專利名稱：對趨化因子受體cxcr4具有表型敲除效應(yīng)的重組蛋白及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種對趨化因子受體CXCR4具有表型敲除效應(yīng)的重組蛋白(命名為54R/Tat/KDEL)及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
乳腺癌等惡性腫瘤高轉(zhuǎn)移性是致使患者病情發(fā)展、難治、惡化乃至死亡的重要原因。有效防止、延緩或阻斷腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移是提高相關(guān)腫瘤患者生存率的關(guān)鍵。人們已經(jīng)注意到許多惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移并非隨機(jī)遷徙，而是有其固有遷移路徑和特定器官。有多種學(xué)說試圖解釋這種現(xiàn)象。其中“土壤學(xué)說”假設(shè)不同器官提供適合特定癌細(xì)胞生長的特殊微環(huán)境；“返巢學(xué)說”則認(rèn)為不同器官具有識別、吸引或捕捉特定癌細(xì)胞的能力。但對引起此現(xiàn)象的內(nèi)在機(jī)制一直缺乏有說服力的解釋。2001年Muller等在《自然》雜志首次發(fā)表的關(guān)于趨化因子受體CXCR4(CXC chemokine receptor 4)與其特異性配體基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF-1，Stromal cell-derived factor-1)相互作用密切介導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移的研究成果為“返巢學(xué)說”提供了有力證據(jù)。他們證實(shí)CXCR4在人類乳腺癌細(xì)胞及其轉(zhuǎn)移瘤的表達(dá)水平顯著高于正常乳腺細(xì)胞；與此相應(yīng)，SDF-1在乳腺癌常規(guī)轉(zhuǎn)移器官，如肺、肝、骨髓、淋巴結(jié)中高水平表達(dá)，而在非常規(guī)性轉(zhuǎn)移器官的表達(dá)水平卻很低；阻斷CXCR4與SDF-1的相互作用能有效削弱乳腺癌細(xì)胞向局部淋巴結(jié)和肺組織的轉(zhuǎn)移。由此他們提出了CXCR4與SDF-1相互作用支配乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行多步驟有序的轉(zhuǎn)移模式(Muller A.，et al.Involvement ofchemokine receptors in breast cancer metastasis.Nature 2001；410(6824)50-56)。相繼人們也發(fā)現(xiàn)卵巢癌(Chris J.Scotton，et al.Cancer Research 2002；62(20)5930-5938.Porcile C，et al.Ann N Y Acad Sci.2004；1030162-169)、小細(xì)胞性肺癌(Takashi Kijima，et al.Cancer Research 2002；62(21)6304-6311)、前列腺癌(Russell S.Taichman，et al.Cancer Res.2002；62(6)1832-1837)、橫紋肌肉瘤(Jolanta Libura，et al.Blood 2002；100(7)2597-2606.)、腎透明細(xì)胞肉瘤(PeterStaller，et al.Nature 2003；425(6955)307-311)、多發(fā)性骨髓瘤(Marisa et al.Experimental Cell Research 2004；294(2)571-580)、子宮內(nèi)膜癌(Yayoi Mizokami，et al.J.Cancer2004；110652-659)、胰腺癌(Sato N，etal.Cancer Biol Ther.2005，Jan 15；4(1))、骨肉瘤(Perissinotto E，et al.Clin CancerRes.2005；15490-497)等存在與乳腺癌相似的轉(zhuǎn)移模式。
CXCR4/SDF-1驅(qū)動(dòng)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移模式的提出無疑為乳腺癌等惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的有效防治開拓出嶄新思路。而如何消除原發(fā)灶與遠(yuǎn)程特定轉(zhuǎn)移器官之間固有的SDF-1梯度，阻斷其與CXCR4相互作用則是利用CXCR4/SDF-1這一新靶點(diǎn)提高防治腫瘤轉(zhuǎn)移有效性的關(guān)鍵。90年代末，人們意外發(fā)現(xiàn)CXCR4是X4HIV-1入侵T細(xì)胞的重要輔助受體，封閉CXCR4可有效保護(hù)T細(xì)胞免遭X4HIV-1的感染。這在艾滋病病毒感染機(jī)制研究領(lǐng)域的突破性進(jìn)展促進(jìn)了CXCR4拮抗劑的研發(fā)速度(Craig Gerard，et al.Nature immunity 2001；2(2)108-115)。