專利名稱：三七皂甙成分治療敗血癥的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥產(chǎn)品的新用途，特別涉及三七皂苷成分Rbl、 Rgl和Rl在治療和/或預(yù)防敗血癥的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
-三七(Panax notoginseng， PN)是風(fēng)干后的中國傳統(tǒng)中藥三七(Burk) F. H. Chen 的根。三七皂甙(也稱為三七總皂苷，英文名Panax Notoginsenosides， PNS) 是三七的主要有效成份，由30余種不同的皂甙組成，臨床上廣泛用于治療微循 環(huán)障礙相關(guān)性疾病，如心血管疾病和肝功能障礙。三七總皂甙己經(jīng)列入國家藥典，有相應(yīng)制劑產(chǎn)品上市，如注射用血塞通。 人參皂甙Rbl，簡稱Rbl [英文名稱]Ginsenoside Rbl [化學(xué)名稱] P -D-Glucopyranoside,(3 P ， 12 P ) -20-[ (6_0- P -D-glucopyranosy卜P -D-glucopyra畫yl) oxy]-12-h ydroxyda誦ar-24-3n-3yl 2-0 P -D-glucopyranosy1- [ 分 子 式 ] C54H92023 [分子量]1109.26人參皂甙Rgl，簡稱Rgl，[英文名稱]Ginsenoside Rgl [別名]panaxoside A, Sanchinoside Cl[化學(xué)名稱]e -D-Gluc叩yranoside, (3 P ， 6 a ， 12 P )-3, 12-dihydroxydammar-24-ene-6， 20-diylbis-[分子式]C42H72014o2H20。 三七皂苷R1，簡稱R1，[英文名稱]Notoginsenoside Rl 這三種皂甙是被廣泛運(yùn)用于中藥的具有活血化淤作用的三七的主要活性成份。 敗血癥是致病菌或條件致病菌侵入血循環(huán)中生長繁殖，產(chǎn)生毒素和其他代謝產(chǎn)物 所引起的急性全身性感染，臨床上以寒戰(zhàn)、高熱、皮疹、關(guān)節(jié)痛及肝脾腫大為特 征，部分可有感染性休克和遷徙性病灶。引起敗血癥的原因有一、人體因素① 當(dāng)皮膚粘膜有破損或發(fā)生化膿性炎癥時，細(xì)菌則容易侵入體內(nèi)。② 人體的免疫反應(yīng)可分為非特異性免疫反應(yīng)及特異性免疫反應(yīng)兩種，后者又可分 為細(xì)胞免疫與體液免疫兩方面。當(dāng)機(jī)體免疫功能下降時，不能充分發(fā)揮其吞噬殺滅細(xì)菌的作用，即使入侵的細(xì)菌量較少，致病力不強(qiáng)也能引起敗血癥。③條件致病菌所引起的醫(yī)源性感染也逐漸增多。二、細(xì)菌因素主要與病原菌的毒力和數(shù)量有關(guān)。毒力強(qiáng)或數(shù)量多的致病菌進(jìn)入機(jī)體，引起敗血癥的可能性較大。敗血癥的主要癥狀是1. 原發(fā)炎癥各種病原菌所引起的原發(fā)炎癥與其在人體的分布部位有關(guān)。 原發(fā)炎癥的特點(diǎn)是局部的紅、腫、熱、痛和功能障礙。2. 毒血癥癥狀起病多急驟。常有寒戰(zhàn)、高熱、發(fā)熱多為弛張熱及或間歇 熱，亦可呈稽留熱、不規(guī)則熱及雙峰熱，后者多系革蘭陰性桿菌敗血癥所致。發(fā) 熱同時伴有不同程度的毒血癥癥狀，如頭痛、惡心、嘔吐、腹脹、腹痛、周身不 適、肌肉及關(guān)節(jié)疼痛等。3. 皮疹見于部分患者，以瘀點(diǎn)最為多見，多分布于軀干、四肢、眼結(jié)膜、 口腔粘膜等處，為數(shù)不多。4. 關(guān)節(jié)癥狀可出現(xiàn)大關(guān)節(jié)紅、腫、熱、痛和活動受限，甚至并發(fā)關(guān)節(jié)腔 積液、積膿，多見于革蘭陽性球菌、腦膜炎球菌、產(chǎn)堿桿菌等敗血癥的病程中。5. 感染性休克約見于1/5 1/3敗血癥患者，表現(xiàn)為煩燥不安，脈搏細(xì)速， 四肢厥冷，皮膚花斑，尿量減少及血壓下降等，且可發(fā)生DIC，系嚴(yán)重毒血癥所 致。