專利名稱：：褐藻多糖硫酸酯在制備治療老年性癡呆藥物中的應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及預防和治療老年性癡呆藥物，具體地說是褐藻多糖硫酸酯在制備預防和治療老年性癡呆藥物方面的用途。技術背景褐藻多糖硫酸酯是一類硫酸化多糖，存在于褐藻中，首先由Kylin在1913年用稀酸從掌狀海帶中提取出來。Kylin將提取物水解后分離出L-巖藻糖，他將這種多糖命名為fucoidin，現(xiàn)根據(jù)多糖的命名原則一般定名為fucoidan，中文名稱為墨角藻多糖、巖藻多糖、巖藻聚糖、巖藻聚糖硫酸酯、褐藻糖膠或褐藻多糖硫酸酯?，F(xiàn)在人們對褐藻多糖硫酸酯的組成有較為清晰的了解，它是一類化學組成和結構非常復雜的多糖，以巖藻糖和硫酸基為主，隨著藻的種類不同還含有半乳糖、木糖、糖醛酸等其他成分。海帶褐藻多糖硫酸酯由巖藻糖、半乳糖、木糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖等單糖組成。以巖藻糖和半乳糖為主，巖藻糖與半乳糖大概在3:1。褐藻多糖硫酸酯化學結構非常復雜，不同褐藻中分離到的褐藻多糖硫酸酯其結構有很大差異。到目前為止，對來源于墨角藻(Fucusvesiculosus)和泡葉藻(Ascophyllumnodosum)的褐藻多糖硫酸酯的結構研究最多，墨角藻褐藻多糖硫酸酯主要以a(1—3)糖苷鍵連接，硫酸化主要發(fā)生在C4位。對泡葉藻褐藻多糖硫酸酯的多項研究都表明其中存在大量的a(1—3)和a(1—4)糖苷鍵。此外還有幾種褐藻褐藻多糖硫酸酯的結構被報道。昆布(Eckloniakurome)褐藻多糖硫酸酯主要為a(l一3)連接，硫酸化在C4位。來源于枝管藻(Cladosiphonokamuranus)和繩藻(Chordafilum)的褐藻多糖硫酸酯主鏈均為a(1—3)的巖藻糖，硫酸化在C4位，而且，二者均有少量的2—0—乙?；?。關于海帶褐藻多糖硫酸酯的結構，多數(shù)的研究資料表明海帶褐藻多糖硫酸酯主要是以a-(1—3)連接的L-巖藻糖組成，硫酸化發(fā)生在C4或C2位，而且部分研究顯示存在部分(1—2)連接的L-巖藻糖作為側鏈。當然分子中還存在半乳糖、木糖、鼠李糖等單糖，半乳糖可能參與了主鏈的組成，而木糖、鼠李糖等是以側鏈的形式存在。褐藻多糖硫酸酯已被發(fā)現(xiàn)具有多種生物學活性，目前已經(jīng)公開報道的活性包括褐藻多糖硫酸酯具有抗凝血、提高免疫力、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、抗補體活化、抗輻射、抑制腹水瘤等活性，CN1547478A則公開了其在治療粘連、關節(jié)炎和牛皮癬中的用途。但尚未有文獻表明褐藻多糖硫酸酯在預防和治療老年性癡呆方面的用途。隨著人類平均壽命的逐年增加，世界正歩入全球老齡化時代。與年齡有關的神經(jīng)退化性疾病也隨之增加，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)方面，主要表現(xiàn)為興奮與抑制過程減弱，大腦功能降低，記憶力減退和喪失，隨后出現(xiàn)識別功能的進行性減退和情緒紊亂的加重等。老年性癡呆已成為心腦血管疾病和腫瘤之后的第四位疾病。目前，全世界65歲以上人群中老年性癡呆患病率約為5%。而老年性癡呆因其復雜的發(fā)病機理，近期在防治上不可能取得突破性進展，故西方有專家預言，老年性癡呆將是21世紀人類第一殺手。