專利名稱：丹參提取物治療敗血癥的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及中藥產(chǎn)品的新用途，特別涉及丹參提取物在治療和/或預防敗血癥的應用。
背景技術：
-丹參為中國的傳統(tǒng)中藥，最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，并被列為上品.丹參以唇型科鼠尾屬多年化:草本植物乃參(Salviami Itior2rhizaBunge)的干燥根及根莖入藥. 別名赤參，紫丹參,血丹參.丹參主產(chǎn)于山西，四川，安徽,河北，江蘇，山東，浙江等 省.丹參味苦,微寒，入心，心包,肝經(jīng).具有活性化瘀,涼血消癰及養(yǎng)血安神的功效, 主治瘀血所致的各種疼痛，癥瘕積聚,瘡瘍痛腫以及心悸失眠等，為臨床之常用藥 物，尤以治療冠心病及缺血性腦血管病最為常用，且療效頗佳，多用于治療冠心病， 心絞痛，心肌梗塞，心動過速，腦血栓等，已被現(xiàn)代臨床實驗和藥理實驗研究所證 實活血化瘀等多方面的藥理活性,其主要成份是丹參酮(I， IIA, IIB),異丹參酮 (I ， II),隱丹參酮，羥基丹參酮IIA,異隱丹參酮，丹參新酮，左旋二氫丹參酮I ,乃-參酸甲酯，次甲丹參醌,丹參酚，乙，丙，e-谷甾醇，3,4 -二羥基苯甲醛,兒茶精,蕓香甙，原兒茶醛,原兒茶酸，乳酸,維生素E等. 丹參中的水溶性成分主要是二羥基苯基乳酸(DLA，見圖1A) H0\ yCH2CH(0H)C00H又名丹參素-D(+) e-(3，4_二羥基苯基)乳酸(1)是丹參水溶性各種成分的基 本結構成分，已被證明有抗氧化、抗纖維化等作用。 丹酚酸B (SAB，見圖1B)丹酚酸類化合物具有很強的抑制脂質過氧化、清除超氧陰離子和羥基自由基的作 用。其中丹酚酸A和B活性最強。丹酚酸B對腦缺血-再灌注損傷所致線粒體損 傷和神經(jīng)細胞凋亡有明顯抑制作用。可抗Caspase-3高表達PCI2細胞的凋亡， 還可抑制B淀粉樣蛋白(A e 1-40)纖維形成及A e 1-40所致PC12細胞線粒體損 傷和細胞凋亡。屬強抗氧化藥，且能消除細胞內鈣超載。敗血癥是致病菌或條件致病菌侵入血循環(huán)中生長繁殖，產(chǎn)生毒素和其他代謝產(chǎn)物 所引起的急性全身性感染，臨床上以寒戰(zhàn)、高熱、皮疹、關節(jié)痛及肝脾腫大為特 征，部分可有感染性休克和遷徙性病灶。引起敗血癥的原因有 --、人體因素① 當皮膚粘膜有破損或發(fā)生化膿性炎癥時，細菌則容易侵入體內。② 人體的免疫反應可分為非特異性免疫反應及特異性免疫反應兩種，后者又可分 為細胞免疫與體液免疫兩方面。當機體免疫功能下降時，不能充分發(fā)揮其吞噬殺 滅細菌的作用，即使入侵的細菌量較少，致病力不強也能引起敗血癥。③ 條件致病菌所引起的醫(yī)源性感染也逐漸增多。二、細菌因素主要與病原菌的毒力和數(shù)量有關。毒力強或數(shù)量多的致病菌進入機體，引起敗血 癥的可能性較大。敗血癥的主要癥狀是1. 原發(fā)炎癥各種病原菌所引起的原發(fā)炎癥與其在人體的分布部位有關。 原發(fā)炎癥的特點是局部的紅、腫、熱、痛和功能障礙。2. 毒血癥癥狀起病多急驟。常有寒戰(zhàn)、高熱、發(fā)熱多為弛張熱及或間歇 熱，亦可呈稽留熱、不規(guī)則熱及雙峰熱，后者多系革蘭陰性桿菌敗血癥所致。發(fā) 熱同時伴有不同程度的毒血癥癥狀，如頭痛、惡心、嘔吐、腹脹、腹痛、周身不 適、肌肉及關節(jié)疼痛等。3. 皮疹見于部分患者，以瘀點最為多見，多分布于軀干、四肢、眼結膜、 口腔粘膜等處，為數(shù)不多。4. 關節(jié)癥狀可出現(xiàn)大關節(jié)紅、腫、熱、痛和活動受限，甚至并發(fā)關節(jié)腔 積液、積膿，多見于革蘭陽性球菌、腦膜炎球菌、產(chǎn)堿桿菌等敗血癥的病程中。5. 感染性休克約見于l/5 l/3敗血癥患者，表現(xiàn)為煩燥不安，脈搏細速，四肢厥冷，皮膚花斑，尿量減少及血壓下降等，且可發(fā)生DIC，系嚴重毒血癥所致。