而在此方面的成果也為開發(fā)抗乳腺癌等腫瘤轉(zhuǎn)移的CXCR4拮抗劑奠定了基礎(chǔ)。新近證明具有阻斷X4HIV-1感染T細(xì)胞活性的CXCR4拮抗劑T140能有效抑制MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞從植入部位向肺部的轉(zhuǎn)移(Tamamura H，at al.FEBS Letters 2003；550(1-3)79-83)。新近，Liang等運(yùn)用反義RNA技術(shù)構(gòu)建兩種針對乳腺癌細(xì)胞所表達(dá)的CXCR4的isRNA。經(jīng)體外基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型證實(shí)該isRNA可抑制乳腺癌細(xì)胞CXCR4的表達(dá)，進(jìn)而阻止乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移(Liang Z，at al.Cancer Res.2005；65(3)967-71)。
已知SDF-1α的結(jié)構(gòu)分為N-端功能區(qū)、β片層結(jié)構(gòu)和C-端α螺旋結(jié)構(gòu)三個(gè)主要功能區(qū)。N-端功能區(qū)是決定SDF-1α與CXCR4相互作用的親和力和內(nèi)在活性的關(guān)鍵部位，C-端α螺旋結(jié)構(gòu)的作用在于維持SDF-1α構(gòu)象和生物活性(PiusLoescher，et al.Journal of Leukocyte Biology 2001；69881-884)。由此提示，采取基因工程的手段，對SDF-1α的定向遺傳改造，保留其對CXCR4的高親和力，取消其內(nèi)在活性的技術(shù)路線，有可能獲得CXCR4特異性拮抗劑。根據(jù)SDF-1的構(gòu)效關(guān)系，在前期研究中，對人和小鼠SDF-1α基因進(jìn)行定向遺傳改造，保留N-端和β片層結(jié)構(gòu)，去除C-端α-螺旋，獲得CXCR4競爭性拮抗劑SDF-1/54R(專利申請?zhí)?3146833.0)。研究證實(shí)，SDF-1/54R在競爭性拮抗野生型SDF-1α與CXCR4結(jié)合的同時(shí)，還可促進(jìn)CXCR4的內(nèi)在化，導(dǎo)致細(xì)胞膜表面CXCR4迅速消失。但此拮抗作用短暫可逆，隨著細(xì)胞膜上反饋性地CXCR4表達(dá)增強(qiáng)，SDF-1/54R對CXCR4介導(dǎo)細(xì)胞遷徙的抑制效應(yīng)也隨之消失(Cai Shao-hui，et al.Acta Pharmacologica Sinica 2004；25(2)152-160)。由此我們得到啟示欲獲得具有臨床抗乳腺癌轉(zhuǎn)移應(yīng)用價(jià)值的CXCR4拮抗劑，嘗試持久性阻斷CXCR4的技術(shù)路線是十分必要的。
近年來，一系列運(yùn)用細(xì)胞內(nèi)抗體/化學(xué)因子(intrabody/kine)從細(xì)胞內(nèi)抑制蛋白質(zhì)表達(dá)及其功能的細(xì)胞表型修飾技術(shù)相繼問世，并在艾滋病、腫瘤等疾病防治領(lǐng)域顯現(xiàn)出潛在的應(yīng)用前景(Yurong Yang Wheeler，et al.Moleculartherapy 2003；8(3)355-366)。既然內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是大多數(shù)蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)加工成熟的核心細(xì)胞器，故最常用方法就是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將intrabody/kine定向?qū)雰?nèi)質(zhì)網(wǎng)。通過定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的intrabody/kine特異性地識別和捕獲目標(biāo)蛋白，加速其降解，阻斷其在細(xì)胞膜上表達(dá)或向胞外分泌的通路?；贑XCR4是HIV-1入侵T細(xì)胞最重要輔助受體之一的事實(shí)，Chen等證明轉(zhuǎn)染SDF intrakine重組質(zhì)粒的T細(xì)胞其胞膜CXCR4表達(dá)顯著降低，且能有效抵抗HIV病毒的感染(Chen JD，et al.Nature Medicine 1997；3(10)1110-1116)。Onai等用另一種SDF-1αintrakine重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠骨髓造血干細(xì)胞，結(jié)果使其CXCR4表達(dá)明顯減少，SDF-1α誘導(dǎo)的脾細(xì)胞和骨髓細(xì)胞遷移明顯抑制(Onai N，et al.Blood2000；96(6)2074-2080.)。另據(jù)報(bào)道，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位片段的介導(dǎo)下，SDF-1intrakine可致人T淋巴細(xì)胞白血病CEM和Jurkat細(xì)胞系以及HeLa-T4+細(xì)胞等表面CXCR4的表達(dá)阻斷或大量下調(diào)(Engle，B.C.Mol.Ther.2000；1165-170)。由此可見，將intrakine細(xì)胞表型修飾技術(shù)用于持久性阻斷乳腺癌細(xì)胞CXCR4的表達(dá)不失為一種新思路。但考慮到現(xiàn)行轉(zhuǎn)基因方法在整體應(yīng)用方面存在諸多局限，因此如何保證將具有CXCR4拮抗作用的蛋白有效導(dǎo)入細(xì)胞是實(shí)現(xiàn)這一新思路的關(guān)鍵。
