專利名稱：一種抑制乙型肝炎病毒的天然提取物及其主要活性成份的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有防治乙型肝炎病毒作用的天然提取物及其主要活性成份，特別是涉及一種含有以表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)為主要成分的茶多酚的抑制乙型肝炎病毒的天然提取物。
背景技術(shù)：
慢性乙型肝炎病毒感染是危害全世界人民健康的主要問題之一，全球范圍內(nèi)有超過4億人曾經(jīng)是慢性乙肝感染者，盡管推行了廣泛的疫苗免疫計劃，WHO的資料顯示，仍然有5％的慢性感染者。許多資料顯示乙型肝炎病毒在肝硬化和肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要的作用。
目前治療所用的藥物主要是干擾素和拉米呋定類核苷類似物，但是治療的結(jié)果并不是那么理想，干擾素除了存在副作用外，它只對特定癥狀的患者有治療效果；拉米呋定作為一種反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑雖然能有效抑制乙肝病毒的復(fù)制，但隨著療程的進(jìn)展，將出現(xiàn)抗性突變病毒株并導(dǎo)致肝炎的復(fù)發(fā)。盡管一些新的核苷類似物如阿德福韋等顯示出了良好的抗乙型肝炎病毒作用，但隨著療程的進(jìn)展，依然會出現(xiàn)抗藥性突變病毒并導(dǎo)致肝炎的復(fù)發(fā)?？傊?，尋找新的治療方法和新的抗病毒藥物勢在必行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種由綠茶中提取的天然提取物及其主要活性成份，該天然提取物及其主要活性成份能夠抑制乙型肝炎病毒，并且能夠用于預(yù)防及治療乙型肝炎病毒；該提取物的主要成份為非干擾素和核苷類似物的可用于抑制乙型肝炎病毒的活性成份。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用以下的技術(shù)方案本發(fā)明提供的抑制乙型肝炎病毒的天然提取物及其主要活性成份，是由綠茶中提取的天然提取物。所述綠茶提取物中是以茶多酚為主要成份，該提取物中的主要成份是茶多酚，該茶多酚中的主要活性成份為EGCG，即表沒食子兒茶素沒食子酸酯。
本發(fā)明提供的抑制乙型肝炎病毒的天然提取物及其主要活性成份，其在用于防治或替代乙型肝炎病毒的中的用途。
本發(fā)明具有以下的主要優(yōu)點(diǎn)所篩選的物質(zhì)為綠茶的天然提取物(green tea extract，GTE)，其主要成分茶多酚具有抗氧化、抗菌、抗炎癥、抗腫瘤、抗病毒等多種生物學(xué)和藥理學(xué)特性。通過體外實(shí)驗(yàn)我們驗(yàn)證了綠茶提取物體具有抗乙肝病毒的作用，此外，研究顯示茶多酚同時具有抗流感病毒、抗人類免疫缺陷病毒、抗腺病毒等抗病毒作用、抗炎癥反應(yīng)、改善四氯化碳引起的肝損傷及可能對乙型肝炎病毒引起的肝部炎癥也會顯示出保護(hù)的作用。因此，綠茶茶多酚有可能成為乙肝治療的新型藥物。本發(fā)明中我們利用HPLC技術(shù)對綠茶體取物進(jìn)行了分析，證實(shí)了表沒食子兒茶素沒食子酸脂EGCG是該綠茶提取物的主要成份，測定了其細(xì)胞毒性及安全作用濃度范圍。


圖1是GTE對乙肝病毒s抗原(A)和e抗原(B)的抑制作用示意圖。
圖2是EGCG對乙肝病毒s抗原(C)和e抗原(D)e抗原的抑制作用示意圖。
圖3是3TC對乙肝病毒s抗原和e抗原形成的抑制(E)示意圖。
圖4是GTE、EGCG、3TC對HBV DNA復(fù)制的抑制示意圖。其中A圖為GTE和3TC對病毒復(fù)制的抑制作用示意圖。B圖為EGCG對病毒復(fù)制的抑制作用示意圖。
圖5是標(biāo)準(zhǔn)品EGCG(A)和綠茶提取物(B)的高效液相色譜。
圖6是標(biāo)準(zhǔn)品EGCG的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供的抑制乙型肝炎病毒的天然提取物及其主要活性成份，是由綠茶中提取的天然提取物。其中所述的提取物中，其主要成份為茶多酚；該茶多酚中主要成份為EGCG，即表沒食子兒茶素沒食子酸酯。
