專(zhuān)利名稱(chēng)：輔助生殖技術(shù)中的代謝組學(xué)測(cè)定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)分析液體培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物來(lái)測(cè)定與液體培養(yǎng)基交換代謝產(chǎn)物的細(xì)胞 的狀態(tài)，及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
代謝組學(xué)
隨著人類(lèi)基因組序列測(cè)定的完成，對(duì)于復(fù)雜的生物體系，很顯然，僅遺傳信息是不能提 供其生物化學(xué)和細(xì)胞功能的綜合特性的。因此，很多生物學(xué)研究的焦點(diǎn)正在轉(zhuǎn)向蛋白質(zhì)組學(xué) 和代謝組學(xué)，在廣義上，蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)定義為對(duì)生理環(huán)境中的蛋白質(zhì)和小分子的系
統(tǒng)分析，其中，生理環(huán)境是指，例如生物樣品、細(xì)胞、組織，或生物體；小分子是指，例如 多肽、激素和神經(jīng)傳遞素(及其代謝產(chǎn)物)。由于蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物比基因更為數(shù)眾多、互異、 和脆弱，對(duì)其發(fā)現(xiàn)、鑒定、和定量的現(xiàn)有手段不能滿足研究和臨床的需要。
蛋白質(zhì)組學(xué)的一個(gè)重要方面是對(duì)發(fā)生了遺傳突變或表達(dá)水平改變的蛋白質(zhì)的鑒定。蛋白 質(zhì)和代謝產(chǎn)物的水平隨時(shí)間或在群體中的差別可以與疾病的狀況、藥物群、或代謝的改變相 關(guān)聯(lián)。已確定的分子種可以用作疾病或該疾病癥狀的生物學(xué)標(biāo)志物(生物標(biāo)志物)，由此可建 立新的診斷、預(yù)后和疾病治療的方法，或針對(duì)病人作更適合的修改。為了找到上述的生物學(xué)標(biāo)志物，精確測(cè)得不同類(lèi)型樣品之間有關(guān)蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物水平的差別是有幫助的，此過(guò)程 稱(chēng)為差示表型分析。
體外受精(IVF)治療法
包括IVF的輔助生殖技術(shù)(ART)領(lǐng)域，無(wú)論是用于人或動(dòng)物，現(xiàn)在都還是不甚精湛的科 學(xué)或技術(shù)。評(píng)估精子(精子細(xì)胞)、卵子(卵細(xì)胞)和胚胎的發(fā)育能力主要是在顯微鏡下通過(guò) 觀察其可見(jiàn)的外觀來(lái)完成的。在很多情況下，這些細(xì)胞的可見(jiàn)外觀與其發(fā)育能力并不是很好 地相關(guān)。有關(guān)這些細(xì)胞中發(fā)生了什么，沒(méi)有其它的信息可提供給ART專(zhuān)家來(lái)指導(dǎo)該過(guò)程。整 個(gè)程序是抱著一種期望來(lái)實(shí)行的選擇能發(fā)育的配子，然后這些能發(fā)育的配子會(huì)產(chǎn)生能發(fā)育 的胚胎，這些胚胎又會(huì)成功地植入到子宮內(nèi)，接著產(chǎn)生健康的后代。盡管通過(guò)提取一個(gè)細(xì)胞 對(duì)胚胎進(jìn)行遺傳檢驗(yàn)，有可能至少測(cè)得一些發(fā)育能力的因子，但這種"侵入式"的步驟會(huì)對(duì) 胚胎產(chǎn)生有害的影響。目前，沒(méi)有一種現(xiàn)有技術(shù)能使胚胎學(xué)家和其它ART專(zhuān)家去有效地評(píng)估 ART程序中這些細(xì)胞的發(fā)育能力。
IVF已被證明是最適用于不孕配偶的選擇，而且正逐漸被公認(rèn)為優(yōu)于其它治療方案的"最 優(yōu)良"的程序。
IVF過(guò)程可分為6個(gè)主要的程序步驟1)用生育激素藥物刺激雌性生物以產(chǎn)生大量同期 的卵子群；2)收取卵子；3)收集并處理雄性配子，隨后是卵子的受精；4)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中 培養(yǎng)所產(chǎn)生的受精卵/胚胎；5)胚胎的選擇；以及最后是6)胚胎的移植。 一般，不把包括 胚胎植入和妊娠的關(guān)鍵過(guò)程考慮作為IVF過(guò)程的一部分，因?yàn)樗鼈儾皇艹绦虮旧淼目刂啤Ｔ?當(dāng)前的IVF實(shí)施中，主要根據(jù)主觀的形態(tài)學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)和發(fā)育的模式(在胚胎的情況下)，設(shè)想選 擇用于程序中的卵子和胚胎是能發(fā)育的或是健康的；沒(méi)有生物學(xué)的量度標(biāo)準(zhǔn)可有助于這種非 常嚴(yán)格的選擇過(guò)程。未使用的胚胎通常將其深低溫保藏。
現(xiàn)在，ART服務(wù)業(yè)使其還可能為下述的患者提供治療的方案這些患者自覺(jué)不是不能生 育的，但他們希望推回或控制其生物鐘，以增強(qiáng)和/或保持他們的生殖功能(或生育力)(生 育力的保持)。另一方面，ART服務(wù)業(yè)應(yīng)用于正常的、能生育的人群已產(chǎn)生了新的保持生育力 的治療范式。對(duì)于控制生育推遲的需要可以進(jìn)一步得到理解，例如，如果一個(gè)患者正在進(jìn)化學(xué)治療，在治療中，其生殖功能可能會(huì)受到干擾。
目前還沒(méi)有實(shí)用的生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)或分析方法使卵子、精子、或胚胎的選擇能夠保證IVF程 序的有效和安全。因此，在IVF程序的前端，由于缺乏可靠地評(píng)估卵子能力的分析方法學(xué)， 胚胎學(xué)家們采用了主觀的和非標(biāo)準(zhǔn)的胚胎發(fā)育標(biāo)準(zhǔn)和形態(tài)學(xué)作為胚胎質(zhì)量的標(biāo)志，并由此推 斷起始的卵子質(zhì)量。

發(fā)明內(nèi)容
在兩門(mén)科學(xué)的學(xué)科匯合的基礎(chǔ)上，確立了一個(gè)新穎的技術(shù)平臺(tái)(l)活組織分光鏡檢査， 這是不同形式的分光鏡檢查分析在人類(lèi)生物學(xué)方面的應(yīng)用，它可用于確定、定量以及證實(shí)蛋 白組學(xué)和分子診斷的生物標(biāo)志物；(2)代謝組學(xué)，它是對(duì)生物樣品中(在體液和在固體的組 織中)的多個(gè)小分子生物標(biāo)志物之間的動(dòng)態(tài)相互作用進(jìn)行檢査和集合的一門(mén)科學(xué)，用以了解 復(fù)雜的生物過(guò)程和功能。代謝組學(xué)可以用于研究在組織和/或細(xì)胞型式中代謝量變曲線的改 變。
在此使用術(shù)語(yǔ)"基于活組織分光鏡檢査的代謝組學(xué)(BSM)"，以描述該技術(shù)平臺(tái)。這里使 用BSM平臺(tái)來(lái)分析樣品的蛋白質(zhì)組和分子生物標(biāo)志物的組成，然后它又利用信息學(xué)將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn) 換為獨(dú)特的"代謝組的量變曲線"。每條量變曲線又轉(zhuǎn)變?yōu)楠?dú)特的"指印"或"識(shí)別特征"， 該"指印"或"識(shí)別特征"確定了目的樣品的代謝狀態(tài)，從而也就確定了樣品來(lái)源的患者的 狀態(tài)。"代謝組的量變曲線"可以用來(lái)系統(tǒng)地區(qū)分通常很微小的差別，該差別可區(qū)別正常的生 理狀態(tài)與疾病的開(kāi)始或發(fā)展，或個(gè)體對(duì)藥物治療的反應(yīng)。
因此，BSM可以廣泛地應(yīng)用于人類(lèi)和動(dòng)物的健康中而對(duì)本發(fā)明的范圍沒(méi)有限制。這種BSM 技術(shù)平臺(tái)的廣泛應(yīng)用包括但不限于(1)非侵入式的分子診斷和預(yù)后的評(píng)估，例如在老年癡 呆癥(AD)、胎-母健康監(jiān)測(cè)、體外受精方法學(xué)中的評(píng)估；以及(2)利用代謝組的量變曲線鑒 定有效和安全的替代標(biāo)志物,用于制定發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)藥物的基于藥物診斷法的策略。上述這些應(yīng) 用利用了在BSM技術(shù)中重點(diǎn)應(yīng)用的基于生物標(biāo)志物的代謝組量變曲線。
各種不同形式的活組織分光鏡檢查分析都表明對(duì)數(shù)種組織、器官和體液的非侵入式體內(nèi)監(jiān)測(cè)是有用的。固體的組織、單個(gè)細(xì)胞和生物體液的體外分析也采用這種方法來(lái)完成。
活組織分光鏡檢査有很多優(yōu)點(diǎn)，包括簡(jiǎn)單、精確和專(zhuān)一性、使用容易、分析快速、低成 本的檢測(cè)設(shè)備、可同時(shí)測(cè)定單個(gè)樣品中的多種被分析物，以及通過(guò)即時(shí)檢驗(yàn)或遠(yuǎn)程分析進(jìn)行 連續(xù)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)在，利用BSM平臺(tái)，人們可以用小型的設(shè)備，對(duì)少至20ri的液體 樣品，在少于l分鐘的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行高速、復(fù)雜的代謝組分析。
代謝組學(xué)是日趨了解基因與蛋白的相互作用后的很有價(jià)值的延伸。現(xiàn)在，醫(yī)學(xué)和I4學(xué)界 已認(rèn)識(shí)到基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)只是體內(nèi)平衡的一小部分?；蚪M代表可能是什 么，蛋白質(zhì)組則明確表達(dá)了什么，代謝組表示細(xì)胞、組織、器官或個(gè)體有關(guān)健康和疾病方面 的實(shí)時(shí)功能狀態(tài)。表達(dá)的蛋白質(zhì)和修飾后蛋白質(zhì)的這些所有"下游后果"的累積影響表現(xiàn)在 一個(gè)反映細(xì)胞的功能狀態(tài)的小分子庫(kù)中。描繪這種分子庫(kù)(代謝組)的量變曲線提供了細(xì)胞 的健康、疾病、年齡以及藥物和在其周?chē)馁e主共棲生物的影響之間的關(guān)聯(lián)。因此，獲取這 種信息的能力促進(jìn)了跨幾個(gè)學(xué)科的分子診斷、預(yù)后和藥物的發(fā)現(xiàn)的技術(shù)的進(jìn)展。它為專(zhuān)業(yè)人 員提供了寶貴的在多種臨床環(huán)境中的決策能力。