新近發(fā)現(xiàn)一類稱為細(xì)胞穿膜肽(CPP，cell penetrating peptide)的小分子肽類化合物可通過無受體介導(dǎo)、無耗能的方式將某些多肽或蛋白質(zhì)有效導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞(Schwarze SR，et al.Trends Pharmacol Sci.2000；21(2)45-48)。源于HIV轉(zhuǎn)錄活化因子Tat蛋白的Tat(47～57)片段(GRKKRRQRRRPPQ)被認(rèn)為是迄今發(fā)現(xiàn)的穿膜功能最強(qiáng)的穿膜肽(Nagahara H，at al.Nat Med 1998；4(12)1449-1452)。其穿膜特點(diǎn)是①廣譜、高效、快速；②在一定范圍內(nèi)對溫度、時(shí)間及其濃度不敏感；③不受組織特異性的限制；④在一定濃度范圍內(nèi)不會(huì)造成細(xì)胞損傷。依據(jù)Tat(47～57)的穿膜特點(diǎn)，我們設(shè)想，利用穿膜肽Tat(47～57)作為跨膜載體，則有可能將CXCR4拮抗蛋白直接導(dǎo)入細(xì)胞。此外，已知KDEL片段具有特異性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位功能，這為促使已進(jìn)入胞內(nèi)的CXCR4拮抗蛋白能夠特異定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)提供了可能(Bu，G.，et al.J.Cell Sci.1997(110)65-73.Townsley，F(xiàn).M.，et al.1993，EMBO J.122821-2829.Barbara C.Engel，t al.Molecular Therapy 2000；1(2)165-170)。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明的首要目的在于提供一種對趨化因子受體CXCR4具有表型敲除效應(yīng)的重組蛋白54R/Tat/KDEL。本發(fā)明對基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1突變體SDF-1/54R進(jìn)行二次基因改造，即通過將其與高效穿膜載體Tat(47～57)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位片段KDEL連接而形成能對腫瘤細(xì)胞所表達(dá)的趨化因子受體CXCR4(CXC chemokine receptor 4)產(chǎn)生表型敲除效應(yīng)的重組蛋白。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述對趨化因子受體CXCR4具有表型敲除效應(yīng)的重組蛋白54R/Tat/KDEL的構(gòu)建方法。
本發(fā)明對具有CXCR4拮抗活性的SDF-1α的重組突變子SDF-1/54R進(jìn)行二次基因改造，構(gòu)建和制備一種由SDF-1/54R(SDF-1α去除C端54個(gè)堿基的重組突變子)、高效穿膜載體Tat(47～57)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位片段KDEL三種短肽片段共同組成的重組蛋白54R/Tat/KDEL。利用Tat(47～57)的高效穿膜功能和KDEL的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位作用，將CXCR4特異性拮抗劑SDF-1/54R導(dǎo)入乳腺癌細(xì)胞，達(dá)到對其膜表面CXCR4進(jìn)行表型敲除的目的，從而為最終實(shí)現(xiàn)有效阻斷乳腺癌轉(zhuǎn)移奠定必要的工作基礎(chǔ)。
本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種對趨化因子受體CXCR4具有表型敲除效應(yīng)的重組蛋白54R/Tat/KDEL，該重組蛋白由SDF-1/54R(SDF-1α去除C端54個(gè)堿基的重組突變子)、HIV(人類免疫缺陷病毒)Tat(47～57)和KDEL片段三部分組成，其核苷酸編碼序列為aagcccgtca gcctgagcta cagatgccca tgccgattct tcgaaagcca tgttgccaga 60gccaacgtca agcatctcaa aattctcaac actccaaact gtgcccttca gattgtagcc 120cggctgaaga acaacaacag acaagtgtgc attgacccga agctaaagtg gattcaggag 180tacctggaga aagctttaaa caagggatcc tacggccgta agaagcgccg ccagcgccgt 240cgtaaggacg agctc 255
