專利名稱：一種新皂苷化合物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及天然藥物領(lǐng)域，具體涉及從中藥灰氈毛忍冬中提取分離得到的一種新皂苷，其制備方法，以及該新皂苷抑制磷脂酶A2(PLA2)活性和在制備抗炎藥物中的用途。
背景技術(shù)：
灰氈毛忍冬(Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.)為忍冬科Caprifoliaceae忍冬屬植物，具有清熱解毒、抗菌消炎的功效，在中醫(yī)臨床及民間廣泛應(yīng)用于癰腫疔瘡，喉痹，丹毒，熱毒血痢，風(fēng)熱感冒，溫?zé)岚l(fā)病等疾病的治療。2005年新版中國(guó)藥典收載，將其與紅腺忍冬、華南忍冬一同列入山銀花項(xiàng)下。忍冬屬植物中富含皂苷類(lèi)成分，其苷元主要為齊墩果酸和常春藤苷元，這些皂苷?qǐng)?bào)道有抑制磷脂酶A2(PLA2)活性，抗炎Inoue，H.et al.J Pharm pharmacol，1988，40272，抗真菌Favel，A.et al.Planta Medica，1994，6050等作用。江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所在灰氈毛忍冬花及花蕾中，分離得到一個(gè)新皂苷化合物，明確了該化合物的結(jié)構(gòu)，藥理活性和用途。
磷脂酶A2(PLA2)存在于各種生物體中.其生理功能是專一性水解磷脂sn-2脂鍵，使之分解為脂肪酸和溶血磷脂。若脂肪酸為花生四烯酸arachidonic acid，則被環(huán)氧合酶cyclooxygenase和5-脂氧合酶lipoxygenase分別分解為前列腺素prostaglandins和白三烯leukotrienes，前列腺素是炎癥的前體，而白三烯在引發(fā)哮喘的發(fā)病機(jī)理中起著重要的作用；溶血磷脂代謝成的血小板活化因子platelet-activating factor也是導(dǎo)致炎癥的重要介質(zhì)。PLA2處于炎癥調(diào)節(jié)因子生物合成的關(guān)鍵位置.如果能夠有效地抑制PLA2的活性，與炎癥過(guò)程密切相關(guān)的三個(gè)調(diào)節(jié)因子的生物合成都將被抑制。高效專一的PLA2抑制劑有可能發(fā)展成為新型的非甾體抗炎藥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種新皂苷化合物--灰氈毛忍冬皂苷丙及其制備方法以及該新化合物在制備PLA2抑制劑和抗炎藥物的新用途。按照本發(fā)明的新化合物制備成藥物，用于制備PLA2抑制劑和炎癥等相關(guān)疾病的治療。
本發(fā)明的化合物為自中提取、分離、純化得到的這種新皂苷化合物，命名為灰氈毛忍冬皂苷丙。
灰氈毛忍冬皂苷丙，化學(xué)名稱為3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1-3)-α-L-吡喃鼠李糖基(1-2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基-23-乙?；?常春藤皂甙元-28-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖苷。
化學(xué)結(jié)構(gòu)式為 上述灰氈毛忍冬皂苷化合物的制備方法，其特征在于以灰氈毛忍冬干燥花蕾為原料，經(jīng)水或有機(jī)溶劑或混合溶劑提取，水提取液直接過(guò)大孔樹(shù)脂吸附，有機(jī)溶劑或混合溶劑提取液濃縮后加水溶解再經(jīng)大孔樹(shù)脂吸附或正丁醇萃取，大孔樹(shù)脂吸附物或正丁醇萃取物經(jīng)柱層析分離而得。其中，大孔樹(shù)脂包括D101、AB-5、或HP-20；柱層析用單體選自硅膠、氧化鋁、凝膠Sephadex LH-20、聚酰胺和填充料ODS中的一種或幾種；有機(jī)溶劑包括甲醇、乙醇、氯仿或正丁醇；提取溫度低于100℃。