6. 肝脾腫大 一般僅輕度腫大。根據(jù)研究，脂多糖(LPS)是革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞壁的組成成分之一，造成了革 蘭氏陽性細(xì)菌導(dǎo)致的人敗血癥和感染性休克的多種表現(xiàn)。敗血癥時發(fā)生的微循環(huán)障是由PS的過度釋放造成的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，由許多激活的因子所介導(dǎo)，這些 因子如粘附分子，活性氧成份(R0S)，以及炎癥前體介質(zhì)如腫瘤壞死因子一 a(TNF-a)、白介素一6(IL-6)以及干擾素一 Y (INF-Y ) 。 LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的微循 環(huán)障礙對敗血癥時發(fā)生的器官功能障礙起著關(guān)鍵作用，在這個過程中白細(xì)胞沿著 內(nèi)皮旋轉(zhuǎn)并粘附于血管內(nèi)皮，血管壁產(chǎn)生過氧化氫和肥大細(xì)胞脫顆粒都是文獻(xiàn)報 道的關(guān)鍵步驟。當(dāng)前敗血癥的主要臨床治療方法包括容量復(fù)蘇，兒茶酚胺的運(yùn)用和抗生素補(bǔ)償治療。這些方法可以增加敗血癥病人的存活率，但是在臨床上會導(dǎo)致血糖升高 以及血壓和血鈣的下降，并發(fā)生出血。臨床研究建議采用抗TNF-a治療對敗血 癥的治療有所幫助。然而，最近的研究表明這種方法不能治愈敗血癥且會增加嚴(yán) 重敗血癥病人的死亡率。因而，在LPS導(dǎo)致的敗血癥中尋找防止出現(xiàn)嚴(yán)重微循 環(huán)障的方法仍然是個挑戰(zhàn)。本發(fā)明人在對三七皂甙進(jìn)行研究過程中，發(fā)現(xiàn)三七中的三種皂甙Rbl、 Rgl 和Rl能夠減弱注射LPS引起的紅細(xì)胞的運(yùn)動速度降低，Rbl、 Rgl和Rl能夠減 少貼壁細(xì)胞的數(shù)目，抑制肥大細(xì)胞脫顆粒以及抑制細(xì)胞因子水平的升高。體外試 驗(yàn)運(yùn)用流式細(xì)胞儀進(jìn)一步證實(shí)了 Rbl、 Rgl能夠顯著的抑制LPS導(dǎo)致的中性粒細(xì) 胞中CDllb/CD18表達(dá)的提高，而Rbl、 Rgl能夠抑制LPS刺激引起11202從中性 粒細(xì)胞的釋放。以上結(jié)果表明，三種皂甙Rbl、 Rgl和Rl能夠改善LPS誘導(dǎo)的微 循環(huán)障礙。對敗血癥有明顯的治療作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種三七皂甙成分新的治療用途。所述新的治療用途，是用三七皂甙 成分治療因微循環(huán)障礙引發(fā)的敗血癥。為此，本發(fā)明提供一種藥物新用途，即用三七皂甙成分制備一種治療和/或預(yù)防 敗血癥的藥物。本發(fā)明所述三七皂甙成分選自人參皂甙Rbl，人參皂甙Rgl以及三七皂苷R1。 本發(fā)明所述的三種皂甙成分人參皂甙Rbl，人參皂甙Rgl以及三七皂苷Rl是現(xiàn) 有技術(shù)，可以從市場上買到，也可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)制備，符合藥用標(biāo)準(zhǔn)即可。優(yōu) 選純度〉50%，更優(yōu)選純度>90%，最優(yōu)選純度〉98%。本發(fā)明所述制備的藥物，是用上述三七皂甙成分作為藥物活性成分制備成的藥物 制劑組合物。本發(fā)明的藥物制劑組合物，根據(jù)需要可以含有藥物可接受的載體，其中三七 皂甙作為藥物活性成分，其在制劑中所占重量百分比可以是O. 1-99.9%，其余為 藥物可接受的載體。本發(fā)明的藥物制劑組合物，以單位劑量形式存在，所述單位 劑量形式是指制劑的單位，如片劑的每片，膠囊的每粒膠囊，口服液的每瓶，顆 粒劑每袋，注射劑的每支等。