6.肝脾腫大 一般僅輕度腫大。 根據(jù)研究，脂多糖(LPS)是革蘭氏陽性細菌細胞壁的組成成分之一，造成了革蘭氏陽性細菌導致的人敗血癥和感染性休克的多種表現(xiàn)。敗血癥時發(fā)生的微循環(huán)障是由LPS的過度釋放造成的系統(tǒng)性炎癥反應，由許多激活的因子所介導，這些 因子如粘附分子，活性氧成份(R0S)，以及炎癥前體介質如腫瘤壞死因子一 a(TNF-a)、白介素一6 (IL-6)以及干擾素一 Y (INF-Y ) 。 LPS誘導產(chǎn)生的微循 環(huán)障礙對敗血癥時發(fā)生的器官功能障礙起著關鍵作用，在這個過程中白細胞沿著 內皮旋轉并粘附于血管內皮，血管壁產(chǎn)生過氧化氫和肥大細胞脫顆粒都是文獻報 道的關鍵步驟。當前敗血癥的主要臨床治療方法包括容量復蘇，兒茶酚胺的運用和抗生素補 償治療。這些方法可以增加敗血癥病人的存活率，但是在臨床上會導致血糖升高 以及血壓和血鈣的下降，并發(fā)生出血。臨床研究建議采用抗TNF-a治療對敗血 癥的治療有所幫助。然而，最近的研究表明這種方法不能治愈敗血癥且會增加嚴 重敗血癥病人的死亡率。因而，在LPS導致的敗血癥中尋找防止出現(xiàn)嚴重微循 環(huán)障的方法仍然是個挑戰(zhàn)。本發(fā)明人在對丹參中的兩個重要提取物二羥基苯基乳酸和丹酚酸B進行的 研究過程中，發(fā)現(xiàn)二羥基苯基乳酸和丹酚酸B顯著改善脂多糖誘導的大鼠腸系 膜微循環(huán)障礙，并抑制脂多糖引起的CDllb和CD18表達和嗜中性粒細胞產(chǎn)生 '02 —和11202，對敗血癥有明顯的治療作用。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供一種丹參提取物的新的治療用途。所述新的治療用途，是用丹參提取 物治療因微循環(huán)障礙引發(fā)的敗血癥。為此，本發(fā)明提供一種藥物新用途，即用丹參提取物制備一種治療和/或預防敗 血癥的藥物。本發(fā)明所述丹參提取物選自兩個重要提取物二羥基苯基乳酸和丹酚酸B。 本發(fā)明所述的二羥基苯基乳酸和丹酚酸B是現(xiàn)有技術，可以從市場上買到，也 可以根據(jù)現(xiàn)有技術制備，符合藥用標準即可。優(yōu)選純度〉50%，更優(yōu)選純度〉90%，。本發(fā)明所述制備的藥物，是用上述丹參提取物作為藥物活性成分制備成的藥物制 劑組合物。本發(fā)明的藥物制劑組合物，根據(jù)需要可以含有藥物可接受的載體，其中丹參 提取物作為藥物活性成分，其在制劑中所占重量百分比可以是0.1-99.9%,其余 為藥物可接受的載體。本發(fā)明的藥物制劑組合物，以單位劑量形式存在，所述單 位劑量形式是指制劑的單位，如片劑的每片，膠囊的每粒膠囊，口服液的每瓶， 顆粒劑每袋，注射劑的每支等。本發(fā)明的藥物制劑組合物可以是任何可藥用的劑型，這些劑型包括片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、 口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注 射劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜劑、噴霧劑、滴劑、貼劑。本發(fā)明的中藥制劑，其口服給藥的制劑可含有常用的賦形劑，諸如粘合劑、 填充劑、稀釋劑、壓片劑、潤滑劑、崩解劑、著色劑、調味劑和濕潤劑，必要時 可對片劑進行包衣。適用的填充劑包括纖維素、甘露糖醇、乳糖和其它類似的填充劑。適宜的崩 解劑包括淀粉、聚乙烯吡咯垸酮和淀粉衍生物，例如羥基乙酸淀粉鈉。適宜的潤 滑劑包括，例如硬脂酸鎂。適宜的藥物可接受的濕潤劑包括十二垸基硫酸鈉。可通過混合，填充，壓片等常用的方法制備固體口服組合物。進行反復混合 可使活性物質分布在整個使用大量填充劑的那些組合物中。口服液體制劑的形式例如可以是水性或油性懸浮液、溶液、乳劑、糖漿劑或 酏劑，或者可以是一種在使用前可用水或其它適宜的載體復配的干燥產(chǎn)品。