)胞,每日更換新鮮培養(yǎng)基,直至觀察到符合EG細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞,一般需7-30天或1-4代。。PS細(xì)胞未分化時的增殖采用促進(jìn)增殖但不促進(jìn)分化的條件,可使pPS細(xì)胞在培養(yǎng)物中持續(xù)增殖。例如采用含血清的ES培養(yǎng)基,其中含80。/。DMEM(例如敲除DMEM,Gibco),20%胎牛血清(FBS,Hyclone)或代血清(W098/30679),1%非必需氨基酸,lmML-谷氨酰胺和0.1mM(3-巰基乙醇。臨用前,加入4ng/ml人bFGF(W099/20741,GeronCorp.)。通常將ES細(xì)胞培養(yǎng)在一層飼養(yǎng)細(xì)胞上,飼養(yǎng)細(xì)胞一般為衍生自胚組織或胎組織的成纖維細(xì)胞。Geron的科學(xué)家發(fā)現(xiàn),既使不用飼養(yǎng)細(xì)胞也可將pPS細(xì)胞維持于未分化狀態(tài)。無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)的條件包括合適的培養(yǎng)基質(zhì),尤其是胞外基質(zhì),例如Matrigel⑧或?qū)诱尺B蛋白。通常,在細(xì)胞完全分散前終止酶解(例如,IV膠原酶處理約5分鐘)。然后將10-2000細(xì)胞左右的細(xì)胞塊直接接種到基質(zhì)上平板培養(yǎng),不再進(jìn)一步分散用含有支持細(xì)胞增殖但不支持其分化的因子的營養(yǎng)培養(yǎng)基來支持無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物。此類因子的引入可通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)分泌此類因子的細(xì)胞,例如輻照過的(約4000rad)原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞、調(diào)聚(telomerized)小鼠成纖維細(xì)胞或衍生自pPS細(xì)胞的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞??烧{(diào)整培養(yǎng)基,例如在無血清培養(yǎng)基(例如補(bǔ)充了20%代血清和4ng/mlbFGF的KODMEM)中以5-6X104/0112左右的密度平板培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞。在如此調(diào)整1-2天的培養(yǎng)基中進(jìn)一步補(bǔ)充bFGF,然后用于支持pPS細(xì)胞培養(yǎng)物1-2天。無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)法的其它細(xì)節(jié)可參見WO01/51616和Xu等,Nat.Biotechnol.19:971,2001,顯微鏡下,ES細(xì)胞呈高核/質(zhì)比,核仁明顯,菌落致密,幾乎觀察不到細(xì)胞接合腺。靈長動物ES細(xì)胞表達(dá)階段特異性胚胎抗原(SSEA)3和4,以及可用抗體測知的標(biāo)記Tra-l-60和Tra-1-81(Thomson等,Science282:1145,1996)。小鼠ES細(xì)胞可用作SSEA-1的陽性對照和SSEA-4、Tra-l-60和Tra-1-81的陰性對照。SSEA-4也存在于人胚胎性癌(hEC)細(xì)胞上。pPS的體外分化不表達(dá)SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81,但提高SSEA-1表達(dá),該抗原也存在于未分化hEG細(xì)胞上。制備胰島細(xì)胞及其衍生物的材料和方法本發(fā)明的胰島細(xì)胞通過在富集所需表型(培養(yǎng)出所需的細(xì)胞或抑制或殺死其它細(xì)胞類型)的特殊生長環(huán)境中培養(yǎng)、分化或增殖干細(xì)胞制得。這些方法適用于許多類型的干細(xì)胞,包括靈長動物多能干細(xì)胞(pPS)。分步驟分化本發(fā)明假設(shè)形成能夠形成胰細(xì)胞和其它細(xì)胞類型的早期多能祖細(xì)胞可促進(jìn)自pPS細(xì)胞產(chǎn)生胰島細(xì)胞并富集。一般說來,該策略需首先形成一個富集了相關(guān)定型前體細(xì)胞的細(xì)胞群,然后進(jìn)一步分化為越來越向形成胰島特化的更成熟的細(xì)胞。根據(jù)該策略,pPS細(xì)胞向成熟胰島的分化細(xì)分為數(shù)個階段進(jìn)行。未分化pPS細(xì)胞與成熟胰島之間的中間體之一是不成熟的內(nèi)胚層細(xì)胞。個體發(fā)育早期,內(nèi)胚層細(xì)胞能夠形成消化道和呼吸系統(tǒng)和重要消化器官(肝和胰)的上皮細(xì)胞。胰島細(xì)胞可用一種兩階段方法生成。1期,獲得共同內(nèi)胚層前體細(xì)胞群。2期,使內(nèi)胚層前體細(xì)胞成熟為胰內(nèi)分泌細(xì)胞。如實施例3所述,可用肝細(xì)胞分化劑正丁酸鹽引發(fā)pPS細(xì)胞沿內(nèi)胚層分化路徑分化。關(guān)于肝細(xì)胞分化的詳述可參見WO01/81549(GeronCorporation)'SonicHedgehog被認(rèn)為參與了肝的特化,所以,在培養(yǎng)基中加入環(huán)杷明(一種SonicHedgehog抑制劑)被認(rèn)為有助于驅(qū)使細(xì)胞向胰細(xì)胞系分化。然后,可用末期分化因子煙酰胺(在環(huán)杷明和活化素A存在下)進(jìn)一步促進(jìn)分化。對該方法進(jìn)一步的解說中,該分化路徑被分成3個階段。pPS細(xì)胞首先分化為內(nèi)胚層(l期),然后分化為第二中間體(2期),可能為定型胰前體細(xì)胞水平(可根據(jù)標(biāo)記Pdxl鑒定)。如果需要獲得成熟胰島,可進(jìn)行下一步分化(3期)。為了完成1期,可用正丁酸鹽+活化素A使pPS細(xì)胞分化為具有消化道內(nèi)胚層標(biāo)記的細(xì)胞(實施例4)?;蛘?,可在富集劑(硒和甲狀腺素例如T3)存在下用維甲酸培養(yǎng)pPS細(xì)胞來制備包含內(nèi)胚層細(xì)胞的混合細(xì)胞群(實施例5)。為了完成2期,可用例如Noggin的TGF-l3拮抗劑+促分裂素(屬于FGF家族,可與EGF或動物纖維素混合)培養(yǎng)細(xì)胞(實施例5)。用環(huán)杷明阻斷Hedgehog信號傳遞也許有幫助。3期可用前述末期分化因子煙酰胺來完成(實施例5)。萍者,可通過使得Pdxl陽性胰前體細(xì)胞進(jìn)化到成熟胰島細(xì)胞的直接操作活化轉(zhuǎn)錄因子(實施例6)。以上分步驟分化的方法只是一種指導(dǎo),本發(fā)明并非局限于此。以上分化路徑還可分解為更多的階段,從而以階進(jìn)方式優(yōu)化分步驟分化。例如,可能存在于胰前體細(xì)胞和成熟胰島之間的一種中間體是定向于形成胰內(nèi)分泌細(xì)胞的前體細(xì)胞。另一方面,根據(jù)條件,可同時將多種有效的分化劑聯(lián)合起來作用于不同階段的細(xì)胞,或者促進(jìn)沿分化路徑的級聯(lián)效應(yīng)。所需的末期細(xì)胞群部分取決于預(yù)期用途。例如,就治療胰島功能不全和體外研究胰島分化而言,特別具有價值的是定型胰島祖細(xì)胞。更早期的祖細(xì)胞可能具有更強(qiáng)的自我更新能力。當(dāng)需要立即產(chǎn)生激素時,則需要高水平合成胰島素或其它內(nèi)分泌激素的成熟細(xì)胞。