本發(fā)明的藥物制劑組合物可以是任何可藥用的劑型，這些劑型包括片劑、5糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、 口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注 射劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜劑、噴霧劑、滴劑、貼劑。本發(fā)明的中藥制劑，其口服給藥的制劑可含有常用的賦形劑，諸如粘合劑、 填充劑、稀釋劑、壓片劑、潤滑劑、崩解劑、著色劑、調(diào)味劑和濕潤劑，必要時可對片劑進(jìn)行包衣。適用的填充劑包括纖維素、甘露糖醇、乳糖和其它類似的填充劑。適宜的崩 解劑包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羥基乙酸淀粉鈉。適宜的潤 滑劑包括，例如硬脂酸鎂。適宜的藥物可接受的濕潤劑包括十二烷基硫酸鈉?？赏ㄟ^混合，填充，壓片等常用的方法制備固體口服組合物。進(jìn)行反復(fù)混合 可使活性物質(zhì)分布在整個使用大量填充劑的那些組合物中?？诜后w制劑的形式例如可以是水性或油性懸浮液、溶液、乳劑、糖漿劑或 酏劑，或者可以是一種在使用前可用水或其它適宜的載體復(fù)配的干燥產(chǎn)品。這種 液體制劑可含有常規(guī)的添加劑，諸如懸浮劑，例如山梨醇、糖槳、甲基纖維素、 明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠或氫化食用脂肪，乳化劑， 例如卵磷脂、脫水山梨醇一油酸酯或阿拉伯膠；非水性載體(它們可以包括食用 油)，例如杏仁油、分餾椰子油、諸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐 劑，例如對羥基苯甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常 規(guī)的香味劑或著色劑。對于注射劑，制備的液體單位劑型含有本發(fā)明的活性物質(zhì)和無菌載體。根據(jù) 載體和濃度，可以將此化合物懸浮或者溶解。溶液的制備通常是通過將活性物質(zhì) 溶解在一種載體中，在將其裝入一種適宜的小瓶或安瓿前過濾消毒，然后密封。 輔料例如一種局部麻醉劑、防腐劑和緩沖劑也可以溶解在這種載體中。為了提高 其穩(wěn)定性，可在裝入小瓶以后將這種組合物冰凍，并在真空下將水除去。本發(fā)明的中藥制劑，在制備成藥劑時可選擇性的加入適合的藥物可接受的載 體，所述藥物可接受的載體選自甘露醇、山梨醇、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、 硫代硫酸鈉、鹽酸半胱氨酸、巰基乙酸、蛋氨酸、維生素C、 EDTA二鈉、EDTA 鈣鈉， 一價堿金屬的碳酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、 磷酸、氨基酸、氯化鈉、氯化鉀、乳酸鈉、木糖醇、麥芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纖維素及其衍生物、 藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土溫80、瓊脂、碳酸鈣、碳酸氫鈣、表面活性劑、聚乙二醇、環(huán)糊精、p —環(huán)糊精、磷脂類材料、高嶺土、滑石粉、 硬脂酸鈣、硬脂酸鎂等。本發(fā)明的制劑在使用時根據(jù)病人的情況確定用法用量，可每日服三次，每次1-20劑，如l-20袋或?；蚱?，每劑lrag-1000mg。 本發(fā)明所述的治療用途是通過以下實(shí)驗(yàn)證明的 材料和方法試娜試驗(yàn)動激Rbl和Rgl購自中國藥品生物制品檢定所，Rl購自昆明Feng-Shan-Jian藥物公司。所有的皂甙都運(yùn)用親和層析法純化。雄性spmgue-dawley(SD)大鼠，體重在200~250克之間，從北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部 動物中心獲得。該批動物的許可證號為SCXK 2002-0001。試驗(yàn)之前采用標(biāo)準(zhǔn)試 驗(yàn)室鼠飼料(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物中心)喂養(yǎng)72小時，維持體溫在24il。