這種 液體制劑可含有常規(guī)的添加劑，諸如懸浮劑，例如山梨醇、糖漿、甲基纖維素、 明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠或氫化食用脂肪，乳化劑，例如卵磷脂、脫水山梨醇一油酸酯或阿拉伯膠；非水性載體(它們可以包括食用 油)，例如杏仁油、分餾椰子油、諸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐 劑，例如對羥基苯甲酯或對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常 規(guī)的香味劑或著色劑。對于注射劑，制備的液體單位劑型含有本發(fā)明的活性物質和無菌載體。根據(jù)載體和濃度，可以將此化合物懸浮或者溶解。溶液的制備通常是通過將活性物質 溶解在一種載體中，在將其裝入一種適宜的小瓶或安瓿前過濾消毒，然后密封。 輔料例如一種局部麻醉劑、防腐劑和緩沖劑也可以溶解在這種載體中。為了提高 其穩(wěn)定性，可在裝入小瓶以后將這種組合物冰凍，并在真空下將水除去。本發(fā)明的中藥制劑，在制備成藥劑時可選擇性的加入適合的藥物可接受的載 體，所述藥物可接受的載體選自甘露醇、山梨醇、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、鹽酸半胱氨酸、巰基乙酸、蛋氨酸、維生素C、 EDTA二鈉、EDTA 鈣鈉， 一價堿金屬的碳酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、 磷酸、氨基酸、氯化鈉、氯化鉀、乳酸鈉、木糖醇、麥芽糖、葡萄糖、果糖、右 旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纖維素及其衍生物、 藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土溫80、瓊脂、碳酸鈣、碳酸氫鈣、表面活性劑、聚乙二醇、環(huán)糊精、e _環(huán)糊精、磷脂類材料、高嶺土、滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂等。本發(fā)明的制劑在使用時根據(jù)病人的情況確定用法用量，可每日服三次，每次 1-20劑，如l-20袋或粒或片，每劑lmg-1000mg。 本發(fā)明所述的治療用途是通過以下實驗證明的 材料和方法 試藥二羥基苯基乳酸和丹酚酸B均購自中國藥品生物制品檢定所(北京，中國)。 脂多糖取自大腸桿菌血清型055: B5，甲苯胺藍，2， ， 7， -二氯熒光素乙酰乙 酸鹽(DCFH-DA)和氫化乙啡啶均購自Sigma (圣路易斯，密蘇里州)。FITC-結合小鼠抗-大鼠CDllb單克隆抗體，F(xiàn)ITC-結合小鼠抗-大鼠CD18單克隆抗體， FITC-結合小鼠IgA， k和FITC-結合小鼠IgGn k均購自BD生物科學系統(tǒng)(圣 地亞哥，加州)。溶血素購自BD生物科學Immunocytometer系統(tǒng)(美國加州硅 谷)。Mono-Pol分離液購自大日本製薬株式會社(大阪，日本)。RPMI 1640和 胎牛血清購自Hyclone (樓根，猶他州)。試驗中使用的所有其它化學試劑為最 優(yōu)商品級試劑。 實驗動物雄性SD大鼠，體重200 250g，由北京大學醫(yī)學部實驗動物中心提供。所有研究經(jīng)過批準，所有實驗動物遵循北京大學實驗動物研究委員會指南進行處 理。腸系膜微循環(huán)觀察試驗前SD大鼠禁食12小時，可以自由飲水。用烏拉坦將實驗動物麻醉 (1.25mg/kg體重，肌肉注射)。將導管插入左頸靜脈和右股靜脈，供注射各種 實驗藥物使用。經(jīng)腹正中線切開20-30mm，輕柔地將20cm腸系膜尾部的回盲腸 由腹部取出，置于透明塑料大鼠實驗臺上。用恒溫裝置將腸系膜保持在37°C， 在表面連續(xù)滴加生理鹽水，保持水分。