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重樓醇提物作為抑制血管生成的應(yīng)用的制作方法

文檔序號:1128761閱讀:371來源:國知局
專利名稱:重樓醇提物作為抑制血管生成的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種重樓醇提物,特別涉及重樓醇提物作為抑制血管生成的應(yīng)用。
背景技術(shù)
腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移依靠新生血管提供營養(yǎng)和轉(zhuǎn)移通道。抑制腫瘤血管生成,與阻斷腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
在本發(fā)明之前,惡性腫瘤的抗血管生成療法,隨著VEGF單克隆抗體獲準FDA應(yīng)用以來,給難治性、耐藥性腫瘤患者帶來了新的希望。但現(xiàn)有的血管生成抑制劑,例如Avastin,Endostatin,因其成本極高,價格昂貴,對于我國絕大多數(shù)腫瘤患者無法承受,使惡性腫瘤的抗血管生成療法無法得到廣泛和實際臨床應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于克服上述缺陷,研制、開發(fā)重樓醇提物在抑制血管生成的中的應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)方案是重樓醇提物作為抑制血管生成的應(yīng)用,其主要技術(shù)步驟為(1)將重樓根莖烘干、粉碎;(2)放入80%酒精中浸泡,加熱至沸騰;(3)過濾得重樓醇提物;(4)將原代分離的人臍靜脈內(nèi)皮細胞在10%胎牛血清的EGM培養(yǎng)液中培養(yǎng);(5)胰酶消化;(6)放入37℃、5%濕化CO2的培養(yǎng)箱中;(7)加入重樓醇提物;本發(fā)明的優(yōu)點和效果在于巧妙地以血管生成作為靶點,應(yīng)用對腫瘤細胞亞細胞毒濃度的重樓醇提物作用于內(nèi)皮細胞,可明顯抑制內(nèi)皮細胞的增殖、遷移及小管形成,促進內(nèi)皮細胞凋亡、抑制內(nèi)皮細胞DNA的合成。重樓醇提物滿足抑制血管生成的條件,即差異細胞毒性,抗血管生成藥物應(yīng)該是其殺傷或抑制內(nèi)皮細胞的藥物劑量低于對腫瘤細胞的毒性劑量;干擾內(nèi)皮細胞功能,抗血管生成藥物應(yīng)該是在尚未引起內(nèi)皮細胞死亡的情況下能夠干擾內(nèi)皮細胞的功能;明確的作用機理,迄今血管生成的基本過程已較明確,采用本發(fā)明的產(chǎn)物制備出的制劑藥物具有抗血管生成效應(yīng),在體內(nèi)抑制血管生成,適合于抗腫瘤血管生成及其他與血管生成有關(guān)疾病的治療,包括可應(yīng)用于腫瘤化療和/或輔助化療。而且價格低廉、適合于臨床應(yīng)用。本發(fā)明指出了重樓醇提物的新用途。
本發(fā)明的其他優(yōu)點和效果將在下面繼續(xù)描述。


圖1——為不同濃度重樓醇提物對人臍靜脈內(nèi)皮細胞和人腸癌LOVO細胞增殖的劑量依賴性抑制作用曲線。
圖2——為不同濃度重樓醇提物處理后人臍靜脈內(nèi)皮細胞小管形成的光學(xué)顯微鏡照片(A-對照,B-重樓60μg/ml,C-重樓30μg/ml,D-重樓15μg/ml)。
圖3——為不同濃度重樓醇提物處理后人臍靜脈內(nèi)皮細胞遷移結(jié)果的光學(xué)顯微鏡照片(A-對照,B-重樓60μg/ml,C-重樓30μg/ml,D-重樓15μg/ml)。
圖4——為不同濃度重樓醇提物處理后人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡的流式檢測圖(A-對照,B-重樓60μg/ml,C-重樓30μg/ml,D-重樓15μg/ml)。
