專利名稱：：一種抗腫瘤藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及抗腫瘤藥物，具體是關(guān)于一種以去甲淫羊藿素作為有效成分的抗腫瘤藥物。
背景技術(shù)：
：淫羊藿常見于亞洲和地中海地區(qū)，是一種辛辣性觀賞草本植物。淫羊藿英文被稱為印imedium，是因為它與古代亞洲Media王國(現(xiàn)為伊朗的一部分)的一種植物相似。淫羊藿是一個屬，包括多種相關(guān)植物，其中一些已作為藥用，包括箭葉淫羊藿、小檗科淫羊藿、大花淫羊藿和朝鮮淫羊藿。箭葉淫羊藿是一種重要的傳統(tǒng)中草藥，在中國、日本和韓國被廣泛用作滋補藥和抗風(fēng)濕藥，并被證明能有效治療骨質(zhì)疏松、心血管疾病和腫瘤。淫羊藿苷(ICA)(分子量為676)，一種黃酮醇糖苷，是箭葉淫羊藿的主要成分。淫羊藿苷是一種新的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑和促分化劑。為進一步闡明其逆轉(zhuǎn)腫瘤惡性表型的機制，有人做了ICA作用于高度轉(zhuǎn)移性肺癌細胞(PG)的體外試驗。結(jié)果顯示，ICA不但可影響PG細胞周期和縮短S期，而且可使PG細胞內(nèi)cAMP水平升高，cGMP水平降低，cAMP/cGMP比值提高。另一方面，ICA可降低PG細胞對層粘連蛋白基質(zhì)的粘附率，抑制PG細胞的侵襲和遷移能力。此外還發(fā)現(xiàn)，ICA可提高PG細胞的膜流動性，增加膜HLA-ABC抗原的表達。這些數(shù)據(jù)提示，ICA可能是一種抗癌藥物(毛海婷等，中藥材，1999，22(1):35-36;毛海婷等，中藥材，2000，23(9):554-556)。然而在另一項研究中，ICA并未顯示抑制肝癌細胞系和白血病細胞系的能力(LinCCetal.，ClinExpPharmacolPhysiol,2004，31(1-2):65-69)。因此，ICA是否具有抗腫瘤作用并不清楚。有文獻報道，ICA己被生物轉(zhuǎn)化，至少被轉(zhuǎn)化成3種代謝產(chǎn)物淫羊藿次甙II(分子量為514),淫羊藿素(分子量為368)以及去甲淫羊藿素(分子量為354)(LiuJetal.，JPharmBiomedAnal，2004，36(2):365-370;LiuJetal.，Pharmazie，2005，60(2):120-125)。研究報道，去甲淫羊藿素有微弱的植物雌激素樣作用，且這種雌激素樣作用是由雌激素受體介導(dǎo)的。但對去甲淫羊藿素抗腫瘤作用的研究未見報道。脂肪酸合成酶(FattyAddSynthase,FAS)是長鏈脂肪酸合成的一個關(guān)鍵酶，在絕大部分正常組織細胞中表達低下。由于正常組織細胞通常利用食物攝取的脂肪酸生長，因此FAS不具有重要功能。然而，腫瘤細胞的快速生長主要利用細胞內(nèi)源性合成的脂肪酸，因此許多類型的腫瘤細胞內(nèi)FAS基因表達水平增高，且酶活性增強。FAS在腫瘤發(fā)生的早期就開始表達上調(diào)，隨著腫瘤發(fā)展而進一步提高，并且高表達FAS的腫瘤患者的預(yù)后較差。而FAS小分子化學(xué)抑制劑淺藍霉素和C75等可抑制腫瘤細胞生長和誘導(dǎo)細胞凋亡(PizerESetal.，CancerRes,1996,56(6):1189-1193;PizerESetal.,CancerRes，1998，58(20):4611-4615)。因此，F(xiàn)AS現(xiàn)己被公認是一個新的腫瘤治療分子靶標。鑒定新的FAS抑制劑一直引起人們很大的興趣。最近有研究報道，茶葉中表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)通過抑制腫瘤細胞FAS活性，抑制細胞內(nèi)源性脂肪酸合成，導(dǎo)致腫瘤細胞生長抑制和凋亡。