專利名稱：：溴酚化合物在制備治療2型糖尿病或肥胖癥藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及治療2型糖尿病和肥胖癥的藥物，具體地說(shuō)是溴酚化合物在制備治療2型糖尿病或肥胖癥藥物中的應(yīng)用，包括三種海洋溴酚化合物的制備、藥理活性及藥學(xué)用途。該化合物作為蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶(PTP1B)抑制劑，可用于治療2型糖尿病和肥胖癥。
背景技術(shù)：
：糖尿病是一種常見(jiàn)的多發(fā)內(nèi)分泌疾病，其發(fā)病原因是由于胰島素相對(duì)或絕對(duì)不足及靶細(xì)胞對(duì)胰島素敏感性降低，分為胰島素依賴型糖尿病(1型)和非胰島素依賴型糖尿病(2型)，臨床90%以上為2型糖尿病患者。胰島素抵抗是2型糖尿病發(fā)病的關(guān)鍵因素，胰島素通過(guò)與受體胞外"亞基結(jié)合，激活受體胞內(nèi)^亞基內(nèi)在的酪氨酸激酶活性，導(dǎo)致酪氨酸殘基自身磷酸化，從而完全激活胰島素受體酪氨酸激酶，再通過(guò)磷酸化胰島素受體底物將信號(hào)傳遞下去。酪氨酸磷酸化是胰島素效應(yīng)實(shí)現(xiàn)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，受作用相反的一對(duì)酶即PTK和PTP所調(diào)節(jié)。PTK在胰島素信號(hào)傳遞中的作用很早即被人們所關(guān)注，但直到最近，人們才逐漸認(rèn)識(shí)到PTP在糖尿病發(fā)病中的重要性。在胰島素Insulin信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中，PTP1B酶將自身磷酸化活化的胰島素受體(IR)去磷酸化，從而降低受體激酶的活性，或?qū)⒁葝u素受體底物(IRs)中的蛋白質(zhì)酪氨酸殘基去磷酸化，從而負(fù)調(diào)控胰島素作用受體后通路；在痩素L印tin信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中，PTP1B酶可將瘦素受體0bR下游的SJAK2去磷酸化，從而負(fù)調(diào)控瘦素作用受體后通路，STAT3與P110/p85(胰島素信號(hào)響應(yīng)過(guò)程中P13K的特殊形式)分別為JAK2與IRS1的下游作用靶點(diǎn)，進(jìn)而影響血糖的吸收與能量轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致糖尿病及肥胖癥的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗患者的胰島素靶組織中PTP1B和LARPTP表達(dá)增加，這兩種PTP的表達(dá)增加能阻斷胰島素受體酪氨酸的激活和胰島素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；PTP1B基因剔除鼠可提高胰島素的敏感性，且這種增敏效應(yīng)具有組織特異性，它可增加骨骼肌對(duì)葡萄糖的攝取，但對(duì)脂肪組織無(wú)明顯影響，這些結(jié)果證實(shí)PTP1B在胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的負(fù)調(diào)控作用，它的活性增高，可能是發(fā)生胰島素抵抗和胰島素受體信號(hào)受損的一個(gè)致病因素，因此，尋找PTP1B的小分子抑制劑可能開發(fā)出有效的抗2型糖尿病和肥胖癥的新藥。國(guó)際上對(duì)PTP1B抑制劑的研究不多，主要有以下幾類反義寡核苷酸類化合物、二氟酯甲基磷酯類(difluro-methylenePhosPhaonates)、甲氧基苯甲酸類(2-caxbometh-oxybenzoicacids)、二草酉先基氨基苯甲酸類(oxalyaminobenzoicacids)、苯并呋卩南類(benzbromarone)、ABDF(thefluorogenicreagent4-(aminosulfonyl)-7-fluoro-2，1，3-benzoxa-diazole);但目前尚未見(jiàn)溴酚類化合物作為PTP1B抑制劑抗糖尿病方面的研究報(bào)道。