分化過程可根據(jù)需要來制定,使之中止于達(dá)到所需成熟度的階段。以下是關(guān)于促進(jìn)分化的組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)。引發(fā)分化有兩種方法可使pPS細(xì)胞向內(nèi)胚層細(xì)胞分化。其一是將細(xì)胞平板培養(yǎng)在新的基質(zhì)上,或更換培養(yǎng)基以去除胞外基質(zhì)或可溶性分化抑制因子。這種方法有時稱為"直接分化法",參見WO01/51616和美國專利公開20020019046。在直接分化法中,通常優(yōu)選從無飼養(yǎng)細(xì)胞的pPS細(xì)胞培養(yǎng)物開始,從而避免殘留詞養(yǎng)細(xì)胞在分化過程中造成的干擾。實施例4通過引入含有早期分化因子的培養(yǎng)基,用直接分化法生成了消化道內(nèi)胚層。另一種方法是懸浮培養(yǎng)未分化pPS細(xì)胞,通常使它們形成胚狀體或聚集體。例如,通過膠原酶簡短消化收獲pPS細(xì)胞,分散為細(xì)胞簇,在非粘附細(xì)胞培養(yǎng)平板上傳代。每隔數(shù)天加一次聚集體,經(jīng)適當(dāng)時間,通常4-8天后收獲細(xì)胞(實施例1和5)。有時,在培養(yǎng)基中加入其它因子來加強(qiáng)分化,例如維甲酸(實施例5)或二甲基亞砜(DMSO)。根據(jù)情況,聚集體通常先形成一個混合細(xì)胞群,其中主要為內(nèi)胚層細(xì)胞。然后,可將這些胚狀體分散,并再平板培養(yǎng)在諸如層粘連蛋白或纖維結(jié)合素等基質(zhì)上,以便進(jìn)入下一分化期;或用非粘附平板和合適的培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮培養(yǎng)傳代??捎煤笪乃鰳?biāo)記監(jiān)測直接分化或聚集體內(nèi)分化,看是否存在內(nèi)胚層細(xì)胞。一旦獲得了足量的內(nèi)胚層細(xì)胞,就可以重新對細(xì)胞進(jìn)行平板培養(yǎng)或其它操作從而啟動II期。某些情況下,如果細(xì)胞成小簇(例如50-5,000個細(xì)胞),可促進(jìn)胰島細(xì)胞的分化和維持,這樣,a-、卩-和5-細(xì)胞可直接相互作用。用這種方法獲得共同的祖細(xì)胞后,可如下所述用特異性分化因子培養(yǎng)和/或用胰島特異性基因或促進(jìn)劑進(jìn)行f導(dǎo)。用可溶性因子進(jìn)一步驅(qū)使細(xì)胞向胰島分化為了驅(qū)使培養(yǎng)物進(jìn)入胰島分化路徑的下一階段,可用多種胰島分化因子的混合物培養(yǎng)pPS細(xì)胞或它們的已分化后代。不論單用或聯(lián)用,這些因子都能提高向所需細(xì)胞類型轉(zhuǎn)化的幾率,從而長出具有胰島表型的細(xì)胞,抑制其它細(xì)胞類型,或以其它方式富集胰島細(xì)胞。要實施本發(fā)明并沒有必要理解這種胰島細(xì)胞富集的機(jī)制。以下是可選分化因子的舉例。表l:促進(jìn)pPS細(xì)胞向胰島細(xì)胞分化的因子因子環(huán)杷明化合物類型或家族甾族生物堿(3-動物纖維素EGF家族成員活化素AExtendin-4胰高血糖素樣肽l(GLP-l)肝細(xì)胞生長因子(HGF)煙酰胺胰島素樣生長因子l(IGF-l)正丁酸鹽維甲酸(全反式)生長素(人垂體生長激素)胎盤催乳素脈管內(nèi)皮生長因子(VEGF)胰島素樣生長因子n(iGF-n)3-異丁基-1-(IBMX)甲吟膽囊收縮素神經(jīng)生長因子(NGF)表皮生長因子TGF-P家族成員胰高血糖素樣肽1激動劑肽激素,胰高血糖素基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物之一;G蛋白偶聯(lián)受體的配體c-Met受體的配體B族維生素肽激素維甲酸類生長激素/催乳素家族生長激素/催乳素家族Flt-l和Flk-l是受體。PDGF/VEGF家族胰島素家族磷酸二酯酶抑制劑,提高cAMP水平PI-3激酶抑制劑肽激素消化道激素NGF家族EGF家族(見(3-動物纖推定功能起效濃度Hedgehog信號傳遞抑制降M劑,也可作為膽固醇生物合成抑制劑促分裂素,P細(xì)胞分化促4nM進(jìn)劑。這兩項功能緣于該蛋白的不同域。分化因子,使管樣細(xì)胞系4nM分化為內(nèi)分泌胰細(xì)胞GLP-1的更穩(wěn)定形式(見20nM后文)誘導(dǎo)葡萄糖生產(chǎn)、胰島素20nM分泌,誘導(dǎo)P細(xì)胞生成,誘導(dǎo)P細(xì)胞增殖在HGF過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因10ng/ml動物中使P細(xì)胞增大,誘導(dǎo)由管細(xì)胞形成(3細(xì)胞影響細(xì)胞的核糖基化和/10mM或氧化狀態(tài);促進(jìn)(3細(xì)胞分化促P細(xì)胞分裂素10nM組蛋白脫乙酰酶抑制劑0.5-2.5mM(用于產(chǎn)生肝細(xì)胞)分化因子10一促(3細(xì)胞分裂素腦ng/ml在PL過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動50ng/ml物中使P細(xì)胞增大,孕期內(nèi)的促(3細(xì)胞分裂素可能是內(nèi)皮胰島前體的50ng/ml促分裂素與IGF-1類似,是促分裂10nM素,但不如對胰發(fā)育或功能的作用那么強(qiáng)增強(qiáng)胰島素分泌腳M增強(qiáng)胰島素分泌30nM促進(jìn)P細(xì)胞再生10ng/ml協(xié)助胰島的成熟增強(qiáng)胰島素分泌50ng/ml轉(zhuǎn)基因過表達(dá)將導(dǎo)致(34nM(EGF)角質(zhì)細(xì)胞生長因子(KGF),akaFGF7血小板衍生的生長因子(PDGF)再生基因(Reg)胰島再生相關(guān)蛋白(INGAP)維素)FGF家族成員PDGF家族(將VEGF)Reg家族Reg家族細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)基因過表達(dá)將導(dǎo)致(3細(xì)胞擴(kuò)增可能是前體細(xì)胞的促分裂素參與胰受傷后的胰島再生可能參與胰島再生說明書第13/26頁10ng/ml50ng/ml100ng/mllOOng/ml結(jié)合相同受體的其它配體或抗體可認(rèn)為與本文中的任一受體之配體相當(dāng)。通常,至少2種、3種或更多種上述因子組成分化混合物。優(yōu)選人源蛋白,但也可采用異種類似物或變體。讀者可用結(jié)合相同受體或引發(fā)同一信號傳導(dǎo)路徑的其它配體,例如受體特異性抗體,取代上述因子。此外,可在培養(yǎng)基中加入其它成分來抵消可能存在的其它因子驅(qū)使細(xì)胞沿其它路徑分化達(dá)到作用??捎镁仃嚪▉頊y定任一上述因子的效果,從而獲得一種可促進(jìn)分化沿胰島細(xì)胞路徑前進(jìn)一到兩步的組合。可用例如后文所述的表型標(biāo)記來監(jiān)測所需中間體的表型或末期細(xì)胞的表現(xiàn)來評價上述效果。例如,被認(rèn)為誘導(dǎo)內(nèi)分泌性胰細(xì)胞分化的因子可根據(jù)它們在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)Pdxl表達(dá)和胰島素表達(dá)的能力來評價其效果。分?jǐn)?shù)因數(shù)設(shè)計可用來高效地篩選化合物。每一種因子被指定兩個水平例如,可在培養(yǎng)基質(zhì)中加入第一水平的纖連蛋白,加入第二水平的層粘連蛋白。