圖5——為不同濃度重樓醇提物處理后人臍靜脈內(nèi)皮細胞周期的流式檢測圖(A-對照,B-重樓60μg/ml,C-重樓30μg/ml,D-重樓15μg/ml)。
圖6——為不同濃度重樓醇提物對雞胚絨毛尿囊膜體內(nèi)血管生長的光學(xué)顯微鏡照片(A-對照,B-重樓60μg/ml,C-重樓30μg/ml,D-重樓15μg/ml)。
圖7——為不同濃度重樓醇提物對荷瘤小鼠腫瘤抑瘤率的影響的光學(xué)顯微鏡照片。
圖8——為不同濃度重樓醇提物對荷瘤小鼠腫瘤微血管密度的影響的免疫組化照片(A-對照組(200×),B-重樓2g/kg(200×))。
圖9——重樓醇提物對荷瘤小鼠腫瘤重量的抑制作用圖。
圖10——重樓醇提物與抑瘤率曲線圖。
具體實施例方式
重樓是天然的延齡草科(Trilliaceae)植物,又名七枝蓮、獨角蓮,分布于云南、廣西等地。
1.1重樓醇提物的提取將重樓根莖在60℃烘箱烘6小時后,粉粹,稱取100g。將藥粉置燒瓶內(nèi)后加入80%酒精800ml浸泡30分鐘,加熱至沸騰,維持2小時。藥液過濾后4℃保存。取80%酒精800ml,加入藥渣中重復(fù)以上提取操作2次。將三次濾出的藥液混勻,藥液倒入蒸發(fā)皿內(nèi)揮發(fā),令其揮干,計算得率,根據(jù)得率配制藥物濃度。
1.2重樓醇提物對人臍靜脈內(nèi)皮細胞和人腸癌LOVO細胞的體外增殖實驗將原代分離的人臍靜脈內(nèi)皮細胞以10%胎牛血清的EGM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。人腸癌LOVO細胞以10%新生牛血清的1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞,用0.05%的胰酶消化后,以2×104cell/mL接種于96孔板,200μl/孔,每組設(shè)3個平行孔,放置于37℃、5%濕化CO2的培養(yǎng)箱中24小時后,加不同濃度的重樓醇提物。
將上述重樓醇提物制備成制劑藥物。
檢測結(jié)果分析如下在進行重樓醇提物對人臍靜脈內(nèi)皮細胞時,同時進行人腸癌LOVO細胞的體外增殖實驗,以加以對照。
設(shè)空白對照孔加完全培養(yǎng)液,實驗對照孔僅加細胞,混勻后置于放置于37℃、5%濕化CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48小時,結(jié)束前4小時加入MTT 20μl/孔,置于培養(yǎng)箱中孵育4小時后棄上清液,每孔加入二甲基亞砜(DMSO)200μl,微型混合器振蕩5-10分鐘,用酶聯(lián)免疫檢測儀于490/630nm波長處測定每孔吸光度OD值,按公式計算抑制率抑制率(%)=(對照組OD值-實驗組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。結(jié)果如圖1所示,表明重樓醇提物對人臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖呈劑量依賴性抑制,和人腸癌LOVO細胞相比有差異的細胞毒性。
2.1重樓醇提物對人臍靜脈內(nèi)皮細胞小管形成的抑制作用24孔培養(yǎng)板每孔加入BD MatrigelTMMatrix原膠300μl,置37℃一小時后聚合成膠,將HUVEC懸液以2×105cell/mL接種于鋪有Mztrigel膠的24孔板中,500μl/孔,設(shè)定對照組、各濃度梯度的用藥組,藥物組加入500μl的含藥培養(yǎng)液,對照組僅加入500μl的培養(yǎng)液。放置于37℃、5%濕化CO2的培養(yǎng)箱中24小時后,光學(xué)顯微鏡下觀察內(nèi)皮細胞小管的形成,每孔取5個隨機視野,數(shù)碼相機拍照,結(jié)果如圖2所示(A-對照,B-重樓60μg/ml,C-重樓30μg/ml,D-重樓15μg/ml),表明重樓醇提物對人臍靜脈內(nèi)皮細胞小管形成能力呈劑量依賴性抑制。