生殖健康的范圍包括正常生殖功能以及生殖力衰退和不孕。對(duì)于在生殖健康領(lǐng)域中，更 具體的是在輔助生殖技術(shù)(ART)中，生物標(biāo)志物的代謝組量變曲線尚未進(jìn)行探索?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，
生物標(biāo)志物量變曲線可以可靠地用于鑒定能發(fā)育的、生物學(xué)上合格的卵子、精子、和胚胎， 以提高體外受精程序(IVF)的治療成功率(懷孕)，同時(shí)，通過(guò)允許審慎地預(yù)選出少一些， 但只要是能發(fā)育的胚胎用于移植，可以降低一胎多生的風(fēng)險(xiǎn)。
因此，通過(guò)用光學(xué)法測(cè)定體液和IVF實(shí)驗(yàn)室程序中所用的配子或胚胎的培養(yǎng)基，提供一 種測(cè)定樣品的代謝組量變曲線的方法，用于確定，例如卵子、精子或胚胎的發(fā)育能力，從而 可確定進(jìn)一步在體外受精程序和相關(guān)方法中的成功可能性，這對(duì)于該技術(shù)是很重大的貢獻(xiàn)。
非常希望提供下述的一種方法，該方法通過(guò)分析液體培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物來(lái)測(cè)定與液體 培養(yǎng)基交換代謝產(chǎn)物的細(xì)胞的狀態(tài)。所述的細(xì)胞可以是在合適的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞，例如 胚胎或干細(xì)胞。該細(xì)胞可以是子宮壁的細(xì)胞，所說(shuō)的液體培養(yǎng)基可以是子宮內(nèi)膜的液體。
本發(fā)明提供一種方法，該方法通過(guò)分析液體培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物來(lái)確定與液體培養(yǎng)基交換代謝產(chǎn)物的細(xì)胞的狀態(tài)。
本發(fā)明還提供一種測(cè)定樣品的代謝組量變曲線的體系和方法，通過(guò)用光學(xué)法測(cè)定體液和 IVF實(shí)驗(yàn)室程序中所用的配子或胚胎的培養(yǎng)基，來(lái)確定，例如，在體外受精程序和相關(guān)方法 中的成功可能性。
本發(fā)明另外還提供的是關(guān)聯(lián)液體中代謝產(chǎn)物的波譜的方法和儀器，例如包括熒光的單波 長(zhǎng)光譜、多波長(zhǎng)的光吸收光譜、拉曼散射光譜、或磁共振譜；所說(shuō)的液體例如是體液、配子 或胚胎的培養(yǎng)基，其中這些波譜顯示至少一種細(xì)胞的狀態(tài)，包括胚胎中的配子和多個(gè)細(xì)胞。
在一些實(shí)施方案中，提供了一種輔助生殖技術(shù)(ART)的方法。這種方法包括在體外使 至少一個(gè)胚胎在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；在該胚胎生長(zhǎng)的期間，不時(shí)地分析檢驗(yàn)所述的至少一個(gè)胚胎
的培養(yǎng)基，以確定該胚胎的狀態(tài)，并利用該胚胎的狀態(tài)來(lái)確定下述時(shí)機(jī)中的至少一種 將胚胎移植到子宮的時(shí)機(jī)；
使胚胎經(jīng)過(guò)短時(shí)期的貯藏，以供此后移植到子宮內(nèi)的時(shí)機(jī)； 使胚胎經(jīng)過(guò)深低溫冷藏，以供此后移植到子宮內(nèi)的時(shí)機(jī)； 調(diào)整培養(yǎng)基，使胚胎繼續(xù)生長(zhǎng)；以及
將胚胎移植到替換的培養(yǎng)基中，使該胚胎繼續(xù)生長(zhǎng)的時(shí)機(jī)。
在一些實(shí)施方案中，上述的方法還包括通過(guò)分別分析檢驗(yàn)卵泡液、精液槳和子宮內(nèi)液， 確定卵子、精子和子宮的發(fā)育能力，當(dāng)卵子、精子和子宮的發(fā)育能力表明胚胎移植的植入或 懷孕成功的或然率高時(shí)，即可將單個(gè)的胚胎移植。
胚胎可以通過(guò)用精子使至少一個(gè)卵子在體外受精而得到。 在一些實(shí)施方案中，在胚胎生長(zhǎng)的過(guò)程，對(duì)培養(yǎng)基的調(diào)整反復(fù)進(jìn)確測(cè)定。 在常規(guī)的IVF中，沒(méi)有可靠的有關(guān)胚胎發(fā)育能力的信息，致使有時(shí)移植會(huì)延誤，因?yàn)樯?存至第3、 4或5天的胚胎預(yù)期是更能發(fā)育的。但是，人們還是希望將已知是(或表明有較大 的可能性是)能發(fā)育的胚胎盡早移植。隨著胚胎發(fā)育至成熟期的某一點(diǎn)，如第2天，該胚胎 的發(fā)育能力的狀態(tài)會(huì)提高，但是，胚胎在體外成熟時(shí)，對(duì)于某些胚胎，其發(fā)育能力可能不會(huì) 明顯地提高更多。因此，在一些實(shí)施方案中，胚胎移植的時(shí)機(jī)確定在最早的時(shí)刻，在該時(shí)刻胚胎達(dá)到植入成功高或然率的起點(diǎn)。
本發(fā)明可以不受限制地應(yīng)用于哺乳類(lèi)動(dòng)物，例如人類(lèi)、?？苿?dòng)物、馬科動(dòng)物、貓^f動(dòng)物、 犬科動(dòng)物、羊科動(dòng)物和鯨類(lèi)。
當(dāng)一些卵子受精，并有若干胚胎長(zhǎng)成時(shí)，至少可以利用所確定的狀態(tài)選擇供移植的胚胎。
分析檢驗(yàn)可以包括獲得培養(yǎng)基的波譜。在一些實(shí)施方案中，對(duì)波譜進(jìn)行校正，確定一些 胚胎的培養(yǎng)基的波譜記錄與使用這些胚胎懷孕成功的記錄之間實(shí)際的相互關(guān)系，然后在此波 譜上運(yùn)用該相互關(guān)系來(lái)確定胚胎的狀態(tài)。在一些實(shí)施方案中，該波譜是一種光譜。所說(shuō)的波 譜可以含有與培養(yǎng)基的氧化壓力組分有關(guān)的信息。
當(dāng)胚胎被深低溫冷藏時(shí)，可以定期地獲得該深低溫冷藏的培養(yǎng)基的光譜，由該深低溫冷 藏的培養(yǎng)基的光譜可確定胚胎的狀態(tài)，用于在深低溫冷藏期間對(duì)深低溫冷藏的胚胎進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
在一些實(shí)施方案中，提供了一種輔助生殖技術(shù)(ART)的方法。
這種方法包括在卵子的卵泡液中提取多個(gè)卵子，分析檢驗(yàn)每個(gè)卵子的卵泡液，以確定該 卵子的狀態(tài)，并依據(jù)狀態(tài)選擇深低溫冷藏或受精。卵泡液的分析檢驗(yàn)基本上與培養(yǎng)基的相同。
在一些實(shí)施方案中，提供了一種方法，該方法可產(chǎn)生生殖健康程序在患者中獲得成功結(jié) 果的或然率數(shù)據(jù)。該方法包括，使用所選擇的分析模式，獲得至少一種與液體培養(yǎng)基交換代
謝產(chǎn)物的細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中的至少一種代謝產(chǎn)物的波譜，該細(xì)胞選自卵子、精子、和胚胎； 然后，利用所獲得的波譜，以及針對(duì)患者群體已建立的生殖健康程序的成功結(jié)果與用所選擇 的分析模式得到的液體培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物的波譜之間的相互關(guān)系，產(chǎn)生所說(shuō)的至少一種細(xì) 胞的成功或然率數(shù)據(jù)。這些液體培養(yǎng)基的分析檢驗(yàn)基本上是相同的。
上述的分析模式可以是單波長(zhǎng)或多波長(zhǎng)的光吸收、拉曼散射或光學(xué)熒光。該光譜可以在 短波長(zhǎng)的近紅外線范圍內(nèi)。所選擇的分析模式也可以是醒R。
生殖健康程序可以涉及先兆子癇、IAI或羊膜內(nèi)炎、早產(chǎn)、反復(fù)流產(chǎn)、胚胎植入、性別 決定、環(huán)境污染/傳染、異位妊娠、正常妊娠、子宮內(nèi)膜異位癥。
在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種輔助生殖技術(shù)(ART)的方法。該方法包括提供 含有一個(gè)或多個(gè)精子的精子漿液樣品，分析檢驗(yàn)該精子漿液以確定該精子的狀態(tài)，然后依據(jù)該狀態(tài)選擇該精子進(jìn)行深低溫冷藏或受精。
在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種輔助生殖技術(shù)(ART)的方法。該方法包括分析 檢驗(yàn)患者的子宮內(nèi)膜液，以確定該子宮對(duì)植入胚胎的發(fā)育能力，并依據(jù)該發(fā)育能力確定植入 胚胎的時(shí)機(jī)。例如，如果該發(fā)育能力較弱，則重復(fù)進(jìn)行檢驗(yàn)，在發(fā)育能力較強(qiáng)的時(shí)候確定為 植入的時(shí)機(jī)。例如，至少可對(duì)患者提供飲食、休息/運(yùn)動(dòng)、和醫(yī)療介入的其中之一種干預(yù)，以 增強(qiáng)其發(fā)育能力。
子宮內(nèi)膜液可用光學(xué)法在原位測(cè)定，然后該分析檢驗(yàn)可獲得一份光譜。
在一些實(shí)施方案中，提供了一種確定與液體培養(yǎng)基交換代謝產(chǎn)物的細(xì)胞的狀態(tài)的方法。 該方法包括，使用所選擇的分析模式，獲得至少一種細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中的至少一種代謝產(chǎn) 物的光譜，并利用所獲得的光譜，以及針對(duì)細(xì)胞群體所建立的至少一種細(xì)胞的狀態(tài)與用所選 擇的分析模式得到的液體培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物的光譜之間的相互關(guān)系，產(chǎn)生所說(shuō)的至少一種 細(xì)胞的成功或然率數(shù)據(jù)。
在一些實(shí)施方案中，分析的模式是光學(xué)光譜法，例如，光的拉曼散射、光吸收或光 學(xué)熒光。在一些實(shí)施方案中，所說(shuō)的光譜提供了有關(guān)液體培養(yǎng)基的氧化壓的信息。