取倒置顯微鏡(DM-IRB, Leica， Wetzlar， 德國)，用透照法觀察腸系膜微循環(huán)血液動力學。 一臺攝像機(Jk-TU53H，日本 東芝公司，東京，日本)安裝在顯微鏡上，將圖像反射到彩色監(jiān)視器(J2118A， TCL，徽州，中國)，使用DVD (DVR-R25， Malata， Xiamen，中國)記錄圖像。 研究中供測量參數(shù)使用的微靜脈應為單根，非分枝，無明顯彎曲，直徑范圍為 30(im-50fxm，長度為200nm。 脂多糖誘導的微循環(huán)障礙和藥物輸注將大鼠隨機分成4組，每組6只。觀察大鼠腸系膜微血管系統(tǒng)的基本血液動 力學10分鐘后，給予溶媒(生理鹽水溶液)或試驗藥品。自試驗開始(第O分 鐘)至試驗結束(第60分鐘)，自對照組實驗動物左頸靜脈插管灌注鹽水溶液 (8ml/kg體重/hr);自試驗開始(第O分鐘)至試驗結束(第60分鐘)，自脂 多糖組實驗動物左股靜脈連續(xù)灌注脂多糖(2mg/kg體重/hrin鹽水溶液)。自脂 多糖+二羥基苯基乳酸組實驗動物左股靜脈輸注脂多糖(2mg/kg體重/hr)后， 自試驗前20分鐘至觀察結束期間由左頸靜脈輸注二羥基苯基乳酸(5mg/kg體重 /hrin鹽水溶液)。脂多糖+丹酚酸B組實驗動物的處理方法與脂多糖+ 二羥基苯 基乳酸組相同，只需用丹酚酸B (5mg/kg體重/hrin鹽水溶液)代替二羥基苯基 乳酸。四個實驗組的總輸注量相同。 微靜脈直徑測量使用圖像-Pro Plus 5.0軟件評價系統(tǒng)記錄的微靜脈動態(tài)圖像，在第O， 10， 30和50分鐘測量微靜脈直徑。 微靜脈紅細胞流速測量記錄微靜脈紅細胞流速，通過CCD將監(jiān)控器調節(jié)至高速度攝像機系統(tǒng)(FAST C層-ultima APX， photron，圣地亞哥，加州)，調節(jié)速度至2000幀每 秒(幀/秒)，以25幀/秒重新播放高速保存圖像。用圖像-Pro Plus 5.0軟件測量 第0， 10， 30和50分鐘的微靜脈紅細胞流速。 切變率測量遵循下述公式計算微靜脈切變率(Y ): Y=8 (微靜脈/微靜脈直徑RBCs平 均速度)。粒性白細胞粘附測量觀察系統(tǒng)記錄的粒性白細胞動態(tài)圖像，鑒定粘附在微靜脈壁上的粒性白細 胞。粘附的粒性白細胞是指重新播放DVD圖像時粒性白細胞在同一位點粘附10 秒鐘以上。在觀察第O， 10， 30和50分鐘圖像隨機選擇200pm微靜脈，然后沿 微靜脈統(tǒng)計粘附的粒性白細胞數(shù)量。 趨化游走粒性白細胞測量檢查記錄的圖像，測量趨化游走粒性白細胞數(shù)。白細胞趨化游走即每200pm 微靜脈粒性白細胞的數(shù)量，在第O， 10， 30和50分鐘隨機選擇圖像。 肥大細胞脫顆粒測量輸注脂多糖或鹽水溶液60分鐘后，用0.1%甲苯胺藍將組織局部染色1分鐘， 然后用生理鹽水清洗。視野中沒有脫顆粒的肥大細胞和脫顆粒的肥大細胞的數(shù)量 放大20X，每只實驗動物共評價5個視野。脫顆粒的肥大細胞數(shù)量與肥大細胞 總數(shù)量的比值即為脫顆粒的肥大細胞百分數(shù)。 嗜中性粒細胞表面CDllb和CD18表達測量經(jīng)腹主動脈采集其它組大鼠血樣(n=6)，加肝臟素抗凝，檢測嗜中性粒細胞 表面CDllb和CD18表達。樣品分成四組對照組，脂多糖組(脂多糖2pg/ml)， 脂多糖+ 二羥基苯基乳酸組(脂多糖2pg/ml加二羥基苯基乳酸0.2mg/ml， 0.5mg/ml或1.0mg/ml)和脂多糖+丹酚酸B組(脂多糖2pg/ml加丹酚酸B 0.2mg/ml， 0.5mg/ml或1.0mg/ml)。樣品在37。C水浴中培育2小時，然后使用 lpg/ml FITC-結合小鼠抗-大鼠CDllb抗體，lpig/mlFITC-結合小鼠抗-大鼠 CD18抗體或FITC-結合相應同種型(小鼠IgA，Kfor CD1 lb，小鼠IgG!， /cforCD18) 在室溫條件下標記20分鐘。