2.2重樓醇提物對人臍靜脈內(nèi)皮細胞遷移能力的抑制作用將8.0μm孔徑的Transwell板內(nèi)套管倒置,在其表面加10μg/ml的纖維粘連蛋白溶液(FN)100μl通風(fēng)櫥中風(fēng)干,PBS漂洗表面,去除多余的結(jié)合蛋白。將已經(jīng)血清饑餓過夜(0.5%胎牛血清)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞消化后調(diào)整細胞密度為4×106/ml,向每個內(nèi)室里面加50μl細胞懸浮液,設(shè)定對照組、各濃度梯度的用藥組,藥物組加入50μl的含藥培養(yǎng)液,對照組僅加入50μl的培養(yǎng)液。下室中加入10%EGM0.6ml。放置于37℃、5%濕化CO2的培養(yǎng)箱中孵育12小時后,用棉簽將微孔膜上表面的細胞除去,下表面用10%的甲醛溶液固定30分鐘,PBS漂洗凈后,結(jié)晶紫染色液(1%結(jié)晶紫2%乙醇100mM硼酸,Ph 9.0)中染色20min,PBS漂洗凈后,將微孔膜剪下,底面朝上貼于載玻片上,光學(xué)顯微鏡下觀察內(nèi)皮細胞的遷移能力,每孔取5個隨機視野,數(shù)碼相機拍照,結(jié)果如圖3所示(A-對照,B-重樓60μg/ml,C-重樓30μg/ml,D-重樓15μg/ml),表明重樓醇提物對人臍靜脈內(nèi)皮細胞的遷移能力呈劑量依賴性抑制。
2.3雙標記流式細胞儀檢測重樓醇提物對人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡率的影響將藥物作用48小時后的人臍靜脈內(nèi)皮細胞用0.05%胰酶消化后,PBS洗滌1000r/min離心5min,去上清,Buffer緩沖液500μl重懸細胞,加入5μlAnnexinV-FITC和5μl PI(凋亡檢測試劑盒),振動后上機檢測。結(jié)果如圖4所示(A-對照,B-重樓60μg/ml,C-重樓30μg/ml,D-重樓15μg/ml),人臍靜脈內(nèi)皮細胞經(jīng)重樓醇提物作用后細胞凋亡率呈劑量依賴性上升。
2.4流式細胞儀分析中藥對人臍靜脈內(nèi)皮細胞周期的影響常規(guī)消化不同濃度作用的人臍靜脈內(nèi)皮細胞1×106個,用PBS洗滌2次,緩沖液洗滌細胞3次,1000r/min離心5min,棄上清,依次加入試劑盒中的溶液A,B,C,各孵育10分鐘,其中溶液C需在冰上避光孵育。孵育結(jié)束后立即上流式細胞儀檢測,應(yīng)用CellQuest軟件分析結(jié)果,記錄細胞不同周期的比例。結(jié)果如圖5所示(A-對照,B-重樓60μg/ml,C-重樓30μg/ml,D-重樓15μg/ml),重樓醇提物抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞DNA的合成,表現(xiàn)為G0-G1期細胞比率增多,而S期、G2-M期細胞比率減少。
2.5重樓醇提物對雞胚絨毛尿囊膜(CAM)體內(nèi)血管生長的抑制作用將雞受精卵在正常孵育條件下孵化,第7天在聚光燈下找出氣室和毛細血管稀疏區(qū)域(此處新生血管形成旺盛)并做出記號。75%乙醇消毒雞卵,在超凈臺內(nèi)于氣室頂端鉆出小孔,在標記區(qū)蛋殼上開窗(直徑約1cm),顯露內(nèi)膜,此時在氣室端小孔負壓吸引,使內(nèi)膜與尿囊膜剝離,撕去內(nèi)膜既可見上有血管生長的尿囊膜。在甲基纖維素薄片上滴加10μl含不同濃度受試藥物的生理鹽水溶液并以不含藥物的生理鹽水為對照,覆于暴露的尿囊膜上。用無菌透明膠布封閉窗孔以免污染。繼續(xù)孵育72小時,每天追加相同劑量的藥品。72小時后解剖雞胚,將薄片周圍3cm直徑區(qū)域內(nèi)的尿囊膜剪下,顯微鏡下觀察薄片周圍毛細血管生長情況。結(jié)果如圖6所示(A-對照,B-重樓60μg/ml,C-重樓30μg/ml,D-重樓15μg/ml),重樓醇提物對雞胚尿囊膜血管形成具有顯著的抑制作用。