在其他的實(shí)施方案中，提供了在培養(yǎng)基中使一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞維持或生長(zhǎng)的方法。該方法 包括，根據(jù)由選擇的分析模式得到的培養(yǎng)基的光譜所確定的細(xì)胞狀態(tài)，對(duì)該培養(yǎng)基進(jìn)行調(diào)整。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，提供了一種儀器，用來(lái)對(duì)體外在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的一個(gè)或多 個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)進(jìn)行控制。這種儀器包括光譜獲得裝置，用來(lái)獲得培養(yǎng)基的光譜；將光譜數(shù) 據(jù)與細(xì)胞的狀態(tài)關(guān)聯(lián)的相關(guān)數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫(kù)；確定狀態(tài)的信息處理系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用相關(guān)數(shù)據(jù) 和光譜產(chǎn)生表示細(xì)胞狀態(tài)的數(shù)據(jù)；培養(yǎng)基控制器，它可產(chǎn)生控制信號(hào)，以實(shí)現(xiàn)在培養(yǎng)基中對(duì) 表示細(xì)胞狀態(tài)的數(shù)據(jù)應(yīng)答的調(diào)整。上述的控制器可以是全自動(dòng)的，用來(lái)改變培養(yǎng)基參數(shù)的閥 門(mén)或開(kāi)關(guān)也是全自動(dòng)的，或者它能夠向技術(shù)員報(bào)告，讓技術(shù)員去操作所需要的調(diào)整。在一些 實(shí)施方案中，所說(shuō)的光譜包含培養(yǎng)基中至少一種組分的有關(guān)氧化壓力的信息。
作為實(shí)施例，上述對(duì)培養(yǎng)基的調(diào)整可以是對(duì)環(huán)境溫度、或氣體組分，如溶解氧方面的調(diào) 整。同樣，例如，該調(diào)整也可以是在培養(yǎng)基中加入某種物質(zhì)去改變PH，或加入蛋白。在其他場(chǎng)合，合適的調(diào)整是替換培養(yǎng)基。
上述的儀器能夠利用所說(shuō)的狀態(tài)作為反饋信息而進(jìn)行操作來(lái)使培養(yǎng)基改變。通過(guò)一次調(diào) 整使?fàn)顟B(tài)產(chǎn)生可測(cè)量的變化所需的時(shí)間通常就確定了反饋環(huán)的循環(huán)時(shí)間。當(dāng)然，當(dāng)調(diào)整立刻 影響培養(yǎng)基的光譜時(shí)，可緊隨調(diào)整再獲得光譜，那么，調(diào)整后立即測(cè)得的以及在隨后的某一 時(shí)間測(cè)得的狀態(tài)的改變，便可用來(lái)評(píng)估該調(diào)整是否有利于細(xì)胞的維持或生長(zhǎng)。
為了本發(fā)明的目的，下面的術(shù)語(yǔ)定義如下
術(shù)語(yǔ)"體液"是指全血、血漿、血清、尿液、唾液、淚液、羊膜液、腦脊髓液(CSF)、 乳液、陰道液、子宮液、精液。
術(shù)語(yǔ)"培養(yǎng)基"是指營(yíng)養(yǎng)物和鹽溶液的任何一種混合物，它可用來(lái)維持在實(shí)驗(yàn)室中體外 培養(yǎng)的活細(xì)胞，包括配子和胚胎。對(duì)于某些分析模式，例如光學(xué)光譜法，分析的培養(yǎng)基可以 是冰凍的形式而不會(huì)影響其獲得有用的光譜的能力。
術(shù)語(yǔ)"患者"是指調(diào)查、觀察、監(jiān)測(cè)或研究的對(duì)象，無(wú)論是人或動(dòng)物。
術(shù)語(yǔ)"非侵入的"是指透皮的或經(jīng)皮的光譜學(xué)分析，該分析是在原位，或是在患者的體 內(nèi)操作，是最低限度的侵入，例如通過(guò)取出小量體積的體液。
術(shù)語(yǔ)"與氧化壓力有關(guān)的疾病"是指引起氧化壓力或由氧化壓力引起或依賴(lài)于氧化壓力 的疾病。
術(shù)語(yǔ)"氧化壓力組分"是指對(duì)體液培養(yǎng)基或其它的研究樣品中的某種生物化學(xué)組分的親 氧化劑/抗氧化劑平衡的干擾，對(duì)前者有利時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致對(duì)組織的損害。同樣，"氧化壓力 組分"是指對(duì)體液培養(yǎng)基或其它的研究樣品中的多種生物化學(xué)組分的親氧化劑/抗氧化劑平衡 的干擾，對(duì)前者有利時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致對(duì)組織的損害。
術(shù)語(yǔ)"氧化還原的識(shí)別標(biāo)志"是指來(lái)自多波長(zhǎng)光吸收光譜學(xué)分析或NMR光譜學(xué)分析的氧 化壓力成分或0S生物學(xué)副產(chǎn)物的集合體。
術(shù)語(yǔ)"抗體"是指實(shí)質(zhì)上由一種免疫球蛋白基因或多種免疫球蛋白基因或其片段編碼的 多肽。己認(rèn)可的免疫球蛋白基因包括k、 X、 a、 Y、 S、 e和u恒定區(qū)域內(nèi)的基因以及 許多免疫球蛋白可變區(qū)域的基因。輕鏈歸為k或A類(lèi)。重鏈歸為Y、 y、 a、 S或e類(lèi)，這反過(guò)來(lái)又確定了免疫球蛋白的分類(lèi)，分別為lgG、 lgM、 lgA、 lgD和lgE。
術(shù)語(yǔ)"生物標(biāo)志物"或"靶標(biāo)志物"是指與特定的程序或醫(yī)學(xué)癥狀或所研究的疾病，如
體外受精或老年癡呆癥有關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)、酶、肽、小分子、氧化壓力化合物、或其它生 物化合物的量變曲線。與特定的生物標(biāo)志物的構(gòu)成有關(guān)的數(shù)據(jù)被轉(zhuǎn)換為新的"代謝組量變曲 線"或"指印"。每條量變曲線通常是采用專(zhuān)有的信息學(xué)進(jìn)行分析，該信息學(xué)可將上述數(shù)據(jù)與 臨床癥狀或結(jié)果相關(guān)聯(lián)。代謝組的量變曲線可以用來(lái)系統(tǒng)地辨認(rèn)出通常很微小的差別，該差 別是正常的生理狀態(tài)與疾病開(kāi)始或發(fā)展?fàn)顟B(tài)間的，或個(gè)體對(duì)治療藥物的反應(yīng)之間的差別。這 種技術(shù)可以應(yīng)用到跨幾個(gè)科學(xué)的學(xué)科和應(yīng)用的領(lǐng)域。
術(shù)語(yǔ)"胚胎質(zhì)量"定義為在隨后的程序中使用的合格胚胎的質(zhì)量表示，并反映出胚胎用 于涉及胚胎的選擇和移植的程序中的發(fā)育能力，這些程序例如是體外受精、以及植入以達(dá)到 懷孕的目的、短期貯藏、長(zhǎng)期貯藏，包括深低溫冷藏。短期貯藏定義為從約3天至約5年的 貯藏。長(zhǎng)期貯藏定義為長(zhǎng)于5年至無(wú)限期的貯藏。
術(shù)語(yǔ)"卵子質(zhì)量"定義為在隨后的程序中使用的合格卵子的質(zhì)量表示，并反映出卵子用 于涉及卵子的選擇和移植的程序中的發(fā)育能力，這些程序例如是體外受精、以及植入以達(dá)到 懷孕的目的、短期貯藏、長(zhǎng)期貯藏，包括深低溫冷藏。短期貯藏定義為約3天至約5年的貯 藏。長(zhǎng)期貯藏定義為長(zhǎng)于5年至無(wú)限期的貯藏。
術(shù)語(yǔ)"精子質(zhì)量"定義為在隨后的程序中使用的合格精子的質(zhì)量表示，并反映出精子用 于涉及精子的選擇和移植的程序中的發(fā)育能力力，這些程序例如是體外受精、以及植入以達(dá) 到懷孕的目的、短期貯藏、長(zhǎng)期貯藏，包括深低溫冷藏。短期貯藏定義為從約3天至約5年 的貯藏。長(zhǎng)期貯藏定義為長(zhǎng)于5年至無(wú)限期的貯藏。
術(shù)語(yǔ)"HLA-G"是指人體白細(xì)胞抗原G，并包括可溶的和不可溶的兩種形式，除非另有說(shuō) 明。該術(shù)語(yǔ)在相應(yīng)的上下文中是指抗原或基因座。
術(shù)語(yǔ)"整連蛋白、泛蛋白、選凝素、生長(zhǎng)因子、抑制素和其它激素、其它酶、小分子和 肽"是有代表性的生物標(biāo)志物，這些生物標(biāo)志物具有其不同的公認(rèn)的科學(xué)含義。
術(shù)語(yǔ)"免疫分析"是一種分析方法或方法論，它利用抗體來(lái)與被分析物特異結(jié)合。免疫分析的特征是利用至少一種抗體的特異結(jié)合性質(zhì)來(lái)分離、靶向或定量被分析物。
術(shù)語(yǔ)"分離的"、"純化的"、或"生物純的"是指實(shí)質(zhì)上或基本上不含在天然狀態(tài)下通常 與其伴隨存在的組分的材料。
術(shù)語(yǔ)"標(biāo)記物"在由以下方法可檢測(cè)的合成物中使用光譜法、光化學(xué)法、生物化學(xué)法、 免疫化學(xué)法、或化學(xué)法。例如，有用的標(biāo)記物包括熒光染料、電子致密試劑、量熱劑、酶， 例如ELISA中常用的酶、生物素、地高辛、或已有抗血清或單克隆抗體因而可檢測(cè)的半抗原 和蛋白質(zhì)。
此處涉及的所有參考文獻(xiàn)特此引入作為參考。


由以下的詳述并結(jié)合附圖，本發(fā)明更多的特征和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)更顯而易見(jiàn)，其中-
圖1是光學(xué)氧化壓力測(cè)定裝置的示意圖，包括一個(gè)光徑為lcm長(zhǎng)的5(￥1樣品池，由寬帶 的鴇鹵素?zé)敉ㄟ^(guò)第一條光纖供光， 一臺(tái)短波長(zhǎng)近紅外分光光度計(jì)(SWNIR)通過(guò)第二條光纖連 接在樣品池的另一端，用于檢測(cè)600nm-1100nm范圍的CW強(qiáng)度，還有一臺(tái)與該分光光度計(jì)連 接的計(jì)算機(jī)，用于光譜的記錄和分析。
圖2表明不同種類(lèi)的各種分子種在600nm-1000nm波長(zhǎng)范圍的吸收水平。
圖3表明20個(gè)IVF胚胎培養(yǎng)基樣品的拉曼光譜。
圖4表明帶有標(biāo)準(zhǔn)偏差的拉曼光譜。
圖5表明能發(fā)育的樣品的光譜。
圖6表明交叉驗(yàn)證。