本發(fā)明提供了灰氈毛忍冬皂苷丙與醫(yī)學(xué)上可接受的藥用輔料組成藥物組合物及其制劑。如，片劑、丸劑、膏劑、膠囊劑、口服液、顆粒劑以及注射液粉針劑或水針液。
本發(fā)明提供了灰氈毛忍冬皂苷化合物制備PLA2抑制劑和抗炎藥物的應(yīng)用。在體外，灰氈毛忍冬皂苷丙的IC50值與吲哚PLA2抑制劑的IC50相近，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明灰氈毛忍冬皂苷丙20mg·kg-1和40mg·kg-1兩劑量組可通過(guò)對(duì)PLA2活性的顯著抑制作用，從而減少炎癥介質(zhì)PGE的含量，提示灰氈毛忍冬皂苷丙有類(lèi)似于PLA2抑制劑的作用；此外，40mg·kg-1和80mg·kg-1兩劑量組對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹有明顯的抑制作用。
本發(fā)明公開(kāi)了從灰氈毛忍冬中提取分離的一種常春藤皂苷類(lèi)新化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，以及該化合物制備方法及在醫(yī)藥領(lǐng)域中的用途，尤其在制備磷脂酶A2(PLA2)抑制劑和抗炎藥物的用途。試驗(yàn)證明，在體外，灰氈毛忍冬皂苷丙的IC50值與吲哚PLA2抑制劑的IC50相近，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明灰氈毛忍冬皂苷丙20mg·kg-1和40mg·kg-1兩劑量組可通過(guò)對(duì)PLA2活性的顯著抑制作用，從而減少炎癥介質(zhì)PGE的含量，提示灰氈毛忍冬皂苷丙有類(lèi)似于PLA2抑制劑的作用；此外，40mg·kg-1和80mg·kg-1兩劑量組對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹有明顯的抑制作用，說(shuō)明灰氈毛忍冬皂苷丙可用于PLA2抑制劑和抗炎藥物的開(kāi)發(fā)。
四

圖1為新化合物的ESI(+)-MS譜圖。
圖2為新化合物的ESI(-)-MS譜圖。
圖3為新化合物的1H-NMR譜圖。
圖4為新化合物的13C-NMR譜圖。
圖5為新化合物的COSY譜圖。
圖6為新化合物的HMQC譜圖。
圖7為新化合物的HMBC譜圖。
圖8為新化合物的ROESY譜圖。
圖9為新化合物的提取分離流程圖。
五具體實(shí)施例方式結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不僅僅限于所列舉的實(shí)施方式。本發(fā)明從灰氈毛忍冬干燥花蕾中提取、分離、純化得到的這種皂苷類(lèi)新化合物，命名為灰氈毛忍冬皂苷丙。
1.提取分離本發(fā)明者將灰氈毛忍冬干燥花蕾在本所中試工廠用90％乙醇回流提取濃縮得浸膏，取浸膏依次用石油醚、乙酸乙酯萃取。得石油醚部、乙酸乙酯部和正丁醇部。
正丁醇部用大孔樹(shù)脂進(jìn)行吸附，再以水-乙醇系統(tǒng)分段洗脫，合并含有皂苷的組分，得灰氈毛忍冬總皂苷。所得灰氈毛忍冬總皂苷進(jìn)行硅膠柱層析，流動(dòng)相依次為氯仿-甲醇(10∶1、4∶1、1∶1)、甲醇。其中氯仿-甲醇(2∶1)部分經(jīng)反復(fù)反相柱分離及凝膠柱純化得到單體化合物灰氈毛忍冬皂苷丙。
2.結(jié)構(gòu)鑒定白色粉末(甲醇-水)，[α]D25.9＝-3.7°，mp224～227℃，TLC香草醛-濃硫酸試液加熱顯紫紅色，放置后變藍(lán)。Molish反應(yīng)和Liebermann-Burchard反應(yīng)陽(yáng)性。難溶于氯仿、水，微溶于甲醇，易溶于水-甲醇混合溶液。以上信息提示該化合物為皂苷類(lèi)化合物。ESI(+)-MS顯示分子離子峰為1301[M+Na]+，ESI(-)-MS顯示分子離子峰為1277[M-H]+結(jié)合氫譜和碳譜推測(cè)，分子式C61H98O28，分子量1278。