老年性癡呆對患者、家庭和社會都帶來巨大的壓力，使得全世界對其給予眾多的關注，老年性癡呆治療藥物研究成為老年醫(yī)學領域中的一個重要課題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供褐藻多糖硫酸酯在制備具有神經(jīng)保護作用、預防和治療老年性癡呆方面的用途。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為褐藻多糖硫酸酯可在制備預防和治療老年性癡呆藥物中的應用。本發(fā)明所述的褐藻多糖硫酸酯可以來源于人工養(yǎng)殖的海帶，也可以是其它褐藻包括馬尾藻、裙帶菜、羊棲菜、鼠尾藻、海黍子、昆布、泡葉藻或墨角藻等。優(yōu)選來源于海帶。本發(fā)明中的褐藻多糖硫酸酯還包括將褐藻多糖硫酸酯通過降解制備的低分子量硫酸多糖和寡糖類物質(zhì)。分子量范圍為2KD1000KD，優(yōu)選是3KD50KD，最佳為5KD30KD。另一方面，本發(fā)明提供了含褐藻多糖硫酸酯的藥物組合物。所述組合物中包含治療有效量的褐藻多糖硫酸酯和至少一種藥學上可接受的輔料，如淀粉、氯化鈉、微晶纖維素、山梨酸和/或甘露醇等。該組合物的給藥方式可以是但不限于經(jīng)靜脈注射、口服、肌肉、皮下、皮膚表面、局部注射等方式給藥，其劑型可以但不限于是注射液、凍干粉針劑、注射微球、脂質(zhì)體、片劑、膠囊劑、水劑、散劑、糊劑、噴霧劑、顆粒劑、軟膠囊、滴丸劑、凝膠劑、貼片、膏劑等，其中優(yōu)選注射液、凍干粉針劑、片劑和膠囊劑。本領域技術人員根據(jù)現(xiàn)有技術以及制劑領域的公知常識可以方便地制備出所需劑型。本發(fā)明具有以下優(yōu)點1.安全性高，可長期限服用。在目前階段，老年性癡呆通常是不可逆的神經(jīng)退行性疾病，病因復雜。為了保持患者病情不繼續(xù)惡化，病人用藥周期較長。褐藻多糖硫酸酯作為來源于食用海藻的一種天然海洋多糖產(chǎn)物，其高安全性可以保證病人長期用藥的需要。經(jīng)急性毒性試驗證明褐藻多糖硫酸酯安全性非常高，毒副作用小。2.使用效果好。褐藻多糖硫酸酯優(yōu)選來源于食用海藻海帶，其它食用褐藻如裙帶菜、羊棲菜、鼠尾藻、馬尾藻等也是褐藻多糖硫酸酯的制備原料?？梢杂糜诶夏晷园V呆的治療。圖1為褐藻多糖硫酸酯對SY5Y細胞Ap25-35損傷的保護作用；*,p<0.01。F:褐藻多糖硫酸酯；Fl:低分子褐藻多糖硫酸酯圖2為褐藻多糖硫酸酯對小鼠避暗試驗的影響圖2A.對錯誤次數(shù)的影響，圖2B.對潛伏期的影響；*,p<0.05。圖3為褐藻多糖硫酸酯對小鼠水迷宮試驗的影響圖3八.對小鼠進入盲端的錯誤次數(shù)的影響，圖3B.對小鼠找到平臺潛伏期的影響；*,p<0.05。圖4為褐藻多糖硫酸酯對小鼠海馬內(nèi)乙酰膽堿轉移酶(ChAT)活性的影響；*,p<0.05。圖5為褐藻多糖硫酸酯對小鼠海馬內(nèi)乙酰膽堿酯酶(AChE)活性的影響；*,p<0.05。具體實施方式以下通過具體實施方式對本發(fā)明進行進一步說明。這里想要指出的是，下面的具體實施方式僅用來說明本發(fā)明，本領域技術人員在理解本發(fā)明精神的前提下，可以根據(jù)本
技術領域：