2.6荷瘤鼠體內(nèi)實驗在嚴格無菌條件下,抽取接種6d的H22瘤種小鼠的腹水,以生理鹽水稀釋,計數(shù)并調(diào)細胞密度至2.5×1010/L。實驗d1每鼠右側(cè)腋下接種0.2mLH22細胞懸液,建立H22肝癌的荷瘤小鼠模型。接種第2天,將小鼠隨機分為重樓4g/kg、2g/kg、1g/kg、0.5g/kg治療組和對照組,每組5只,每天灌胃給藥,連續(xù)10天后,脫椎處死小鼠,剝離皮下腫瘤,稱重,取部分腫瘤組織做病理切片。腫瘤組織固定于10%多聚甲醛中,石蠟包埋,連續(xù)切片(2μm),切片行免疫組織化學(xué)染色,檢測腫瘤微血管密度(MVD)、增殖細胞核抗原(PCNA)水平。抑瘤率測定給藥前及給藥過程中每兩天,游標卡尺測量瘤結(jié)節(jié)長徑(a)、短徑(b),按公式V=1/2ab2計算體積,繪制腫瘤體積生長曲線。剝離的皮下腫瘤稱重,按下面公式計算瘤重抑制率,瘤重抑制率(%)=(1-治療組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100%。結(jié)果如圖7、9、10所示對照組小鼠瘤結(jié)節(jié)增長較快,而重樓組小鼠瘤結(jié)節(jié)增長緩慢且腫瘤重量明顯低于對照組(P值為0.007)。微血管密度(MVD)的測定結(jié)果如圖8所示(A-對照組(200×),B-重樓2g/kg(200×)),重樓醇提物組的微血管計數(shù)與對照組比較,具有顯著性差異(P值均<0.01=)。
權(quán)利要求
1.重樓醇提物作為抑制血管生成的應(yīng)用,其步驟為(1)將重樓根莖烘干、粉碎;(2)放入80%酒精中浸泡,加熱至沸騰;(3)過濾得重樓醇提物;(4)將原代分離的人臍靜脈內(nèi)皮細胞在10%胎牛血清的EGM培養(yǎng)液中培養(yǎng);(5)胰酶消化;(6)放入37℃、5%濕化CO2的培養(yǎng)箱中;(7)加入重樓醇提物
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重樓醇提物作為抑制血管生成的應(yīng)用,其特征在于重樓醇提物的濃度為60μg/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重樓醇提物作為抑制血管生成的應(yīng)用,其特征在于可應(yīng)用于抗腫瘤血管生成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重樓醇提物作為抑制血管生成的應(yīng)用,其特征在于可應(yīng)用于腫瘤化療和/或輔助化療。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重樓醇提物作為抑制血管生成的應(yīng)用,其特征在于可應(yīng)用于由血管生成引發(fā)的疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及重樓醇提物作為抑制血管生成的應(yīng)用。本發(fā)明將重樓根莖烘干、粉碎,放入80%酒精中浸泡、加熱至沸騰,過濾得重樓醇提物,將原代分離的人臍靜脈內(nèi)皮細胞在10%胎牛血清的EGM培養(yǎng)液中培養(yǎng),胰酶消化,放入37℃、5%濕化CO
文檔編號A61P35/00GK101024031SQ20071002060
公開日2007年8月29日 申請日期2007年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月14日
發(fā)明者錢曉萍, 劉寶瑞, 胡靜 申請人:南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院
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