21世紀(jì)人類生存和發(fā)展的巨大壓力，迫使人們加快合理開發(fā)海洋資源的步伐，如何進(jìn)行海洋天然活性物質(zhì)的深度開發(fā)與利用，開發(fā)針對(duì)人類重大疾病的新藥，是合理利用我國(guó)生物資源的戰(zhàn)略需求。海洋是生命的起源，海藻是海洋中最大的植物類群，為了對(duì)付海洋食草動(dòng)物的大量吞食來(lái)維護(hù)自身的生存繁衍，大多海藻能產(chǎn)生一些很有特色的活性物質(zhì)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供3種溴酚類化合物在制備治療2型糖尿病和肥胖癥藥物中的應(yīng)用，所述溴酚類化合物具有蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶(PTP1B)抑制活性，可用于治療2型糖尿病和肥胖癥。申請(qǐng)人從海洋紅藻中得到三個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的溴酚類化合物，體外活性篩選中發(fā)現(xiàn)其具有極強(qiáng)的PTP1B酶抑制活性，抑制率高達(dá)73.38%、69.79%、72.71%(濃度5ug/mL);對(duì)海藻乙醇提取物進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中、高級(jí)量組表現(xiàn)出顯著的降血糖效果，且呈良好的量效關(guān)系，這說(shuō)明海藻內(nèi)含有強(qiáng)活性的降糖成分，溴酚類化合物是一類2型糖尿病和肥胖癥防治的新型藥物。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為溴酚化合物在制備治療2型糖尿病和肥胖癥藥物中的應(yīng)用。所述溴酚化合物分別為3，4-二溴-5(甲氧基甲基)-1，2-二苯酚、2隱甲基-3畫(2，3-二溴-4，5-二羥基)苯丙醛、3-(2,3-二溴-4,5-二羥基苯)-4-溴-5,6-二羥基-l,3-二氫異苯并呋喃及其藥物學(xué)上可接受的鹽、酯或醚；蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶(PTP1B)抑制劑可作為2型糖尿病和肥胖癥治療藥物。溴酚化合物結(jié)構(gòu)如下<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage4</formula>3，4-二溴-5(甲氧基甲基)-1,2-二苯酚3，4-dibromo-5(methoxymethyl)-l，2-benzenedio1<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage5</formula>2-甲基-3-(2，3-二溴-4，5-二羥基)苯丙醛2-methyl-3(2，3-dibromo國(guó)4，5-dihydroxy)-propylaldehyde<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage5</formula>3-(2，3-二溴-4，5-二羥基苯)-4-溴-5，6-二羥基-1，3-二氫異苯并呋喃3—(2，3-dibromo國(guó)4，5-dihydro:xy-pheiiyl)一4國(guó)bromo-5，G-dihydroxy一l，3-dihydroiso-benzofuran本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)、生物資源豐富我國(guó)是海洋大國(guó)，擁有豐富的海洋生物資源，海藻資源分布尤其廣泛，其中富含溴酚類化合物。(2)、生物利用度高溴酚化合物分子量相對(duì)較小(MW〈500)，生理環(huán)境下具有較好的細(xì)胞膜通透性，易于口服，吸收，具有較高的生物利用度。(3)、療效顯著作為極具海洋特色的多鹵代化合物，溴酚類藥物是一種新型、高效的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶(PTP1B)抑制劑，在試驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)表現(xiàn)出顯著的降血糖活性，具有很好的抗糖尿病和肥胖癥療效。