C， 相對濕度為50±1%，所有試驗(yàn)動物接受12/12-光亮/黑暗周期。試驗(yàn)前對動物 禁食不禁水12小時。遵照北京大學(xué)動物研究委員會的指南進(jìn)行動物處理。 腿扁徵餅運(yùn)用烏拉坦對試驗(yàn)大鼠進(jìn)行麻醉(1.25 mgAcg體重)，采用正中切口切開試驗(yàn) 大鼠腹腔(長20-30 mm)。進(jìn)行股靜脈和頸內(nèi)靜脈插管注射試驗(yàn)藥物。小心分離出腸系膜的回盲部(腸系膜尾部10-15 cm的區(qū)域)，把腸系膜從腹腔 內(nèi)取出并平鋪于透明塑料臺之上。通過表面持續(xù)灌注37'C生理鹽水保持腸系膜 的溫度和濕度。采用使用透照器的倒置顯微鏡(德國，Leica， DM-IRB)來觀察腸 系膜微循環(huán)的血液動力學(xué)情況。在顯微鏡上安裝電視照相機(jī)(日本，東芝 Jk-TU53H)并傳輸圖像到一個彩色顯示器(中國，TCL,J2118A),通過DVD機(jī)(中 國，Malata DVR-R25)記錄所有影像。本研究選擇無分枝的單支且無明顯彎曲的 小靜脈作為試驗(yàn)觀察的對象，小靜脈的直徑在3(Hmi到50 pm之間，長度在200 pm 左右。 給藥試驗(yàn)大鼠被隨機(jī)分為五組，每組6只。對于LPS組和對照組的大鼠，先對試驗(yàn)動物進(jìn)行10分鐘的預(yù)觀察，接著通過右頸靜脈進(jìn)行持續(xù)給藥，鹽水(l ml/hr，對 照組)，溶于鹽水的皂甙(Rbl，Rgl或者Rl) (5 mg/kg/hr,單純皂甙組)，以及溶 解于鹽水的LPS (2 mg/kg/hr, LPS組)，時間為60分鐘。對于三個試驗(yàn)組，每組 經(jīng)過右頸靜脈采用和LPS組相同的方法再分別增加注射皂甙Rbl (Rbl+LPS組)， Rgl (Rgl+LPS組)或者R1(R1+LPS組)。在注射LPS之前20分鐘開始注射皂甙， 持續(xù)注射皂武一直到觀察結(jié)束。三組中每組使用的皂甙都預(yù)先溶于鹽水然后以5 mg/kg/hr的劑量給藥。持續(xù)觀察和記錄每一組的大鼠腸系膜微循環(huán)的血流動力學(xué) 狀態(tài)。賄就顏定使用Image-Pro Plus 5.0 (Media Cybernetic, USA)軟件分別對LPS注射時(O 分鐘)，以及LPS注射之后20分鐘、40分鐘和60分鐘時記錄到的圖像進(jìn)行血 管直徑的測定。同一位置測定血管直徑三次然后取其平均值。 飾應(yīng)遂率,定把監(jiān)視器的CCD轉(zhuǎn)換為高速電視照相系統(tǒng)(FASTCAM-ultima APX, photron， 日本)以2000幀/s的速度記錄小靜脈內(nèi)紅細(xì)胞的速率，之后把儲存的高速影像以 25幀/s的速度從新播放。分別在LPS注射時(O分鐘)，以及LPS注射之后的20 分鐘、40分鐘和60分鐘時使用Image-Pro Plus 5.0軟件(Media Cybernetic, USA)測量小靜脈內(nèi)的紅細(xì)胞的速率。 ，率激定運(yùn)用公式SR-2.12x8x[V/D]估算小靜脈血管壁的剪切率，這里的D代表血管 平均直徑，V為紅細(xì)胞的平均速率，2.12為測量到的體內(nèi)微血管速度剖面圖的經(jīng) 驗(yàn)修正系數(shù)。 ，應(yīng)層腳定通過重播記錄到的圖像來回顧分析白細(xì)胞的動力學(xué)行為從而評價白細(xì)胞對 血管壁的粘附。在本研究中，把粘附白細(xì)胞定義為粘附于同側(cè)血管壁時間超過 10s的細(xì)胞。分別在LPS注射時(O分鐘)以及LPS注射之后的20分鐘、40分鐘 和60分鐘，通過隨機(jī)選取記錄到的圖像計數(shù)一定的血管片斷(直徑30~50 nm,長 度為200pm)內(nèi)貼壁細(xì)胞的數(shù)目。 S潘艇移趣定通過復(fù)習(xí)LPS注射時(O分鐘)以及LPS注射之后20分鐘、40分鐘和60分 鐘時記錄到的白細(xì)胞圖像來估計遷移的白細(xì)胞數(shù)目。