所述的對趨化因子受體CXCR4具有表型敲除效應(yīng)的重組蛋白54R/Tat/KDEL氨基酸序列為Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu15 10 15Ser His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn20 25 30Thr Pro Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn35 40 45Asn Arg Gln Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu50 55 60Tyr Leu Glu Lys Ala Leu Asn Lys Gly Ser Tyr Gly Arg Lys Lys65 70 75Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Asp Glu Leu80 85其中，SDF-1/54R為中國申請專利的天然SDF-1α的重組突變子(專利申請?zhí)?3146833.0)，研究證實(shí)其具有CXCR4競爭拮抗活性，利用結(jié)構(gòu)中Tat(47～57)的高效穿膜功能和KDEL片段的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位作用，SDF-1/54R可被導(dǎo)入細(xì)胞，定位內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，發(fā)揮捕獲CXCR4蛋白質(zhì)前體的作用，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對CXCR4的表型敲除。
上述對趨化因子受體CXCR4具有表型敲除效應(yīng)的重組蛋白54R/Tat/KDEL的構(gòu)建方法，包括如下步驟按照編碼Tat(47～57)和KDEL片段的核酸序列人工合成兩條單鏈寡核苷酸；在95℃下變性5min后，人工合成的單鏈寡核苷酸自然冷卻至室溫，即退火形成雙鏈寡核苷酸；然后利用BamHI和XhoI雙酶切，將酶切后的雙鏈寡核苷酸定向插入到已含有SDF-1/54R的原核表達(dá)載體pET-28a(+)中(3’-末端)，構(gòu)建成帶His-Tag的54R/Tat/KDEL原核表達(dá)克隆載體；將帶His-Tag的54R/Tat/KDEL原核表達(dá)克隆載體轉(zhuǎn)入克隆菌株JM109，擴(kuò)增并提取重組質(zhì)粒，經(jīng)過測序鑒定后轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株大腸桿菌BL21(DE3)，用IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，最后獲得裂解菌體上清液，并通過Ni親和柱獲得C端帶His-Tag的重組蛋白54R/Tat/KDEL。目標(biāo)蛋白的N-端帶有啟始密碼子翻譯的甲硫氨酸(M)和為了保證閱讀框正確而添加的丙氨酸(A)，C-端帶有XhoI酶切位點(diǎn)編碼的亮氨酸(L)、谷氨酸(E)和6個(gè)組氨酸(H)。其氨基酸序列如下MAKPVSLSYRCPCRFFESHVARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKNNNRQVCIDPKLKWIQEYLEKALNKGSYGRKKRRQRRRKDELLEHHHHHH。
所述兩條單鏈寡核苷酸如下A5’-GATCCTACGGCCGTAAGAAGCGCCGCCAGCGCCGTCGTAAGGACGAGCTCC-3’；B5’-TCGAGGAGCTCGTCCTTACGACGGCGCTGGCGGCGCTTCTTACGGCCGTAG-3’。
所述Tat(47～57)的N-端帶有BamHI酶切位點(diǎn)，所述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位片段KDEL的C-端帶有XhoI酶切位點(diǎn)。
利用穩(wěn)定高表達(dá)CXCR4的人白血病T淋巴細(xì)胞MOLT-4在體外證實(shí)，54R/Tat/KDEL能夠?qū)⒑铣傻腃XCR4定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，對MOLT-4(人白血病T淋巴細(xì)胞)細(xì)胞表面所表達(dá)的CXCR4具有表型敲除作用(如圖7所示)；并利用高表達(dá)CXCR4的人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231，在細(xì)胞水平證實(shí)54R/Tat/KDEL對CXCR4介導(dǎo)的SDF-1趨化作用具有抑制活性(如圖8所示)。