(4)、副作用小溴酚類藥物來(lái)源于海藻，屬純天然生物制品，相比化學(xué)合成類藥物，具有高效低毒的優(yōu)點(diǎn)。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1溴酚化合物的提取、分離及結(jié)構(gòu)鑒定風(fēng)干的松節(jié)藻i^odome/acw7/erv0/cfes樣品14.4kg(干重)粉碎后用10L95%乙醇提取三次，每次72小時(shí)；合并浸提液，提取液40°C下減壓濃縮的乙醇提取物723g，濃縮物用IO倍重量蒸餾水懸浮后，用乙酸乙酯(體積比1:l)萃取，減壓濃縮，得乙酸乙酯相浸膏594.6g，乙酸乙酯萃取部位進(jìn)行硅膠柱色譜，以石油醚-丙酮梯度洗脫(體積比從500:1至1:1)，改用氯仿-甲醇梯度洗脫(體積比從20:1至1:1)，最后用95%乙醇洗脫，薄層色譜檢査，合并成分相似的洗脫液，減壓濃縮得14個(gè)部分LiL,4。Lu)部分[氯仿甲醇=5:l]洗脫部分經(jīng)過(guò)硅膠色譜，采用氯仿-甲醇(體積比依次為50:1-20:1-10:1-5:1)進(jìn)行梯度洗脫，HPLC純化、重結(jié)晶可得純化合物l25mg，經(jīng)波譜分析，此化合物為3，4-二溴-5(甲氧基甲基)-1，2-二苯酚(中文)；3,4-dibromo-5(methoxymethyl)-1,2-benzenediol(英文)。L9部分[石油醚丙酮體積比=1:l]洗脫部分經(jīng)過(guò)SephadexLH20凝膠色譜，采用石油醚-氯仿-甲醇(體積比為5:5:1)進(jìn)行洗脫，HPLC純化、重結(jié)晶可得純化合物II18mg，經(jīng)波譜分析，此化合物為2-甲基-3-(2，3-二溴-4，5-二羥基)苯丙醛(中文)，2-methyl匿3(2,3-dibromo-4,5-dihydroxy)-propylaldehyde(英文)。采集并風(fēng)干褐藻小粘膜藻丄e^/2ew'a"a"a樣品8.25kg(干重)，粉碎后用10L95%乙醇提取三次，每次72小時(shí)；合并浸提液，提取液40。C下減壓濃縮的乙醇提取物710g，濃縮物用10倍重量蒸餾水懸浮后，依次用等體積乙酸乙酯、正丁醇萃取，乙酸乙酯、正丁醇萃取，減壓濃縮，得乙酸乙酯相浸膏125g，正丁醇相浸膏70g。乙酸乙酯萃取部位進(jìn)行硅膠柱色譜，以石油醚-丙酮梯度洗脫(體積比依次為500:11:1)，改用氯仿-甲醇梯度洗脫(體積比20:11:1)，最后用95%乙醇洗脫，薄層色譜檢査，合并成分相似的洗脫液，減壓濃縮得24個(gè)部分L!L24。1^丄15[石油醚丙酮=5:l]洗脫部分經(jīng)過(guò)SephadexLH-20色譜、硅膠色譜和反相HPLC等分離純化技術(shù)得到純化合物m18mg，經(jīng)波譜分析，此化合物為3-(2,3-二溴-4,5-二羥基苯)-4-溴-5,6-二羥基-1,3-二氫異苯并呋喃(中文)；3—(2，3-dibromo-4,5-dihydroxy-phenyl)-4-bromo-5,G-dihydroxy-1,3-dihydroiso-benzofuran(英文)?；衔锞哂幸韵吕砘匦曰衔颕淡黃色粉末，C8H8Br203，mp:129~130°C，EI-MS:w/z(%):312,293,281,252，231,217,201,188,173，145,124,107,92,75，64,53;IRv=cm":3467,3157,2927,1684,1572,1466,1446,1371,1273,1165,1092,1014,916,858,804;化NMR(300MHz,Me2CO-4):3.38(3H,s,H隱8),4.40(2H,s，H-7),7.05(1H,s,H陽(yáng)6);13C-NMR(75MHz,Me2CO-d6):57.7(q,C-8),74.5(t,C-7),113.1(d,C-3)，113.9(s,C-4),114.8(s,C-6),130.8(s,C-5),143.9(s,C-2)，144.9(s,C-l).化合物II膠狀物，d。