專利名稱：：對抗登革熱病毒感染的疫苗接種的制作方法對抗登革熱病毒感染的疫苗接種
背景技術(shù)：
：本發(fā)明涉及對抗登革熱病毒感染的疫苗接種。登革熱，一種由4種截然不同的登革熱病毒(命名為血清型1-4)引起的疾病，為人類最重要的媒介傳播疾病。在世界熱帶和亞熱帶地區(qū)每年大約1億人感染登革熱病毒(Halstead,"EpidemiologyofDengueandDengueHemorrhagicFever(登革熱和登革出血熱流行病學(xué)),"CABIPubl"NewYork,pp.23-44,1997;Gubler,"DengueandDengueHemorrhagicFever(登革熱和登革出血熱)，"CABIPubl.,NewYork,pp.1-22,1997)。一種登革熱病毒感染導(dǎo)致的嚴重的和潛在致死形式的疾病，登革熱出血熱(DHF),其地理分布和發(fā)病率在增加。這些事實已促使全力以赴構(gòu)建安全和有效的登革熱疫苗，但是，盡管作了許多努力，跨越了超過50年，未開發(fā)出對抗登革熱的市售疫苗。因此世界衛(wèi)生組織認為對抗登革熱疫苗的開發(fā)是高優(yōu)先級的(Chambers等，Vaccine(疫苗)15:1494-1502,1997)。DHF的發(fā)病機理推動著登革熱疫苗的設(shè)計。DHF是一種免疫病理學(xué)疾病，主要發(fā)生于如下個體先經(jīng)受一種登革熱血清型感染，然后暴露于第二種不同的(異源的)血清型。感染登革熱4種血清型之一，提供基于中和抗體的對異源血清型的持久免疫力。然而，如果曾經(jīng)發(fā)生的話，感染一種登革熱血清型后對其它異源登革熱血清型的免疫是短期的(Sabin,Am.J.Trop.Med.Hyg.1:30-50,1952)。一般地，幾周或幾月后，只有與異源血清型結(jié)合但不中和的抗體存在。這些結(jié)合但未中和的抗體可增強隨后異源登革熱病毒血清型的感染，增加嚴重疾病的風險(Rothman等，Virology257:1-6，1999)。對于DHF的免疫發(fā)病機制，成功的對抗登革熱疫苗必須是安全的，并誘導(dǎo)同時對抗所有4種登革熱病毒血清型的長效、交叉中和抗7體反應(yīng)，使其滴度不低至不能保護受試者對抗進一步的感染的水平。從歷史觀點上說，開發(fā)減毒活疫苗候選物的經(jīng)驗努力說明難以在候選疫苗病毒足夠的減毒作用(安全性)和免疫原性之間達到平衡。也難以將代表所有4種血清型的疫苗菌林組合成有效的4價混合物，需要多次給藥計劃來達到對抗所有血清型的血清轉(zhuǎn)化，由于免疫接種計劃中各次免疫接種之間存在時間間隔，期間可能會^f吏受試者對免疫病理事件過^:,從而導(dǎo)致不良后果。實際上，試圖通過單價的、活登革熱疫苗混合物來免疫，顯示出在4種病毒抹之間顯著的相互作用，導(dǎo)致病毒性干擾作用(綜述于Saluzzo,Adv.VirusRes,61:420-444，2003)。已開發(fā)出基于遺傳工程嵌合黃病毒的對抗登革熱病毒疫苗，其中登革熱血清型1、2、3或4的兩個序列(即編碼前膜(prM)和包膜(E)蛋白的序列)插入黃熱病17D病毒的全長感染性克隆，替代編碼相應(yīng)黃熱病毒蛋白的序歹'J(見，例如，Guirakhoo等，J.Virol.75:7290-7304，2001;Guirakhoo等，Virology298:146-159，2002)。