上述的天然提取物中的茶多酚在應(yīng)用濃度為10～40mg/ml時，能有效抑制乙型肝炎病毒的抗原蛋白表達(dá)、DNA復(fù)制、復(fù)制中間體的形成及共價閉合DNA的形成。
上述的活性成份EGCG，其單體在濃度為6.25～50μM時，能有效抑制乙型肝炎病毒的抗原蛋白表達(dá)、DNA復(fù)制、復(fù)制中間體的形成及共價閉合DNA的形成。
本發(fā)明提供的抑制乙型肝炎病毒的的天然提取物及其主要活性成份，其在用于防治或替代乙型肝炎病毒中的用途。例如在制備用于有效抑制乙型肝炎病毒的抗原蛋白的表達(dá)、抑制病毒DNA的復(fù)制，或者抑制病毒復(fù)制中間體的形成及抑制共價閉合病毒DNA的形成的藥物中的用途。
本發(fā)明利用整合有乙型肝炎病毒基因組的肝細(xì)胞系，通過在培養(yǎng)基中加入待篩選提取物，經(jīng)培養(yǎng)一定時間后，用ELISA和熒光定量PCR技術(shù)分別測定病毒S抗原和e抗原的表達(dá)量及病毒的拷貝數(shù)的變化情況，從而確定待測提取物是否具有抑制乙型肝炎病毒的作用。
本發(fā)明中所用的天然綠茶提取物可采用常規(guī)方法從綠茶中提取，提取方法可選用溶劑萃取法、鹽沉淀法、樹脂分離法或者超臨界萃取法等，具體步驟參考文獻(xiàn)(1.從綠茶葉中提取茶多酚的工藝方法，袁珂，《林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)》，1997/17/01 P 56-60；2.沉淀法提取茶多酚的技術(shù)研究，楊曉林，《現(xiàn)代化工》，1996//05 P 24-26)等。
下面結(jié)合試驗(yàn)及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但不限定本發(fā)明。
本發(fā)明通過技術(shù)方案得以驗(yàn)證采用基因組內(nèi)整合有1.3倍乙肝病毒基因組的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系HepG2-N10，經(jīng)過MTT試驗(yàn)測定藥物的安全濃度，在安全濃度范圍內(nèi)將藥物按不同的濃度配成DMEM培養(yǎng)基，將1×105個/ml細(xì)胞傳入24孔培養(yǎng)板，細(xì)胞數(shù)每孔1×105個，每兩天更換新的含有藥物的培養(yǎng)基1ml，ELISA測定上清中HBsAg和HBeAg中間體表達(dá)情況，熒光定量測定培養(yǎng)上清中的HBV DNA，細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制中間體和細(xì)胞核內(nèi)的cccDNA。
核酸的定量采用基于熒光染料EvaGreenTM的熒光定量，用于熒光定量檢測乙型肝炎病毒HBV，用一對特異性針對乙型肝炎病毒S基因保守序列的PCR引物，其中上游引物HBV-F為5′-ACTTCGCTTCACCTCTGCACG-3′和下游引物HBV-R為5′-GGCAACATACCTTGATAATCCAGA-3′，用該對引物能以HBV基因組為模板擴(kuò)增出大小為412bp的片斷，可用于HBV DNA的熒光定量測定。定量采用的標(biāo)準(zhǔn)品為帶有乙肝病毒基因組的質(zhì)粒，EvaGreenTM為一種專門用于實(shí)時定量PCR試驗(yàn)的DNA熒光試劑，購于Biotium公司。
抗原的測定采用ELISA方法，所用試劑為上海科華公司生產(chǎn)的抗原ELISA檢測試劑盒，按試劑盒說明書操作，測定450nm的OD值，并同時測定630nm吸光值給予矯正。
藥物的細(xì)胞毒性檢測采用常規(guī)的MTT法，MTT(噻唑藍(lán))購于Amersco，用1×PBS配制成50mg/ml，并避光保存于4℃。