文獻又報道，包括毛地黃黃酮、櫟皮黃酮、山奈酚在內(nèi)的多種植物黃酮化合物都具有抑制腫瘤細胞FAS的作用。此外，文獻也已明確報道，腫瘤血管生成在腫瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中有著十分重要的作用。因此，阻斷腫瘤血管新生，切斷腫瘤組織獲得營養(yǎng)的途徑已成為新的抗腫瘤治療策略，一直是抗腫瘤治療領(lǐng)域熱門的研究內(nèi)容。去甲淫羊藿素也是一種黃酮類化合物，對其抑制FAS活性，抑制細胞脂肪酸生成的活性，抑制人血管內(nèi)皮細胞生長作用與抗腫瘤作用研究也是一個新的研究動向。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種以去甲淫羊藿素作為有效成分的抗腫瘤藥物。抗腫瘤藥物中含有抗腫瘤有效量的去甲淫羊藿素及可藥用載體和/或賦形劑。本發(fā)明人通過試驗證明去甲淫羊藿素是一個非常有效的FAS拮抗物，具有抑制人血管內(nèi)皮細胞生長的作用，也能廣泛抑制多種人類腫瘤細胞系生長，并進一步誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。在3種人腫瘤異種移植模型的試驗中，去甲淫羊藿素被證明是一種有效的抗腫瘤劑，能強烈抑制人肺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌細胞在體內(nèi)生長。去甲淫羊藿素具有被開發(fā)成廣譜抗腫瘤新藥的巨大潛力。去甲淫羊藿素的制備，參考文獻報道(葉海涌等.浙江大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2005，34(2):131-136),簡述如下將箭葉淫羊藿磨成粉末，用溶劑萃取，萃取物通過硅膠柱層析，用溶劑洗脫，可制得淫羊藿素和去甲淫羊藿素的前體淫羊藿苷。再按照下列示意的反應(yīng)路線，將淫羊藿苷通過水解反應(yīng)制得淫羊藿素，再進一步通過脫甲基化反應(yīng)制得去甲淫羊藿素。去甲淫羊藿素的藥理試驗1.體外試驗a)去甲淫羊藿素具有抑制細胞脂質(zhì)生成的活性為了證實去甲淫羊藿素抑制細胞脂質(zhì)生成的活性，用不同濃度的去甲淫羊藿素處理前列腺癌細胞LnCAP5小時，定量測定2-"C標記的醋酸鹽在細胞脂質(zhì)中的摻入量。如圖1所示，0.5)iiM去甲淫羊藿素抑制脂質(zhì)生成大于50%。更高濃度去甲淫羊藿素以劑量依賴性方式減少細胞脂質(zhì)生成。處理24小時后則進一步降低。b)去甲淫羊藿素通過抑制FAS活性以降低細胞中脂肪酸生成為了證實去甲淫羊藿素是一個FAS抑制劑，用不同濃度的去甲淫羊藿素預(yù)處理LnCAP細胞蛋白質(zhì)提取物，然后定量測定2-14C標記的丙二酸單酰輔酶A在脂肪酸中的摻入量。如圖2所示，0.5^M去甲淫羊藿素在體外降低FAS酶活性，酶活性小于50%。Westernblot分析表明，去甲淫羊藿素不影響FAS蛋白水平。因此證實抑制脂肪酸生成是抑制FAS酶活性的直接結(jié)果，而不是通過降低FAS表達實現(xiàn)的。c)去甲淫羊藿素具有抑制人微血管內(nèi)皮細胞HMVEC生長并導(dǎo)致凋亡的作用為了證實去甲淫羊藿素抑制人血管內(nèi)皮細胞生長并導(dǎo)致內(nèi)皮細胞凋亡，對去甲淫羊藿素進行了體外抑制人微血管內(nèi)皮細胞生長和管狀結(jié)構(gòu)形成的試驗。試驗結(jié)果顯示，10iiM去甲淫羊藿素能抑制人微血管內(nèi)皮細胞生長并導(dǎo)致內(nèi)皮細胞凋亡，8pM去甲淫羊藿素能抑制HMVEC細胞體外血管管狀結(jié)構(gòu)形成。