這些病毒注射入猴體內(nèi)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)時是高度有效的。然而，初步數(shù)據(jù)也顯示一些人類中的病毒千擾作用，該作用能限制一劑登革熱疫苗給藥后對抗所有4種血清型的免疫接種。本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)一種新的、安全的對抗登革熱病的免疫接種方法，該方法使得能夠誘導(dǎo)對抗登革熱血清型l-4的長效的、交叉中和抗體反應(yīng)，同時避免多劑量登革熱疫苗接種計劃和初次未平衡的免疫反應(yīng)相關(guān)的潛在風險。本發(fā)明的方法使用一種免疫方式，該方式包含在給予第一種黃熱疫苗后給予基于嵌合黃病毒的登革熱疫苗，使得能夠誘導(dǎo)對抗登革熱病毒的交叉中和免疫反應(yīng)，該方式顯示出給予登革熱疫苗后早期出現(xiàn)(30天內(nèi))、長效、對抗四種血清型交叉反應(yīng)的優(yōu)點。此點。Price等(Am.J.Epid.88:392-397,1968)先前描述了連續(xù)的黃病毒免疫接種的方法，該方法包含系列的3次免疫接種(用登革熱2型和兩種異源病毒(黃熱病和日本腦炎))。此外，與本發(fā)明不同，接種順序為先黃熱病后登革熱2型，無另外的JE免疫接種，不產(chǎn)生交叉保護性免疫力。Scott等(J.Infect.Dis.148:1055-1060,1983)展示了先用黃熱病免疫、隨后接種減毒活登革熱2型疫苗的受試者對登革熱2型有增強的免疫反應(yīng)，該免疫反應(yīng)比無先前黃熱病免疫力的受試者更持久(持續(xù)3年)。增強的反應(yīng)可能是由于先前的黃熱病疫苗接種增強了對登革熱2型的(結(jié)合，非中和)抗體的產(chǎn)生(Eckels等，J.Immunol.135(6):4201-4203，1985)。然而，Scott等未展示黃熱病疫苗接種后登革熱2型疫苗產(chǎn)生對其它3種登革熱血清型(1、3或4型)的長效免疫反應(yīng)。與本發(fā)明不同，通過中和試驗(唯一指示保護性免疫性的試驗)，黃熱病后登革熱2型未顯示產(chǎn)生廣泛反應(yīng)。近來的論文中，Kanesa-thasan等(Am.J.Trop.Med.Hyg.69(Suppl6):32-38,2003)發(fā)現(xiàn)在很早以前接種過黃熱病后接種減毒登革熱疫苗的受試者內(nèi)有增強的異源反應(yīng)和抗-登革熱抗體滴度。這些短期(至30天)抗體反應(yīng)以包括中和的抗體測定法說明，但作者推斷對抗隨后登革熱感染的保護的證據(jù)是不確定的。與本發(fā)明不同，作者未能確定地說明之前敏化或接受YF疫苗接種、長期廣泛的中和抗體反應(yīng)，或提供對登革熱的交叉反應(yīng)T細胞反應(yīng)的證據(jù)。本發(fā)明者首次說明了在人體對抗多種登革熱血清型的交叉中和免疫性的誘導(dǎo)可實際上由連續(xù)給予黃熱病和登革熱嵌合病毒來產(chǎn)生。發(fā)明概述本發(fā)明提供包含在受試者體內(nèi)誘導(dǎo)對登革熱病毒的長效、交叉中和免疫反應(yīng)的方法，包含給予受試者(i)一劑黃熱病毒疫苗，和(ii)一劑嵌合黃病毒疫苗，該疫苗包含至少一種嵌合黃病毒，該病毒包含黃熱病毒骨架，其中編碼黃熱病毒包膜蛋白的序列由編碼登革熱病毒包膜蛋白的序列替代，其中在給予黃熱病疫苗后至少30天至IO年內(nèi)給予嵌合黃病毒疫苗。