遷移的白細(xì)胞被定義為一定 長度的小靜脈周圍的白細(xì)胞數(shù)目，通過隨機(jī)選擇記錄的圖像并選擇長度為200 Hm的血管來測定周圍組織(直徑30~50 nm)內(nèi)的白細(xì)胞數(shù)目(直徑30~50 pm)。 ,，層贗粒層定注射LPS之后60分鐘，用0.1%的甲苯胺藍(lán)灌注組織1分鐘，然后用鹽水漂 白。細(xì)胞內(nèi)顆粒釋放到周圍組織的細(xì)胞被認(rèn)為是脫顆粒的肥大細(xì)胞，計數(shù)20x物 鏡顯微鏡圓形視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)目來確定這類細(xì)胞的個數(shù)。選擇微血管系統(tǒng)周圍的 5個視野來評價每個腸系膜窗。記錄脫顆粒和非脫顆粒的肥大細(xì)胞數(shù)目，然后計 算脫顆粒肥大細(xì)胞的比例。觀察完腸系膜微循環(huán)之后，經(jīng)過腹主動脈途徑采集每個試驗(yàn)動物的血液標(biāo) 本進(jìn)行肝素抗凝(20 unit/ml血液)。然后通過離心分離血漿。在室溫之下50 pl血 漿及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與50 pi吸引珠共孵化1小時，然后與50 pi PE標(biāo)記的TNF-a和 IL-6檢測抗體混合，在室溫之下共孵化2小時形成三明治復(fù)合物。共孵化之后， 每管加入lml的清洗緩沖液(BD BiosciencesPharmingen,美國)，運(yùn)用流式細(xì)胞儀 (FACS Calibur, B.D.Co,美國)檢測平均熒光強(qiáng)度。采用BD Cytometric Bead Array 分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 O)層C扁表這游沐/層定對另外一組(r^6)SD大鼠進(jìn)行CDllb/CD18表達(dá)的體外測定。大鼠在試驗(yàn)之 前禁食不禁水12小時。采用烏拉坦對大鼠進(jìn)行麻醉(1.25 mg/每公斤體重，肌肉 注射)。從每個試驗(yàn)動物的腹主動脈取血，然后用肝素抗凝(20單位/每ml血液)， 然后按照下面的要求制備20份樣品對照，Rbl (0.2 mg/ml), Rgl (0.2 mg/ml), Rl (0.2 mg/ml)， Rbl (1.0 mg/ml)， Rgl (1.0 mg/ml)， Rl (1.0 mg/ml)， Rbl (2.0 mg/ml)， Rgl (2.0 mg/ml)， Rl (2.0 mg/ml), LPS, Rbl+LPS (0.2 mg/ml)， Rgl+LPS (0.2 mg/ml): R1+LPS (0.2 mg/ml), Rbl+LPS (1.0 mg/ml), Rgl+LPS (1.0 mg/ml), R1+LPS (1.0 mg/ml), Rbl+LPS (2.0 mg/ml), Rgl+LPS (2.0 mg/ml) and R1+LPS (2.0 mg/ml)。在 每一份制備的樣品當(dāng)中，加入0.2 ml的血液。對照組為8 pl的鹽水。單一皂甙 組由4 /il鹽水和4 Ml的三種皂甙中的一種構(gòu)成，最終濃度見以上圓括號之內(nèi)。LPS樣品由4 jul鹽水和4 /xl LPS構(gòu)成，最終使LPS的濃度達(dá)到2 /ig/ml。其他所 有樣品由4 pi LPS和4 /xl的三種皂甙中的某一種構(gòu)成，最終使LPS的濃度達(dá)到2 jug/ml，每個試驗(yàn)皂甙的最終濃度見以上圓括號內(nèi)(Sun et al., 2006)。混合樣品在 37 。C之下保存2小時，然后與lugFITC-標(biāo)記的抗CDllb抗體或者抗CD18抗體 (BD Biosciences Pharmingen,美國)在室溫之下共孵化20分鐘。采用溶血素溶解 細(xì)胞(BD Biosciences ImmunocytometerSystems，美國)，然后用PBS清洗兩次。使 用流式細(xì)胞儀(FACS Calibur, B.D.Co,美國)測定平均熒光強(qiáng)度。采用FSC-SSC散 點(diǎn)圖選擇中性粒細(xì)胞。