然后，按照生產(chǎn)廠家(BD生物科學系統(tǒng)，美國加 州硅谷)說明，用溶血素將紅細胞溶解，磷殘留細胞用酸鹽緩沖溶液洗滌兩次。9根據(jù)前向角-/側向角-散射表達特性，使用FACSCalibur流式細胞儀(BD生物 科學系統(tǒng)，美國加州硅谷)將嗜中性粒細胞分類，評價每個樣本中的5000個嗜 中性粒細胞，測量平均熒光強度。 嗜中性粒細胞產(chǎn)生的細胞內11202和'02 —測量血樣分別取自不同組大鼠，加肝臟素抗凝。遵循Ting所述方法，使用Mono-多分離液分離嗜中性粒細胞，然后將其懸浮在0.1M磷酸鹽緩沖溶液中。使用 FACSCalibur流式細胞計量術(BD生物科學系統(tǒng)，美國加州硅谷)分析細胞內產(chǎn) 生的'02 —和11202。簡而言之，將采集的嗜中性粒細胞在20mM2' -7， -二氯熒光 素雙醋酸鹽溶液中培育5分鐘，溫度為37。C，然后在10mM氫化乙啡P定中培育15 分鐘。2' -7' -二氯熒光素雙醋酸鹽的硝酸鹽部分被細胞內酯酶斷開，釋放不能 通過細胞膜的2' ，7' -二氯熒光素，被11202氧化成2' ，7' -二氯熒光素(DCF) 后發(fā)出熒光；另一方面Hydroethidium可以直接被'02 —氧化成菲啶溴紅(EB)， 嵌入核酸后發(fā)熒光。然后使用二羥基苯基乳酸(0.5mg/ml)或丹酚酸B (0.5mg/ml) 處理細胞，用脂多糖(2ug/ml)刺激細胞。在冰中培育20分鐘后，用流式細胞 計量術測量產(chǎn)生的11202和'02 —，測量發(fā)射波長為525nm (FL1， forDCF)和590nm(FL2， forEB)。 統(tǒng)計分析使用ANOVA和Fisher' s post hoc test計算統(tǒng)計顯著性。統(tǒng)計顯著水平為 p<0.05。數(shù)據(jù)以平均土S.E.M表示。 結果二羥基苯基乳酸和丹酚酸B對脂多糖誘導的微靜脈紅細胞流速變化的干預 作用在不同時間點測量四個實驗組中微靜脈紅細胞流速(見表l)。脂多糖輸 注30分鐘后，微靜脈紅細胞流速降低至74%基礎值水平，并且這種干預作用一 直維持觀察結束。二羥基苯基乳酸或丹酚酸B處理后，脂多糖誘導的微靜脈紅 細胞流速降低明顯降低。二羥基苯基乳酸和丹酚酸B對脂多糖誘導的腸系膜微靜脈切變率變化的干 預作用表2顯示四個實驗組不同時間點觀察的腸系膜微靜脈切變率。對照組， 脂多糖組，脂多糖+ 二羥基苯基乳酸組和脂多糖+丹酚酸B組的基礎值微靜脈 切變率未出現(xiàn)顯著性差異。給予脂多糖后腸系膜微靜脈切變率明顯降低，30分鐘后變得更加顯著，并且這種降低一值維持到脂多糖輸注結束50分鐘。二羥基 苯基乳酸或丹酚酸B處理減弱脂多糖誘導的腸系膜微靜脈切變率降低，降低數(shù) 值較小，因此并不顯著，脂多糖輸注50分鐘后可以檢測到脂多糖+ 二羥基苯基 乳酸或脂多糖+丹酚酸B組切變率降低。二羥基苯基乳酸和丹酚酸B對脂多糖誘導的粘附在微靜脈壁上的粒性白細胞數(shù)量變化的干擾作用評價不同條件下粘附在微靜脈壁上的粒性白細胞數(shù)量隨 時間的變化(見圖2)。在觀察期內，對照組粘附的粒性白細胞數(shù)隨著時間的推 移只有少量增加。但是，脂多糖刺激后粘附的粒性白細胞數(shù)量出現(xiàn)顯著性遞增， 自脂多糖輸注第IO分鐘開始增加，且這種增加趨勢維持了 50分鐘。二羥基苯基 乳酸或丹酚酸B處理顯著抑制脂多糖誘導的白細胞粘附。二羥基苯基乳酸和丹酚酸B對脂多糖誘導的沿微靜脈壁趨化游走的粒性白 細胞數(shù)量變化的干擾作用沿微靜脈壁趨化游走的粒性白細胞數(shù)量的變化時間過 程見圖3。在所有時間點，對照組出現(xiàn)很少或沒有出現(xiàn)趨化游走的粒性白細胞。 給予脂多糖引起趨化游走粒性白細胞數(shù)量在50分鐘顯著增加，二羥基苯基乳酸 或丹酚酸B處理后幾乎完全沒有出現(xiàn)這種增加。二羥基苯基乳酸和丹酚酸B對脂多糖誘導的肥大細胞脫顆粒的干預作用 圖4顯示四個實驗組中微靜脈中脫顆粒肥大細胞百分數(shù)。對照組中甚至可以檢測 到少量脫顆粒肥大細胞。