本發(fā)明首次采取對乳腺癌細(xì)胞所表達(dá)的CXCR4進(jìn)行表型敲除的策略來抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移。借鑒intrakine和穿膜肽的最新研究成果，對具有CXCR4拮抗活性的SDF-1α的重組突變子SDF-1/54R進(jìn)行二次基因改造，構(gòu)建由SDF-1/54R與高效穿膜載體Tat(47～57)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位片段KDEL共同組成的重組蛋白54R/Tat/KDEL。其中的TAT可以把融合蛋白帶入細(xì)胞，KDEL可以使融合蛋白定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，SDF-1/54可以與新合成的CXCR4結(jié)合，使CXCR4也定位在此，從而靶向敲除細(xì)胞表面的CXCR4，抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果本發(fā)明運(yùn)用關(guān)于CXCR4與SDF-1相互作用支配腫瘤細(xì)胞多步驟有序轉(zhuǎn)移的理論，選擇CXCR4為靶標(biāo)原創(chuàng)性提出在蛋白水平上通過對乳腺癌細(xì)胞胞膜表面CXCR4進(jìn)行表型敲除來抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的策略，借鑒intrakine和穿膜肽的研究成果，構(gòu)建具有細(xì)胞CXCR4表型敲除功能的重組蛋白54R/Tat/KDEL。本發(fā)明利用Tat(47～57)的高效穿膜功能和KDEL的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位作用，將CXCR4特異性拮抗劑SDF-1/54R導(dǎo)入乳腺癌細(xì)胞，達(dá)到對其細(xì)胞膜表面CXCR4進(jìn)行表型敲除的目的，為最終實(shí)現(xiàn)有效阻斷乳腺癌轉(zhuǎn)移奠定必要的工作基礎(chǔ)。本發(fā)明的重組蛋白的活性已在體外得到證實(shí)，本發(fā)明的重組蛋白制備成基因工程藥物，相對于化學(xué)合成藥物還具有科技含量高、投資效益大、符合環(huán)保要求等特點(diǎn)。


圖1為本發(fā)明54R/Tat/KDEL嵌合重組體的構(gòu)建方案圖。
圖2為54R/Tat/KDEL/pET28-a(+)的PCR鑒定結(jié)果圖。
圖3為54R/Tat/KDEL/pET28-a(+)測序結(jié)果圖。
圖4為重組蛋白54R/Tat/KDEL的表達(dá)結(jié)果圖。
圖5為重組蛋白54R/Tat/KDEL的Western Blot驗(yàn)證結(jié)果圖。
圖6為重組蛋白54R/Tat/KDEL的純化結(jié)果圖。
圖7為54R/Tat/KDEL使MOLT-4細(xì)胞表面CXCR4敲除結(jié)果圖。
圖8為54R/Tat/KDEL抑制SDF-1α誘導(dǎo)的T細(xì)胞遷徙結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
實(shí)施例1 重組蛋白54R/Tat/KDEL的原核表達(dá)系統(tǒng)建立1)Tat(47～57)穿膜肽和KDEL片段的合成在www.pubmed.com網(wǎng)站查找編碼Tat(47～57)和KDEL片段的核酸序列，按照BamHI-TAT-KDEL-XhoI依次串聯(lián)的順序人工合成兩條單鏈寡核苷酸，兩條鏈序列反向互補(bǔ)，在95℃下變性5min后，人工合成的單鏈寡核苷酸自然冷卻至室溫，即退火形成雙鏈寡核苷酸。所述兩條單鏈寡核苷酸如下A5’-GATCCTACGGCCGTAAGAAGCGCCGCCAGCGCCGTCGTAAGGACGAGCTCC-3’；B5’-TCGAGGAGCTCGTCCTTACGACGGCGCTGGCGGCGCTTCTTACGGCCGTAG-3’。
其中，高效穿膜載體Tat(47～57)的N-端帶有BamHI酶切位點(diǎn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位片段KDEL的C-端帶有XhoI酶切位點(diǎn)。
2)將上述雙鏈寡核苷酸和已含有SDF-1/54R的原核表達(dá)載體pET-28a(+)同步用BamHI和XhoI雙酶切，回收的酶切產(chǎn)物采用T4連接酶進(jìn)行連接，將TAT-KDEL定向插入到SDF-1/54R/pET-28a(+)中(3’-末端)，構(gòu)建成帶His-Tag的54R/Tat/KDEL原核表達(dá)載體。將連接產(chǎn)物用CaCl2法轉(zhuǎn)入100ul感受態(tài)菌株JM109，篩選陽性克隆，擴(kuò)增并按質(zhì)粒提取試劑盒的操作說明提取重組質(zhì)粒，DNA自動(dòng)測序儀(上海生工)測序鑒定證實(shí)54R/Tat/KDEL/pET-28a(+)重組體構(gòu)建成功。54R/Tat/KDEL嵌合重組體的構(gòu)建方案如圖1所示，54R通過BamHI酶切位點(diǎn)與TAT-KDEL順次連接。54R/Tat/KDEL/pET-28a(+)的PCR鑒定結(jié)果如圖2所示(其中1.Marker；2-5.54R/Tat/KDEL)。54R/Tat/KDEL/pET-28a(+)測序結(jié)果如圖3所示(測序引物為T7 promoter primer和T7 terminator primer，ABIDNA自動(dòng)測序儀，上海生工測定)。