關(guān)于其作用機制，發(fā)明人認為，由于FAS是去甲淫羊藿素的分子靶點，去甲淫羊藿素作為FAS抑制劑可使血管內(nèi)皮細胞FAS活性受抑，脂肪酸合成受阻，血管內(nèi)皮細胞生長因子受體II(VEGF2/KDR/FLK1)不能正常表達在細胞膜上，于是血管內(nèi)皮細胞生長因子不能與其結(jié)合，導(dǎo)致有關(guān)信號傳遞阻斷，從而誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞生長抑制和凋亡。去甲淫羊藿素抑制人微血管內(nèi)皮細胞增殖的試驗按照文獻描述的方法進行(KochAE,etal.,Nature,1995Aug10;376(6540):517-519)。應(yīng)用不同濃度的去甲淫羊藿素處理人微血管內(nèi)皮細胞HMVEC72小時，測定細胞生長存活情況，以未經(jīng)去甲淫羊藿素處理的細胞為對照，計算HMVEC細胞生長抑制率。結(jié)果如圖3所示，10pM去甲淫羊藿素能完全抑制HMVEC細胞生長，導(dǎo)致細胞凋亡。由于該試驗以去甲淫羊藿素處理前種植的細胞數(shù)為基準對照，因此圖3中曲線在零基線下面的數(shù)據(jù)則表示去甲淫羊藿素處理后的存活細胞數(shù)低于處理前種植的細胞數(shù)。去甲淫羊藿素抑制人微血管內(nèi)皮細胞在體外基質(zhì)膠中形成管狀結(jié)構(gòu)的試驗按照文獻描述的方法進行(FajardoLF，etal.，LabInvest.,1988Jim;58(6):718-724)。應(yīng)用不同濃度的去甲淫羊藿素處理HMVEC細胞，并以煙曲霉素(fomagilin，一種確認的血管生成抑制劑)為陽性對照，檢測在基質(zhì)膠中形成管狀結(jié)構(gòu)的情況。顯微鏡下觀察結(jié)果如圖4所示，與陰性對照賦形劑相比，去甲淫羊藿素處理后形成的管狀結(jié)構(gòu)數(shù)目顯著減少。經(jīng)計數(shù)、統(tǒng)計，結(jié)果如圖5所示，去甲淫羊藿素能抑制HMVEC細胞形成管狀結(jié)構(gòu)，并且具有濃度依賴性。8去甲淫羊藿素即能明顯抑制HMVEC細胞形成管狀結(jié)構(gòu)，其作用相當于218|iM煙曲霉素，抑制管狀結(jié)構(gòu)形成的EC50為3.2^M。d)使用人腫瘤細胞系進行細胞毒性試驗在含有不同濃度去甲淫羊藿素的正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)33種腫瘤細胞株，3天后應(yīng)用MTT法測定細胞存活情況。結(jié)果(表1)顯示大多數(shù)人體腫瘤細胞對去甲淫羊藿素敏感。有些腫瘤細胞對該化合物的IC50(半數(shù)抑制濃度)低于10"m。而且顯示，與雌激素依賴性人體乳腺癌細胞相比，雌激素非依賴性人乳腺癌細胞對去甲淫羊藿素更敏感。但是，正常人乳腺上皮細胞(MCF10a)對去甲淫羊藿素不敏感，即便該化合物的濃度高達50um，這些細胞仍然生長良好。體外試驗證明去甲淫羊藿素能廣泛抑制人體腫瘤細胞株，但對正常細胞株沒有作用。2.應(yīng)用人腫瘤移植裸鼠模型進行去甲淫羊藿素的抗腫瘤有效性試驗在去甲淫羊藿素有效抑制多種腫瘤細胞體外增殖的基礎(chǔ)上，應(yīng)用人腫瘤移植裸鼠(皮下接種)評價去甲淫羊藿素的抗腫瘤作用，受試的腫瘤細胞包括人前列腺癌細胞LnCAP、人肺癌細胞NCI-H23和人結(jié)腸癌細胞HCT-116。結(jié)果(見圖6-8)顯示，去甲淫羊藿素強烈抑制這3種腫瘤生長，其TGI值分別為12%，44.7%和20%。同時未發(fā)現(xiàn)去甲淫羊藿素具有明顯的副作用，包括體重的變化。這些數(shù)據(jù)表明，去甲淫羊藿素能明顯抑制體內(nèi)腫瘤生長，是開發(fā)新的抗腫瘤藥物的很好的候選化合物。