圖7是發(fā)育中胚胎的代謝組學(xué)識(shí)別特征，用帶有紫外光檢測(cè)的毛細(xì)管電泳獲得，該檢測(cè) 可確定培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物和代謝產(chǎn)物的級(jí)分。
注意，所有附圖中，相同的特征用相同的參照數(shù)字確認(rèn)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供一種用于關(guān)聯(lián)波譜的方法和儀器，所說(shuō)的波譜例如是培養(yǎng)基或體液的多波長(zhǎng) 光吸收、拉曼散射光譜、或磁共振譜，其中的體液例如是，取自與氧化壓力有關(guān)疾病患者的 體液。
氧化壓力測(cè)定現(xiàn)在尚未作為診斷或預(yù)見(jiàn)病癥開(kāi)始的一種方法而在臨床中使用。本發(fā)明提 供了一種能迅速測(cè)定氧化壓力的適用于臨床環(huán)境的方法。
為了更好地研究癥狀的時(shí)間過(guò)程，從而能夠千預(yù)和改正氧化壓力的水平，從這觀點(diǎn)來(lái)看， 以前還沒(méi)有縱向地(全過(guò)程)對(duì)氧化壓力進(jìn)行過(guò)測(cè)定。本發(fā)明提供了一種儀器，該儀器能夠 非侵入地以適合用于任何患者的方式快速測(cè)定氧化壓力。
作為實(shí)施例，本發(fā)明提供了一種利用光學(xué)分析方法來(lái)測(cè)定體液中一種或多種氧化壓力組 分的一種手段。按照本發(fā)明，所分析的體液可以是全血、血漿、血清、尿液、唾液、淚液和 腦脊髓液(CSF)、羊膜液、乳液、陰道液或子宮液中的任意一種或其混合物。另一方面，本 發(fā)明提供了一種測(cè)定培養(yǎng)基中一種或多種氧化壓力組分的方法，以確定卵子的質(zhì)量、胚胎的 質(zhì)量、精子的質(zhì)量等。光學(xué)分析可用光譜中不同范圍的波長(zhǎng)來(lái)完成，例如NIR、 S麗IR和THz 范圍。除了吸收光譜以外，拉曼光譜、熒光光譜也可以用作分析。
本發(fā)明還提供一種方法和儀器，用來(lái)測(cè)定與氧化壓力有關(guān)的癥狀在患者或樣品中存在的 或然率數(shù)據(jù)。針對(duì)患者群或樣品群，建立與氧化壓力有關(guān)的疾病和用選擇的分析模式獲得的 體液的波譜之間的相互關(guān)系。對(duì)于要測(cè)定其或然率數(shù)據(jù)的患者，用選擇的分析模式獲得體液 的波譜。利用所獲得的譜和已建立的相互關(guān)系，產(chǎn)生該患者的或然率數(shù)據(jù)。
本發(fā)明還提供了測(cè)定胚胎質(zhì)量的方法，以便其在隨后的程序中使用，該質(zhì)量包括精子的 發(fā)育能力。這些方法包括通過(guò)對(duì)胚胎發(fā)育能力的生物標(biāo)志物的代謝組量變曲線的評(píng)估，利 用體外受精和胚胎移植(IVF/ET)以及輸卵管胚胎移植(TET)技術(shù)將胚胎移植到子宮。
BSM技術(shù)平臺(tái)可以應(yīng)用于許多不同的診斷、預(yù)后和監(jiān)測(cè)顯示中，包括體外受精程序(IVF)。 研究表明，BSM可以容易地以非侵入的方式實(shí)施，并且具有高度的靈敏度和專(zhuān)一性。小型的 設(shè)備可很容易適用于商業(yè)單位的大規(guī)模生產(chǎn)。大多數(shù)針對(duì)代謝組學(xué)的方法都依賴(lài)下述的技術(shù)作為其核心技術(shù)例如質(zhì)譜術(shù)、NMR、 HPLC、 電泳和很多基于蛋白組學(xué)的分析檢驗(yàn)方法，包括微矩陣和免疫分析等。雖然這些技術(shù)對(duì)于一 些應(yīng)用，例如在研究、服務(wù)或臨床參考實(shí)驗(yàn)室中的應(yīng)用，都是有用的方法，但是這些方法是 費(fèi)錢(qián)和復(fù)雜的。相反，BSM是用小型、方便使用和便攜的現(xiàn)場(chǎng)使用設(shè)備來(lái)實(shí)施的，該設(shè)備甚 至可用于篩選的目的。
有關(guān)化學(xué)和生物樣品中組分的相對(duì)定量的信息可以由光譜通過(guò)使光譜標(biāo)準(zhǔn)化，產(chǎn)生峰的 強(qiáng)度值而得到，該強(qiáng)度值精確地反映了相應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)的濃度。由固有組分的峰強(qiáng)度計(jì)算出 標(biāo)準(zhǔn)化的因子，這些固有組分的濃度在一系列樣品中是保持恒定的。 一種組分在不同樣品中 的相對(duì)濃度可以由標(biāo)準(zhǔn)化的峰強(qiáng)度判斷。與常規(guī)的方法不同，它不需要內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)和添加試劑。 在蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的研究中，該方法對(duì)差示表型分析尤為有用，在該分析中，確認(rèn)了 其濃度在不同樣品中變化的分子。這些被確認(rèn)的分子種可以用作疾病或?qū)χ委煈?yīng)答的生物標(biāo) 志物。
自由基是在其外層軌道含有不配對(duì)電子的原子或分子。它們的電子形態(tài)使得這些化學(xué)物 質(zhì)與膜脂、蛋白、核酸和其他細(xì)胞基質(zhì)具有高的反應(yīng)活性。自由基可以來(lái)自環(huán)境的來(lái)源，或 可以在組織內(nèi)再產(chǎn)生。
過(guò)氧化物陰離子(02—)、過(guò)氧化氫(HA)、單純氧、次氯酸(H0C1)、過(guò)亞硝酸鹽(ONOO-)、 羥基自由基(0H*)是內(nèi)源產(chǎn)生的反應(yīng)性氧類(lèi)物質(zhì)(ROS)的例子。過(guò)渡金屬，例如亞鐵離子 (Fe2+)或亞銅的銅(Cu1+)，在細(xì)胞的氧化還原化學(xué)中，通過(guò)將仏02還原為高細(xì)胞毒性的OH* 自由基(芬頓催化)而起重要的作用。在哺乳類(lèi)動(dòng)物的組織中，進(jìn)化保守的抗氧化酶(例如 過(guò)氧化物岐化酶、過(guò)氧化氫酶、甘肽過(guò)氧化物酶以及各種氧化還原酶)與許多非酶的低分子 量的抗氧化劑化合物(例如GSH、硫氧還蛋白、抗壞血酸、生育酚、尿酸、退黑激素、膽紅 素)協(xié)同起作用，以維持氧化還原反應(yīng)在體內(nèi)的平衡。通過(guò)將過(guò)渡金屬維持在相對(duì)低的氧化 還原狀態(tài)，金屬結(jié)合蛋白，例如鐵蛋白、運(yùn)鐵蛋白、乳鐵蛋白、金屬硫蛋白、血漿銅藍(lán)蛋白， 基本上成為組織和體液中的抗氧化劑蛋白。
氧化壓力(0s)被定義為"在親氧化劑/抗氧化劑平衡中的干擾，對(duì)前者有利時(shí)，導(dǎo)致可能的[組織]損傷"。這種平衡可以與體液中的一種或多種生物化學(xué)組分有關(guān)。氧化壓力被牽 連為細(xì)胞機(jī)能障礙和死亡的重要常見(jiàn)途徑，而且可能是很多人類(lèi)內(nèi)科疾病的治療目標(biāo)，這些 疾病包括癌癥、糖尿病、阻塞性肺疾患、炎性的腸道疾病、心臟缺血、腎小球腎炎、斑疹變 性以及各種神經(jīng)變性的疾患。
由此，目前已知道采用色譜技術(shù)和質(zhì)譜儀來(lái)測(cè)定血漿和腦瘠液(CSF)中的氧化壓力。這 種分析技術(shù)很費(fèi)時(shí)，而且要獲得相當(dāng)大量的體液來(lái)取得氧化壓力的測(cè)定結(jié)果。
本發(fā)明所用的生物標(biāo)志物包括炎癥標(biāo)志物、氧化壓力標(biāo)志物、和細(xì)胞損傷標(biāo)志物，或它 們的結(jié)合。炎癥標(biāo)志物包括但不限于細(xì)胞因子、或其它促進(jìn)白細(xì)胞或炎癥細(xì)胞的吸引力的 炎癥介質(zhì)。炎癥標(biāo)志物可以，但不是必須由炎癥細(xì)胞釋放。癥標(biāo)志物包括但不限于8-異前 列烷(8-isoprostane)、髓過(guò)氧化物酶、IL-6和C-活性蛋白。氧化壓力標(biāo)志物顯示出由氧化 劑或自由基引起的細(xì)胞損傷。氧化壓力標(biāo)志物包括到達(dá)其各自的目標(biāo)，例如脂、蛋白或DNA 的自由基和氧化劑，以及由自由基和氧化劑引起的損傷的間接標(biāo)志物。氧化壓力標(biāo)志物包括 但不限于游離鐵、8-異前列烷、髓過(guò)氧化物酶、谷甘胱肽過(guò)氧化物酶、脂質(zhì)氫過(guò)氧化物酶、 雙酪氨酸、和8-羥基喹啉。細(xì)胞損傷標(biāo)志物包括生物分子(例如酶)，其中該生物分子的釋 放與壞死或損傷的細(xì)胞有關(guān)。細(xì)胞損傷標(biāo)志物包括但不限于:肌酸激酶和乳酸脫氫酶。 一些 生物標(biāo)志物可以歸類(lèi)于一種以上的標(biāo)志物類(lèi)型。例如，8-異前列烷可歸為炎癥標(biāo)志物和氧化 壓力標(biāo)志物兩類(lèi)。
本發(fā)明提供了一種處理波譜數(shù)據(jù)的方法，其中的波譜包含有峰強(qiáng)度的峰。由多個(gè)化學(xué)樣 品，例如含有代謝產(chǎn)物、蛋白或肽的生物樣品，獲得了一組波譜。該波譜可以是由下述方法 得到的質(zhì)譜例如，電子噴射離子化(EST)、基質(zhì)促進(jìn)的激光解吸離子化(MALDI),或電子 撞擊離子化(EI)。每個(gè)波譜的峰強(qiáng)度通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化因子換算，產(chǎn)生與對(duì)應(yīng)組分的濃度成比例的 峰強(qiáng)度。根據(jù)換算的峰強(qiáng)度，可以估計(jì)特定樣品中組分的相對(duì)濃度。標(biāo)準(zhǔn)化因子根據(jù)化學(xué)樣 品中的組分計(jì)算得出，該組分的濃度在其各個(gè)化學(xué)樣品中的濃度基本上是不變的。在一個(gè)實(shí) 施方案中，這些組分未預(yù)先確定，而且是化學(xué)樣品中的固有組分，在另一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo) 準(zhǔn)化因子由所說(shuō)的一組波譜中的兩個(gè)(例如第一和第二個(gè))波譜的峰強(qiáng)度之間的比率計(jì)算而得，而且是非參量性的測(cè)定，例如是中值。 包括體外受精的輔助生殖技術(shù)(ART)