在64種因子組合(64個實驗)中,可以確定約15-20種因子中哪些能夠以統(tǒng)計學(xué)顯著性影響分化。適合用這種方法分析的組合包括環(huán)杷明,TGF家族成員(TGF-a、活化素A、活化素B、TGF-pi,TGF-(33),Extendin-4,煙酰胺,正丁酸鹽,DMSO,全反式維甲酸,GLF-1,骨成形蛋白(BMP-2、BMP-5、BMP-6、BMP-7),胰島素樣生長因子(IGF-I、IGF-II),成纖維細(xì)胞生成因子(FGF7、FGFIO、bFGF、FGF4),其它生長因子(EGF、卩-動物纖維素,生長素,HGF),其它激素(催乳素、膽囊收縮素、胃泌素1、胎盤催乳素),TGF-P族拮抗劑(Noggin,follistatin,chordin),IBMX,渥曼青霉素,地塞米松,Reg,INGAP,cAMP或cAMP活化齊l」(毛喉萜)和胞外基質(zhì)組分(層粘連蛋白、纖連蛋白)。產(chǎn)生的細(xì)胞群根據(jù)表型標(biāo)記來評價,通過分析表達(dá)方式來確定哪些因子對分化路徑具有促進(jìn)作用,哪些具有反作用。用基因修飾過的細(xì)胞引導(dǎo)或監(jiān)測分化有時,使用以載體進(jìn)行過基因改造的細(xì)胞有助于某一分化或分離方法的優(yōu)化,所述載體具有驅(qū)動某報道基因表達(dá)的組織特異性啟動子。合適的胰島祖細(xì)胞特異性啟動子包括驅(qū)動Pdxl(NT_009799),神經(jīng)生成素3(NT—008583),NeurolD1(NT—005265),Nestin(NT—004858)和Ptf1a-p48(NT—008705)表達(dá)的那些啟動子。合適的成熟胰島細(xì)胞特異性啟動子是驅(qū)動胰島素(GenBank登錄號NT—009308),胰高血糖素(NT一022154),抑生長素(NT—005962)或胰多肽(NTJ)10755)表達(dá)的那些。選定啟動子的最小有效序列(約0.5至5kB上游序列)以PCR擴(kuò)增,然后接入標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒,腺病毒、慢病毒或逆病毒載體中,接入位置使其可驅(qū)動合適的報道基因的表達(dá)。合適的報道基因編碼熒光分子(例如綠熒光蛋白或熒光素酶),編碼可測酶(例如堿性磷酸酶),或者產(chǎn)生可用抗體或通過血凝素接合作用檢測的細(xì)胞表面抗原(各種異源蛋白或糖)。以組織特異性啟動子轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可用于優(yōu)化前述分化方法。例如,可對經(jīng)轉(zhuǎn)化的未分化pPS細(xì)胞或分化早期階段細(xì)胞實施各種分化方案,然后分析表達(dá)胰島特異性啟動子所驅(qū)動報道基因的細(xì)胞所占百分比。這就能夠迅速找出有效的分化劑、培養(yǎng)條件和時間安排。然后可將優(yōu)化過程用于非轉(zhuǎn)染細(xì)胞來產(chǎn)生高質(zhì)量的含有天然基因型的胰島細(xì)胞系的細(xì)胞群。以組織特異性啟動子轉(zhuǎn)染的細(xì)胞還可用于機(jī)械分選。例如,啟動子驅(qū)動某抗藥性表型的表達(dá),例如新霉素抗性基因(賦予對G418的抗性)或博來霉素抗性基因。此時,細(xì)胞分化后立即用相應(yīng)藥物培養(yǎng)以促進(jìn)所需細(xì)胞類型的長出?;蛘?,報道基因編碼一熒光分子或表達(dá)一可測的表面抗原。此時,根據(jù)直接或間接熒光或根據(jù)免疫吸附來分選細(xì)胞,由此從分化細(xì)胞中選出所需細(xì)胞。非復(fù)制非整合載體(例如腺病毒載體)可用于分選步驟的臨時轉(zhuǎn)染,然后隨著細(xì)胞的增殖而淡出,不改變細(xì)胞的天然基因型。還可以以直接驅(qū)動細(xì)胞進(jìn)一步向胰島細(xì)胞或其祖細(xì)胞分化為目的對細(xì)胞進(jìn)行基因改造。本發(fā)明假設(shè),人為上調(diào)胰島細(xì)胞內(nèi)某基因的表達(dá)可使分化程度較低的細(xì)胞采用適合更成熟胰島細(xì)聰?shù)幕虮磉_(dá)模式。合適的基因包括編碼影響下游基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑的基因。用于促進(jìn)胰個體發(fā)育的候選基因包括(大致按照它們在分化路徑中的位置)Soxl7(GenBank登錄號NM_022454)、Hlx9(NM—05515)、Pdxl(NM—000209)、神經(jīng)生成素3(NM_020999)、Pax4(NM—006193)或NeuroDl(NM一0002500)、IsIl(NM一002202)、Nkx2.2(NMJ)02509)禾口Nkx6.1(NM一006168)。該方法的說明詳見實施例6。在胰島細(xì)胞分化中通過細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)的神經(jīng)生成素3表達(dá)增強(qiáng)了下游調(diào)節(jié)基因和編碼胰島激素的基因的表達(dá)。神經(jīng)生成素是一族neuroD相關(guān)bHLH轉(zhuǎn)錄因子活躍于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的神經(jīng)元決定基因。已分化細(xì)胞的特征細(xì)胞可根據(jù)表型標(biāo)準(zhǔn)來鑒fe,例如顯微觀察其形態(tài)特征,檢測或定量細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá),可體外測知的功能指標(biāo),以及輸入宿主動物后的表現(xiàn)。表型標(biāo)記本發(fā)明細(xì)胞可根據(jù)它們是否表達(dá)各種胰島細(xì)胞的特征性表型標(biāo)記來鑒定??捎玫臉?biāo)記見表2。_表2:用于細(xì)胞鑒定的表型標(biāo)記SSEA-4Oct-4端粒末端轉(zhuǎn)移酶逆轉(zhuǎn)錄酶Pdxl神經(jīng)生成素3(Ngn3)胰高血糖素Nkx61葡糖激酶胰島素或前胰島素抑生長素胰多肽胰島淀粉樣多肽(IAPP)胰島-1(3-2/NeuroDHNF3bHNF4aSoxl7淀粉酶HESNestinSonicHedgehogCK19Glut-2補(bǔ)丁類似物(Patchedhomologue)平滑類似物(Smoothenedhomologue)胚胎干細(xì)胞和胚胎生殖細(xì)胞未分化胚胎多能細(xì)胞能夠無限復(fù)制的細(xì)胞(例如未分化pPS細(xì)胞)胰芽形成前在十二指腸將產(chǎn)生胰的區(qū)域內(nèi)表達(dá)。也在成熟P細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。胰島前體細(xì)胞的標(biāo)記a細(xì)胞P細(xì)胞標(biāo)記(3細(xì)胞標(biāo)記成熟P細(xì)胞5細(xì)胞PP細(xì)胞胰島標(biāo)記胰島標(biāo)記,也在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)泛胰島標(biāo)記內(nèi)胚層標(biāo)記內(nèi)胚層標(biāo)記明確的內(nèi)胚層標(biāo)記外分泌細(xì)胞外分泌胰腺標(biāo)記潛在前體細(xì)胞標(biāo)記信號分子,胰形成要求其不存在胰管標(biāo)記(可能是胰的前體)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體Hedgehog受體Hedgehog受體組織特異性標(biāo)記可用各種適當(dāng)?shù)拿庖邔W(xué)技術(shù)來檢測,例如檢測細(xì)胞表面標(biāo)記的流式免疫細(xì)胞化學(xué),檢測胞內(nèi)或細(xì)胞表面標(biāo)記的免疫組織化學(xué)(例如對固定細(xì)胞或組織切片)。