此外還進行了下列試驗去甲淫羊藿素在小鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)試驗口詞給藥的去甲淫羊藿素在4個小鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)見表2，這些實驗數(shù)據(jù)說明去甲淫羊藿素能在體內(nèi)保持一定的藥物濃度，有利于抗腫瘤的效果。給藥后去甲淫羊藿素對小鼠的急性毒性試驗受試小鼠處死后進行病理分析，結(jié)果顯示，以單次劑量1000mg/kg和多次劑量200mg/kg(Q2DX15)給予去甲淫羊藿素，均未觀察到毒性，所有受試小鼠生長良好，無一死亡。由以上藥理試驗的效果證明，來源于天然物質(zhì)中草藥箭葉淫羊藿的去甲淫羊藿素具有抑制細胞脂質(zhì)生成的活性；能通過抑制FAS活性以降低細胞中脂肪酸生成；還具有抑制人微血管內(nèi)皮細胞生長并導(dǎo)致凋亡的作用；對33種腫瘤細胞株的細胞毒性試驗，結(jié)果顯示有廣譜的抗腫瘤作用；應(yīng)用人腫瘤移植裸鼠模型試驗，去甲淫羊藿素顯示出對人前列腺癌細胞LnCAP、人肺癌細胞NCI-H23或人結(jié)腸癌細胞HCT-116有強烈的抑制腫瘤生長的作用，這3種腫瘤都屬于惡性實體瘤，同時未顯示有明顯的副作用。此外，藥代動力學(xué)試驗也顯示去甲淫羊藿素在體內(nèi)能保持一定的藥物濃度，有利于抗腫瘤效果，去甲淫羊藿素對小鼠的急性毒性試驗也未觀察到毒性，所有受試小鼠生長良好，無一死亡。因此去甲淫羊藿素是一種具有很大開發(fā)前景的廣譜抗腫瘤新藥，去甲淫羊藿素可作為抗腫瘤藥物的原料藥，優(yōu)先作為抗惡性實體瘤藥物的原料藥，去甲淫羊藿素也可與可藥用載體和/或賦形劑制成抗腫瘤藥物。所述可藥用載體和/或賦形劑例如Captisul，谷物油，羧甲基纖維素鈉等。一般口服推薦劑量為每天750mg/體表面積m2，連續(xù)三周，休息一周為一療程。每天總劑量分早晚兩次，于餐后半小時口服，具體病例可由醫(yī)師根據(jù)病情調(diào)整。表l去甲淫羊藿素體外抑制人腫瘤細胞生長<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>圖1是LnCAP細胞經(jīng)去甲淫羊藿素處理后的脂質(zhì)生成-去甲淫羊藿素濃度曲線圖。圖2是LnCAP細胞經(jīng)去甲淫羊藿素處理后的脂肪酸合成酶-去甲淫羊藿素濃度曲線圖。圖3是HMVEC細胞經(jīng)去甲淫羊藿素處理后的細胞生長抑制率-去甲淫羊藿素濃度曲線圖。圖4是去甲淫羊藿素、賦形劑或煙曲霉素抑制HMVEC細胞體外形成管狀結(jié)構(gòu)的顯微鏡觀察結(jié)果。圖中4a陰性對照賦形劑4b煙曲毒素(218pM)4c去甲淫羊藿素(lpM)4d去甲淫羊藿素(8pM)圖5是用去甲淫羊藿素、煙曲霉素或陰性對照賦形劑處理后抑制HMVEC細胞體外形成的管狀結(jié)構(gòu)數(shù)目。圖中處理物編號1，煙曲霉素(218^M);3，煙曲霉素(21.8|LlM);5，去甲淫羊藿素(0.25pM)7，去甲淫羊藿素(1|iM);9，去甲淫羊藿素(4pM);2，煙曲霉素(108|aM);4，陰性對照賦形劑；6，去甲淫羊藿素(0.5^M);8，去甲淫羊藿素(2pM);10，去甲淫羊藿素(8juM)。圖6是去甲淫羊藿素，對照組治療皮下接種的人前列腺癌(LnCAP)腫瘤的腫瘤體積一移植后天數(shù)曲線圖。圖7是去甲淫羊藿素，對照組治療皮下接種的人肺癌(NCI-H23)腫瘤的腫瘤體積一移植后天數(shù)曲線圖。圖8是去甲淫羊藿素，對照組治療皮下接種的人結(jié)腸癌(HCT-116)腫瘤的腫瘤體積一移植后天數(shù)曲線圖。