本發(fā)明的方法可用于確定體外受精的成功時(shí)機(jī)。目前，在體外受精(IVF)實(shí)驗(yàn)室中，對(duì) 前胚胎的選擇只能根據(jù)其在受精后的前48-72小時(shí)期間的形態(tài)和體外的卵裂速率來(lái)進(jìn)行。這 些標(biāo)準(zhǔn)是有用的，但是，作為發(fā)育潛力的指標(biāo)，這些標(biāo)準(zhǔn)不總是好的。在大多數(shù)情況下，根 據(jù)這些相對(duì)粗糙的指標(biāo)選擇3或4個(gè)胚胎，然后移植到子宮腔中。如果在生物化學(xué)、遺傳、 發(fā)育參數(shù)的基礎(chǔ)上，另外提供更嚴(yán)格的前胚胎選擇的標(biāo)準(zhǔn)，則有可能移植一個(gè)或兩個(gè)成活可 能性最大的健康胚胎，而不會(huì)使患者處于因反復(fù)發(fā)生的胚胎植入的失敗、自然流產(chǎn)、多次IVF 試驗(yàn)或多次妊娠的風(fēng)險(xiǎn)所引起的心理創(chuàng)傷之中。因此，為了成功的植入，醫(yī)學(xué)上需要一種更 有預(yù)見(jiàn)性的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。
生殖健康(IVF)
目前，商業(yè)上還沒(méi)有診斷的檢驗(yàn)方法去評(píng)估卵子、精子或胚胎的能力?，F(xiàn)在，胚胎的選 擇是在任意的形態(tài)、速率的尺度的基礎(chǔ)上進(jìn)行的。著床前胚胎遺傳學(xué)診斷(PGD)是一種檢驗(yàn) 有限數(shù)量的遺傳疾病，但不能用于預(yù)見(jiàn)胚胎的能力的程序，PGD是有高度侵入性的標(biāo)準(zhǔn)化的 程序，它僅在美國(guó)的很少幾個(gè)專(zhuān)業(yè)化的實(shí)驗(yàn)室中使用。再者，該程序很費(fèi)錢(qián)、費(fèi)時(shí)，而且很 有爭(zhēng)議。這種技術(shù)在生殖健康和產(chǎn)科醫(yī)學(xué)方面的其它應(yīng)用包括對(duì)下述方面的評(píng)估先兆子癇、 IAI或羊膜內(nèi)炎、早產(chǎn)、反復(fù)流產(chǎn)、胚胎植入、性別決定、環(huán)境污染、傳染、異位妊娠、正 常妊娠、子宮內(nèi)膜異位癥等。
卵子
直至最近，人們還是假定卵子一般是"正常"或合格的。它們不被看成可能是在IVF中 造成障礙的來(lái)源，除非在觀察到形態(tài)發(fā)生嚴(yán)重變異，或如果該卵細(xì)胞是不成熟的(主要用大 小度量)明顯情況下。在上述的情況下，有缺陷的卵細(xì)胞會(huì)被丟棄，并繼續(xù)被丟棄。然而， 增長(zhǎng)的科學(xué)証據(jù)正在改變這種見(jiàn)解，正如幾份新的報(bào)告(最近，2005年的ASRM年會(huì))已證 明的，在年輕的女性(21-31歲)中，所有卵子的50%至高達(dá)75%是不正常的(非整倍體的)， 而且，該數(shù)字隨著年齡而顯著地上升。 一般來(lái)說(shuō)，由于對(duì)人類(lèi)卵子缺乏在任何水平，如基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)或代謝組學(xué)水平上的調(diào)査研究，因此，就沒(méi)有令人滿意的用于卵子選擇的 程序。
基因組學(xué)檢驗(yàn)
一些基因組學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)只是最近(不到2年)才使其適用于嚐試評(píng)估卵子的能力中(例 如，比較基因組雜交)。這些技術(shù)尚處在其發(fā)展的初期，還未標(biāo)準(zhǔn)化或被承認(rèn)，而且離開(kāi)成為 IVF試驗(yàn)室中實(shí)用的、有普通席位的程序還相差很遠(yuǎn)。目前，這些程序是很費(fèi)錢(qián)、費(fèi)力的， 而且對(duì)卵子的侵入性程度很高，因?yàn)樾枰雎鸭?xì)胞的切片。這種切片的作用，即使有，也是 未知的。
新近，著床前胚胎遺傳學(xué)診斷(PGD)已通過(guò)評(píng)估胚胎中非整倍體的發(fā)生率，間接地用于 卵子質(zhì)量的研究，其中所說(shuō)的胚胎如沒(méi)有非整倍體的發(fā)生，則是在健康、形態(tài)方面合格的胚 胎。在這些研究中，甚至取自年輕女性的卵子都發(fā)現(xiàn)其染色體異常的發(fā)生率都很高；根據(jù)推 斷，該非正常的胚胎來(lái)源于非正常的卵子。令人信服地，用CGH或PGD程序在卵子中檢測(cè)得 到的非整倍體發(fā)生率是很相似的，約為50%。
胚胎
從歷史的事實(shí)看，為了監(jiān)測(cè)和預(yù)見(jiàn)IVF的成功，胚胎作為干預(yù)的目標(biāo)更為引人注目。IVF 的"圣杯(holygrail)"是為了了解哪些胚胎是能發(fā)育的、合格的胚胎以及哪些不是。其前 題是有一種程序一貫地只鑒定并選擇出高質(zhì)量的胚胎，即具有引起妊娠的最大可能性的胚 胎，這種胚胎可以常規(guī)地進(jìn)行選擇來(lái)用于移植。其本身又可期望提高妊娠率而降低一胎多生 的幾率，因?yàn)槿绻A(yù)知這些胚胎是能發(fā)育的，就只需移植較少的胚胎。
形態(tài)的評(píng)估
現(xiàn)今，在IVF實(shí)驗(yàn)室中，基于+卜+4分級(jí)系統(tǒng)的胚胎形態(tài)的評(píng)估是確定胚胎發(fā)育能力的 主要方法。胚胎通常用"分級(jí)胚胎記分(GES)"進(jìn)行評(píng)價(jià)。GES系統(tǒng)在受精后的前72小時(shí)期 間進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)每個(gè)胚胎，按最大為100分進(jìn)行記分。GES分大于70的胚胎有最大的可能發(fā) 育成為能發(fā)育的胚泡，該胚泡在胚胎移植(ET)后，接著植入子宮內(nèi)層(或內(nèi)膜)中并產(chǎn)生能 發(fā)育的妊娠。這樣，GES建立了一套完整的標(biāo)準(zhǔn)，為ET在有關(guān)選擇胚胎方面向患者提出建議。對(duì)于培養(yǎng)過(guò)程中的胚胎發(fā)育模式(例如，卵裂速率、裂殖、包涵體、內(nèi)細(xì)胞群等)也進(jìn) 行了評(píng)價(jià)，但是，就這些量度的使用而言，胚胎學(xué)家之間甚至很少一致。由于缺乏國(guó)家的或 國(guó)際的標(biāo)準(zhǔn)所帶來(lái)的明顯困難，形態(tài)的評(píng)估遭受到麻煩。內(nèi)部和外部的觀測(cè)者與生俱來(lái)的易 變傾向與分級(jí)系統(tǒng)的主觀性，以及缺乏任何有關(guān)的生物學(xué)的量度結(jié)合起來(lái)，阻止了該方法的 發(fā)展。此外，該分級(jí)系統(tǒng)的基本科學(xué)缺陷是因下述的原則而引起的形態(tài)分析不能被認(rèn)可為 是生物學(xué)功能的測(cè)定。這種方法的局限性在最近的ASRM年會(huì)上再次受到熱烈的關(guān)注。然而， 由于還沒(méi)有產(chǎn)生替代的方法，胚胎學(xué)家們?nèi)员仨氁蕾?lài)于這種分級(jí)系統(tǒng)。
通過(guò)分析生長(zhǎng)的細(xì)胞和胚胎的代謝組學(xué)的光譜量變曲線，可評(píng)估對(duì)營(yíng)養(yǎng)物、補(bǔ)給品、PH 和代謝產(chǎn)物的調(diào)整。這樣可以連續(xù)監(jiān)測(cè)細(xì)胞和胚胎的生長(zhǎng)，并使其最佳化。例如，對(duì)確定的 氧化壓力水平可以進(jìn)行測(cè)定，或通過(guò)補(bǔ)充化學(xué)物質(zhì)，如氧化劑來(lái)抵消。更具體地說(shuō)，根據(jù)對(duì) 培養(yǎng)基的監(jiān)測(cè)，較弱的胚胎可以補(bǔ)充更多的氧，或改良其生長(zhǎng)培養(yǎng)基，以提高該胚胎的發(fā)育 能力，例如更改培養(yǎng)基的pH、除去代謝產(chǎn)物、在培養(yǎng)基中補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物。根據(jù)本發(fā)明的對(duì)培養(yǎng) 基的監(jiān)測(cè)，在第3天的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的弱胚胎可以轉(zhuǎn)移到第5天的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
子宮的評(píng)估
子宮對(duì)胚胎植入的發(fā)育能力可以與子宮內(nèi)膜液，即子宮壁的內(nèi)層液體的分析光譜組分相關(guān)。
該方法論可應(yīng)用于測(cè)定子宮頸粘液和子宮內(nèi)層內(nèi)膜的代謝組量變曲線，以確定該內(nèi)膜對(duì) 胚胎植入的生物接受能力。雖然不同子宮的內(nèi)膜內(nèi)層可以用采用光纖的不同光譜法非侵入式 地進(jìn)行檢査，該方法將光纖通過(guò)子宮頸直接插入子宮，但是，作為一種生物液體，子宮頸粘 液可以通過(guò)不同的光譜法進(jìn)行分析，以確定表明有接受能力的內(nèi)膜特征的代謝組學(xué)量變曲線。 子宮內(nèi)膜的代謝組測(cè)定將會(huì)導(dǎo)致胚胎植入成功率的提高，因而妊娠率也提高。
著床前遺傳學(xué)診斷和基因組學(xué)檢驗(yàn)
胚胎的基因組學(xué)檢驗(yàn)(即，CGR)受到與上面提及的卵子同樣的限制，而且到目前為止， 胚胎的CGR還未受到科學(xué)界可信任的關(guān)心。然而，目前ART領(lǐng)域卻得益于著床前遺傳學(xué)診斷 的程序，該程序可用于對(duì)發(fā)育中的胚胎篩査其有限的幾種特殊的遺傳病和非整倍體，非整倍體使23對(duì)可能受到影響的染色體中的9對(duì)受到影響。PGD是一種費(fèi)力的程序，它與另一種稱(chēng) 為熒光原位雜交(FISH)的程序聯(lián)合使用。遺憾的是，PGD/FISH為IVF程序鑒定卵子和胚胎 的總體發(fā)育能力時(shí)，缺乏靈敏性和專(zhuān)一性。雖然PGD在檢測(cè)能影響胚胎的發(fā)育能力的非整倍 體中是有用的，但這不能證明在總體評(píng)估胚胎的發(fā)育能力中有用。PGD被認(rèn)為是有爭(zhēng)議的程序，因?yàn)樗枰鲈缙谂咛サ膯渭?xì)胞切片檢査，而且該過(guò)程本 身所固有的對(duì)健康風(fēng)險(xiǎn)也是未知的。盡管切片是在IVF實(shí)驗(yàn)室中完成，但該切片必須送到另 一遠(yuǎn)處的遺傳實(shí)驗(yàn)室去做染色體分析。PGD也被FDA和ASRM看成是一種試驗(yàn)程序，而且，由 于從試驗(yàn)所得的遺傳信息性質(zhì)的原因，已對(duì)其提出了生物倫理道德的問(wèn)題。作為IVF的常規(guī)、 主流的試驗(yàn)，PGD的費(fèi)用也是過(guò)高的。直至最近，該領(lǐng)域被PGD的占領(lǐng)，很有可能阻止了科 學(xué)家們繼續(xù)從事其它基因組的方法學(xué)或蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的研究。