有關(guān)流式細(xì)胞計數(shù)發(fā),詳見Gallacher等,"血液"96:1740,2000。如果在標(biāo)準(zhǔn)免疫細(xì)胞化學(xué)或流式細(xì)胞計數(shù)分析中,檢測到明顯的抗體與抗原接合,則認(rèn)定為該細(xì)胞表面抗原表達(dá)陽性,所述分析可在細(xì)胞固定后進(jìn)行,可采用經(jīng)標(biāo)記的第二抗體或其它偶聯(lián)物來放大標(biāo)記效果。目前特異性抗體來源包括胰島素,SigmaAldrich(12018),胰高血糖素,SigmaAldrich(G2654);抑生長素,SantaCruzBiotech(sc-7820);神經(jīng)生成素3,Chemicon(AB5684);nestin,BDTransductionLabs(N17220);a-淀粉酶,SigmaAldrich(A8273);Glut陽2,AlphaDiagnostics(GT-22A)組織特異性基因產(chǎn)物的表達(dá)還可以通過Northern印染分析、斑點雜交分析或采用序列特異性引物按照標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶引發(fā)的聚合酵鏈反應(yīng)(RT-PCR)進(jìn)行mRNA水平的檢測。詳見美國專利5,843,780。本文中具體標(biāo)記的序列可由公開的數(shù)據(jù)庫例如GenBank獲取。最初的評價可采用標(biāo)記組合,從而獲知寬泛的個體發(fā)育情況例如,Pdxl指示早期胰細(xì)胞;Ngn3指示早期胰內(nèi)分泌細(xì)胞;胰島素指示成熟(5細(xì)胞。定期(例如每周)從前述分化過程中收獲細(xì)胞,測定分化動力學(xué)特征。然后,經(jīng)測定呈上述標(biāo)記陽性的細(xì)胞進(jìn)一步分析是否表達(dá)其它標(biāo)記,例如IAPP和Nkx6.1。明確細(xì)胞特征后,即可優(yōu)化每一步驟的分化因子組合和時間設(shè)定。本發(fā)明的部分實施例涉及這樣的細(xì)胞群其中,至少2%、5%、10%或更多細(xì)胞帶有一個或多個前述表面f示記。內(nèi)分泌功能對許多研究和治療性用途來說意義重大,這些用途中,特別需要至少5%的細(xì)胞分泌胰島素、胰高血糖素、抑生長素或胰多肽的細(xì)胞群或含有至少5%能夠分化為此類內(nèi)分泌激素分泌細(xì)胞的祖細(xì)胞的細(xì)胞群。本發(fā)明假設(shè)oc、(3和5細(xì)胞之間的相互作用對避免去分化和保持有效的內(nèi)分泌特性非常重要。本發(fā)明還包括這樣的細(xì)胞群或細(xì)胞簇(約50-5,000細(xì)胞)含有兩種或三種上述細(xì)胞類型,它們因自身產(chǎn)生的基質(zhì)、培養(yǎng)基中含有的基質(zhì)祖父,或因莢膜包裹而結(jié)合在一起。本發(fā)明還描述了一種未分化pPS細(xì)胞低殘留的細(xì)胞群。較好的細(xì)胞群為1%或0.2%以下SSEA-4+ve、Oct-4+ve或內(nèi)源性端粒末端轉(zhuǎn)移酶逆轉(zhuǎn)錄酶陽性。較好的細(xì)胞群中其它細(xì)胞類型(例如肝細(xì)胞(白蛋白陽性細(xì)胞)、骨骼肌細(xì)胞(myoD陽性)、平滑肌細(xì)胞(平滑肌肌動蛋白)、具有成纖維細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞或神經(jīng)元(卩-微管蛋白III或NCAM陽性細(xì)胞))的比例也較低(5%、1%或0.2%以下)。如果是衍生自已確立的pP^細(xì)胞系,本發(fā)明細(xì)胞群和分離細(xì)胞具有與其源細(xì)胞系相同的基因組。這表示,不論是否染色異常,如果胰島細(xì)胞是由未分化細(xì)胞系通過正常有絲分裂獲得的,即可推定pPS細(xì)胞與胰島細(xì)胞之間的染色體DNA具有90%以上相同性。重組引入了某轉(zhuǎn)基因或敲除了某內(nèi)源基因的胰島細(xì)胞仍被認(rèn)為具有與其源細(xì)胞系相同的基因組,因為所有未操作基因元素全被保留。動物模型實驗胰島細(xì)胞臨床應(yīng)用尤其關(guān)注的是細(xì)胞群重建宿主動物胰島系統(tǒng)的能力。重建可用各種常用動物模型來檢驗。非肥胖糖尿病(NOD)小鼠模型帶有遺傳缺陷,導(dǎo)致數(shù)周齡時發(fā)生胰島炎(Yoshida等,Rev.Imm翻genet.2:140,2000)。20-30周時,已有60-90%雌性小鼠患上明顯的糖尿病。這種免疫相關(guān)性病理學(xué)與人I型糖尿病類似。其它I型糖尿病模型是轉(zhuǎn)基因小鼠和帶有敲除突變的小鼠(Wong等,Immunol.Rev.169:93,1999)。最近,Lenzen等報道了一種自發(fā)性I型糖尿病的大鼠模型(Diabetologia44:1189,2001)。也可通過一次腹膜內(nèi)注射鏈脲霉素(Soria等,Diabetes49:157,2000)或連續(xù)低劑量鏈脲霉素(Ito等,Environ.Toxicol.Phamacol.9:71,2001)在小鼠模型中誘導(dǎo)高血糖癥。為了測定移植胰島細(xì)胞的效果,可檢測小鼠葡萄糖水平是否恢復(fù)正常(低于200mg/ml)。更大的動物是跟蹤慢性高血糖癥后遺癥的良好模型。可通過胰切除(J.Endocrinol.158:49,2001)或半乳糖喂養(yǎng)(Kador等,Arch.Opthalmol.113:352,1995)使狗產(chǎn)生胰島素依賴。還有一種建立在荷蘭巻尾獅毛狗中的I型糖尿病遺傳模型(Am.J.Pathol.105:194,1981)。用狗進(jìn)行的早期工作(Banting等,Can.Med.Assoc.J.22:141,1922)導(dǎo)致數(shù)名加拿本人于1925年2月遠(yuǎn)涉重洋來到斯得哥爾摩。作為說明,可在以下動物中用pPS衍生的胰島細(xì)胞進(jìn)行前期試驗a)非糖尿病裸(T細(xì)胞缺乏)小鼠;b)鏈脲霉素致糖尿病的裸小鼠和c)部分胰切除后處于胰島再生過程中的裸小鼠。移植細(xì)胞量相當(dāng)于約1000-2000正常人胰島,移植在腎囊下、肝內(nèi)或胰內(nèi)。對于非糖尿病小鼠,實驗最后可評價移植物的存活(組織學(xué)檢查)和通過生物化學(xué)分析、RIA、ELISA和免疫組織化學(xué)檢測胰島素產(chǎn)生。鏈脲霉素處理過和部分胰切除的動物可評價其存活、代謝控制(血糖)和體重。未分化細(xì)胞的基因修飾本發(fā)明胰島前體細(xì)胞具有強(qiáng)大的增殖能力。如果需要,可通過提高細(xì)胞內(nèi)端粒末端轉(zhuǎn)移酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)水平,或提高內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄,或引入轉(zhuǎn)基因來進(jìn)一步增強(qiáng)這種復(fù)制能力。尤其適合的是人端粒末端轉(zhuǎn)移酶(hTERT)的催化性組分,參見W098/14592。關(guān)于人細(xì)胞內(nèi)的端粒末端轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)染和表達(dá)參見Bodna等,科學(xué)279:249,1998和Jiang等,Nat.Genet.21:111,1999??