脂多糖輸注60分鐘后脫顆粒肥大細胞數(shù)量開始增加， 二羥基苯基乳酸或丹酚酸B處理組顯著抑制脂多糖誘導的脫顆粒反應肥大細胞。二羥基苯基乳酸和丹酚酸B對嗜中性粒細胞體外CDllb和CD18表達的干預 作用本研究使用流式細胞計量術分析接受不同處理的嗜中性粒細胞表面粘附分 子CDllb和CD18表達。圖5A顯示，與對照組比較經(jīng)脂多糖處理后嗜中性粒細胞 表面CDllb的熒光強度顯著增加，加入丹酚酸B或二羥基苯基乳酸后這種由脂多 糖誘導的CDllb熒光強度增強消失，加入的丹酚酸B的有效濃度可以低至 0.2mg/ml， 二羥基苯基乳酸的有效濃度可以低至0.5mg/ml。圖5B表明，粘附分 子CD18出現(xiàn)類似的趨勢經(jīng)脂多糖處理后嗜中性粒細胞表面CD18熒光強度顯著 增加，使用的濃度達到0.2mg/tnl時，二羥基苯基乳酸或丹酚酸B處理后這種作 用受到抑制。二羥基苯基乳酸和丹酚酸B對嗜中性粒細胞細胞內產(chǎn)生'(V和&02的體外千預作用使用流式細胞計量術檢測二羥基苯基乳酸和丹酚酸B的抗氧化作用。細胞 經(jīng)脂多糖刺激后，嗜中性粒細胞產(chǎn)生大量'(V ，加入0.5mg/ml二羥基苯基乳酸或 丹酚酸B后，顯著抑制細胞產(chǎn)生'(V (見圖6A)。與對照組比較，脂多糖刺激后嗜 中性粒細胞HA熒光強度幾乎增加兩倍，使用O. 5mg/ml二羥基苯基乳酸或丹酚酸B 處理后這種作用顯著降低(見圖6B)。試驗結果表明，二羥基苯基乳酸和丹酚酸B均可以改善脂多糖誘導的大鼠腸 系膜微循環(huán)障礙。包括抑制白細胞粘附和趨化游走，減弱紅細胞流速和微靜脈切 變率降低，抑制肥大細胞脫顆粒?？梢砸种浦嗵谴碳さ氖戎行粤＜毎掣椒肿?CDllb和CD18表達和'02 —和11202產(chǎn)生。這些結果為LPS誘導的敗血癥的臨床 治療提供了一個新的可供選擇的方法。 表l輸注鹽水溶液或脂多糖后不同時間點微靜脈紅細胞流速。 按照材料和方法所述方法，輸注鹽水溶液或脂多糖后，給予或不給予二羥基苯 基乳酸或丹酚酸B預處理，在第O， 10， 30和50分鐘測量微靜脈紅細胞流速。 數(shù)據(jù)以6只大鼠的平均土S. E. M表示。微靜脈RBCsi速度(mm/秒)對照(n=6) 脂多糖(n=6) 脂多糖+二羥基 苯基乳酸(n=6) 脂多糖+丹酚酸 B (n=6)0分鐘 1,91 ±0.351.90±0.141.79±0.261.90±0.3310分鐘 1.89±0.291.52±0.171.79±0.331.93 ±0.3230分鐘 50分鐘 2.18±0.25 1.99±0.17 1.41±0.09* 1.35±0.11*1.78 ±0.271.94±0.351.50 ±0.201.78±0.33對照組大鼠灌注溶媒(鹽水溶液)(8ml/kg體重/hr);脂多糖組大鼠灌注脂多 糖(2mg/kg體重/hr);脂多糖+ 二羥基苯基乳酸組實驗動物在輸注脂多糖(2mg/kg體重/hr) 20分鐘前灌注二羥基苯基乳酸(5mg/kg體重/hr);脂多 糖+丹酚酸B，實驗動物在輸注脂多糖(2mg/kg體重/hr) 20分鐘前灌注丹酚 酸B (5mg/kg體重/hr).0.05。 表2輸注鹽水溶液或脂多糖后不同時間點的微靜脈切變率。按照材料和方法所述方法，給予或不給予二羥基苯基乳酸或丹酚酸B預處理， 輸注鹽水溶液或脂多糖后，在第0， 10， 30和50分鐘測量微靜脈切變率。數(shù)據(jù) 以6只大鼠的平均士S.E.M。表示。微靜脈切變率(s—')O分鐘對照(n=6) 421.18±95.19脂多糖394.95±31.90(n=6) 脂多糖+ 二羥基苯基乳 417.35土64.11402.50±69.90410.05±59.77 338.48±48.86酸(n=6) 脂多糖+丹酚酸B 375.85±58,82375.15±51.61380.36±64.61 340.35±61.02(n=6)對照組大鼠灌注溶媒(鹽水溶液)(8ml/kg體重/hr);脂多糖組大鼠灌注脂多 糖(2mg/kg體重/hr);脂多糖+二羥基苯基乳酸組大鼠灌注脂多糖(2mg/kg 體重/hr) 20分鐘前，灌注二羥基苯基乳酸(5mg/kg體重/hr);脂多糖+丹酚 酸B組大鼠灌注脂多糖(2mg/kg體重/hr) 20分鐘前，灌注丹酚酸B (5mg/kg 體重/hr)。承與對照組比較p〈0. 05。