在一個實施例中，登革熱包膜序列為改組序列。一個實施方案中，嵌合黃病毒包含黃熱病毒骨架，其中編碼黃熱病毒膜和包膜蛋白的序列由編碼登革熱病毒膜和包膜蛋白的序列替代。在一個實施例中，每個或所有這些登革熱序列為改組序列。具體實施方案中，嵌合黃病毒疫苗在給予黃熱病疫苗后30、60或90天后給予受試者。具體實施方案中，本發(fā)明登革熱疫苗中使用的嵌合黃病毒由黃熱病17D(YF17D)病毒骨架組成。另一個實施方案中，本發(fā)明方法中使用的黃熱病毒疫苗包含YF17D林。另一個實施方案中，本發(fā)明方法中使用的嵌合黃病毒疫苗包含一種嵌合黃病毒，該病毒包含黃熱病毒骨架，其中編碼黃熱病毒膜和包膜蛋白的序列由編碼登革熱血清型1病毒膜和包膜蛋白的序列替代。另一個實施方案中，本發(fā)明方法中使用的嵌合黃病毒疫苗包含一種嵌合黃病毒，該病毒包含黃熱病毒骨架，其中編碼黃熱病毒膜和包膜蛋白的序列由編碼登革熱血清型2病毒膜和包膜蛋白的序列替代。另一個實施方案中，本發(fā)明方法中使用的嵌合黃病毒疫苗包含一種嵌合黃病毒，該病毒包含黃熱病毒骨架，其中編碼黃熱病毒膜和包膜蛋白的序列由編碼登革熱血清型3病毒膜和包膜蛋白的序列替代。另一個實施方案中，本發(fā)明方法中使用的嵌合黃病毒疫苗包含一種嵌合黃病毒，該病毒包含黃熱病毒骨架，其中編碼黃熱病毒膜和包膜蛋白的序列由編碼登革熱血清型4病毒膜和包膜蛋白的序列替代。一個具體實施方案中，本發(fā)明方法中使用的嵌合黃病毒疫苗為單價疫苗或4價疫苗。另一個實施方案中，本發(fā)明方法進一步包含在首劑嵌合黃病毒疫苗后6個月至10年給予加強劑量的上述定義的嵌合黃病毒疫苗。另一方面，本發(fā)明涉及包含如下的試劑盒(i)黃熱病毒疫苗，和(ii)嵌合黃病毒疫苗，該疫苗包含至少一種嵌合黃病毒，該病毒包含黃熱病毒骨架，其中編碼黃熱病毒包膜蛋白的序列由編碼登革熱病毒包膜蛋白的序列替代。在一個實施例中，登革熱包膜序列為改組序列。一個實施方案中，嵌合黃病毒包含黃熱病毒骨架，其中編碼黃熱病毒膜和包膜蛋白的序列由編碼登革熱病毒膜和包膜蛋白的序列替代。在一個實施例中，每個或所有這些登革熱序列為改組序列。本發(fā)明試劑盒的一個實施方案中，黃熱病毒疫苗包含YF17D林，其中YF17D包含許多用于對抗黃熱病的疫苗接種的亞林(包含17D-204、17D-213和17DD)。另一個實施方案中，嵌合黃病毒由YF17D病毒骨架組成。本發(fā)明試劑盒的另一個實施方案中，嵌合黃病毒疫苗包含一種嵌合黃病毒，該病毒包含YR7D病毒骨架，其中編碼黃熱病毒膜和包膜蛋白的序列由編碼登革熱血清型1病毒膜和包膜蛋白的序列替代。本發(fā)明試劑盒的另一個實施方案中，嵌合黃病毒疫苗包含一種嵌合黃病毒，該病毒包含黃熱病毒骨架，其中編碼黃YF17D病毒膜和包膜蛋白的序列由編碼登革熱血清型2病毒膜和包膜蛋白序列替代。本發(fā)明試劑盒的另一個實施方案中，嵌合黃病毒疫苗包含一種嵌合黃病毒，該病毒包含黃熱病毒骨架，其中編碼黃YF17D病毒膜和包膜蛋白的序列由編碼登革熱血清型3病毒膜和包膜蛋白序列替代。本發(fā)明試劑盒的另一個實施方案中，嵌合黃病毒疫苗包含一種嵌合黃病毒，該病毒包含YF17D病毒骨架，其中編碼黃熱病毒膜和包膜蛋白的序列由編碼登革熱血清型4病毒膜和包膜蛋白序列替代。另一個實施方案中，上述定義的試劑盒進一步包含至少一種加強劑量的上述定義的嵌合黃病毒疫苗。另一個實施方案中，本發(fā)明涉及以上說明的和本發(fā)明其它地方的病毒的用途和登革熱病毒感染的治療，以及這些病毒在制備這種目的的藥品中的用途。