具體實施例方式實施例1去甲淫羊藿素的制備(參見葉海涌等，浙江大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2005，34(2):131-136)。取在中國南部山區(qū)采集獲得的箭葉淫羊藿2kg磨成粉末，然后用950/^乙醇(10L)萃取。獲得250g濃縮原料，然后用2.5L氯仿、乙酸乙酯和n-丁醇進一步萃取。將8g乙酸乙酯萃取物和10gn-丁醇萃取物裝入硅膠層析柱，用CHCl3-MeOH-HCOOH(150:1:0.5)和CHCl3_MeOH(8:2)分別洗脫。通過這一過程，可制得300mg淫羊藿素和去甲淫羊藿素前體淫羊藿苷。然后按照以下簡要描述的方法將前體水解，先制得淫羊藿素。溶液A:將80mg前體超聲溶解于18ml甲醇溶液中；溶液B:500U(0.433g)纖維素酶溶于180ml(0.lmol/L)，pH5.0乙酸緩沖液中。一邊攪拌一邊將溶液A緩慢加入溶液B中，然后將所得混合物在37'C的振蕩水浴中孵育過夜，以充分水解連接在前體上的葡萄糖和鼠李糖。第二天用三份等體積(約200ml)的乙酸乙酯萃取，并將有機物層在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上真空干燥得淫羊藿素(150mg)。再用如下描述的方法，使淫羊藿素去甲基化即得去甲淫羊藿素。在干燥條件下，將20mg淫羊藿素與10ml新鮮蒸餾的二氯甲垸配制的溶液，加入到lml三溴化硼與5ml二氯甲垸配制的溶液中，在8(TC反應(yīng)1小時，然后轉(zhuǎn)移至室溫繼續(xù)反應(yīng)過夜。加水(10ml)終止反應(yīng)，以去除過量的三溴化硼和水解生成的硼化物。用三份等體積(約25ml)的乙酸乙酯萃取，并將有機物層在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上真空干燥得去甲淫羊藿素(130mg)。實施例2用(2-14C)S昔酸鹽摻入法測定去甲淫羊藿素對細胞脂質(zhì)生成的抑制活性用不同濃度的去甲淫羊藿素處理LnCAP細胞5小時或24小時后，2-14C標記的醋酸鹽(57mCi/廳ol;2pCi/dish;AmershamBiosciences)加入LnCAP細胞培養(yǎng)基中。孵育4小時后，收集細胞和培養(yǎng)基，重懸離心收集的細胞于0.8mlPBS。應(yīng)用BlighDyer法(Swi皿enJ.V.etal.,Endocrinology,1996;137:4468~4474)抽提脂類，通過閃爍計數(shù)法定量測定細胞脂類的(2-14C)醋酸鹽摻入量。獲得的結(jié)果被標準化為樣品蛋白質(zhì)含量。去甲淫羊藿素處理LnCAP細胞后脂質(zhì)生成-去甲淫羊藿素濃度曲線圖見圖l。實施例3去甲淫羊藿素對LnCAP細胞提取物脂肪酸合成酶活性抑制的試驗利用LnCAP細胞蛋白抽提物測定FAS酶活性(BrusselmansK.etal.,JBiolChem，2005Feb18;280(7):5636-5645)。通過離心收集LnCAP細胞，重懸于低滲緩沖液中(lmMEDTA,20mMTris-HCl,pH7.5)，然后應(yīng)用BCA法(Pierce)測定樣品蛋白質(zhì)含量。等量的蛋白(50pg)與不同濃度的去甲淫羊藿素(0.03-30^M)置于2.5ml磷酸鹽緩沖液(100mM,pH7.0)，在37。C預(yù)孵育30分鐘。之后加入20pl反應(yīng)液[2.5mMNADPH,1.25mM乙酰-輔酶A，1.25mM丙二酰-輔酶A,0.02mM[2少C]丙二酰-輔酶A(60mCi/mmol;PerkinElmerLifeSciences)],37。C再孵育15分鐘，加入3ml冰冷的lM鹽酸/甲醇混合液(6:4，V/V)終止反應(yīng)，并用石油醚抽提脂肪酸，通過閃爍計數(shù)分析摻入2-"C的丙二酰輔酶A。