筛鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)方法,評價遺傳改造細(xì)胞的hTERT,表達(dá)(RT-PCR),端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性(TRAP試驗),.hTERT的免疫細(xì)胞化學(xué)染色或復(fù)制能力。還可以考慮采用令細(xì)胞無限增殖化的其它方法,例如用編碼myc、SV40大T抗原或MOT-2的DNA轉(zhuǎn)如果需要,可進(jìn)一步體外去除本發(fā)明細(xì)胞群中未分化細(xì)胞,或確保不發(fā)生體內(nèi)回復(fù)突變。從細(xì)胞群中清除未分化干細(xì)胞的方法之一是用以下載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞,所述載體帶有引起效應(yīng)基因在未分化細(xì)胞內(nèi)優(yōu)先表達(dá)的啟動子,例如TERT啟動子或OCT-4啟動子。所述效應(yīng)基因可以是用于細(xì)胞分選的報道基因,例如綠熒光蛋白。效應(yīng)物可以直接裂,軍細(xì)胞,編碼例如某毒素或介導(dǎo)凋亡,例如caspase(Shinoura等,CancerGeneTher.7:739,2000)。效應(yīng)基因的作用可以是使細(xì)胞易受某外來試劑例如抗體或前藥的毒性作用。實例之一是單純性皰疹病毒胸苷激酶(A)基因,其表達(dá)會使該細(xì)胞易受更昔洛韋攻擊(USSN60/253,443)?;蛘?,效應(yīng)物可引起某種外源決定基的細(xì)胞表面表達(dá),該決定基使得任何回復(fù)未分化表型的細(xì)胞易受體內(nèi)天然抗體的攻擊(USSN60/253,357)。胰島細(xì)胞在研究和臨床治療中的用途本發(fā)明提高了一種生產(chǎn)大量胰島前體細(xì)胞和成熟胰島細(xì)胞的方法。這些細(xì)胞群可用于多種重要的研究、開發(fā)和商業(yè)目的。本發(fā)明的細(xì)胞可用來制備cDNA文庫,該文庫將不含在其它細(xì)胞系細(xì)胞中優(yōu)先表達(dá)的雜cDNA。本發(fā)明的已分化細(xì)胞還可用于通過標(biāo)準(zhǔn)方法制備具有胰島前體或其衍生物的特異性單克隆或多克隆抗體。尤其值得關(guān)注的是本發(fā)明組合物用于藥物開發(fā)和臨床治療。藥物篩選本發(fā)明胰島細(xì)胞可用來篩選影響胰島前體細(xì)胞或其各種后代特征的因子(伊j如溶劑、小分子藥物、肽、聚核苷酸)或環(huán)境條件。重要實例之一是用胰島細(xì)胞簇或(3細(xì)胞均一制備物檢驗小分子藥物上調(diào)或下調(diào)胰島素合成或分泌的能力。將細(xì)胞與待測化合物混合,然后通過例如RT-PCR或?qū)ε囵B(yǎng)基的免疫試驗來監(jiān)測表達(dá)或分泌速度變化。本發(fā)明的其它篩選方法涉及檢驗藥物化合物對胰島細(xì)胞生長、發(fā)育的影響或其毒性。這種篩選不僅是設(shè)計對胰島細(xì)胞具有藥理作用的化合物所必需的,而且是檢測藥物化合物胰島相關(guān)性副作用所必需的。第三個例子中,(未分化或己分化的)pPS細(xì)胞被用于篩選促進(jìn)胰島細(xì)胞成熟、促進(jìn)長期培養(yǎng)中胰島細(xì)胞增殖和維持的因子。例如,將候選分化因子或成熟因子加給測試板不同格中的細(xì)胞,然后檢測引起的表型變化,看是否符合進(jìn)一步培養(yǎng)及使用這些細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)。這樣可獲得改良的衍生和培養(yǎng)方法,這些方法不僅適用于pPS衍生的胰島細(xì)胞,而且適用于分離自胰腺的胰島細(xì)胞及它們的祖細(xì)胞本文讀者可參考標(biāo)準(zhǔn)教科書"藥物研究的標(biāo)準(zhǔn)體外方法",AcademicPress,1997和美國專利5,030,015。評價候選候選藥物化合物的活性通常需將本發(fā)明的已分化細(xì)胞與候選化合物或該化合物與前體藥物的組合物混合。研究者檢測化合物引起的細(xì)胞的形態(tài)變化、標(biāo)記表型或功能活性(與非處理細(xì)胞或接受惰性化合物處理的細(xì)胞比較),然后將化合物作用與觀察到的變化相關(guān)聯(lián)。毒性首先可根據(jù)對細(xì)胞活度、存活率、形態(tài)以及某種標(biāo)記或受體的表達(dá)來測定。藥物作用于染色體DNA的效果可通過測定DNA合成或修復(fù)來測定。[2H]-胸苷或BrdU摻入,尤其是細(xì)胞周期意外時刻的摻入,或者高于細(xì)胞復(fù)制所需水平的摻入,都是藥物效果的表征。副作用還可能包括根據(jù)分裂中期延長測知的姐妹染色單體交換速度異常。更多細(xì)節(jié)可參考A.Vickers(pp.375-410)"藥物研究的標(biāo)準(zhǔn)體外方法"AcademicPress,1997,375-410。胰島功能的恢復(fù)本發(fā)明還提供了胰島前體細(xì)胞或其衍生細(xì)胞用于患者恢復(fù)其胰島功能的用途。任何與胰內(nèi)分泌激素(胰島素、胰高血糖素或抑生長素)產(chǎn)生不足或分泌失調(diào)相關(guān)的病癥都可考慮用本發(fā)明細(xì)胞進(jìn)行治療。尤其值得關(guān)注的是I型(胰島素依賴型)糖尿病的治療。挑選確認(rèn)長期依賴外源胰島素并且危險不大的患者接受治療。患者接受約10,000胰島當(dāng)量細(xì)胞/kg體重。為了克服同種異型錯配,患者于手術(shù)前先接受抗排斥藥物例如FK506和雷帕霉素(口服)和daclizumab(靜脈注射)。門靜脈導(dǎo)管輸注胰島細(xì)胞。然后給患者做腹部超聲波檢査和驗血來檢測肝功能。記錄每日胰島素需要量,如果需要可對患者進(jìn)行再次移植。隨訪監(jiān)測包括定期驗血測定藥物水平,免疫功能,總體健康狀況和是否仍然依賴胰島素。護(hù)理糖尿病人的通用方法可參見標(biāo)準(zhǔn)教科書,例如"內(nèi)服藥課本"第3版,W.N.Kelley編,Lippincott-Raven,1997;專業(yè)參考書籍,例如"糖尿病基本和臨床教程"第2版,D.Leroith,LippincottWilliams&Wilkins2000;"糖尿病(臨床內(nèi)分泌導(dǎo)讀Vol.2)"C.R.Kahn等,BlackwellScience1999;和"I型糖尿病的醫(yī)治"第3版,McGrawHill1998。用胰島細(xì)胞治療I型糖尿病的詳細(xì)論述可參見"胰內(nèi)的細(xì)胞間相互關(guān)系胰島移植所涉問題",L.Rosenberg等,Chapman&Hall,1999;和"胎兒胰島移植",C.M.Peterson等,Kl畫r1995。通常,患者的挑選、給藥方式和內(nèi)分泌胰細(xì)胞的劑量最終都由主治醫(yī)師負(fù)責(zé)為了商業(yè)銷售,本發(fā)明胰島細(xì)胞一般以藥物組合物的形式提供,其中包含等滲賦形劑。組合物需在滿足人用的足夠嚴(yán)格的無菌條件下制備。本發(fā)明還包括生產(chǎn)、分發(fā)或使用過程中任何時候的成組細(xì)胞。這些細(xì)胞組包含兩種或更多種本文所述細(xì)胞群的組合,例如但不限于已分化pPS細(xì)胞衍生的細(xì)胞(胰島細(xì)胞及其前體、亞型等)與未分化pPS細(xì)胞或其它已分化細(xì)胞類型,有時它們具有相同的基因組。