的現(xiàn)有技術和公知知識對本發(fā)明進行相應變換，這些技術方案均落入本發(fā)明的范圍之內(nèi)。實施例l褐藻多糖硫酸酯的制備將海藻粉碎后添加20倍蒸餾水沸水提取2-3小時，提取液以硅藻土助濾過濾，濾液先以自來水流水透析一天，然后以蒸餾水透析一天，將透析液濃縮，加乙醇至體積濃度為75%沉淀，沉淀干燥得粗褐藻多糖硫酸酯。將粗品重溶于水，在0.05mol/LMgCl2存在下體積濃度20%乙醇沉淀除去水溶性褐藻膠，濾液透析、濃縮后體積濃度75%乙醇沉淀，干燥后即得到純化的褐藻多糖硫酸酯。按照上述方法制備四種海藻褐藻多糖硫酸酯，其化學組分分析如下表所示表1不同褐藻中褐藻多糖硫酸酯的化學組分分析<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>實施例2低分子量褐藻多糖硫酸酯Fl的制備取提取的海帶褐藻多糖硫酸酯50g配成1.5%的水溶液，在該溶液中加入30mM抗壞血酸和30mM過氧化氫，常溫反應2小時。將該反應液用截留分子量為3600Da的透析袋在自來水中透析2天，在蒸餾水中透析2天，之后真空濃縮。凍干該濃縮物得到30g分子量為7kD的低分子量褐藻多糖硫酸酯樣品F1。實施例3褐藻多糖硫酸酯注射劑的制備取褐藻多糖硫酸酯100g，加入注射用水1000ml,甘露醇100g，調(diào)PH值至7.0，分裝，冷凍干燥。實施例4褐藻多糖硫酸酯片劑的制備取褐藻多糖硫酸酯50g，加入微晶纖維素，聚乙烯吡咯烷酮，混合，加入適量水，制軟材，制粒，干燥。粒子加入交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、硬脂酸鎂，混合，壓片，每片含褐藻多糖硫酸酯100mg。實施例5褐藻多糖硫酸酯對神經(jīng)母細胞瘤株SH—SY5Y的保護作用本發(fā)明以細胞存活率為指標，研究了褐藻多糖硫酸酯對神經(jīng)母細胞瘤株SH—SY5Y細胞的P-淀粉樣肽((3-amyloidpeptide,A(3)損傷模型的保護作用。材料SY5Y細胞株由瑞典卡羅琳斯卡研究所BengtWinblad教授和裴進京博士贈送。A(325-35片斷由首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院北京腦老化實驗室合成，高效液相色譜法純化，純度98%以上，無血清MEM配成溶液，0.22|im慮膜抽濾，一2(TC保存。海帶褐藻多糖硫酸酯提取物為F(由實施例1從海帶中制備)，海帶褐藻多糖硫酸酯經(jīng)實施例2降解制得分子量為7KD的Fl樣品。試驗方法細胞培養(yǎng)條件為MEM(GibcoBRL，41500-067)培養(yǎng)基中加入10Q%胎牛血清(Hyclone，SH30070.03)、15mmol丄"HEPES(DNNcompany)、青霉素lxl05RLL"、鏈霉素lxl051111/1，5%CC>2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，370C，每周換液兩次，傳代一次。MTT代謝率測定將SY5Y細胞以密度為1x10個細胞接種于96孔板(Costar產(chǎn)品)，3天后分為對照組、A(325—35組和Ap25—35+F組(10、20昭/ml)、Ap25—35+Fl(10、20ng/ml)藥物組，每組8孔。接種后24小時每孔加MTT(5mg/ml)20^d，37。C孵育4小時，吸出培養(yǎng)液，每孔加入DMSO20(Vl，振搖10分鐘，用酶標儀(DiagnosticPasteurLP400)測定550nm處光密度值(OD)。結果如圖1所示，樣品F禾nFl在10嗎/ml和20嗎/ml時能顯著對抗2(HiMAI325-35毒性，提高培養(yǎng)細胞MTT代謝率。結果表明褐藻多糖硫酸酯及低分子量褐藻多糖硫酸酯能夠保護神經(jīng)細胞SY5Y對抗A卩25-35毒性，具有顯著的神經(jīng)保護作用。