一、細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞為HepG2-N10細(xì)胞株，能穩(wěn)定表達(dá)HBsAg，HBeAg以及adw2亞型的病毒Dane顆粒。HepG2-N10細(xì)胞株的培養(yǎng)條件為基本培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基，含有10％胎牛血清，380μg/mL的G418。細(xì)胞培養(yǎng)條件為37℃增濕CO2培養(yǎng)箱，CO2濃度為5％。細(xì)胞生長和試驗(yàn)期間，每日觀察細(xì)胞形態(tài)。當(dāng)細(xì)胞在25cm2培養(yǎng)瓶中生長成均勻單層時，按適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度轉(zhuǎn)接種于96孔或24孔培養(yǎng)板中，進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)和抗病毒試驗(yàn)。
二、藥物配制與存放綠茶提取物購于西安華萃生物技術(shù)公司，其中茶多酚含量＞98％，表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量＞50％.標(biāo)準(zhǔn)品表沒食子兒茶素沒食子酸酯購于杭州禾田生物技術(shù)公司，EGCG含量＞95％。
綠茶提取物(GTE)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)和拉米呋定(3TC)用二甲亞砜(DMSO)分別配成100mg/Ml、1mol/L、1mol/L，儲存于-20℃，臨用前用DMEM(含10％FBS)培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。
三、細(xì)胞毒性試驗(yàn)采用MTT法，將HepG2-N10細(xì)胞傳入96孔培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞數(shù)4×104個，培養(yǎng)基100μl，過夜貼壁生長后，將培養(yǎng)基更換為含有不同濃度藥物的100μl培養(yǎng)基，對照孔加不含藥物的DMSO濃度為0.02％(v/v)的培養(yǎng)基，并設(shè)不加藥物及DMSO的對照孔，每個處理6個重復(fù)，藥物處理三天后，用移液管吸棄培養(yǎng)基，用1×PBS洗細(xì)胞2次，每孔加入50μl的MTT，37℃孵育4h后，加入150μl的DMSO，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)再繼續(xù)孵育2-4小時左右，直至在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，紫色formazan結(jié)晶全部溶解后測定570nm吸光值，抑制率(％)＝(對照孔平均OD值-加藥孔平均OD值)/(對照孔平均OD值-空白孔OD值)×100％。
四、熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制將從大腸桿菌宿主菌中提出的插入有乙肝基因組的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒(質(zhì)粒含量超過109)用紫外分光光度計測定DNA的濃度并換算成拷貝數(shù)，拷貝數(shù)＝(質(zhì)量÷分子量)×6.0×1023，然后進(jìn)行10倍倍比稀釋成107-103濃度梯度，在所述的反應(yīng)條件下進(jìn)行定量PCR儀擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后儀器會自動繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
五、抗病毒試驗(yàn)將HepG2-N10細(xì)胞按1×105個/ml傳入24孔培養(yǎng)板，細(xì)胞數(shù)每孔1×105個，待細(xì)胞貼壁生長后，吸棄培養(yǎng)基，加入含有不同濃度藥物的培養(yǎng)基，每兩天收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，并加入新的含有藥物的培養(yǎng)基1ml，將每次收集的上清于2500rpm離心10分鐘，除去細(xì)胞碎片，保留上清，并將之保存于-20℃，試驗(yàn)結(jié)束后一起進(jìn)行抗原蛋白水平及核酸水平的測定。