HwBr203，IRv=cm":3386,2968,2931,2873,2733,1712，1576,1469,1406,1273,1188,1014,930,856,814,650.H-畫R(300MHz，Me2CO-t4):1.07(3H,d,J=6.9Hz,H-9)，2.73(lH,m,H-8),3,21(2H,d,H-7),6.86(1H,s,H-6),9.70(1H,d,J=1.5Hz,H-10).13C-NMR(75MHz,Me2CO-c/6):12.8(q,C-9);37.7(t，C-7);46.5(d，C-8);117.0(d,C-6),113,3(s，C-3);115.8(s,C-4);131.5(s,C-5);143.4(s，C-2);144.9(s,C畫l),203.7(d,C-10).化合物m紅色粉末(Me2CO),C14H9Br305，mp:132~134°C，[a]2D°+6°(MeOH,c0.16);HREIMSm/z493.7971—forC14H979Br305,493.8000);EIMSm/z500/498/496/494[M]+(8/36/35/10%)，297/295/293(35A77/40),231/229(100/98);IRv=cm":3415,3386,2866,1595,1464,1408,1358,1308，1277,1163,1024,858,812;ifl-NMR(Me2CO-4500顧z)(5:6.88(1H,s,H陽(yáng)6'),6.45(1H,s,H-7),6.31(1H,s,H-6),5.03(1H,d,/=12.0Hz,H-7'a),4.94(1H,d,J=12.0Hz,H-7'b);13C-NMR(Me2CO-4,125MHz)<5:147.0(s,C-5'),145.4(s,C-5),145.3(s,C-4),143.5(s,C-4'),133.5(s,C-l'),133.2(s，C-l),132.8(s,C-2'),117.5(s,C-2)，115.2(d,C-6),113.8(s，C-3),107,5(d,C-6'),105.0(s,C-3')，87.9(d,C-7),73.5(t,C-7')。實(shí)施例2蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯斷PTPIB)活性抑制活性測(cè)試實(shí)驗(yàn)原理PTPIB是首個(gè)被鑒定的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶(proteintyrosinephosphatase),通過(guò)基因敲除試驗(yàn)表明，PTPIB在胰島素Insulin信號(hào)傳導(dǎo)及痩素Leptin信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中起負(fù)調(diào)控作用，在調(diào)節(jié)胰島素敏感性和糖代謝過(guò)程中起關(guān)鍵作用。利用分子生物學(xué)手段在大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)人源蛋白質(zhì)酪氨酸磷脂酶1B(hPTPlB)催化活性域，經(jīng)純化后的hPTPlB重組蛋白能水解底物pNPP的磷脂鍵，得到的產(chǎn)物在410nm處有很強(qiáng)的光吸收，因此，可以通過(guò)直接檢測(cè)410nm處的光吸收的變化，以觀察酶的活性變化以及化合物對(duì)酶活性的抑制情況，計(jì)算抑制率及IC5。，陽(yáng)性對(duì)照為正礬酸鈉。實(shí)驗(yàn)方法將實(shí)施例1中的3種溴酚化合物分別用磷酸鹽緩沖液配制200nM和20uM供試品溶液，分別加入到標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)活體系(10mMTris.Cl,PH7.6,10mMpNPP,2%DMSO,100nMhPTPlB)，動(dòng)態(tài)測(cè)定波長(zhǎng)為410nm處的光吸收，時(shí)間為3分鐘，計(jì)算化合物PTP1B抑制率及ICso;PTP1B:為大腸桿菌中表達(dá)并純化的GST融合蛋白；底物PNPP;陽(yáng)性參照物正釩酸鈉(2uM)。