實(shí)施例2 54R/Tat/KDEL/pET-28a(+)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21及IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和純化取經(jīng)測序鑒定正確的54R/Tat/KDEL/pET-28a(+)重組質(zhì)粒約200ng加入200ul感受態(tài)BL21(DE3)細(xì)菌中(氯化鈣法制備)，輕輕混勻，在冰上放置30min，然后在42℃熱休克90sec，立即轉(zhuǎn)到冰上放置2min，隨后加入800ul LB培養(yǎng)液在37℃條件下振蕩培養(yǎng)45min，取200ul鋪到含50ug/ml卡那霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜(約12hr)，隨機(jī)挑取5個(gè)陽性菌落分別接種于5ml的LB液體培養(yǎng)基(含50ug/ml卡那霉素)37℃振蕩培養(yǎng)約12hr，然后分別取50ul上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于50ml的LB液體培養(yǎng)基(含50ug/ml卡那霉素)37℃振蕩培養(yǎng)約3hr，當(dāng)OD600＝0.5時(shí)，分別加入終濃度為1.0mM的IPTG 37℃誘導(dǎo)表達(dá)3hr，10000×g離心5min收獲細(xì)菌。54R/Tat/KDEL融合蛋白表達(dá)結(jié)果如圖4所示(1.Marker；2.pET-28a(+)上清；3.pET-28a(+)沉淀；4.54R/Tat/KDEL/pET-28a(+)上清；5.54R/Tat/KDEL/pET-28a(+)沉淀)。54R/Tat/KDEL融合蛋白Western Blot驗(yàn)證結(jié)果如圖5所示(1-4.54R/Tat/KDEL；5.pET-28a(+))。然后按鎳固相親和層析樹脂(Invitrogen，Catalog nos.R801-01，R801-15)操作說明的Native protocol進(jìn)行純化，具體操作如下1)離心收集細(xì)菌，將沉淀重懸于8ml溶菌酶裂解緩沖液(50mM Tris-HClpH 9.0，0.1mg/ml溶菌酶，1％曲拉通X-100)中。
2)在冰上超聲處理細(xì)菌裂解液3sec，間隔3sec，重復(fù)100次。
3)15000×g離心15min，將上清轉(zhuǎn)入干凈的離心管中，取5μl裂解液上清用作SDS-PAGE檢測樣品。
4)將8ml上清液加入2ml非變性結(jié)合緩沖液(20mM NaPO4，pH 8.0，500mM NaCl)平衡的鎳固相親和層析樹脂中。
5)室溫下靜置結(jié)合30min，800×g離心5min，吸取上清液。
6)用4ml非變性結(jié)合緩沖液(20mM NaPO4，pH 8.0，500mM NaCl)重懸沉淀，在室溫下振蕩洗滌2min，800g離心5min，小心吸取上清液，并取50μl上清用作SDS-PAGE檢測樣品。此步驟重復(fù)一次。
7)用8ml非變性洗滌緩沖液(20mM咪唑，20mM NaPO4，pH 8.0，500mM NaCl)重懸沉淀，在室溫下振蕩洗滌2min，800g離心5min，小心吸取上清液，并取50μl上清用作SDS-PAGE檢測樣品。此步驟重復(fù)三次。
8)用8ml洗脫緩沖液(250mM咪唑，20mM NaPO4，pH 8.0，500mMNaCl)重懸沉淀，在室溫下振蕩洗滌2min，800g離心5min，小心吸取上清于干凈的離心管中，并取50μl上清用作SDS-PAGE檢測樣品，其余保存于-80℃或進(jìn)行如下操作。
9)將重組蛋白溶液裝入透析帶中，用PBS透析兩次，每次12hr。
10)然后將透析袋內(nèi)的重組蛋白溶液轉(zhuǎn)移到超濾離心管中進(jìn)行低溫脫鹽。
重組蛋白54R/Tat/KDEL的純化結(jié)果如圖6所示(1.Marker；2.3.54R/Tat/KDEL)。
實(shí)施例3 54R/Tat/KDEL體外CXCR4的表型敲除活性研究1)54R/Tat/KDEL進(jìn)入細(xì)胞的活性研究用54R/Tat/KDEL處理MOLT-4細(xì)胞24h，經(jīng)過SDF-1-熒光抗體染色，用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀鑒定其侵入細(xì)胞的效率，結(jié)果顯示隨濃度的增加和時(shí)間的延長侵入細(xì)胞的54R/Tat/KDEL增加。
2)亞細(xì)胞定位研究用54R/Tat/KDEL處理MOLT-4細(xì)胞24h，經(jīng)抗SDF-1和CXCR4-熒光抗體染色后，再用ConA標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，共聚焦顯微鏡顯示54R/Tat/KDEL和CXCR4共同定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。