1.抗原測定將收集的樣品用1×PBST稀釋至適當(dāng)濃度，使450nm吸收值在0.1和2.0之間，并將結(jié)果換算為抑制率，抑制率(％)＝(對照孔平均OD值-加藥孔平均OD值)/(對照孔平均OD值-空白孔OD值)×100。
2.上清中HBV DNA的定量取24孔培養(yǎng)板收集的上清500μl，用等體積的PEG8000于4℃沉淀后，10000rpm離心20分鐘后棄上清，按改良的高鹽沉淀法提取DNA，提取的DNA室溫干燥后溶解于50μl雙蒸水。取5μl為模板進(jìn)行熒光定量。
EvaGreenTM熒光定量PCR體系為50μl，0.40uM引物HBV-F，0.40uM引物HBV-R，2μl EvaGreen(20x)，模板5μl，dNTP、PCR反應(yīng)緩沖液和taq DNA聚合酶按說明書的量加入。定量擴(kuò)增條件為預(yù)變性94℃，2min；其后為38個循環(huán)的94℃ 15sec；58℃ 30sec；72℃ 30sec；84℃ 3sec；讀板。38個循環(huán)結(jié)束后為16℃ 5sec；熔解曲線繪制從55℃到94℃之間，每隔0.2℃讀板一次，每次持續(xù)2sec。熒光信號收集設(shè)在84℃。熒光定量的結(jié)果換算為每毫升培養(yǎng)基中的DNA拷貝數(shù)(copies/ml)。
六、綠茶提取物及標(biāo)準(zhǔn)品的反相高效液相色譜(HPLC)綠茶提取物及標(biāo)準(zhǔn)品的反相高效液相色譜采用Gilson高效液相檢測系統(tǒng)，柱子為Gilson supeclo column(5μm，4.6mm×250mm)，將綠茶提取物及標(biāo)準(zhǔn)品EGCG用色譜純級甲醇分別配成1.2mg/ml和0.8mg/ml，用0.45μm的微孔過濾膜過濾后，取1μl注射器注入高效液相色譜儀器的加樣孔中，流速為1ml/s，洗脫條件為水∶甲醇∶磷酸＝65∶35∶0.1，設(shè)定時間為15分鐘，檢測波長280nm。
七、試驗(yàn)結(jié)果1對乙肝病毒s抗原的抑制(圖1A，圖2C，圖3)細(xì)胞經(jīng)過不同濃度GTE和EGCG處理后，s抗原的表達(dá)隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，抑制作用也相應(yīng)的增加，40mg/ml的GTE作用六天后，s抗原的抑制率達(dá)99％，91.6ug/ml的EGCG作用六天后，s抗原的抑制率達(dá)85％，而作為陽性對照的拉米呋定對s抗原的抑制率只有20％左右，可見對抗原的表達(dá)抑制并不是很強(qiáng)。
2對乙肝病毒e抗原的抑制(圖1B，圖2D，圖3)細(xì)胞經(jīng)過GTE和EGCG處理后，e抗原的表達(dá)也隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，抑制作用也相應(yīng)的增加，40mg/ml的GTE作用六天后，e抗原的抑制率達(dá)95％，91.6ug/ml的EGCG作用六天后，s抗原的抑制率達(dá)92％。而作為陽性對照的拉米呋定對s抗原的抑制率也不是很高，可見對e抗原的表達(dá)抑制也不是很強(qiáng)，這可能和拉米呋定的作用機(jī)理有關(guān)，拉米呋定主要是抑制乙型肝炎病毒的DNA聚合酶活性，而不是從病毒基因組轉(zhuǎn)錄和蛋白的翻譯水平進(jìn)行抑制。
3對乙肝病毒DNA復(fù)制的抑制(圖4)細(xì)胞經(jīng)過GTE和EGCG處理后六天后，藥物處理孔和對照孔中細(xì)胞分泌的HBV量有明顯差異，40ug/ml的GTE作用六天后，95％的DNA得到了抑制。
而EGCG在所試驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出波動，在較低濃度時能明顯抑制，隨著藥物濃度的增加，HBV DNA的量反而增加，這可能是由于高濃度的EGCG存在細(xì)胞毒性，由于MTT法測定細(xì)胞毒性的局限并沒有檢測到毒性的產(chǎn)生。