每份樣品測定5千的中性粒細(xì)胞數(shù)目，然后計算平均的熒 光強(qiáng)度。沐種微謝應(yīng)雄艦02浙.02-產(chǎn)扁藩從腹主動脈取血然后采用肝素抗凝。按照Ting報導(dǎo)的方法使用mono-poly溶 解介質(zhì)分離中性粒細(xì)胞(Ting and Morris, 1971)。然后按照改進(jìn)的Shen方法(Shen et al.， 1998)，運(yùn)用RPMI 1640介質(zhì)制備細(xì)胞懸液然后用流式細(xì)胞儀(BD company, USA)測定細(xì)胞內(nèi)過氧化氫(H20》和超氧陰離子('02—)的產(chǎn)量。簡要過程為，中性 粒細(xì)胞在37 。C下和0.2 mM2',7'-二氯熒光素雙醋酸鹽(DCFH-DA)共孵化5分鐘， 再次和O.l mM的二氫溴化乙啶(HE)共孵化15分鐘。然后單獨(dú)用Rbl (1.0 mg/ml)， Rgl (1.0mg/ml)或R1 (1.0mg/ml)處理細(xì)胞，或者同時用LPS (2 ]Ug/ml)處理。在 和冰塊共孵化20分鐘之后，用流式細(xì)胞儀通過測定2',7'-二氯熒光素(DCF)發(fā)射的 525 nm熒光和溴化乙錠(EB)發(fā)射的590nm的熒光來測定H202和'02—的含量。 逾炎滅絲錄變艨游漱定在觀察完腸系膜的微循環(huán)之后，從每只試驗(yàn)動物的腹主動脈取血然后用肝素 抗凝(20 unit/每ml血液)。通過離心分離出血漿。運(yùn)用自動生化分析儀(7170A, Hitachi, Japan),采用堿性磷酸酶試劑盒(01ympus, US)檢測血漿中堿性磷酸酶的 濃度。采用方差分析和F—檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)值以平均值土S.E (N二6)表示。P 值小于0.05則認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)的顯著意義。 結(jié)果LPS注射之后于O時點(diǎn)以及其他時間點(diǎn)檢測到的腸系膜小靜脈的直徑之間沒有顯著的差異。各試驗(yàn)條件下腸系膜小靜脈紅細(xì)胞速率隨時間的變化，對照組小 靜脈中紅細(xì)胞速率在60分鐘的觀察期內(nèi)沒有發(fā)生變化。相反，LPS組大鼠腸系 膜小靜脈的紅細(xì)胞速率在LPS注射40分鐘之后進(jìn)行性降低，并且顯著的低于0 時點(diǎn)以及對照組(p0.05)。在注射之后60分鐘，測量到的紅細(xì)胞的速率為1.30± 0.11 mm/秒，是0點(diǎn)時間值的70%。 Rbl,Rgl或者Rl處理之后能夠從一定程度 之上改變大鼠LPS誘導(dǎo)的腸系膜小靜脈紅細(xì)胞速率的降低。大鼠腸系膜小靜脈紅細(xì)胞粘附隨時間進(jìn)程的情況是，在0時點(diǎn)，粘附于小靜 脈壁的白細(xì)胞數(shù)目在這些組間并沒有顯著的差異，在對照組的觀察期末，粘附的 白細(xì)胞數(shù)目僅有一個輕微的增長到了 1.72 ±0.71 cells/200]Lim。相反，LPS組的 值則表現(xiàn)出明顯的時間和數(shù)目的線性增長關(guān)系，從LPS注射之后20分鐘時的 5.00 ± 0.83 cells /200/rni增長到了 60分鐘時的一個高值達(dá)到了 12.72 ± 1.41 cells /200/xm，相比于O時點(diǎn)的值增長超過了 15倍。給予Rbl, Rgl或者Rl之后都導(dǎo) 致了 LPS誘導(dǎo)的白細(xì)胞對小靜脈壁粘附獲得了改善，雖然對于每一個皂甙而言 隨著時間的進(jìn)程有一些變異，Rl的抑制作用出現(xiàn)在LPS注射之后的20分鐘， Rbl的抑制作用出現(xiàn)在LPS注射之后的40分鐘，而Rgl的抑制作用出現(xiàn)在LPS 注射之后的60分鐘。白細(xì)胞隨著時間進(jìn)程遷移出腸系膜小靜脈壁的情況是，任何情況0時點(diǎn)都沒 有檢測到有明顯的遷移出血管壁的白細(xì)胞。對于對照組而言，差不多在整個觀査 的時間段都沒有觀察到遷移出血管壁的白細(xì)胞。