1H-NMR(C5D5N，500MHz)δ0.84，0.85，0.90，1.06，1.06，1.23(3H，s，×6CH3)，1.56(3H，d，J＝6.1Hz，Rha-Me)。分別為常春藤皂苷母核上的6個(gè)甲基的信號(hào)和鼠李糖上甲基的信號(hào)。13C-NMR(C5D5N，500MHz)δ176.5(C-28)，82.3(C-3)，及95-107之間有五個(gè)糖端基碳，顯示化合物在C-28與C-3位上共有五個(gè)糖取代。1H-NMRδ2.0(3H s)以及13C-NMRδ170.6，20.8說(shuō)明該皂苷結(jié)構(gòu)存在乙酰基。比較該化合物和灰氈毛忍冬皂苷甲的碳譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)該皂苷的C-23，-4，-3，-5和-24δ值分別+2.0，-1.1，+1.0，+1.0和-0.7ppm，說(shuō)明乙?；釉贑-23位。HMBC譜中H-23和C(COCH3)相關(guān)信號(hào)進(jìn)一步證明乙?；釉贑-23位。該皂苷的酸水解實(shí)驗(yàn)給出吡喃葡萄糖、吡喃鼠李糖和吡喃阿拉伯糖。他們的連接位置和順序通過(guò)HMBC和ROESY譜確定見(jiàn)圖-1。綜合各數(shù)據(jù)及與文獻(xiàn)對(duì)比[2]鑒定化合物為3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1-3)-α-L-吡喃鼠李糖基(1-2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基-23-乙?；?常春藤皂甙元-28-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖苷。

新皂苷的主要ROESY相關(guān)

and主要HMBC相關(guān)

表1新皂苷的核磁共振數(shù)據(jù)(δ，ppm，O＝TMS，C5D5N)


本發(fā)明的新化合物作為藥物活性成分可以制成常規(guī)的藥用劑型，如，片劑、丸劑、膏劑、膠囊劑、口服液、顆粒劑以及注射液粉針劑或水針液。
3.體外抑制PLA2作用以SIBLINKS類(lèi)似物為底物，以naja najaPLA2眼鏡蛇蛇毒中提取的PLA2作為水解酶，吲哚PLA2抑制劑5-甲氧基-1-芐基-1H-吲哚-3-乙酰胺為對(duì)照，通過(guò)酶標(biāo)儀比色系統(tǒng)測(cè)定水解的最大反應(yīng)速率，進(jìn)行抑制活性的定性定量比較，結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 對(duì)Naja Naja PLA2抑制作用和SCORE的預(yù)測(cè)值

從表2的結(jié)果表明，灰氈毛忍冬皂苷丙的IC50值與吲哚PLA2抑制劑的IC50相近，實(shí)驗(yàn)測(cè)定值與SCORE預(yù)測(cè)值呈對(duì)應(yīng)關(guān)系，提示灰氈毛忍冬皂苷丙有類(lèi)似于PLA2抑制劑的作用。
4.抗炎作用(1)對(duì)小鼠耳廓二甲苯炎癥的影響對(duì)雄性小鼠60只隨機(jī)分5組，①對(duì)照組②灰氈毛忍冬皂苷丙I(20mg·kg-1)、II(40mg·kg-1)、III(80mg·kg-1)三個(gè)劑量組③吲哚美辛組(8mg·kg-1)，各組灌胃給藥或給予等量的生理鹽水，每天1次，連續(xù)3d，末次給藥后30min，每鼠右耳廓內(nèi)外側(cè)滴涂20μl二甲苯致炎，左耳作為對(duì)照，致炎后30min脫頸椎處死小鼠，用直徑7mm打孔器分別于左、右耳相同部位打下耳片，稱重，以左、右耳片重量差值表示腫脹度，結(jié)果見(jiàn)表3。
表3灰氈毛忍冬皂苷丙對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓炎癥耳腫脹度的影響(X±S，n＝15)