作為對照的拉米呋定組，在所試驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)有強(qiáng)烈的抑制乙肝病毒DNA，這和以往的很多報道相似。
4綠茶提取物及標(biāo)準(zhǔn)品的反相高效液相色譜(HPLC)見圖5，HPLC結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)品EGCG的保留時間在5.792分鐘，在綠茶提取物的HPLC圖中有相應(yīng)的峰出現(xiàn)，該峰的峰面積明顯高于其他峰，說明EGCG是該綠茶提取物的主要成分，除了EGCG主峰外，其他的8個未知峰，其中三個峰較為明顯，其他峰含量較低。
八、結(jié)論本發(fā)明利用整合有乙型肝炎病毒基因組的肝細(xì)胞系，通過利用ELISA和熒光定量PCR技術(shù)，驗(yàn)證了綠茶提取物及其主要成分表沒食子兒茶素沒食子酸脂具有抑制乙型肝炎病毒作用，不僅具有抑制抗原表達(dá)水平，而且具有很強(qiáng)的抑制HBV DNA復(fù)制的作用。
同時，我們還測定了兩種藥物的細(xì)胞毒性，確定了安全濃度范圍。
結(jié)合前人的研究和實(shí)際生活中綠茶的多種生物學(xué)活性和醫(yī)療保健作用，我們認(rèn)為以EGCG為主要成分的綠茶提取物有望成為治療乙型肝炎的另一種替代或輔助治療藥物。
最后，為了對綠茶體取物質(zhì)量進(jìn)行把握，我們利用HPLC技術(shù)對藥物進(jìn)行分析，證實(shí)EGCG確為綠茶提取物的主要成分(見圖5)。
標(biāo)準(zhǔn)品EGCG的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖6。
權(quán)利要求
1.一種抑制乙型肝炎病毒的天然提取物及其主要活性成份，其特征是一種綠茶的天然提取物；該提取物中的主要成份是茶多酚，該茶多酚中的主要活性成份為EGCG，即表沒食子兒茶素沒食子酸酯。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制乙型肝炎病毒的天然提取物及其主要活性成份，其特征是天然提取物中茶多酚的應(yīng)用濃度為10～40mg/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制乙型肝炎病毒的天然提取物及其主要活性成份，其特征是所述的活性成份EGCG，其單體的應(yīng)用濃度為6.25～50μM。
4.一種權(quán)利要求1、2或3所述的抑制乙型肝炎病毒的天然提取物及其主要活性成份，其在用于預(yù)防及治療乙型肝炎病毒中的用途。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征是用于抑制乙型肝炎病毒的抗原蛋白的表達(dá)、抑制病毒DNA的復(fù)制，或者抑制病毒復(fù)制中間體的形成及抑制共價閉合病毒DNA的形成的預(yù)防及治療中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供一種抑制乙型肝炎病毒的天然提取物及其主要活性成份，具體是一種綠茶提取物，其主要成份是茶多酚，茶多酚的主要成份為EGCG即表沒食子兒茶素沒食子酸酯。所述的天然提取物及其主要活性成份具有用于防治或替代乙型肝炎病毒的用途。本發(fā)明通過ELISA和熒光定量PCR技術(shù)，利用整合有乙型肝炎病毒基因組的肝細(xì)胞系，驗(yàn)證了綠茶提取物及其主要活性成份EGCG具有抑制乙型肝炎病毒的作用，不僅具有抑制抗原表達(dá)水平，而且具有很強(qiáng)的抑制HBV DNA復(fù)制的作用，同時結(jié)合前人的研究和實(shí)際生活中綠茶的多種生物學(xué)活性和醫(yī)療保健作用，我們認(rèn)為本天然提取物及其主要活性成份有望成為治療乙型肝炎的另一種替代或輔助治療藥物。
文檔編號A61K31/352GK101028382SQ20071005176
公開日2007年9月5日 申請日期2007年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月29日
發(fā)明者王華林, 許君, 鄧菲, 胡志紅 申請人:中國科學(xué)院武漢病毒研究所