組內(nèi)的各細(xì)胞類型可以包裝在一起,或分裝在同一裝置的不同容器內(nèi),或放置在不同的位置,但都由同一實體或存在商務(wù)關(guān)系的不同實體掌控。關(guān)于細(xì)胞組合物的藥用配制可參見"細(xì)胞治療干細(xì)胞移植,基因治療和細(xì)胞免疫治療"G.Morstyn&W.Sheridan,CambridgeUniversityPress,1996。可將組合物裝在合適的容器內(nèi),配以寫明適宜用途例如治療糖尿病的說明書。裝置本發(fā)明細(xì)胞還可以用作用來生產(chǎn)一種或多種胰島細(xì)胞內(nèi)分泌多肽的裝置的功能性組件。最簡單的是,所述裝置包含pPS衍生的胰島細(xì)胞,將其置于一層半透膜之后,該半透膜可阻止細(xì)胞群透過從而將其保留在裝置中,但允許細(xì)胞群所分泌的胰島素、胰高血糖素或抑生長素透過。這包括微膠囊化的胰島細(xì)胞,它們通常呈細(xì)胞簇的形式從而通過允許細(xì)胞間相互作用來抑制去分化。例如,美國專利4,391,909記載了一種胰島細(xì)胞微膠囊,由大于3000mol.wt.的多糖交聯(lián)聚合物構(gòu)成的球狀半透膜包裹,該半透膜允許胰島素大小的蛋白質(zhì)透過但不允許大于lOO,OOOmol.wt.的分子透過。美國專利6,023,009記載了包裹在瓊脂糖和瓊脂膠構(gòu)成的半透膜中的胰島細(xì)胞。這種微膠囊被制成適合輸入糖尿病人體內(nèi)的形式,且被認(rèn)為有利于減少組織相容性問題或細(xì)菌感染。還可將本發(fā)明胰島細(xì)胞用于更精細(xì)的裝置,以用于植入體內(nèi)或用于體外治療。美國專利4,378,016記載了一種人造內(nèi)分泌腺,包括一個體外部分,一個皮下部分和一個可替換包膜,包膜內(nèi)包含了產(chǎn)激素的細(xì)胞。美國專利5,674,289記載了一種人造胰腺,具有一個胰島腔,腔內(nèi)由一張半透膜隔成一個或多個管狀腔并與周圍組織連通??捎玫难b置通常包括一個容納胰島細(xì)胞的腔室和一個由半透膜與胰島細(xì)胞隔開的腔室,該腔室收集胰島細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì),并且還可能允許信號例如循環(huán)葡萄糖水平向胰島細(xì)胞反饋。實施例實施例l:胚胎干細(xì)胞的無飼養(yǎng)細(xì)胞增殖將已建立的未分化人胚胎千細(xì)胞(hES)細(xì)胞系維持在基本無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)條件下。事先用按照標(biāo)準(zhǔn)方法分離(WO01/51616)的原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mEF)制備條件培養(yǎng)基。將hES培養(yǎng)物移植到涂有Matrigd⑧的平板上。接種后1周左右,培養(yǎng)物鋪滿平板并可以傳代。培養(yǎng)物在這種條件下可維持180天以上,仍然呈現(xiàn)ES樣形態(tài)。根據(jù)免疫組織化學(xué)檢測,hES菌落表達(dá)SSEA-4、Tra-1-160、Tra-l-81和堿性磷酸酶,但位于菌落之間的已分化細(xì)胞則不表達(dá)這些標(biāo)記。對這些細(xì)胞進(jìn)行制造特定細(xì)胞類型的標(biāo)準(zhǔn)操作,從而確認(rèn)它們的多能性。實施例2:hES細(xì)胞向肝細(xì)胞的衍生在亞鋪滿培養(yǎng)物中加入DMSO引發(fā)全面分化,由此令未分化hES細(xì)胞分化為具有人肝細(xì)胞特征的細(xì)胞。然后,加入正丁酸鈉,誘導(dǎo)細(xì)胞形成肝細(xì)胞樣細(xì)胞簡而言之,分離后,將hES細(xì)胞在非分化培養(yǎng)條件下維持2-3天。此時,細(xì)胞鋪滿率約50-60%,將培養(yǎng)基換成含l%DMSO的非條件SR培養(yǎng)基(步驟11)。連續(xù)4天每天給培養(yǎng)物添加SR培養(yǎng)基,然后換成含"/。DMSO+2.5。/。正丁酸鈉的非條件SR培養(yǎng)基,連續(xù)6天每天添加(步驟m)。然后,將細(xì)胞接種到膠原蛋白平板上,培養(yǎng)在含親肝細(xì)胞生長因子混合物的肝細(xì)胞成熟培養(yǎng)基中(步驟IV)。該過程可概括如表3所示。表3:肝細(xì)胞分化方案<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>圖1顯示獲得了肝細(xì)胞樣細(xì)胞。左欄IO倍放大;右欄40倍放大。加入正丁酸鹽4天時,培養(yǎng)物中80%以上細(xì)胞直徑較大,含有大細(xì)胞核和粒狀細(xì)胞質(zhì)(A行)。SR培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天后,細(xì)胞改在HCM中培養(yǎng)。2天后,許多細(xì)胞形成多核并呈較大的多角形(B行)。HCM中培養(yǎng)4天后,多核多角細(xì)胞成為主體,且胞質(zhì)溶膠顏色變深(C行),據(jù)此標(biāo)準(zhǔn),它們類似于新鮮分離的成人肝細(xì)胞(D行)或胎兒肝細(xì)胞(E行)。實施例3:由肝細(xì)胞路徑中的早期細(xì)胞獲得胰島素分泌細(xì)胞對以上肝細(xì)胞分化方案進(jìn)行調(diào)整,從而由H9細(xì)胞系中的hES細(xì)胞衍生胰島素分泌細(xì)胞。簡而言之,步驟I,在最后一次傳代后,在7-8天內(nèi),用實施例l所述采用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的SR條件培養(yǎng)基將hES細(xì)胞培養(yǎng)至鋪滿。步驟II,換用含1%DMS0的非條件SE培養(yǎng)基并加入10(iM環(huán)杷明,培養(yǎng)4天。步驟III,在加有B27,0.5mM正丁酸鹽(肝細(xì)胞方案的五分之一),lO(iM環(huán)杷明,4nM活化素A和lOmM煙酰胺的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)11天。然后,收獲細(xì)胞,固定,對胰島素表達(dá)進(jìn)行染色(用1:500稀釋的Sigma小鼠多克隆抗胰島素抗體),并用DAPI反染色以檢測細(xì)胞核。步驟IV,用補(bǔ)充了B27并可能含有胰島分化因子的RPMI培養(yǎng)基培養(yǎng)11天以令細(xì)胞成熟。圖2顯示步驟IV中用4nM活化素A、4nMp-動物纖維素、1OnMIGF-1和1OmM煙酰胺培養(yǎng)細(xì)胞的結(jié)果。上圖中的圓圈代表DAPI染藍(lán)的細(xì)胞核。集中在視野中間的迷散性染色是紅色熒光,代表合成并固定在細(xì)胞內(nèi)的胰島素。據(jù)估計,測試格中約1%細(xì)胞表達(dá)胰島素。同一載玻片上的其它細(xì)胞簇以及同種異型對照中都沒有看到胰島素染色。實施例4:通過優(yōu)化消化道內(nèi)胚層的形成來進(jìn)入胰島細(xì)胞路徑本實施例說明如何模擬子宮內(nèi)的正常發(fā)育分步驟誘導(dǎo)pPS細(xì)胞分化為胰島。用標(biāo)準(zhǔn)無飼養(yǎng)細(xì)胞條件將hES細(xì)胞的H7和H9細(xì)胞系培養(yǎng)至鋪滿,作為起始材料。為了引發(fā)分化,將培養(yǎng)基換成補(bǔ)充了B27(Iiwitrogen)和以下成分之一的RPMI1640:無其它添加(培養(yǎng)基對照)4nM活化素A(R&Dsystem)0.5mM正丁酸鈉(Sigma)活化素A+正丁酸鈉每日更換培養(yǎng)基(第一天除外),共8天。