神經(jīng)細胞凋亡在神經(jīng)細胞損傷中起十分重要的作用，藥物可通過干預凋亡過程阻止其進一步發(fā)展，對神經(jīng)細胞起到保護作用。SH-SY5Y細胞來源于人的神經(jīng)母細胞瘤，其形態(tài)和生理功能與正常神經(jīng)元相似，呈錐形，且具有明顯的軸突，是目前國際上研究神經(jīng)細胞功能較好的一種細胞。褐藻多糖硫酸酯對SY5Y細胞具有神經(jīng)保護作用，表明褐藻多糖硫酸酯可以用于老年性癡呆的治療。實施例6褐藻多糖硫酸酯的抗老年性癡呆作用本發(fā)明采用AP'-4()損傷的癡呆動物模型，以行為學和腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶和乙酰膽堿轉移酶為指標，對褐藻多糖硫酸酯的抗老年性癡呆(AD)活性進行了深入研究。實驗動物KM小鼠。在試驗前，使平均體重約為26g的雄性KM小鼠自由獲取飼料和水一周以適應實驗室環(huán)境。材料海帶褐藻多糖硫酸酯F(由實施例l制備)。A(3卜4o購自Sigma公司，將其溶于無菌生理鹽水，配成1mg/ml濃度，密封后置于37t:培養(yǎng)箱中7天使之凝聚。試驗方法小鼠適應一周后，將其稱重并隨機分為5組，即對照組、模型組、褐藻多糖硫酸酯低、中、高(75、150、300mg/kg)三個劑量組，陽性對照藥鹽酸多納哌齊(2.5mg/kg)組。除對照組外，向小鼠單側腦室內(nèi)注射A(3卜4。。參照Maurice方法，以水合氯醛麻醉后，右側腦室定位(A:一2mm;L:2mm;H:—4mm)，垂直顱骨進針3mm，緩慢注射3pl/只的A卩卜4。，對照組為等量的滅菌生理鹽水。動物于術后第二天開始給予相應藥物，給藥量0.5ml/20g，對照組、模型組灌服等量生理鹽水，每日1次，連續(xù)至實驗結束。(1)小鼠避暗試驗自Ap卜4o造模后第9天進行避暗試驗。避暗裝置分為明(25x25x16cm)暗(24x20xl5cm)兩個隔室，之間由一個拱門(8.9xll.4cm)相聯(lián)，門可以由試驗者根據(jù)需要關上或打開。隔室地板為不銹鋼柵欄(3.175mm)。暗室一側的柵欄地板與剌激器相聯(lián)，并可給予電擊，明室一側則不與刺激器相聯(lián)，故沒有電流通過。將小鼠放入明室，10s后將明暗室之間的門打開。待小鼠(四肢)完全進入暗室后，立即將中門關上，并給予一次電擊(電流為0.6mA)。讓小鼠在暗室內(nèi)停留10s，將小鼠放回籠內(nèi)。電刺激訓練24小時后，將小鼠放回明室，中門打開，記錄5min內(nèi)小鼠進入暗室的次數(shù)和潛伏期。(2)小鼠迷宮實驗自A(3卜4o造模后第12天進行水迷宮試驗，為期五天。水迷宮裝置共有5個盲端，試驗第一天用一塊黑色塑料板將迷宮分成兩部分，使小鼠在只含有一個盲端的部分游泳；試驗第二天，重新設置塑料板的位置，使小鼠在含有三個盲端的部分游泳；試驗第三天至第五天除掉塑料板，使小鼠游完全程。分別記錄其找到平臺的潛伏期和到達盲端的錯誤次數(shù)。(3)皮層乙酰膽堿酯酶(AchE)禾卩乙酰膽堿轉移酶(ChAT)活性測定行為學測試結束之后，小鼠斷頭取腦，于冰浴中迅速剝離海馬組織，以預冷的生理鹽水制成10%組織勻漿。按照試劑盒說明書操作，測定該組織的乙酰膽堿酯酶和乙酰膽堿轉移酶活性。結果1)小鼠避暗試驗由圖2可以看出，AP模型組與對照組和褐藻多糖硫酸酯的三個劑量組相比小鼠潛伏期顯著縮短，錯誤次數(shù)明顯增多(p<0.05)。2)小鼠迷宮試驗由圖3可以看出，模型組和對照組相比，小鼠找到平臺的潛伏期及經(jīng)過盲端的錯誤次數(shù)明顯延長(p<0.05)Af3卜4o單側腦室注射致小鼠癡呆模型建立成功。