結(jié)果如圖2所示。實施例4去甲淫羊藿素抑制人微血管內(nèi)皮細胞增殖的試驗(參見KochAE，etal,,Nature,1995Aug10;376(6540):517-519)HMVEC購自ATCC(美國細胞、菌種庫)。用含2%FBS(胎牛血清)的EBM培養(yǎng)基，在含5°/￡02的37。C孵箱中培養(yǎng)。胰蛋白酶消化匯合的細胞，經(jīng)培養(yǎng)液洗滌后計數(shù)。向96孔培養(yǎng)板的每孔中加入2.5X10S個細胞，貼壁培養(yǎng)4小時。然后向孔內(nèi)加入不同濃度的去甲淫羊藿素，對照組加入去甲淫羊藿素溶劑0.5%DMS0。繼續(xù)培養(yǎng)72小時后，對藥物處理組細胞和對照組細胞進行MTT(四氮唑藍)試驗，測定細胞生長存活情況，計算HMVEC細胞生長抑制率。結(jié)果見圖3。實施例5去甲淫羊藿素抑制人微血管內(nèi)皮細胞體外形成管狀結(jié)構(gòu)的試驗(參見FajardoLF,etal.,LabInvest,1988Jun;58(6):718-724)。內(nèi)皮細胞在基質(zhì)膠中可以形成由內(nèi)皮細胞圍成的毛細血管管腔樣結(jié)構(gòu)，然后進行定量計數(shù)，這是測定體外血管生成的一種方法。簡言之，把90pi的基質(zhì)膠(10mg/ml)涂鋪在96孔培養(yǎng)板上，于37。C溫育30分鐘，以促進膠凝。將HMVECs重懸于簡化的生長培養(yǎng)基(1%血清，5單位肝素/ml)，每孔加入10，000個細胞，應(yīng)用不同濃度的去甲淫羊藿素處理HMVEC細胞，并以煙曲霉素(fumagilin，一種確認的血管生成抑制劑)為陽性對照，使終容積為100pl。18小時后，將培養(yǎng)板置于顯微鏡下檢査在基質(zhì)膠中形成管狀結(jié)構(gòu)的情況，結(jié)果見圖4。實施例6細胞毒性試驗(參見CarmichaelJetal.，CancerResearch,1987，47:943-946)使用人腫瘤細胞系進行細胞毒性試驗。人腫瘤細胞系購自ATCC(美國細胞、菌種庫)和NCI(美國國立癌癥研究所)，用含10%FBS(胎牛血清)的DMEM(改良的Eagle培養(yǎng)基)，在含5%C02的37。C孵箱中培養(yǎng)。用胰蛋白酶消化匯合的細胞，經(jīng)培養(yǎng)液洗漆后計數(shù)。向96孔培養(yǎng)板的每孔中加入30006000個細胞，孵育16小時或24小時。然后向孔內(nèi)加入不同濃度的去甲淫羊藿素。繼續(xù)培養(yǎng)72小時后，對藥物處理組細胞和對照組細胞進行MTT(四氮唑藍)試驗。結(jié)果見表l。實施例7應(yīng)用人腫瘤異種移植裸鼠模型進行去甲淫羊藿素的抗腫瘤有效性試驗(1)建立人腫瘤異種移植裸鼠模型(參見HarrisonSDJr.，etal.，JNatlCancerInst，1991，83(20):1509)BALB/c裸小鼠(T淋巴細胞功能缺陷，nu/nu)，雄性，6周齡，購自中科院上海實驗動物中心，在SPF級動物實驗室詞養(yǎng)管理。將5X106個LnCaP、NCI-H23、HCT-116細胞分別懸浮于0.2mlHBSS(Hanks，平衡鹽溶液)或基質(zhì)膠(50:50，V/V)中，皮下接種到36只小鼠的側(cè)腹部區(qū)域。當腫瘤平均直徑達78rnrn時，從中選出16只腫瘤大小為100200,3的小鼠，分為給予15%Captisol(美國CyDex公司開發(fā)的一種載體)配制的去甲淫羊藿素處理組(8只)和只給予載體(15%Captisol)的對照組。