結(jié)束時,去除培養(yǎng)基,用PBS洗滌細(xì)胞,加入400nlRTL裂解緩沖液(Qiagen)制備細(xì)胞裂解液。用Qiagen的"RNAeasy迷你試劑盒"按照其說明制備RNA。用DNAse處理RNA,用Invitrogen的"擴(kuò)增前cDNA第一鏈試劑盒"按照其說明制備隨機(jī)引發(fā)的cDNA第一鏈。用Soxl7、HNFl-a和HNF3-p的相應(yīng)異物-探針組對每份cDNA樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)實時RT-PCR(Taqman)。為了將表達(dá)水平歸一化,用cycophilin的探針和引物(AppliedBiosystems)進(jìn)行平行的Taqman試驗。用deltadeltaCt法(AppliedBiosystems)計算每份樣品與胰標(biāo)準(zhǔn)品相比的相對豐度。圖3顯示各消化道內(nèi)胚層標(biāo)記的表達(dá)水平。所有結(jié)果相對人胎兒胰內(nèi)的表達(dá)水平進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化。同時還顯示了未分化hES細(xì)胞(起始細(xì)胞系)內(nèi)的表達(dá)水平以供比較?;罨谹+正丁酸鈉誘導(dǎo)這三種標(biāo)記最有效。Soxl7在未分化H9細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)(2.3相對表達(dá)),但用以上兩種添加劑誘導(dǎo)時可達(dá)32相對表達(dá)(提高100倍以上)。H7細(xì)胞內(nèi),誘導(dǎo)效果更顯著,從胎兒胰的0.007倍提高到79倍(提高10,000倍以上)。HNF3-(3的表達(dá)由0.5以下相對表達(dá)提高至5.1或6.3(提高IO倍以上)。HNF4-a表達(dá)由0.1以下相對表達(dá)提高至1.0以上(提高IO倍以上)。這三種標(biāo)記的強(qiáng)烈誘導(dǎo)證明這些hES衍生的細(xì)胞具有消化道內(nèi)胚層的關(guān)鍵特征。然后對這些細(xì)胞進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng),并用誘導(dǎo)胰形成的因子誘導(dǎo),并監(jiān)測關(guān)鍵性胰標(biāo)記Pdxl的誘導(dǎo)。實施例5:在長期聚集體培養(yǎng)物中加入添加劑來獲取胰島細(xì)胞將hES細(xì)胞的H7細(xì)胞系培養(yǎng)在實施例1所述mEF培養(yǎng)基中保持未分化形式。然后,在含有l(wèi):lmEF條件培養(yǎng)基和l:lDFB+的混合培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)(形成胚狀體)。DFB+即補(bǔ)充了B27(lx)、胰島素(25嗎/ml)、前列腺素(6.3ng/ml)、腐胺(10嗎/ml)、砷(砷酸鹽,100ng/ml)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(50(ig/ml)和甲狀腺素受體的配體T3(40ng/ml)的DMEM/F12培養(yǎng)基。次日,加入lOpM全反式(all-trans)維甲酸。第3天,將培養(yǎng)基換成含l(HiM全反式維甲酸的DFB+,然后隔日添加,持續(xù)7天(l期)。為了啟動2期,去除維甲酸換以含Noggin(200ng/ml)、EGF(20ng/ml)和bEGF(2ng/ml)的培養(yǎng)基。隔日添加培養(yǎng)基,培養(yǎng)14天。3期,去除Noggin、EGF禾QbFGF,將細(xì)胞培養(yǎng)在含煙酰胺(10mM)的DFB+培養(yǎng)基中。隔日更換培養(yǎng)基,持續(xù)5天。然后,將細(xì)胞鋪在有涂層的分格載玻片上,放置1天,固定并用抗胰島素c肽抗體或抗抑生長素抗體染色。C肽是前胰島素的組分之一,分泌前被切除。該肽可用于區(qū)分細(xì)胞合成的胰島素與存在于培養(yǎng)基中的胰島素。圖4顯示了結(jié)果。上圖和中圖分別以低放大率和高放大率顯示胰島素c肽染色結(jié)果,該染色表征成熟胰卩細(xì)胞。下圖顯示抑生長素染色,這是胰島5細(xì)胞的標(biāo)記。Taqman實時RT-PCR在mRNA水平確認(rèn)這些細(xì)胞表達(dá)胰島素和胰高血糖素實施例6:用神經(jīng)生成素3基因表達(dá)驅(qū)動胰島路徑的末期本實施例表明某胰島相關(guān)基因過表達(dá)能夠重新啟用分化III期胰島細(xì)胞系特有的基因表達(dá)模式。構(gòu)建含有受組成型啟動子調(diào)控的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因神經(jīng)生成素3(Ngn3)的腺病毒載體。AdNgn3是一種復(fù)制缺陷型、El-和E3-缺失的重組腺病毒5載體,用AdMAX載體構(gòu)建試劑盒(MicrobixBiosystems,Toronto)構(gòu)建。將Ngn3cDNA645bp(GenBank登錄號NMJ)20999)克隆到pDC515穿梭載體的mCMV(鼠巨細(xì)胞病毒極早期基因)啟動子的下游。將緊接在ATG啟動子上游的天然序列TAGAAAGG換成共有Kozak序列GCCACC。將含有Ngn3插入片段的穿梭質(zhì)粒和Ad基因組質(zhì)粒(AdMAX質(zhì)粒)共轉(zhuǎn)染到表達(dá)El的293細(xì)胞內(nèi),以期發(fā)生同源重組。分離噬菌斑,擴(kuò)增293細(xì)胞制備病毒原液,然后用CsCI密度梯度離心純化。測定A28。處的光密度以確定病毒顆粒濃度,用標(biāo)準(zhǔn)空斑試驗測定感染效價。將人ES細(xì)胞的H7細(xì)胞懸浮培養(yǎng)在實施例5所述混合培養(yǎng)基中。第二天加入全反式維甲酸(10)LiM)。7天后,在Matrigel⑧上將EB平板培養(yǎng)在加有EGF(20ng/ml)和bFGF(2ng/ml)的DFB+培養(yǎng)基中。5天后,用50MOI的AdNgn3載體感染細(xì)胞。用AdGFP(含綠熒光蛋白的相同載體,不會直接分化)作為陰性對照。細(xì)胞在6格培養(yǎng)板上于lml加有EGF(20ng/ml)的DFB+培養(yǎng)基中培養(yǎng),加入50Mol的AdNgn3或AdGFI1病寧,培養(yǎng)4小時,然后每格添加2ml該培養(yǎng)基。此后隔日補(bǔ)充培養(yǎng)基。感染后第2天或第8天收獲細(xì)胞,如實施例4所述用實時RT-PCR分離mRNA進(jìn)行分析。將細(xì)胞鋪在帶格載玻片上以進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,先用4%低聚甲醛固定,封閉,然后先用抗胰高血糖素抗體(1:1000)接著用FITC偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG(1:5OO)染色。圖5顯示神經(jīng)生成素3轉(zhuǎn)導(dǎo)后9天轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的免疫組織化學(xué)染色。平板上的胚狀體顯示明顯的抗體可測水平的胰高血糖素表達(dá)。圖6(A)和(B)顯示與陰性對照(陰影柱)相比,神經(jīng)生成素3轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞(實心柱)的mRNA表達(dá)水平。