隨著訓練時間的延長，小鼠潛伏期和錯誤次數(shù)逐漸縮短。從第三天開始，A(3卜4。單側腦室注射模型組與對照組和褐藻多糖硫酸酯的三個劑量組相比，小鼠錯誤次數(shù)明顯增多，其中褐藻多糖硫酸酯高劑量組小鼠潛伏期與模型組相比顯著縮短。訓練第四天，對照組和褐藻多糖硫酸酯的中、高劑量組與模型組相比潛伏期顯著縮短，而陽性對照藥鹽酸多納哌齊未顯效，表明褐藻多糖硫酸酯顯效快。訓練第五天，褐藻多糖硫酸酯的三個劑量組和鹽酸多納哌齊組同模型組相比，小鼠的潛伏期明顯縮短和錯誤次數(shù)明顯減少。3)海馬乙酰膽堿酯酶和乙酰膽堿轉移酶活性乙酰膽堿酯酶和乙酰膽堿轉移酶分別是乙酰膽堿的分解酶和合成酶，兩者共同調(diào)節(jié)腦內(nèi)乙酰膽堿的含量。如圖4所示，在海馬組織中，褐藻多糖硫酸酯的三個劑量組與AP卜幼單側腦室注射模型組相比乙酰膽堿轉移酶活性顯著升高。如圖5所示對照組、鹽酸多納哌齊組和褐藻多糖硫酸酯三個劑量組與模型組相比，乙酰膽堿酯酶活性顯著降低，而且值得說明的是前兩組乙酰膽堿酯酶活性比對照組低約50%，說明中濃度的褐藻多糖硫酸酯和鹽酸多納哌齊都能夠顯著抑制海馬內(nèi)乙酰膽堿的分解，從而提高海馬內(nèi)乙酰膽堿的含量。這可能是褐藻多糖硫酸酯改善A(3卜4。單側腦室注射造成AD癥狀的途徑之一。結論褐藻多糖硫酸酯能夠AP卜4。損傷的小鼠的行為學指標，改善小鼠的記憶力，降低錯誤次數(shù)。提高乙酰膽堿轉移酶活性，降低乙酰膽堿酯酶活性。具有顯著的抗老年性癡呆作用。以上描述了本發(fā)明的具體實施例，然并非用以限定本發(fā)明，本領域技術人員對在此公開的實施方案可進行并不偏離本發(fā)明范疇和精神的改進和變化。權利要求1.褐藻多糖硫酸酯在制備預防和治療老年性癡呆藥物中的應用。2.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于所述褐藻多糖硫酸酯來源于海帶、馬尾藻、裙帶菜、羊棲菜、鼠尾藻、海黍子、昆布、泡葉藻或墨角藻的一種或幾種。3.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于所述褐藻多糖硫酸酯的分子量為2kD—1000kD。4.根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于所述褐藻多糖硫酸酯的分子量為3KD50KD。5.根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于所述褐藻多糖硫酸酯的分子量為5KD30KD。6.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于所述藥物為含有褐藻多糖硫酸酯和藥學可接受的載體的藥物組合物。7.根據(jù)權利要求6所述的應用，其特征在于所述藥物的劑型為注射劑、口服制劑或局部給藥制劑。全文摘要本發(fā)明提供褐藻多糖硫酸酯在預防和治療老年性癡呆藥物中的用途。本發(fā)明中的褐藻多糖硫酸酯可以是從海帶、墨角藻、泡葉藻、昆布或繩藻等褐藻中提取得到的天然多糖提取物，也可以是經(jīng)任何方法將褐藻多糖硫酸酯通過降解而制得的低分子量硫酸多糖或寡糖類物質(zhì)。其安全性高，可長期限服用。文檔編號A61K31/737GK101152208SQ20071015394公開日2008年4月2日申請日期2007年9月14日優(yōu)先權日2006年9月27日發(fā)明者張全斌,徐祖洪,李智恩,趙婷婷申請人:中國科學院海洋研究所