表l人源蛋白質(zhì)酪氨酸磷脂酶1B抑制率及IC:<table>complextableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>[實(shí)驗(yàn)結(jié)論]:溴酚化合物對(duì)人源蛋白質(zhì)酪氨酸磷脂酶IB(PTPIB)有顯著的抑制作用，可用于2型糖尿病及肥胖癥的防治。實(shí)施例3松節(jié)藻乙醇提取物體內(nèi)抗糖尿病活性測(cè)試(1)、動(dòng)物分組及處理采用高脂飲食STZ-DM模型(鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠模型)對(duì)松節(jié)藻的乙醇提取物進(jìn)行了體內(nèi)抗糖尿病活性試驗(yàn)，分別測(cè)定體重、血糖生理指標(biāo)，評(píng)價(jià)海藻乙醇提取物的體內(nèi)降糖活性。1、2型糖尿病模型制備Wistar大白鼠70只，環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后，隨機(jī)抽取10只(雌雄各半)作為正常對(duì)照組，其余大鼠禁食24h后，按照35mg/kg—次性腹腔注射鏈脲佐菌素(溶解于0.1mol/L枸櫞酸鈉溶液，pH=4.5)，誘導(dǎo)糖尿病模型。3d后禁食12h，尾靜脈采血，血糖儀測(cè)定空腹血糖，以血糖大于16.7mmol/L確定為糖尿病模型造模成功。2、治療采用隨機(jī)分組法，將成模大鼠分為模型組，醇提物高劑量組，醇提物中劑量組，醇提物低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組(即文迪雅組)，每組10只(雌雄各半)。高、中、低劑量組分別按照200mg/kg，100mg/kg，50mg/kg劑量每日灌服ig松節(jié)藻醇提物大豆色拉油稀釋液；陽(yáng)性對(duì)照組灌服ig陽(yáng)性藥物文迪雅(有效成分羅格列酮)；正常組和模型組灌服等量大豆色拉油，各組均采用高脂飲食，自由飲水。3、指標(biāo)檢測(cè)每7d將小鼠禁食12h后，稱體重，尾靜脈采血測(cè)定血糖。表2松節(jié)藻醇提物對(duì)大鼠血糖的影響<table>complextableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>[實(shí)驗(yàn)結(jié)論]:采用STZ-DM模型對(duì)松節(jié)藻的醇提取物體內(nèi)降血糖活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其在大鼠體內(nèi)具有顯著的降血糖效果，且呈良好的量效關(guān)系。權(quán)利要求1.溴酚化合物在制備治療2型糖尿病或肥胖癥藥物中的應(yīng)用。2.按照權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述溴酚化合物為3，4-二溴-5(甲氧基甲基)-1，2-二苯酚、2-甲基-3-(2，3-二溴-4，5-二羥基)苯丙醛和/或3-(2,3-二溴-4，5-二羥基苯)—4-溴-5,6-二羥基-l,3-二氫異苯并呋喃。3.按照權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述溴酚化合物為3，4-二溴-5(甲氧基甲基)-1，2-二苯酚、2-甲基-3-(2，3-二溴-4，5-二羥基)苯丙醛和/或3-(2,3-二溴-4,5-二羥基苯)-4-溴-5,6-二羥基-l,3-二氫異苯并呋喃的藥物學(xué)上可接受的鹽、酯或醚。全文摘要本發(fā)明涉及治療2型糖尿病和肥胖癥的藥物，具體地說(shuō)是3種溴酚類化合物在制備治療2型糖尿病和肥胖癥藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明中的溴酚類化合物具有蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶(PTP1B)抑制活性，可用于治療2型糖尿病和肥胖癥。文檔編號(hào)A61P3/00GK101342159SQ20071001529公開日2009年1月14日申請(qǐng)日期2007年7月13日優(yōu)先權(quán)日2007年7月13日發(fā)明者史大永,曉范,袁兆慧,鳳許,韓麗君申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所