與本發(fā)明的代謝組量變曲線相比，PGD是很費(fèi)錢(qián)和對(duì)胚胎有侵入性的程序，因此未知風(fēng) 險(xiǎn)的程度很高；對(duì)遺傳疾病的試驗(yàn)有限制；而且費(fèi)時(shí)。此外，除了非整倍體的基因組學(xué)評(píng)估 之外，尚未證明PGD是測(cè)定胚胎的發(fā)育能力的有用方法。因?yàn)樗且环N復(fù)雜和費(fèi)錢(qián)的程序， 它不可能成為常規(guī)的胚胎評(píng)估中的主流方案。由于許多科學(xué)的、社會(huì)政治的理由，PGD仍被 考慮為一種試驗(yàn)程序。因此，代謝組量變曲線作為卵子和精子總體能力檢驗(yàn)的引進(jìn)，在技術(shù) 上是很大的進(jìn)步。胚胎生物標(biāo)志物至少己對(duì)一種胚胎發(fā)育能力的分子生物標(biāo)志物已經(jīng)稍嚴(yán)格地進(jìn)行了檢査，即一種稱(chēng)為可 溶的人白細(xì)胞抗原(sHLAG)的分子。這種蛋白是通過(guò)免疫分析法測(cè)定的，因此比較麻煩，周 期長(zhǎng)(數(shù)小時(shí))，而且運(yùn)轉(zhuǎn)起來(lái)費(fèi)錢(qián)。由于體積的限制(培養(yǎng)基樣品的體積)，該測(cè)定不能按 重復(fù)測(cè)兩份樣品的方式進(jìn)行，所以計(jì)算的精確度會(huì)有所降低。其它的蛋白組生物標(biāo)志物(如 整連蛋白e、遍在蛋白、HCG、其他)近來(lái)也被提出用于胚胎；但是，這些標(biāo)記物尚未被廣 泛地研究，而且，它們作為胚胎發(fā)育能力的標(biāo)志，其作用，如果有，還需要進(jìn)一步研究。實(shí)現(xiàn)單個(gè)胚胎的移植樹(shù)立信心，以單個(gè)胚胎移植過(guò)程作為一種手段，減少一胎多生而又不降低妊娠率，是IVF從事者的目標(biāo)，同樣也是ASRM和保險(xiǎn)提供者的目標(biāo)。遺憾的是，迄今已證明這是個(gè)難以達(dá)到 的目標(biāo)。人們預(yù)期到了代謝組量變曲線的可利用性，它可給予該從事者在IVF的臨床實(shí)踐中 選擇多個(gè)胚胎移植或單個(gè)胚胎移植的機(jī)會(huì)。因此可以領(lǐng)會(huì)到代謝組學(xué)檢驗(yàn)的益處，它包括 (i)提高治療的效果(即妊娠率)同時(shí)降低一胎多生(三胞胎或更多)的幾率；(ii)降低對(duì)母 親和后代的醫(yī)療風(fēng)險(xiǎn)；(iii)減少對(duì)多個(gè)早產(chǎn)嬰兒提供醫(yī)療健康看護(hù)的費(fèi)用；(iv)對(duì)IVF的較 寬的保險(xiǎn)覆蓋范圍；(v)給予尋求不育治療的患者更強(qiáng)的信心。人們也預(yù)期到代謝組量變曲線 為ART業(yè)界實(shí)現(xiàn)的其它益處的開(kāi)發(fā)，包括l)冷凍的供體卵細(xì)胞庫(kù)，它僅為未來(lái)的接受者提 供預(yù)選的，能發(fā)育的卵細(xì)胞，以及2)"卵子營(yíng)救"，該過(guò)程是收集合格的但多余的卵細(xì)胞， 用于深低溫冷藏，隨后在將來(lái)的下一輪IVF中受精。 sHLAG生物標(biāo)記物測(cè)定sHLAG單個(gè)生物標(biāo)記物的測(cè)定目前正在IVF程序中使用。所用的試劑盒另外還包含實(shí)施 本發(fā)明方法的說(shuō)明書(shū)。 干細(xì)胞通過(guò)分析培養(yǎng)基，本發(fā)明同樣可以應(yīng)用于測(cè)定培養(yǎng)基中一個(gè)或多個(gè)干細(xì)胞的發(fā)育能力。按照本發(fā)明，為了使干細(xì)胞分化為e細(xì)胞或分化的細(xì)胞類(lèi)型的分化達(dá)到最大化，必須對(duì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行評(píng)估，以測(cè)定這些干細(xì)胞的氧化壓力。利用干細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基，例如蛋 白或其他代謝產(chǎn)物的監(jiān)測(cè)光譜，可以對(duì)分化因子進(jìn)行鑒定。參照以下的實(shí)施例，將會(huì)更容易理解本發(fā)明，給出的實(shí)施例是用來(lái)說(shuō)明該發(fā)明而不是限 制其范圍的。實(shí)施例l由短波長(zhǎng)遠(yuǎn)紅外(SWNIR)光譜分析測(cè)定血漿中的OS取樣方法分析前，將樣品融化l小時(shí)以達(dá)到室溫，然后離心30分鐘。為了清潔和預(yù)處理樣品池， 該樣品池先用200W的0. 1M NaOH淋洗，然后用3X200W的純水淋洗。短波長(zhǎng)遠(yuǎn)紅外(SWNIR)光譜分析記錄第三次淋洗水的SWNIR光譜用作對(duì)照。隨即，將75W樣品注入樣品池，并用圖l所 示的儀器記錄樣品的光譜。由所制備的樣品按下述的方案獲得短波長(zhǎng)近紅外光譜。該測(cè)定是使用美國(guó)全像攝影近紅 外分光光度計(jì)完成的。該分光光度計(jì)配備了一個(gè)雙路徑的入口，這樣，參照可以與樣品同時(shí) 測(cè)量。所得的光譜覆蓋了 580-1100nm的范圍。該檢測(cè)儀器完成測(cè)定的時(shí)間是100微秒。所有 的樣品都測(cè)定50次，將結(jié)果平均以減少光譜的噪音。用印pendorff移液管將樣品送入內(nèi)徑 為10mm的樣品池中。大約使用的樣品。得到光譜數(shù)據(jù)后，樣品池先用200W的0. 1MNaOH， 然后用3倍體積的200W純水清洗。在每次的樣品測(cè)定后，另外獲取第三次淋洗水的參照光 譜。這樣可以監(jiān)測(cè)樣品池的污染或光學(xué)系統(tǒng)組合的變化。每個(gè)樣品的光譜都以連續(xù)流動(dòng)的水 樣品為參照，用于后面的程序。 IVF取樣卵子在卵子收集的期間， 一旦確認(rèn)了卵子，并將其移至支持培養(yǎng)基中之后，即從培養(yǎng) 皿中回收一份約含通常要丟棄的卵泡液。胚胎在IVF培養(yǎng)過(guò)程(叢受精至分裂為囊泡)的每個(gè)階段的結(jié)束，收集通常要丟棄的 用過(guò)的培養(yǎng)基，用BSM進(jìn)行分析。單個(gè)胚胎培養(yǎng)是該程序中制備胚胎的最好方法，但不是必 須要使用的方法。另一方面，PGD丟棄的培養(yǎng)基、輔助孵化技術(shù)和其他有關(guān)的ART程序也都 可以按類(lèi)似的方式分析。樣品可以直接用BSM分析，或冰凍保藏后，在將來(lái)進(jìn)行分析。卵子 和胚胎的選擇是根據(jù)在各自樣品中的生物標(biāo)志物的獨(dú)特代謝量變曲線來(lái)確定的。 液體樣品可以經(jīng)冰凍后直接使用，以得到光譜，或以后經(jīng)融化后再獲得光譜。分析方法學(xué) 事先選擇波長(zhǎng)S麗IR光譜包含各種的分子種的吸收。為了選出血漿中主要的分子種類(lèi)，如圖2所示， 確認(rèn)了與血紅素(700nm)、 CH(830nm)、 R0H(940nm)、 H20 (960nm)、 0H(980nm)和NH(1020nm) 組分有聯(lián)系的波長(zhǎng)范圍(15nm寬)。然后將這六個(gè)范圍組合在一起的吸收用于下面描述的回歸模型中。Haar小波變換Haar變換(HT)是最古老也是最簡(jiǎn)單的小波變換。與傅立葉變換相似，Haar變換將數(shù)據(jù)(例 如近紅外光譜)映射到一個(gè)給定的基組。與傅立葉變換不同的是，傅立葉變換使用正弦函數(shù)和 余弦函數(shù)作為基組，而HT使用Haar小波作為基組。在本研究中，離散的小波變換(DWT)是 從連續(xù)的小波變換或者小波包變換中挑選出來(lái)的，用以使計(jì)算的簡(jiǎn)單程度和速度最大化。對(duì) 定義在0 < ;c < 1范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)，對(duì)于DWT的Haar小波類(lèi)由以下公式給出1 ifOsx<l0其余范圍(1)1 ifOsx<% -1 if^sx<l0其余范圍(2)屮n,k, (x)=屮(2"x — k), 0 s k s 2n — 1(3)實(shí)現(xiàn)Haar變換包含將光譜分解為0，平，和甲 ，4,的加權(quán)和數(shù)，其中的權(quán)重為"小波 系數(shù)"。為了獲得父小波^的系數(shù)，對(duì)整個(gè)數(shù)據(jù)窗口上的信號(hào)求積分。母小波甲的權(quán)重由第一 半數(shù)據(jù)點(diǎn)積分后減去第二半數(shù)據(jù)點(diǎn)的總和得到。子小波是母小波的縮小和平移的形式。符號(hào) 甲w,表示標(biāo)度，k表示平移。由此，為了找到子小波的系數(shù)，即使是數(shù)據(jù)中再小的區(qū)域都進(jìn) 行求和，直到數(shù)據(jù)的最小單位尺寸。因此，子小波更像是高通量濾波器，而父小波的功能類(lèi) 似于低通量濾波器?？偟膩?lái)說(shuō)，所獲得的小波系數(shù)的數(shù)目與原始數(shù)據(jù)組中點(diǎn)的數(shù)目相同。根據(jù)以上描述，顯而易見(jiàn)，Haar小波是簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)，因?yàn)樗鼈冎挥腥齻€(gè)不同的取值+1， -l或0，而且很可能通過(guò)引入父小波的縮小和平移的形式來(lái)將它們進(jìn)一步簡(jiǎn)化，父小波的縮 小和平移的形式稱(chēng)為標(biāo)度函數(shù)或"son"小波<formula>formula see original document page 26</formula>母小波也可以重寫(xiě)為因此，使用2z-1個(gè)僅由1和0組成的小波，可以在具有z個(gè)點(diǎn)的光譜上實(shí)現(xiàn)"son"小 波的Haar變換。該小波變換的基組為非直角的，因?yàn)楦叽?son"小波是低代"son"小波 的子集。然而，"son"小波具有單向性的優(yōu)勢(shì)，亦即，它們只能取正。因此，與子小波不同 的是son小波在數(shù)據(jù)處理中并不會(huì)固有地執(zhí)行一階導(dǎo)數(shù)。Haar變換特別適合于光譜分析。所獲得的小波系數(shù)包含頻率和波長(zhǎng)信息(這里"頻率" 并不是通常意義上的所指，而是指小波是否描述為小標(biāo)度或大標(biāo)度的特征)。由于波長(zhǎng)信息的 保持力，比起傅立葉變換的結(jié)果，Haar小波變換的結(jié)果更容易理解光譜的含義。