實時RT-PCR數(shù)據(jù)相對人胎兒胰內(nèi)的表達(dá)水平進(jìn)行了歸一化結(jié)果發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞內(nèi),數(shù)個位于神經(jīng)生成素3下游的基因與對照相比被特異性地上調(diào)。NeuroDl和Nkx2.2在第2天顯著上調(diào);Nkx6.1在第8天上調(diào)。胰島素和胰高血糖素表達(dá)也在第8天顯著上調(diào),表明基因轉(zhuǎn)染顯著促進(jìn)了細(xì)胞的成熟,由此產(chǎn)生了具有重要臨床意義的末期產(chǎn)物即胰島細(xì)胞。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是,可對本發(fā)明進(jìn)行常規(guī)優(yōu)化,這并不背離本發(fā)明的主旨,也不超越本發(fā)明的范圍。如果允許多項從屬權(quán)利要求,則本發(fā)明的實施應(yīng)包括以下內(nèi)容-1.一種分離的細(xì)胞群,由分化靈長動物多能干細(xì)胞獲得,其中至少5%細(xì)胞分泌一種或多種以下內(nèi)源基因編碼的蛋白質(zhì)胰島素,胰高血糖素,抑生長素或胰多肽。2.—種分離的細(xì)胞簇,由分化靈長動物多能千細(xì)胞獲得,包含分泌胰島素的細(xì)胞,分泌胰高血糖素的細(xì)胞和分泌抑生長素的細(xì)胞。3.如前述權(quán)利要求中任一項所述的細(xì)胞群,其中至少5%細(xì)胞表達(dá)至少兩種以下標(biāo)記Pdxl,Ngn3,胰島素,IAPP禾卩Nkx6.1。4.如前述權(quán)利要求中任一項所述的細(xì)胞群,未分化靈長動物多能干細(xì)胞少于1%。5.如前述權(quán)利要求中任一項所述的細(xì)胞群,當(dāng)其被移植到高血糖癥NOD小鼠內(nèi)時可使空腹葡萄糖水平降至200mg/L以下。6.如前述權(quán)利要求中任一項所述的細(xì)胞群,其經(jīng)遺傳改造而以高于正常的水平表達(dá)端粒末端轉(zhuǎn)移酶逆轉(zhuǎn)錄酶。7.如前述權(quán)利要求中任一項所述的細(xì)胞群,與已建立的靈長動物胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞系具有相同的基因組。8.兩細(xì)胞細(xì)胞群,包含前述權(quán)利要求中任一項所述的已分化細(xì)胞群和作為其來源的未分化靈長動物多能于細(xì)胞。9.一種獲得多肽分泌細(xì)胞的方法,包括在胰島細(xì)胞分化因子混合物中培養(yǎng)靈長動物多能干細(xì)胞或其后代,由此獲得一細(xì)胞群,其中至少5%細(xì)胞分泌一種或多種以下內(nèi)源基因編碼的蛋白質(zhì)胰島素,胰高血糖素,抑生長素和胰多肽。10.如權(quán)利要求9所述的方法,所述靈長動物多能干細(xì)胞分化成胚狀體或具有肝細(xì)胞或消化道內(nèi)皮特征的細(xì)胞。11.如權(quán)利要求9或10所述的方法,所述胰島細(xì)胞分化因子混合物包含至少一種以下物質(zhì)活化素A,煙酰胺,環(huán)杷明,(3動物纖維素和IGF-1。12.如權(quán)利要求9或10所述的方法,所述胰島細(xì)胞分化因子混合物包含TGF-(3拮抗劑和一種或多種促分裂素。13.如權(quán)利要求9至12中任一項所述的方法,還包括改變細(xì)胞的基因使其表達(dá)胰轉(zhuǎn)錄因子,例如神經(jīng)生成素3。14.如權(quán)利要求1-8中任二項所述的已分化細(xì)胞群,由權(quán)利要求9-13中任一項所述的方法制得。15.—種生產(chǎn)胰島素、胰高血糖素或抑生長素的方法,包括a)培養(yǎng)權(quán)利要求1-8中任一項所述的已分化細(xì)胞群或按照權(quán)利要求9-13中任一項所述方法制得的已分化細(xì)胞群,和b)收獲培養(yǎng)細(xì)胞所分泌的胰島素、胰高血糖素或抑生長素。16.—種生產(chǎn)胰島素、胰高血糖素或抑生長素的裝置,包含a)權(quán)利要求1-8中任一項所述的已分化細(xì)胞群或按照權(quán)利要求9-13中任一項所述方法制得的已分化細(xì)胞群,和b)阻止所述細(xì)胞群通過但允許其分泌的胰島素、胰高血糖素或抑生長素通過的半透膜。17.—種藥物組合物,包含權(quán)利要求1-8中任一項所述的已分化細(xì)胞群或按照權(quán)利要求9-13中任一項所述方法制得的已分化細(xì)胞群。18.—種篩選能夠調(diào)節(jié)胰島細(xì)胞功能的化合物的方法,包括將化合物與如權(quán)利要求1-8中任一項所述或按照權(quán)利要求9-13任一項所述方法制得的已分化細(xì)胞群接觸,測定接觸化合物引起的表型或代謝改變,將這些改變與化合物調(diào)節(jié)胰島素、胰高血糖素或抑生長素的能力相關(guān)聯(lián)。19.一種恢復(fù)個體胰島細(xì)胞功能的方法,包括給予如權(quán)利要求l-8中任一項所述或按照權(quán)利要求9-13任一項所述方法制得的已分化細(xì)胞群。20.—種治療I型糖尿病的方法,包括給予如權(quán)利要求1-8中任一項所述或按照權(quán)利要求9-13任一項所述方法制得的已分化細(xì)胞群。21.如權(quán)利要求1-8中任了項所述或按照權(quán)利要求9-13任一項所述方法制得的已分化細(xì)胞群在制備治療胰島素、胰高血糖素或抑生長素缺乏相關(guān)性疾病的藥物中的用途。22.如權(quán)利要求18所述多用途,所述疾病是I型糖尿病。23.前述權(quán)利要求中任一項所述的細(xì)胞群、裝置、方法或用途,所述靈長動物多能細(xì)胞是由人胚泡獲得的細(xì)胞的后代。24.前述權(quán)利要求中任一項所述的細(xì)胞群、裝置、方法或用途,所述靈長動物多能細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。權(quán)利要求1.由人多能干細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)胚層細(xì)胞的方法,包括將人多能干細(xì)胞培養(yǎng)在含活化素A的培養(yǎng)基中以產(chǎn)生內(nèi)胚層細(xì)胞,所述內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)標(biāo)記Sox17、HNF3β和HNF4α。2.如權(quán)利要求l所述的方法,所述培養(yǎng)基還含有丁酸鈉。3.如權(quán)利要求l所述的方法,所述人多能干細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。4.如權(quán)利要求l所述的方法,所述人多能干細(xì)胞在用活化素A進(jìn)行培養(yǎng)之前在無飼養(yǎng)細(xì)胞條件下培養(yǎng)至鋪滿。全文摘要本發(fā)明提供由胚胎干細(xì)胞生產(chǎn)胰島細(xì)胞的系統(tǒng)。用促進(jìn)胰島前體細(xì)胞和成熟胰島素分泌細(xì)胞產(chǎn)生的藥物將分化引向并定向于內(nèi)胚層細(xì)胞。由此可產(chǎn)業(yè)規(guī)模地生產(chǎn)大量胰島細(xì)胞以用于研究、藥物篩選或再生藥物。文檔編號A61K35/12GK101240262SQ20071030735公開日2008年8月13日申請日期2002年12月6日優(yōu)先權(quán)日2001年12月7日發(fā)明者G·J·菲斯克,M·S·伊庫瑪申請人:杰龍公司