與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，灰氈毛忍冬皂苷丙40mg·kg-1和80mg·kg-1兩劑量組對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹有明顯的抑制作用，提示灰氈毛忍冬皂苷丙有一定抗炎作用。
(2)對(duì)角叉菜膠制備大鼠氣囊滑膜炎炎癥模型的影響取健康SD雄性大白鼠，隨機(jī)分為6組①正常組；②模型組；③灰氈毛忍冬皂苷丙I(10mg·kg-1)、II(20mg·kg-1)、III(40mg·kg-1)三個(gè)劑量；④地塞米松組(0.15mg·kg-1)。各組動(dòng)物乙醚輕度麻醉，背部正中s.c無(wú)菌空氣20ml，3d補(bǔ)充注射空氣10ml維持氣囊腫脹，6d氣囊內(nèi)注射角叉菜膠50mr·kg-1致炎，正常對(duì)照組同法注射生理鹽水等容積。各組動(dòng)物于第3d開(kāi)始灌胃給藥①②組給予等容積生理鹽水，6d致炎前30min再給藥給藥一次。致炎6h后動(dòng)物i.p戊巴比妥鈉25mg·kg-1麻醉，氣囊內(nèi)注射無(wú)菌無(wú)鈣鎂Hank′s平衡鹽液(HBSS)4ml灌洗，收集灌洗液，進(jìn)行灌洗液中白細(xì)胞數(shù)和蛋白質(zhì)含量的測(cè)定；采用微量酸滴定法測(cè)定PLA2活性；采用放免法測(cè)定PGE的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。
表4灰氈毛忍冬皂苷丙對(duì)大鼠氣囊滑膜炎灌洗液中白細(xì)胞數(shù)、蛋白質(zhì)和PGE含量及PLA2活性的影響(X±S，n＝8)


與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01在小鼠耳廓炎癥實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，又進(jìn)行了大鼠氣囊滑膜炎癥試驗(yàn)，結(jié)果與上次實(shí)驗(yàn)基本一致，灰氈毛忍冬皂苷丙可減少灌流液中白細(xì)胞的滲出和蛋白質(zhì)的含量；與此同時(shí)，灰氈毛忍冬皂苷丙20mg·kg-1和40mg·kg-1兩劑量組可通過(guò)對(duì)PLA2活性的顯著抑制作用，從而減少炎癥介質(zhì)PGE的含量，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其體外抑制PLA2作用一致，說(shuō)明灰氈毛忍冬皂苷丙可用于PLA2抑制劑和抗眼藥物的開(kāi)發(fā)。
結(jié)合
具體實(shí)施例方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不僅僅限于所列舉的實(shí)施方式。
實(shí)施例1灰氈毛忍冬干燥花蕾40Kg，用90％乙醇回流提取三次，用量200升，每次3天，濃縮合并成無(wú)醇味的濃縮液，得總浸膏。再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。正丁醇萃取物經(jīng)柱層析分離后分別得到灰氈毛忍冬皂苷丙4克。(見(jiàn)附圖9)實(shí)施例2灰氈毛忍冬干燥花蕾10Kg，用水加熱提取三次，水用量為20升，提取時(shí)間為1小時(shí)，提取溫度為70℃，提取液經(jīng)大孔樹(shù)脂(D101、AB-5、HP-20等)吸附，用水，30％乙醇沖洗后用70％乙醇洗脫，70％乙醇洗脫液減壓回收溶劑得皂苷混合物?；旌衔镌俳?jīng)柱層析(硅膠柱層析氯仿-甲醇系統(tǒng)，RP-C18柱層析水-甲醇系統(tǒng))分離后，分別得到灰氈毛忍冬皂苷丙0.8克。
實(shí)施例3灰氈毛忍冬干燥花蕾10Kg，用甲醇冷浸提取三次，甲醇用量為20升，提取時(shí)間為1天，提取液經(jīng)大孔樹(shù)脂(D101、AB-5、HP-20等)吸附。用水，30％乙醇沖洗后用70％乙醇洗脫，70％乙醇洗脫液減壓回收溶劑得皂苷混合物?；旌衔镌俳?jīng)柱層析(硅膠柱層析氯仿-甲醇系統(tǒng)，RP-C18柱層析水-甲醇系統(tǒng))分離后，分別得到灰氈毛忍冬皂苷丙0.9克。