圖1. 二羥基苯基乳酸和丹酚酸B的化學結構。圖2. 二羥基苯基乳酸和丹酚酸B對大鼠輸注脂多糖后粘附在微靜脈壁上的粒 性白細胞數(shù)量變化的時間過程干預作用。對照組大鼠灌注鹽水溶液60分鐘 (8ml/kg體重/hr)，脂多糖組大鼠灌注脂多糖(2mg/kg體重/hr) 60分鐘。遵10分鐘 30分鐘 50分鐘397.88±74.85459.61 ±68.58 426.06±50.02330.87±44.96295.52±24.36* 282.94±25.99*13循材料和方法所述方法，大鼠輸注脂多糖(2mg/kg體重/hr) 20分鐘前靜脈注 射二羥基苯基乳酸(5mg/kg體重/hr)或丹酚酸B (5mg/kg體重/hr)，連續(xù)輸 注直至觀察結束。四個實驗組的總輸注量相同。統(tǒng)計粒性白細胞趨化游走數(shù)量， 結果以每200 u m微靜脈的細胞數(shù)量表示。數(shù)據(jù)為6只大鼠的平均士S. E. M表示。 *與對照組比較P〈0. 05。， t與脂多糖比較p<0, 05。圖3. 二羥基苯基乳酸和丹酚酸B對大鼠輸注脂多糖后微靜脈趨化游走粒性白細 胞數(shù)量變化的時間過程干預作用。對照組大鼠灌注鹽水溶液60分鐘(8ml/kg 體重/hr),脂多糖組大鼠灌注脂多糖(2mg/kg體重/hr) 60分鐘。按照材料和 方法所述方法，大鼠輸注脂多糖(2mg/kg體重/hr) 20分鐘前靜脈注射二羥基 苯基乳酸(5mg/kg體重/hr)或丹酚酸B (5mg/kg體重/hr)，連續(xù)輸注直至觀 察結束。四個實驗組的總輸注量相同。統(tǒng)計粒性白細胞趨化游走數(shù)量，結果以 每200um微靜脈的細胞數(shù)量表示。數(shù)據(jù)6只大鼠的平均土S.E.M表示。*與對 照組比較p<0. 05。 ， t與脂多糖比較p〈0. 05。圖4. 二羥基苯基乳酸和丹酚酸B對大鼠輸注脂多糖后沿微靜脈肥大細胞脫顆粒 的干預作用。對照組大鼠灌注鹽水溶液60分鐘(8ml/kg體重/hr)，脂多糖組 大鼠灌注脂多糖(2mg/kg體重/hr) 60分鐘。按照材料和方法所述方法，大鼠 輸注脂多糖(2mg/kg體重/hr) 20分鐘前靜脈注射二羥基苯基乳酸(5mg/kg體 重/hr)或丹酚酸B (5mg/kg體重/hr，連續(xù)輸注直至觀察結束。四個實驗組的 總輸注量相同。脂多糖輸注60分鐘后測量肥大細胞脫顆粒。數(shù)據(jù)6只大鼠的平 均士S.E.M表示。Hc與對照組比較p〈0.05。， t與脂多糖比較p〈0.05。 圖5. 二羥基苯基乳酸和丹酚酸B對體外脂多糖刺激嗜中性粒細胞粘附分子 CDllb (A)和CD18 (B)表達的干預作用。使用流式細胞計量術分析CDUb和 CD18表達。血樣用脂多糖(2Pg/ml)培育，加入或不加各種濃度的二羥基苯基 乳酸或丹酚酸B，然后使用相應抗體培育。將紅細胞溶解，將嗜中性粒細胞分 類，使用流式細胞計量術評價，測量平均熒光強度。數(shù)據(jù)6只大鼠的平均士S. E. M 表示。本與對照組比較p〈0.05。， t與脂多糖比較p〈0.05。 圖6. 二羥基苯基乳酸和丹酚酸B對體外脂多糖刺激嗜中性粒細胞產(chǎn)生'(V (A) 和H202 (B)的干預作用。嗜中性粒細胞用2化Anl脂多糖培育，加入或不加二 羥基苯基乳酸(0.5mg/ml)或丹酚酸B (0.5mg/ml)。用流式細胞計量術測量產(chǎn)生的.(V和HA。數(shù)據(jù)6只大鼠的平均土S.E.M表示。氺與對照組比較p〈0.05。十 與脂多糖比較p<0.05。
具體實施例方式
以下通過實施例進一步說明本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明的限制。