定乂"交叉中和免疫反應(yīng)"指包含對抗多個(至多4)不同登革熱血清型中和抗體的特殊免疫反應(yīng)。通過參考空斑減少中和試驗(PRNTso)可容易地測定交叉中和免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)。例如，交叉中和免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)可由實施例1所述的PRNT5Q測定法之一檢測。在至少一種這些測定法中檢測到的中和抗體滴度至少高于或等于1:10時，血清樣品被認為是是陽性的，表示存在交叉中和抗體。"長效免疫反應(yīng)"指如上定義的陽性交叉中和免疫反應(yīng)，該反應(yīng)能在人血清中至少6個月被^r測到，優(yōu)選地，至少給予如下定義的嵌合黃病毒疫苗12個月后能被檢測到。"患者"指包括成人和兒童的黃熱病幼稚型(na'i've)個體。"黃熱病幼稚型"個體指超過10年無對抗黃熱病疫苗接種記錄和/或超過IO年無確認的黃熱病毒感染的個體。"黃熱病免疫個體"指在本發(fā)明框架內(nèi)，有對抗黃熱病疫苗4妻種記錄和/或10年前或更短(如5年或更短，如4、3、2或1年前，或甚至6、5、4、3或2個月前，和任何超過30天前)發(fā)生確認的黃熱病毒感染的個體。"嵌合黃病毒"指嵌合黃病毒，該病毒包含黃熱病毒骨架，其中編碼黃熱病毒包膜蛋白的序列由編碼登革熱病毒包膜蛋白的序列替代。優(yōu)選地，嵌合黃病毒包含黃熱病毒骨架，其中編碼黃熱病毒膜和包膜蛋白的序列由編碼登革熱病毒膜和包膜蛋白的序列替代。黃熱病骨架可優(yōu)選地來自疫苗抹，例如YF17D或YF17DD。這些嵌合黃病毒如下更詳細地定義，命名為YF/登革熱-N,用N區(qū)別登革熱血清型。"嵌合黃病毒疫苗"指包含免疫有效量的至少一種上述定義的嵌合黃病毒和藥學(xué)可接受輔料的免疫原性組合物。當疫苗包含一種登革熱血清型的一種嵌合黃病毒表達蛋白時，嵌合黃病毒疫苗稱為"單價"。單價疫苗的實例為包含YF/登革熱-l、YF/登革熱-2、YF/登革熱-3或YF/登革熱-4，優(yōu)選YF/登革熱-2的疫苗。當疫苗包含兩種不同登革熱血清型嵌合黃病毒表達蛋白時，嵌合黃病毒疫苗稱為"兩價"。兩價疫苗的實例為包含YF/登革熱-2和YF/登革熱_4,或YF/登革熱-2和YF/登革熱-3，或YF/登革熱-2和YF/登革熱-1的疫苗。當疫苗包含三種不同登革熱血清型嵌合黃病毒表達蛋白時，嵌合黃病毒疫苗稱為"三價"。三價疫苗的實例為包含YF/登革熱-2、YF/登革熱-1和YF/登革熱-4，或YF/登革熱-2、YF/登革熱-3和YF/登革熱-4的疫苗。當疫苗包含四種不同登革熱血清型嵌合黃病毒表達蛋白時，嵌合黃病毒疫苗稱為"四價"。四價疫苗實例為包含YF/登革熱-l、YF/登革熱-2、YF/登革熱-3和YF/登革熱-4的疫苗。"免疫有效量嵌合黃病毒"指在黃熱病免疫個體給藥后，能誘導(dǎo)如上所定義的交叉中和免疫反應(yīng)的嵌合黃病毒的量。一般地，嵌合黃病毒免疫有效量包含每血清型、每劑量的感染單位(例如，空斑形成單位或組織培養(yǎng)感染劑量)在102至107之間的量，例如在103和106之間，例如104、105或106。本發(fā)明方法的中心優(yōu)點為能快速和同時誘導(dǎo)對抗四種登革熱血清型的中和抗體，從而保護受試者不受登革熱侵害，由此避免隨后自然暴露于登革熱感染后發(fā)生登革熱出血熱的潛在相關(guān)風險。