相反，注射LPS之后遷移出靜 脈壁的白細(xì)胞的數(shù)目顯著增長，在60分鐘的時候達(dá)到了 3.20 ± 0.73 cells /200/mi， 和對照組相比增加了四倍。LPS誘導(dǎo)的遷移白細(xì)胞數(shù)目的增加在給予R1之后獲 得了顯著的改善，在60分鐘的時候達(dá)到了 1.20±0.37 cells/200//m。在注射LPS 之后60分鐘后觀察到的沿著腸系膜小靜脈脫顆粒的肥大細(xì)胞的百分比，對照組 的脫顆粒的肥大細(xì)胞的百分比為19.8 ± 8.1%,代表了自發(fā)性的肥大細(xì)胞脫顆粒。 注射LPS 60分鐘之后發(fā)生脫顆粒的肥大細(xì)胞的數(shù)目上升到了 49.4 ± 7.3%。給予 Rbl和Rl能夠顯著的抑制LPS誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒(在觀察期的終點(diǎn)分別達(dá) 到了 13.9 ±3.8%禾卩23.8 ±4.1%)。 Rgl也表現(xiàn)出了一定的抑制LPS誘導(dǎo)的肥大 細(xì)胞脫顆粒的作用(觀察終點(diǎn)達(dá)到了 30.1 ± 7.4%)。血漿細(xì)胞因子TNF-a和IL-6的濃度情況是，在對照組，TNF-a和IL-6的濃度分別是24.51 ±5.57禾B 22.72 ± 8.67 ng/L。測定的兩個細(xì)胞因子的在LPS刺激之后 迅速上升，分別達(dá)到了 493.97 ± 192.29和741.53 ± 126.86 ng/L。給予Rbl, Rgl和 Rl能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的IL-6的產(chǎn)生。CDllb和CD18都為陽性的細(xì)胞比例在所有試驗(yàn)條件下基本都是一致的。然 而，如果以熒光強(qiáng)度來代表這些粘附分子的表達(dá)，則有明顯的差異。LPS刺激 之后CDllb的熒光強(qiáng)度迅速的升高(相比較于對照增加了 247.9 ± 6.9， 1.8倍)， Rbl和Rl能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的CDllb表達(dá)的提高并且表現(xiàn)出劑量依賴的 狀態(tài)。使用R1甚至觀察到了更為明顯的效應(yīng)，中性粒細(xì)胞CD18的表達(dá)類似于 CDllb的表達(dá)。在LPS刺激之后，熒光強(qiáng)度迅速增長，LPS誘導(dǎo)的CD18表達(dá) 能夠顯著的被Rbl降低并呈現(xiàn)出劑量依賴的關(guān)系(176.8 ± 10.3, 1.0 mg/ml和 138.9 ± 12.7, 2.0 mg/ml)。運(yùn)用Rl預(yù)處理導(dǎo)致更為明顯的減少LPS誘導(dǎo)的CD18 表達(dá)的作用(119.6 ±7.9, 0.2 mg/ml)，雖然沒有像CDllb—樣表現(xiàn)出劑量依賴的 關(guān)系。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，注射LPS能夠降低紅細(xì)胞的運(yùn)動速度，但Rbl、 Rgl和Rl 能夠減弱LPS的這種效應(yīng)。注射LPS后能夠?qū)е掳准?xì)胞對管壁的粘附、肥大細(xì)胞 脫顆粒以及細(xì)胞因子的釋放。而Rbl、 Rgl和Rl能夠減少貼壁細(xì)胞的數(shù)目，抑制 肥大細(xì)胞脫顆粒以及抑制細(xì)胞因子水平的升高。這些結(jié)果為LPS誘導(dǎo)的敗血癥 的臨床治療提供了一個新的可供選擇的方法。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明的限制。實(shí)施例1片劑處方Rbl 100g 微晶纖維素50g 微粉硅膠3g 硬脂酸鎂1.5g制法取原、輔料分別過100目篩；取三七皂苷、微晶纖維素，混勻， 用60%乙醇適量作為粘合劑制軟材，過20目篩制顆粒，6(TC干燥，取出， 過30目篩整粒，加入微粉硅膠及硬脂酸鎂，混勻，壓片，制成1000片，即得。 