3)表型敲除活性研究用54R/Tat/KDEL處理MOLT-4細(xì)胞24h后，用PBS洗兩次，用抗CXCR4-PE熒光抗體冰上孵育30min后，再用PBS洗兩次，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞膜表面CXCR4的表達(dá)量，結(jié)果表明細(xì)胞表面的CXCR4表達(dá)量明顯降低。54R/Tat/KDEL使MOLT-4細(xì)胞表面CXCR4敲除結(jié)果如圖7所示(a.陽性對照，高表達(dá)CXCR4的MOLT-4細(xì)胞，PE染色；b.54R/Tat/KDEL)。
4)54R/Tat/KDEL對SDF-1趨化作用的抑制活性研究用10-9M，10-8M，10-7M，10-6M，10-5M不同濃度的54R/Tat/KDEL預(yù)處理乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞24h。將含有SDF-1(終濃度1nM)的1640培養(yǎng)基(700μl)加入趨化小室的下層培養(yǎng)腔，小心將上腔置入下層培養(yǎng)腔，并使之腔底懸浮于下腔之中。將預(yù)處理的MDA-MB231細(xì)胞懸液加入上腔，于37℃培養(yǎng)3小時(shí)后，記數(shù)轉(zhuǎn)移到下腔的細(xì)胞數(shù)。結(jié)果顯示與未經(jīng)預(yù)處理的細(xì)胞相比，用54R/Tat/KDEL處理的MDA-MB-231細(xì)胞對SDF-1誘導(dǎo)的趨化遷移有顯著的抑制作用。54R/Tat/KDEL抑制SDF-1α誘導(dǎo)的T細(xì)胞遷移結(jié)果如圖8所示。
上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
SEQUENCE LISTING<110>暨南大學(xué)<120>對趨化因子受體CXCR4具有表型敲除效應(yīng)的重組蛋白及其構(gòu)建方法<130>26<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>255<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>對趨化因子受體CXCR4具有表型敲除效應(yīng)的重組蛋白54R/Tat/KDEL核苷酸編碼序列<400>1aagcccgtca gcctgagcta cagatgccca tgccgattct tcgaaagcca tgttgccaga 60gccaacgtca agcatctcaa aattctcaac actccaaact gtgcccttca gattgtagcc 120cggctgaaga acaacaacag acaagtgtgc attgacccga agctaaagtg gattcaggag 180tacctggaga aagctttaaa caagggatcc tacggccgta agaagcgccg ccagcgccgt 240cgtaaggacg agctc255
<210>2<211>85<212>PRT<213>Artificial sequence<220>
<223>對趨化因子受體CXCR4具有表型敲除效應(yīng)的重組蛋白54R/Tat/KDEL氨基酸序列<400>2Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu15 10 15Ser His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn20 25 30Thr Pro Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn35 40 45Asn Arg Gln Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu50 55 60Tyr Leu Glu Lys Ala Leu Asn Lys Gly Ser Tyr Gly Arg Lys Lys65 70 75Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Asp Glu Leu80 8權(quán)利要求
1.一種對趨化因子受體CXCR4具有表型敲除效應(yīng)的重組蛋白，所述重組蛋白由SDF-1/54R、人類免疫缺陷病毒HIV Tat(47～57)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位片段KDEL片段三部分組成，其特征在于所述重組蛋白的核苷酸編碼序列為aagcccgtca gcctgagcta cagatgccca tgccgattct tcgaaagcca tgttgccaga 60gccaacgtca agcatctcaa aattctcaac actccaaact gtgcccttca gattgtagcc 120cggctgaaga acaacaacag acaagtgtgc attgacccga agctaaagtg gattcaggag 180tacctggaga aagctttaaa caagggatcc tacggccgta agaagcgccg ccagcgccgt 240cgtaaggacg agctc 255。