直接對抗登革熱包膜蛋白的中和抗體被認為是對抗感染的保護性免疫力的主要介導(dǎo)物，因此中和抗體的存在被認為是患者中和免疫力的重要標志(surrogate)。本發(fā)明其它特點和優(yōu)點在下列發(fā)明詳述、權(quán)利要求和圖表中是顯而易見的。附圖簡述圖1為顯示應(yīng)答疫苗的IFNY的圖片(研究的第31天減去第l天)。兩次劑量的ChimeriVaxTM-Den2產(chǎn)生等價的T細胞反應(yīng)。反應(yīng)在先前接種黃熱病毒疫苗的受試者體內(nèi)未被抑制。發(fā)明詳述本發(fā)明提供使用簡單的、兩步法在患者體內(nèi)誘導(dǎo)對四種登革熱血清型(l-4)的長效、交叉中和免疫力的方法。目標人群因此特別包含下列有登革熱感染風險患者外國旅行者、流亡者和軍事人員，以及登革熱流行地區(qū)的居民。在此方法中，患者先用一劑(優(yōu)選一劑，但可能超過一劑(例如，2或3劑))的黃熱病毒疫苗(例如，市售的減毒活疫苗；見下文)免疫。在至少30天的合適時間間隔后(該間隔特別產(chǎn)生由黃熱病毒疫苗誘導(dǎo)的固有免疫反應(yīng)靜止期)，進行方法的第二步，包括給予一劑嵌合黃病毒疫苗，該疫苗包含一種或多種減毒活嵌合病毒，每種包含黃熱病毒骨架，其中一種或多種編碼結(jié)構(gòu)蛋白(例如，前膜和包膜蛋白)的序列由編碼相應(yīng)登革熱病毒(例如，登革熱1、2、3或4)蛋白的序列替代。本發(fā)明者展示了這種免疫反應(yīng)程序產(chǎn)生對抗所有四種登革熱血清型的高中和抗體滴度。這些抗體在給予登革熱疫苗后保持在高水平超過6個月，甚至超過12個月，顯示廣泛的登革熱免疫力為長效的。由于初次免疫/敏化劑(黃熱病疫苗)不能使受試者對DHF敏感，因此如果第二次注射被延遲或未進行，第一次即敏化接種不會使對象易受這種疾病攻擊，所以不存在危險。這些結(jié)果是意想不到的，因為即使連續(xù)感染兩種登革熱病毒血清型(相互之間在基因序列和抗原性關(guān)系上比黃熱病與登革熱更近緣相關(guān))，不誘導(dǎo)對抗另外兩種登革熱血清型感染的可靠保護或廣泛交叉中和抗體反應(yīng)。通過在第二步(接種嵌合登革熱病毒)后檢查黃熱病抗體反應(yīng)，進一步說明了本發(fā)明連續(xù)疫苗接種方法意想不到的特性。本發(fā)明方法進一步描述如下。黃熱病毒疫苗如上述說明的，發(fā)明方法的第一步包含給予受試者一劑黃熱病毒疫苗。這種可用于發(fā)明的疫苗實例包含減毒活疫苗，例如那些衍生自YF17D株的，其最初從野生型Asibi抹減毒獲得(Smithburn等，"YellowFeverVaccination(黃熱病疫苗才妾種)，"WorldHealthOrganization(世界衛(wèi)士組織),p.238,1956;Freestone,inPlotkin等(eds.),Vaccines,2ndedition(疫苗，第二版),W.B.Saunders,Philadelphia,U.S.A.,1995)。