實(shí)施例處方Rgl 75g 微晶纖維素37g 微粉硅膠2.3g 硬脂酸 鎂l.lg制法取原、輔料分別過100目篩；取三七皂苷、硫酸鈣、微晶纖維素， 混勻，用60%乙醇適量作為粘合劑制軟材，過20目篩制顆粒，60'C干燥， 取出，過30目篩整粒，加入適量微粉硅膠及硬脂酸鎂，混勻，壓片，制 成1000片，即得。 實(shí)施例處方Rl 133g 微晶纖維素66g 微粉硅膠4g 硬脂酸鎂2g制法取原、輔料分別過100目篩；取三七皂苷、硫酸鈣、微晶纖維素，混勻，用60%乙醇適量作為粘合劑制軟材，過20目篩制顆粒，6(TC干燥， 取出，過30目篩整粒，加入適量微粉硅膠及硬脂酸鎂，混勻，壓片，制 成1000片，即得。 實(shí)施例4 膠囊取Rbl，加入適量淀粉，硬脂酸鎂等輔料，制粒，整粒，裝入1號膠囊，即得。實(shí)施例5口服液取Rgl，加入適量蔗糖，防腐劑，加水到1000ml，分裝成10ml—支，即得口服 液。實(shí)施例6 顆粒劑取R1，加入適量糊精、甜菊素，干式制粒，整粒，分裝，即得。實(shí)施例7注射劑Rbl 150g加水溶解，另氯化鈉、對羥基苯甲酸乙酯加熱水溶解，混勻，調(diào) pH值。注射用水稀釋至1000ml，用中空纖維膜濾過，灌裝，滅菌，即得。 實(shí)施例8應(yīng)用實(shí)例，敗血癥的治療典型病例患者張XX，男性，55歲，職員，有頭痛、惡心、嘔吐、腹脹、腹痛、周身 不適、肌肉及關(guān)節(jié)疼痛等，經(jīng)診斷為敗血癥開始注射Rbl注射液，規(guī)格0.05g/支，每日三次每次2支。半月后自覺癥狀 有明顯好轉(zhuǎn)。用藥期間無任何不良反應(yīng)。
權(quán)利要求
1、三七皂甙成分在制備一種治療敗血癥的藥物中的應(yīng)用。
2、 權(quán)利要求l的應(yīng)用，其特征在于，所述三七皂甙成分為Rbl。
3、 權(quán)利要求l的應(yīng)用，其特征在于，所述三七皂甙成分為Rgl。
4、 權(quán)利要求l的應(yīng)用，其特征在于，所述三七皂甙成分為R1。
5、 權(quán)利要求l的應(yīng)用，其特征在于，所述敗血癥是致病菌或條件致病菌侵入血 循環(huán)中生長繁殖，產(chǎn)生毒素和其他代謝產(chǎn)物所引起的急性全身性感染。
6、 權(quán)利要求l的應(yīng)用，其特征在于，所述敗血癥引發(fā)微循環(huán)障礙，該微循環(huán)障 礙是由LPS的過度釋放造成的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)。
7、 權(quán)利要求l的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是Rbl、 Rgl和Rl減少貼壁細(xì)胞 的數(shù)百，減弱LPS引起的紅細(xì)胞的運(yùn)動速度降低。
8、 權(quán)利要求1的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是Rbl、 Rgl和Rl抑制肥大細(xì)胞 脫顆粒以及抑制細(xì)胞因子水平的升高。
9、 權(quán)利要求l的應(yīng)用，其特征在于，所述三七皂甙成分是含有三七皂甙成分的 藥物制劑組合物。
10、 權(quán)利要求9的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物制劑組合物，以Rbl、 Rgl或/ 和R1作為藥物活性成分，同時含有藥物可接受的載體，其中三七皂甙在制劑中 所占重量百分比是0. 1-99. 9%，其余為藥物可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及三七皂甙成分治療敗血癥的應(yīng)用，特別涉及三七皂苷的有效成分人參皂甙Rb1，人參皂甙Rg1以及三七皂苷R1在治療和/或預(yù)防敗血癥的應(yīng)用。
文檔編號A61P7/00GK101327236SQ200710111278
公開日2008年12月24日 申請日期2007年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月21日
發(fā)明者劉育英, 凱 孫, 王傳社, 俊 郭, 韓晶巖 申請人:天津天士力制藥股份有限公司