實施例1
片劑
處方二羥基苯基乳酸或丹酚酸B100g 微晶纖維素50g 微粉
硅膠3g 硬脂酸鎂1. 5g
制法取原、輔料分別過100目篩；取三七皂苷、微晶纖維素，混勻， 用60%乙醇適量作為粘合劑制軟材，過20目篩制顆粒，6(TC干燥，取出， 過30目篩整粒，加入微粉硅膠及硬脂酸鎂，混勻，壓片，制成1000片，
即得。 實施例處方二羥基苯基乳酸或丹酚酸B75g 微晶纖維素37g 微粉硅膠 2. 3g 硬脂酸鎂l.lg
制法取原、輔料分別過IOO目篩；取三七皂苷、硫酸鈣、微晶纖維素， 混勻，用60%乙醇適量作為粘合劑制軟材，過20目篩制顆粒，6(TC干燥， 取出，過30目篩整粒，加入適量微粉硅膠及硬脂酸鎂，混勻，壓片，制 成1000片，即得。 實施例處方二羥基苯基乳酸或丹酚酸B133g 微晶纖維素66g 微粉硅膠 4g
硬脂酸鎂2g
制法取原、輔料分別過100目篩；取三七皂苷、硫酸鈣、微晶纖維素， 混勻，用60%乙醇適量作為粘合劑制軟材，過20目篩制顆粒，6(TC干燥， 取出，過30目篩整粒，加入適量微粉硅膠及硬脂酸鎂，混勻，壓片，制 成1000片，即得。 實施例4
膠囊，取二羥基苯基乳酸或丹酚酸B100mg，加入適量淀粉，硬脂酸鎂等輔料，制粒，整粒，裝入1號膠囊，即得。 實施例5
口服液，取二羥基苯基乳酸或丹酚酸B100mg，加入適量蔗糖，防腐劑，加水到 1000ml，分裝成10ml—支，即得口服液。 實施例6
顆粒劑，取二羥基苯基乳酸或丹酚酸B100mg，加入適量糊精、甜菊素，干式制 粒，整粒，分裝，即得。 實施例7
注射劑，二羥基苯基乳酸或丹酚酸B150g加水溶解，另氯化鈉、對羥基苯甲酸 乙酯加熱水溶解，混勻，調
pH值。注射用水稀釋至1000ml,用中空纖維膜濾過，灌裝，滅菌，即得。 實施例8
應用實例，敗血癥的治療 典型病例(一)
患者孫XX，男性，30歲，印刷工人，有頭痛、惡心、嘔吐、腹脹、腹痛、 周身不適、肌肉及關節(jié)疼痛等，經(jīng)診斷為敗血癥
開始注射二羥基苯基乳酸注射液，規(guī)格0.1g/支，每日三次每次2支。半月 后自覺癥狀有明顯好轉。用藥期間無任何不良反應。
權利要求
1、丹參提取物在制備一種治療敗血癥的藥物中的應用。
2、 權利要求l的應用，其特征在于，所述丹參提取物是二羥基苯基乳酸。
3、 權利要求l的應用，其特征在于，所述丹參提取物丹酚酸B。
4、 權利要求l的應用，其特征在于，所述敗血癥是致病菌或條件致病菌侵入血 循環(huán)中生長繁殖，產(chǎn)生毒素和其他代謝產(chǎn)物所引起的急性全身性感染。
5、 權利要求l的應用，其特征在于，所述敗血癥引發(fā)微循環(huán)障礙，該微循環(huán)障 礙是由脂多糖的過度釋放造成的系統(tǒng)性炎癥反應。
6、 權利要求l的應用，其特征在于，所述應用是用二羥基苯基乳酸或丹酚酸B 處理后，脂多糖誘導的微靜脈紅細胞流速降低。
7、 權利要求l的應用，其特征在于，所述應用是二羥基苯基乳酸或丹酚酸B抑 制脂多糖誘導的白細胞粘附。
8、 權利要求l的應用，其特征在于，所述應用是二羥基苯基乳酸或丹酚酸B抑 制脂多糖誘導的肥大細胞脫顆粒反應。
9、 權利要求l的應用，其特征在于，所述丹參提取物是含有丹參提取物的藥物 制劑組合物。
10、 權利要求9的應用，其特征在于，所述藥物制劑組合物，以丹參提取物二羥 基苯基乳酸和乃酚酸B作為藥物活性成分，同時含有藥物可接受的載體，其中丹 參提取物在制劑中所占重量百分比是0. 1-99. 9%，其余為藥物可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及丹參提取物治療敗血癥的應用，特別涉及丹參提取物二羥基苯基乳酸或丹酚酸B在治療和/或預防敗血癥的應用。
文檔編號A61P31/04GK101327249SQ200710111279
公開日2008年12月24日 申請日期2007年6月21日 優(yōu)先權日2007年6月21日
發(fā)明者劉育英, 凱 孫, 王傳社, 俊 郭, 韓晶巖 申請人:天津天士力制藥股份有限公司