衍生后可用于本發(fā)明的YF17D林的實例為YF17D-204(YF-VAX,Sanofi-Pasteur,Swiftwater，PA，USA;Stamaril,Sanofi-Pasteur,Marcy-L'Etoile,France;ARILVAX,Chiron,Speke,Liverpool,UK;FLAVIMUN,BernaBiotech,Bern,Switzerland;YF17D-204France(X15067,X15062);YF17D-204,234US(Rice等，Science229:726-733,1985))，而其它可使用的這種4朱的實例與YF17DD才朱(GenBank登記號U17066)、YF17D-213(GenBank登記號U17067)和黃熱病毒17DD林(Galler等，Vaccines(疫苗)16(9/10):1024-1028,1998)緊密相關(guān)。除這些抹之外，任何其它發(fā)現(xiàn)的人類(例如人類患者)可接受的減毒黃熱病毒疫苗株，可用于本發(fā)明。本發(fā)明使用的黃熱病毒疫苗可市售獲得(見以上)或可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法制備。在這種方法的一個實施例中，雞胚以固定傳代水平的病毒接種，然后冷凍干燥從離心的勻漿上清液分離的病毒。在另一個方法中，黃熱病林生長于培養(yǎng)的雞胚成纖維細胞(見，例如，F(xiàn)reire等，Vaccine23(19):2501-2512，2005)或其它生產(chǎn)病毒疫苗的培養(yǎng)細胞如Vero細胞中。黃熱病毒疫苗一般在使用前以凍干形式儲存。當需要給予時，疫苗在含水溶液例如0.4%氯化鈉溶液中重建(一般地，約0.5mL),然后在如三角肌皮下注射給予。其它由本領(lǐng)域技術(shù)人員決定是合適的給予模式(例如，肌肉或皮內(nèi)注射，或使用傳輸病毒至皮膚表皮層的方法經(jīng)皮給予)也可使用。疫苗可以例如每劑量2-5(例如，3或4)1ogu)空斑形成單位(PFU)的劑量范圍給予。所有市售的疫苗按生產(chǎn)商建議使用。在一個實施方案中，本發(fā)明方法的第一步包含給予一劑StamarilTM或一劑YF-VAX。本發(fā)明方法也可調(diào)整后用于黃熱病免疫受試者。在這種病例中，方法只包括第二步，包含給予一劑如下定義的嵌合黃病毒疫苗。所述方法也包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。嵌合#4#瘦蘿本發(fā)明免疫方法的第二步包含給予一劑如上述定義的嵌合黃病毒疫苗。為了清晰的緣故，在如下描述中，本發(fā)明只限定在相關(guān)于嵌合黃病毒的用途，其中嵌合黃病毒包含黃熱病毒骨架，其中編碼黃熱病毒膜和包膜蛋白的序列由編碼登革熱病毒膜和包膜蛋白的序列替代。發(fā)明也包含其它嵌合體的用途，例如其中只有一種黃熱病疫苗林的蛋白(例如，包膜蛋白)被替代的嵌合體，或其中所有三種結(jié)構(gòu)蛋白被替代的嵌合體?？捎糜诒景l(fā)明的嵌合病毒包含那些如上所描述的基于人類黃熱病疫苗林YF17D(例如YF17D-204、YF17D-213或YF17DD)的嵌合病毒。在這些病毒中，黃熱病毒的前膜和包膜蛋白被登革熱病毒(血清型1、2、3或4)的前膜和包膜蛋白替代。在本發(fā)明一個實施方案中，嵌合病毒包含YF17D-204骨架，其中編碼黃熱病毒前膜和包膜蛋白的序列由編碼野生型登革熱血清型1、2、3和/或4前膜和包膜蛋白的序列替代，例如，由編碼登革熱1病毒PUO-359、登革熱2病毒PUO-218、登革熱3病毒PaH-881/88或登革熱4病毒1228前膜和包膜蛋白的序列。