而且，有可 能不僅研究分離波長(zhǎng)的重要性，而且研究不同尺寸光譜特征。這一特性的通常應(yīng)用于通過(guò) 刪除高頻率小波系數(shù)來(lái)使數(shù)據(jù)平滑?；蛘?，在數(shù)據(jù)集塊中很大的傾向，例如傾斜的基線，可 以通過(guò)除去低頻率小波的方法來(lái)修正。Haar變換的另一個(gè)重要特征是將大量的信息壓縮成很小數(shù)目的變量的能力。子小波在 數(shù)據(jù)壓縮中是有效的，并且這一特性在現(xiàn)有的研究中巳經(jīng)被用以尋找最精簡(jiǎn)的模型來(lái)評(píng)價(jià)樣 本的特性。比較起來(lái)，由于son Haar變換是部分多余的，因此son Haar變換在數(shù)據(jù)壓縮中 做得并不是很好，但它可使相鄰的波長(zhǎng)的完全去耦。因此這一基組在特征選擇上能夠有更大 的自由。此外用son小波建立的模型更易于說(shuō)明。因?yàn)椤禴只有兩種不連續(xù)的取值， 一個(gè)波長(zhǎng) 區(qū)域要么被最優(yōu)化算法選取，要么不被選取?；谒x擇的son小波，很可能構(gòu)建起一個(gè)簡(jiǎn) 單化的使用峽縫或過(guò)濾器進(jìn)行樣品分析的儀器。子小波Haar變換和son小波Haar變換均用Matlab (Mathworks公司，MA， Natick)中 所寫(xiě)的程序來(lái)進(jìn)行計(jì)算。對(duì)于子小波Haar變換，基于Mallat的金字塔算法的快速Haar變換 程序，通過(guò)執(zhí)行一系列的遞歸和與遞歸差來(lái)決定小波系數(shù)。對(duì)于son小波Haar變換，使用 簡(jiǎn)單的和。由于算法需要輸入的數(shù)據(jù)長(zhǎng)度為2的乘方，為了達(dá)到最接近的2n，實(shí)驗(yàn)的光譜使用最后的數(shù)據(jù)值來(lái)填補(bǔ)。小波系數(shù)被確定，并由寬的小波至更密的小波依次排列(^，甲，A,o'…，l乂或0，《o...，《k)。 遺傳算法用于評(píng)估目的級(jí)別的最精簡(jiǎn)變量(方法1的波長(zhǎng)或方法2的小波)子集，由反向最小二 乘(ILS)回歸法確定。當(dāng)包含很少的波長(zhǎng)時(shí)，如方法l，對(duì)所有可能的結(jié)合均進(jìn)行模擬。當(dāng) 許多小波都包含在分級(jí)系統(tǒng)中時(shí)，(即方法2)，使用遺傳算法(GA)最優(yōu)化來(lái)決定小波的最 佳選擇。使用諸如交配、交叉和突變的原理對(duì)許多模型進(jìn)行了評(píng)價(jià)。對(duì)于每種變量的結(jié)合， 樣本級(jí)別根據(jù)如下公式評(píng)估-7="。 + c !Xj + or2X2 +----h anXn ( 6 )其中，Y為因變量(神經(jīng)學(xué)上的分級(jí)，艮P， O代表正常，1代表AD)， X,， X2，……，Xn 是自變量(即，給定波長(zhǎng)或小波系數(shù)的強(qiáng)度)，"。，",，……，A是系數(shù)，由一組校正的X's 確定。遺傳算法最優(yōu)化的完整描述先前已在別處給出，因此，這里只給出該方法的概要。使用遺傳算法的方法尋找包含1至15個(gè)變量的擬合最好(最佳)的模型。通過(guò)用二進(jìn)制 對(duì)選定的變量編碼，并按照詞典編纂的方式將它們堆成單個(gè)個(gè)體(如模型)的群體。對(duì)于2a 變量的預(yù)處理光譜，二進(jìn)制編碼使用n位。群體數(shù)量設(shè)置為IOOO，使用每個(gè)個(gè)體與一組校正 值按照公式6建立一個(gè)模型。相應(yīng)的選擇校正標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEC)的計(jì)算基于測(cè)試組。根據(jù)其 SEC確認(rèn)擬合最好的兩個(gè)個(gè)體，并且不進(jìn)行突變地保留到下一代。余下的新群體通過(guò)以1的 交叉幾率和0.02的突變率使個(gè)體間隨機(jī)交配來(lái)進(jìn)行擬合。隨著該群體突破2000代之后，該 算法逐漸趨近一個(gè)穩(wěn)定的解。對(duì)1至15個(gè)變量組成的模型進(jìn)行了同樣的研究，它們的SEC用于獲得預(yù)報(bào)殘差平方和 (PRESS)的圖。令h代表帶有最小PRESS值的模型中小波的數(shù)目。最精簡(jiǎn)的模型就是具有 最少小波數(shù)目的模型，這樣，該模型的PRESS值不會(huì)很明顯地大于具有h個(gè)小波(f-測(cè)試， 99%的置信水平)的模型的PRESS值。評(píng)估的級(jí)值不是0就是1。然而，上述的回歸確定為連續(xù)的實(shí)數(shù)值。級(jí)別間的間隔用大 于0.5的值，如1級(jí)，和小于0.5的值，如O級(jí)來(lái)確定。對(duì)于每個(gè)模型，確定其靈敏度和特異性，并作為模型選擇的標(biāo)準(zhǔn)。正如對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，是顯而易見(jiàn)的，我們知道，本發(fā)明能夠在光譜中不同范圍 的波長(zhǎng)下工作得很好，例如在NIR、 S麗IR和THz范圍。除了吸收光譜之外，拉曼光譜和熒光 光譜也可以類(lèi)似地進(jìn)行分析。同樣對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的是，在核磁共振情況 下，分析技術(shù)會(huì)被修改，用以確認(rèn)氧化壓力組分和/或與疾病或癥狀相關(guān)。我們還知道，除了提供一個(gè)或多個(gè)氧化壓力的值之外，本發(fā)明可以用于將光譜與疾病或 癥狀相關(guān)。在后面的這種情況下，本發(fā)明提供一個(gè)處理器，該處理器可以產(chǎn)生一個(gè)值，該值 代表多個(gè)氧化壓力組分的值的加權(quán)平均，這樣，該加權(quán)平均就提供了表明該病人氧化壓力程 度的值。實(shí)施例2實(shí)施例1的示范方法可以用于IVF程序和胎-母健康監(jiān)領(lǐng)!l。該方法也可以應(yīng)用于獲得卵子、 精子和胚胎，以及卵子、精子和胚胎的深低溫冷藏。這些方法也被考慮用于體外受精程序中。實(shí)施例3利用鑒定培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物和代謝產(chǎn)物級(jí)分的分析分離技術(shù)，也可以得到氧化壓力組分的 代謝組識(shí)別特征。圖7給出的是利用帶有紫外光監(jiān)測(cè)的毛細(xì)管電泳進(jìn)行分離的實(shí)施例。與胚 胎發(fā)育有關(guān)的組分已被鑒定出來(lái)，而且與胚胎的發(fā)育能力有正的和負(fù)的相關(guān)。具體是， 一種 在900秒的營(yíng)養(yǎng)物級(jí)分與胚胎的發(fā)育能力負(fù)相關(guān)，而兩種代謝產(chǎn)物的級(jí)分(1000-1100秒) 與胚胎的發(fā)育能力正相關(guān)。結(jié)合上述兩組組分的信息，可以將能導(dǎo)致妊娠的胚胎和不能導(dǎo)致 妊娠的胚胎分開(kāi)，其靈敏度為80%，特異性為100%。利用相同的方法論建立的分離技術(shù)，例 如，其它電動(dòng)分離技術(shù)、液相和氣相色譜分析法也可以用來(lái)分離這些從發(fā)育的細(xì)胞至發(fā)育能 力評(píng)估的代謝組識(shí)別特征。對(duì)于本發(fā)明，雖然己經(jīng)結(jié)合了其具體的實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，該發(fā)明是可以作進(jìn)一步修改的，而且，本專(zhuān)利申請(qǐng)意欲覆蓋本發(fā)明的任何變更體、用途或改編本，一般來(lái)說(shuō)，這些變更體、用途或改編本遵循本發(fā)明的原則，又包含偏離本發(fā)明所公開(kāi)的內(nèi)容， 例如在本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)公知的或常規(guī)的操作規(guī)程，和可以適用于上文所述的基本特征 的內(nèi)容，以及下面所附的權(quán)利要求范圍內(nèi)的內(nèi)容。參考書(shū)目Sies和H.在1991年發(fā)表于紐約Elsevier的"Oxidative Stress, Oxidants and Antioxidants."《氧化壓力、氧化劑和抗氧化劑》第507頁(yè)；Hailiwell， B.和J.M.C.Gutteridge在1999年發(fā)表于"Oxford University Press Inc." 《牛津大學(xué)出版公司》第三期的"Free Radicals in Biology and Medicine."《生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中 的自由基》第736頁(yè)；Albuszies， G.和U.B.Bruckner在2003年發(fā)表于"Intensive Care Med."《強(qiáng)化治療》29巻第10 期的"Antioxidant therapy in sepsis."《膿毒病的抗氧化劑治療》1632頁(yè)至1636頁(yè)；Abu-Zidan， RM.， L.D. 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權(quán)利要求
1.一種輔助生殖技術(shù)(ART)方法，該方法包括在體外使至少一個(gè)胚胎在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；在所說(shuō)的胚胎生長(zhǎng)期間，不時(shí)地分析檢驗(yàn)所說(shuō)的至少一個(gè)胚胎的培養(yǎng)基，以確定該胚胎的狀態(tài)；利用所說(shuō)的胚胎的狀態(tài)確定下述的時(shí)機(jī)中的至少之一將胚胎移植到子宮中的時(shí)機(jī)；將胚胎短期貯藏以供此后移植到子宮中的時(shí)機(jī)；將胚胎深低溫冷藏以供此后移植到子宮中的時(shí)機(jī)；調(diào)整所說(shuō)的培養(yǎng)基，以便使所說(shuō)的胚胎繼續(xù)生長(zhǎng)的時(shí)機(jī)；以及將胚胎移植到替換的培養(yǎng)基中，以便使所說(shuō)的胚胎繼續(xù)生長(zhǎng)的時(shí)機(jī)。
2. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所說(shuō)的胚胎是通過(guò)用精子使至少一個(gè)卵子在體外受精而獲得的。
3. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所說(shuō)的利用所說(shuō)的胚胎的狀態(tài)包括反復(fù)地確定對(duì)所說(shuō)的培養(yǎng)基的調(diào)整。
4. 權(quán)利要求l所述的方法，其中所說(shuō)的狀態(tài)是胚胎對(duì)植入的發(fā)育能力，所說(shuō)的胚胎移植的時(shí)機(jī)確定在最早的時(shí)刻，在該時(shí)刻，胚胎達(dá)到其植入成功高或然率的起點(diǎn)。
5. 權(quán)利要求l-4所述的方法，其中所說(shuō)的子宮是哺乳動(dòng)物的子宮，所說(shuō)的哺乳動(dòng)物選自人類(lèi)、?？苿?dòng)物、馬科動(dòng)物、貓科動(dòng)物、犬科動(dòng)物、羊科動(dòng)物和鯨類(lèi)。
6. 權(quán)利要求2所述的方法，該方法還包括通過(guò)分別分析檢驗(yàn)卵泡液、精液漿和子宮內(nèi)層液，確定所說(shuō)的卵子、精子和子宮的發(fā)育能力，當(dāng)該卵子、精子和子宮的發(fā)育能力表明胚胎移植的植入或懷孕成功的或然率高時(shí)，即將其中所說(shuō)的單個(gè)胚胎移植。
7. 權(quán)利要求2所述的方法，其中一些所說(shuō)的卵子受精并長(zhǎng)成若干所說(shuō)的胚胎，其中可以利用至少所說(shuō)的狀態(tài)選擇所說(shuō)的胚胎進(jìn)行移植。
8. 權(quán)利要求6所述的方法，其中一些所說(shuō)的卵子受精并長(zhǎng)成若干所說(shuō)的胚胎，其中可以利用至少部分所說(shuō)的狀態(tài)選擇所說(shuō)的胚胎進(jìn)行移植。
9. 權(quán)利要求l所述的方法，其中所說(shuō)的分析檢驗(yàn)包括獲得培養(yǎng)基的波譜。
10. 權(quán)利要求9所述的方法，該方法還包括通過(guò)下述的方式，校正所說(shuō)的波譜確定若干胚胎培養(yǎng)基的記錄波譜與使用所說(shuō)的若干胚胎的妊娠成功記錄之間的有效相互關(guān)系；其中所說(shuō)的狀態(tài)是通過(guò)用所說(shuō)的相互關(guān)系在所說(shuō)的波譜上進(jìn)行運(yùn)算而確定的。
11. 權(quán)利要求10所述的方法，其中所說(shuō)的波譜是一種光譜。
12. 權(quán)利要求11所述的方法，其中所說(shuō)的光譜包含所說(shuō)培養(yǎng)基中與氧化壓力有關(guān)的組分的信息。
13. 權(quán)利要求ll所述的方法，其中的胚胎是深低溫冷藏的，該方法還包括定期地獲得該深低溫冷藏的培養(yǎng)基的光譜，并由該深低溫冷藏的培養(yǎng)基的光譜確定所說(shuō)胚胎的狀態(tài)，以便在深低溫冷藏期間對(duì)該深低溫冷藏的胚胎進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
14. 權(quán)利要求10所述的方法，其中一些所說(shuō)的卵子受精并長(zhǎng)成若干所說(shuō)的胚胎，其中至少可以利用所說(shuō)的狀態(tài)選擇所說(shuō)的胚胎進(jìn)行移植。
15. —種輔助生殖技術(shù)(ART)的方法，包括在卵子本身的卵泡液中提取多個(gè)卵子；分析檢驗(yàn)每個(gè)所說(shuō)卵子的卵泡液，以確定該卵子的狀態(tài)；利用所說(shuō)的狀態(tài)選擇卵子進(jìn)行深低溫冷藏或受精。
16. 權(quán)利要求15所述的方法，其中所說(shuō)的分析檢驗(yàn)包括獲得卵泡液的波譜。
17. 權(quán)利要求16所述的方法，該方法還包括通過(guò)下述的方式，對(duì)所說(shuō)的波譜進(jìn)行校正確定一些卵子的卵泡液的記錄光譜與使用所說(shuō)的一些卵子的受精和/或妊娠成功記錄之間的有效相互關(guān)系；其中所說(shuō)的狀態(tài)是通過(guò)用所說(shuō)的相互關(guān)系在所說(shuō)的波譜上進(jìn)行運(yùn)算而確定的。
18. 權(quán)利要求17所述的方法，其中所說(shuō)的波譜是一種光譜。
19. 一種可產(chǎn)生生殖健康程序在患者中獲得成功結(jié)果的或然率的數(shù)據(jù)，該方法包括使用所選擇的分模形式，獲得至少一種與液體培養(yǎng)基交換代謝產(chǎn)物的細(xì)胞的至少一種在該液體培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物的波譜，該細(xì)胞選自卵子、精子、和胚胎；利用所獲得的波譜，以及在患者群體中所建立的生殖健康程序的成功結(jié)果與用所選擇的分析模式得到的液體培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物的波譜之間的相互關(guān)系，產(chǎn)生針對(duì)所說(shuō)的至少一種細(xì)胞的或然率數(shù)據(jù)。
20. 權(quán)利要求19所述的方法，其中所說(shuō)的分析模式是多波長(zhǎng)光吸收。權(quán)利要求19所述的方法，其中所說(shuō)的分析模式是光的拉曼散射和光學(xué)熒光中的一種。權(quán)利要求20所述的方法，其中所說(shuō)的光譜是短波長(zhǎng)近紅外光譜。權(quán)利要求21所述的方法，其中所說(shuō)的光譜是近紅外光譜。權(quán)利要求19所述的方法，其中所說(shuō)的選擇的分析模式是醒R。權(quán)利要求19-24之任意一項(xiàng)所述的方法，其中所說(shuō)的至少一種細(xì)胞是卵子。
21.
22.
23.
24.
25.
26.權(quán)利要求19-24之任意一項(xiàng)所述的方法,
27. 權(quán)利要求19-24之任意一項(xiàng)所述的方法,
28. 權(quán)利要求19-24之任意一項(xiàng)所述的方法:
29. 權(quán)利要求19-24之任意一項(xiàng)所述的方法:癥。
30.
31.
32.
33.
34.權(quán)利要求19-24之任意一項(xiàng)所述的方法，權(quán)利要求19-24之任意一項(xiàng)所述的方法，權(quán)利要求19-24之任意一項(xiàng)所述的方法，權(quán)利要求19-24之任意一項(xiàng)所述的方法，權(quán)利要求19-24之任意一項(xiàng)所述的方法，
35. 權(quán)利要求19-24之任意一項(xiàng)所述的方法，
36. 權(quán)利要求19-24之任意一項(xiàng)所述的方法，其中所說(shuō)的至少一種細(xì)胞是胚胎。其中所說(shuō)的生殖健康程序是體外受精。其中所說(shuō)的生殖健康程序涉及先兆子癇。其中所說(shuō)的生殖健康程序涉及IAI或羊膜內(nèi)炎其中所說(shuō)的生殖健康程序涉及早產(chǎn)/分娩。其中所說(shuō)的生殖健康程序涉及反復(fù)流產(chǎn)。其中所說(shuō)的生殖健康程序涉及胚胎植入。其中所說(shuō)的生殖健康程序涉及性別確定。其中所說(shuō)的生殖健康程序涉及環(huán)境污染/傳染。其中所說(shuō)的生殖健康程序涉及異位妊娠。其中所說(shuō)的生殖健康程序涉及正常妊娠。
37.權(quán)利要求19-24之任意一項(xiàng)所述的方法，其中所說(shuō)的生殖健康程序涉及子宮內(nèi)膜異位癥。
38. —種輔助生殖技術(shù)(ART)的方法，該方法包括提供含有一個(gè)或多個(gè)精子的精子漿液樣品，分析檢驗(yàn)該精子漿液，以確定該精子的狀態(tài);以及利用該狀態(tài)對(duì)選擇所說(shuō)的精子進(jìn)行深低溫冷藏或受精。
39. 權(quán)利要求38所述的方法，其中所說(shuō)的分析檢驗(yàn)包括獲得該漿液的波譜。
40. 權(quán)利要求39所述的方法，該方法還包括通過(guò)下述的方式，校正所說(shuō)的波譜-確定一些精子的精液的記錄光譜與使用所說(shuō)的一些精子的受精和/或妊娠成功記錄之間的有效相互關(guān)系；其中所說(shuō)的狀態(tài)是通過(guò)用所說(shuō)的相互關(guān)系在所說(shuō)的波譜上進(jìn)行運(yùn)算而確定的。
41. 權(quán)利要求40所述的方法，其中所說(shuō)的波譜是一種光譜。
42. —種輔助生殖技術(shù)(ART)的方法，該方法包括分析檢驗(yàn)患者子宮的內(nèi)膜液，以確定該子宮對(duì)胚胎植入的發(fā)育能力；以及利用所說(shuō)的發(fā)育能力確定植入的時(shí)機(jī)。
43. 權(quán)利要求42所述的方法，其中，如果該發(fā)育能力弱，則重復(fù)進(jìn)行檢驗(yàn)，在發(fā)育能力較強(qiáng)的時(shí)候確定為植入的時(shí)機(jī)。
44. 權(quán)利要求43所述的方法，其中，至少可對(duì)患者提供飲食、休息/運(yùn)動(dòng)、和醫(yī)療介入的其中之一種干預(yù)，以增強(qiáng)該發(fā)育能力。
45. 權(quán)利要求44所述的方法，其中所說(shuō)的內(nèi)膜液用光學(xué)法在原位測(cè)定，所說(shuō)的分析檢驗(yàn)包括波譜的獲得。
46. 權(quán)利要求45所述的方法，該方法還包括通過(guò)下述的方式，校正所說(shuō)的波譜確定一些患者體液的記錄光譜與所說(shuō)的一些患者的妊娠成功記錄之間的有效相互關(guān)系；其中所說(shuō)的狀態(tài)是通過(guò)用所說(shuō)的相互關(guān)系在所說(shuō)的波譜上進(jìn)行運(yùn)算而確定的。
47. 權(quán)利要求l-46所述的方法，其中所說(shuō)的培養(yǎng)基是冰凍的。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種確定包括體外受精的生殖健康程序中的理想時(shí)機(jī)及其結(jié)果的方法。該方法包括，針對(duì)患者群體，建立所說(shuō)程序的成功結(jié)果與用選擇的分析模式所得的體液的光譜之間的相互關(guān)系；針對(duì)某個(gè)患者，用所說(shuō)的分析模式獲得該患者體液的光譜。
文檔編號(hào)A61B17/435GK101600396SQ200680050781
公開(kāi)日2009年12月9日 申請(qǐng)日期2006年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月9日
發(fā)明者戴維·休·伯恩 申請(qǐng)人:麥吉爾大學(xué)