為保證去甲淫羊藿素處理組和對照組在處理開始時腫瘤體積分布大致相等，將小鼠分成三類腫瘤體積小(長度〈4mm)，腫瘤體積中等(長度48mm)，腫瘤體積大(長度〉8mm)。(2)裸小鼠腫瘤移植模型的給藥在口服給藥試驗中，將去甲淫羊藿素溶解于15%Captisol中。每日灌飼給予單次劑量200|al藥液(用15%Captisol配制，含5mg去甲淫羊藿素)，連續(xù)5天，休息2天，如此持續(xù)3周；對照組按同樣方法給予載體(Captisol)。小鼠單獨飼養(yǎng)，允許自由采食。(3)抗腫瘤效應(yīng)評價每34天沿兩個垂直方向?qū)δ[瘤進行測量。腫瘤體積根據(jù)以下公式計算V=(a2Xb)/2其中a是腫瘤寬度(較小直徑)，b是長度(較大直徑)。每個腫瘤的相對腫瘤體積(RTV)定義為給定時間點的腫瘤體積與處理開始時腫瘤體積的比值。每個處理組均計算平均RTV和SE。根據(jù)以下公式計算腫瘤生長抑制值(TGI)，判斷抗腫瘤活性TGI(%)=T/CX100%其中T是處理組試驗終點(4周)RTV的平均值，C是對照組試驗終點RTV的平均值。采用美國國立癌癥研究所的最小抗腫瘤活性標準(TGI《42%)。試驗結(jié)束時，將腫瘤切除并在甲醛中固定，進行組織學(xué)觀察。試驗結(jié)果見圖6-圖8。實施例8淫羊藿素在小鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)試驗取4只8周齡BALB/c小鼠(2只雄性和2只雌性)，單次劑量100mg/kg給予淫羊藿素。分別于給藥后0.5、1、3、6、12、24、48、72小時，經(jīng)眼靜脈取血并制得血漿，以測定淫羊藿素的血漿濃度?？陲暯o藥的淫羊藿素在4個小鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)見表2，這些實驗數(shù)據(jù)說明淫羊藿素能在體內(nèi)保持一定的藥物濃度。實施例9給藥后去甲淫羊藿素對小鼠的急性毒性試驗取兩組8周齡的BALB/c小鼠，每組10只(5只雄性和5只雌性)，分別以單次劑量lOOOmg/kg和多次劑量200rag/kg(Q2DX15)給予去甲淫羊藿素(用谷物油或載體配制)，然后分別觀察1周和4周。每二天稱體重。試驗結(jié)束后，將受試小鼠處死，進行病理分析。結(jié)果顯示，以單次劑量lOOOmg/kg和多次劑量200mg/kg(Q2DX15)給予淫羊藿素，均未觀察到毒性，所有受試小鼠生長良好，無一死亡。權(quán)利要求1、一種抗腫瘤藥物，其特征在于該藥物是以去甲淫羊藿素作為有效成分。2、如權(quán)利要求1所述的抗腫瘤藥物，其特征在于該藥物中含有抗腫瘤有效量的去甲淫羊藿素及可藥用載體和/或賦形劑。全文摘要一種以去甲淫羊藿素作為有效成分的抗腫瘤藥物，藥理試驗效果證明去甲淫羊藿素具有抑制細胞脂質(zhì)生成的活性；能通過抑制FAS活性以降低細胞中脂肪酸生成；還具有抑制人微血管內(nèi)皮細胞生長并導(dǎo)致凋亡的作用；對33種腫瘤細胞株的細胞毒性試驗，顯示具有廣譜的抗腫瘤作用；應(yīng)用人腫瘤移植裸鼠模型試驗，對人前列腺癌細胞LnCAP、人肺癌細胞NCI-H23和人結(jié)腸癌細胞HCT-116也都顯示有強烈的抑制腫瘤生長作用。去甲淫羊藿素在小鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)試驗表明在體內(nèi)能保持一定的濃度，有助于抗腫瘤的效果。去甲淫羊藿素對小鼠的急性毒性試驗顯示無毒性。因此去甲淫羊藿素是一種具有很大開發(fā)前景的廣譜抗腫瘤新藥。文檔編號A61P35/00GK101103973SQ20071010645公開日2008年1月16日申請日期2007年5月29日優(yōu)先權(quán)日2006年9月14日發(fā)明者南張,殷正豐申請人:殷正豐;張南