提供了這些的構(gòu)建詳圖和相關(guān)的嵌合病毒構(gòu)造，例如，在如下出版物WO98/37911;WO01/39802;Chambers等，J.Virol.73:3095-3101:1999;WO03/103571;WO2004/045529;美國專利號6,696,281;美國專利號6,184,024;美國專利號6,676,936;美國專利號6,497,884;Guirakhoo等，J.Virology75:7290-7304,2001;Guirakhoo等，Virology298:146-159,2002;和Caufour等，VirusRes.79(1-2):1-14,2001。作為可用于本發(fā)明的一個嵌合黃病毒的具體實例，我們記錄了下列嵌合黃病毒，根據(jù)布達佩斯條約該病毒存放于美國弗吉利亞州Manassas的美國標準培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，存放日期為1998年1月6日嵌合黃熱病17D/登革熱2型病毒(YF/DEN-2;ATCC檢索號ATCCVR-2593)。用于本發(fā)明方法的嵌合黃病毒可任選地包含登革熱病毒序列減弱的突變。例如，登革熱序列可包含包膜氨基酸204(登革熱血清型1、2和4)或202(登革熱血清型3)的缺失或替代，在野生型病毒為賴氨酸。在這種替代的一個實施例中，這個位點的賴氨酸由精氨酸替代。在其它實施例中，一種或多種其它氨基酸在氨基酸200-208(或這些氨基酸的組合)區(qū)間是變異的，具體實例包含如下登革熱-1的202(K)位點；登革熱-2的202(E)位點；登革熱-3的200(K)位點；和登革熱-4的200(K)、202(K)和203(K)位點。這些殘基可纟皮例如精氨酸替代。這些變異詳細描述于WO03/103571，其內(nèi)容通過引用結(jié)合于本文。除上述的嵌合體之外，其它包含結(jié)構(gòu)蛋白(包含來自不止一種(2、3或4)登革熱病毒血清型的抗原決定簇)的嵌合體可用于本發(fā)明。在一個實施例中，嵌合體可使用改組(shuffling)技術(shù)制備，該技術(shù)包含斷裂、再結(jié)合和選擇已改組序列的循環(huán)(見，如Locher等，DNACellBiol.24(4):256-263,2005)。這樣，在這種情況下，編碼所需亞型登革熱血清型(或所有登革熱血清型)包膜和/或前膜蛋白的序列可以這種方法產(chǎn)生改組的包膜和/或前膜序列，然后用于替代本文所描述的相應(yīng)黃熱病毒骨架序列(例如，YF17D)。這種嵌合YF/Denl-4改組體(shufflant)(假設(shè)改組序列包含所有四種血清型的抗原決定簇)可通過例如，用嵌合RNA轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)染Vero細胞林，并從前述(Guimkhoo等，J。Virol。75(16):7290-7304，2001)和本文任何地方提及的上清液回收活病毒而生產(chǎn)。這些改組嵌合體可用于本發(fā)明疫苗接種方法，該方法包含黃熱病(例如，YF17D)疫苗接種后纟合予改組嵌合體，或用于本文其它任何地方描述的組合方法。上述嵌合病毒可使用本領(lǐng)域標準方法制備。例如，病毒基因相關(guān)RNA分子可導(dǎo)入原代細胞、雞胚，或二倍體細胞系，從中(或其上清液)可純化子代病毒。其它可用來生產(chǎn)該病毒的方法使用異倍體細胞，例如Vero細胞(Yasumura等，NihonRinsho21:1201-1215,1963)。