實(shí)施例4含本發(fā)明新皂苷單體的片劑取實(shí)施例1制得的新皂苷化合物100mg與淀粉50mg，糊精50mg混合，用適量30％乙醇做濕潤(rùn)劑，制成軟材，常規(guī)方法制粒，加入適量硬脂酸鎂混合，制成片劑。
實(shí)施例5含本發(fā)明新皂苷的膠囊劑取新皂苷化合物50mg與淀粉70mg，糊精10mg，糖粉10mg混合，用適量30％乙醇做濕潤(rùn)劑，制成軟材，常規(guī)方法制粒，裝入硬膠囊中。
實(shí)施例6含本發(fā)明新皂苷的緩釋膠囊劑取新皂苷化合物80mg與羥丙基甲基纖維素K15M 120mg，乙基纖維素45cps 40mg，乳糖40mg混合，用10％乙烯吡咯烷酮k30乙醇溶液適量，制成軟材，常規(guī)方法制粒，裝入硬膠囊中制成緩釋膠囊。
權(quán)利要求
1.一種灰氈毛忍冬中常春藤皂苷類(lèi)新化合物，簡(jiǎn)稱灰氈毛忍冬皂苷丙，化學(xué)名稱為3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1-3)-α-L-吡喃鼠李糖基(1-2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基-23-乙?；?常春藤皂甙元-28-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為 灰氈毛忍冬皂苷丙。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新化合物的制備方法，其特征在于以灰氈毛忍冬花蕾為原料，經(jīng)水或有機(jī)溶劑或混合溶劑提取，水提取液直接過(guò)大孔樹(shù)脂吸附，有機(jī)溶劑或混合溶劑提取液濃縮后加水溶解再經(jīng)大孔樹(shù)脂吸附或正丁醇萃取，大孔樹(shù)脂吸附物或正丁醇萃取物經(jīng)柱層析分離而得。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于大孔樹(shù)脂包括D101、AB-5或HP-20；柱層析用單體選自硅膠、ODS或凝膠Sephadex LH-20的一種或一種以上；有機(jī)溶劑包括甲醇、乙醇、氯仿或正丁醇；提取溫度低于100℃。
4.權(quán)利要求1所述的新化合物與醫(yī)學(xué)上可接受的藥用輔料組成藥物組合物及其制劑。
5.權(quán)利要求4所述的制劑，包括片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液和注射劑。
6.權(quán)利要求1所述的新化合物制備的磷脂酶A2(PLA2)抑制劑和抗炎藥物的新用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新皂苷化合物及其制備方法和用途，屬于天然藥物化學(xué)領(lǐng)域，其特征是通過(guò)水或有劑溶劑的化學(xué)方法，從灰氈毛忍冬花蕾中提取分離、純化，得到了一種常藤皂苷類(lèi)新化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，被命名為灰氈毛忍冬皂苷丙。該化合物通過(guò)體外抑制PLA2的試驗(yàn)以及對(duì)小鼠耳廊二甲苯炎癥試驗(yàn)，對(duì)角叉菜膠制備大鼠氣囊滑膜炎炎癥模的影響試驗(yàn)，證明灰氈毛忍冬皂苷丙在醫(yī)藥領(lǐng)域中具有PlA2抑制劑和抗炎藥物的新用途。
文檔編號(hào)A61K31/7028GK101074259SQ200710020528
公開(kāi)日2007年11月21日 申請(qǐng)日期2007年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月8日
發(fā)明者馮煦, 陳雨, 王鳴, 趙興增, 趙友誼, 董云發(fā) 申請(qǐng)人:江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所