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的對趨化因子受體CXCR4具有表型敲除效應(yīng)的重組蛋白，其特征在于所述重組蛋白的氨基酸序列為Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu1 5 10 15Ser His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn20 25 30Thr Pro Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn35 40 45Asn Arg Gln Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu50 55 60Tyr Leu Glu Lys Ala Leu Asn Lys Gly Ser Tyr Gly Arg Lys Lys65 70 75Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Asp Glu Leu80 85。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的對趨化因子受體CXCR4具有表型敲除效應(yīng)的重組蛋白的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟按照編碼高效穿膜載體Tat(47～57)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位片段KDEL片段的核酸序列人工合成兩條單鏈寡核苷酸；在95℃下變性5min后，人工合成的單鏈寡核苷酸冷卻至室溫，即退火形成雙鏈寡核苷酸；然后用BamHI和XhoI雙酶切，將酶切后的雙鏈寡核苷酸定向插入到已含有SDF-1/54R的原核表達(dá)載體pET-28a(+)中，構(gòu)建成帶His-Tag的原核表達(dá)克隆載體；將帶His-Tag的原核表達(dá)克隆載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)克隆菌株JM109，擴(kuò)增并提取重組質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定后轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21，用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，最后獲得裂解菌體上清液，并通過Ni親和柱獲得C端帶His-Tag的重組蛋白
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的對趨化因子受體CXCR4具有表型敲除效應(yīng)的重組蛋白的構(gòu)建方法，其特征在于所述兩條單鏈寡核苷酸如下A5’-GATCCTACGGCCGTAAGAAGCGCCGCCAGCGCCGTCGTAAGGACGAGCTCC-3’；B5’-TCGAGGAGCTCGTCCTTACGACGGCGCTGGCGGCGCTTCTTACGGCCGTAG-3’。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的對趨化因子受體CXCR4具有表型敲除效應(yīng)的重組蛋白的構(gòu)建方法，其特征在于所述高效穿膜載體Tat(47～57)的N-端帶有BamHI酶切位點(diǎn)，所述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位片段KDEL的C-端帶有XhoI酶切位點(diǎn)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種對趨化因子受體CXCR4具有表型敲除效應(yīng)的重組蛋白及其構(gòu)建方法。本發(fā)明對具有CXCR4拮抗活性的SDF－1α的重組突變子SDF－1/54R進(jìn)行二次基因改造，構(gòu)建一種由SDF－1/54R與高效穿膜載體Tat(47～57)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位片段KDEL三種短肽片段共同組成的重組蛋白54R/Tat/KDEL。利用Tat(47～57)的高效穿膜功能和KDEL的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位作用，將CXCR4特異性拮抗劑SDF－1/54R導(dǎo)入乳腺癌細(xì)胞，達(dá)到對其膜表面CXCR4進(jìn)行表型敲除的目的，為最終實(shí)現(xiàn)有效阻斷乳腺癌轉(zhuǎn)移奠定必要的工作基礎(chǔ)。
文檔編號A61P35/00GK101063130SQ20071002771
公開日2007年10月31日 申請日期2007年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月26日
發(fā)明者蔡紹暉, 杜軍, 馬偉峰, 陳宏遠(yuǎn), 蔡紹皙, 譚毅, 郭芝剛 申請人:暨南大學(xué)