在這種方法的一個實施例中，病毒基因組對應(yīng)的核酸分子(例如，RNA分子)導(dǎo)入異倍體細胞，從培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基中收獲病毒，用核酸酶處理獲得的病毒(例如，降解DNA和RNA兩者的內(nèi)切核酸酶，例如BenzonaseTM;美國專利號5,173,418),濃縮核酸酶處理過的病毒(例如，通過使用具有分子量截值(如500kDa)的過濾器超濾)，制備濃縮后的病毒用于疫苗接種目的。這種方法的細節(jié)提供于WO03/060088A2，其通過引用結(jié)合于本文。另外，生產(chǎn)嵌合病毒的方法描述于上述引用的文件中，為構(gòu)建嵌合病毒構(gòu)造的參考。本發(fā)明方法中使用的嵌合病毒的制備可使用本領(lǐng)域標準方法實現(xiàn)。多種用于疫苗制備的藥學(xué)可接受溶液是已知的，且容易由本領(lǐng)域才支術(shù)人員調(diào)整后用于本發(fā)明(見，例如，7e柳,"gto"S尸/zam^cei^'ca//SWe"c&y(18thedition),ed.A.Gennaro,1990,MackPublishingCo.,Eastern,PA)。在兩個具體的實施例中，病毒在含7.5%乳糖和2.5%人血清白蛋白的伊格爾(氏)鹽最低必需培養(yǎng)基(MEME)或含10%山梨醇的MEME中制備。然而，嵌合黃病毒可簡單地在生理學(xué)可接受溶液例如無菌鹽或無菌緩沖鹽中稀釋。在另一個實施例中，病毒可給予和制備，例如，以黃熱病17D疫苗相同的方式，例如，以感染的雞胚組織的澄清懸液或從感染嵌合病毒的細胞培養(yǎng)物獲得的液體。本發(fā)明嵌合黃病毒疫苗通常地以水凍液體組合物形式或凍干產(chǎn)品形式儲存。為此目的，嵌合黃病毒可以通常用緩沖水溶液(包含冷凍保護化合物如糖醇和穩(wěn)定劑)的稀釋劑混合。使用前，凍干產(chǎn)品與藥學(xué)可接受稀釋劑或賦形劑(例如4%NaCl無菌溶液)混合以重建液體可注射嵌合黃病毒疫苗。本發(fā)明方法中，嵌合黃病毒疫苗可為單價、兩價、三價或四價疫苗。在一個實施方案中，嵌合黃病毒疫苗為單價疫苗，其中嵌合病毒包含YF17D-204骨架，其中編碼黃熱病毒前膜和包膜蛋白的序列由編碼登革熱2病毒PUO-218前膜和包膜蛋白的序列替代。另一個實施方案中，嵌合黃病毒疫苗為四價疫苗，即疫苗包含四種登革熱(l-4)病毒血清型嵌合病毒表達抗原。在一個具體實施方案中，這種四價疫苗優(yōu)選包含四種嵌合黃病毒，相應(yīng)由YF17D-204骨架組成，其中編碼黃熱病毒前膜和包膜蛋白序列由編碼登革熱1病毒PUO-359(YF/登革熱1)、登革熱2病毒PUO-218(YF/登革熱2)、登革熱3病毒PaH-881/88(YF/登革熱3)或登革熱4病毒1228(YF/登革熱4)前膜和包膜蛋白序列替代。這種具體的四價疫苗在如下實施例2中命名為ChimeriVax-DEN四價。適合用于本發(fā)明方法的四價嵌合黃病毒疫苗的實例也詳細描述于WO03/101397，其內(nèi)容通過引用結(jié)合于本文。多價疫苗可通過組合單個單價登革熱疫苗獲得。本發(fā)明嵌合病毒可使用本領(lǐng)域已知的方法給予。例如，病毒可制備為每血清型在劑量容積為0.1至1.0mL中含有102至107(例如，含有103至106，例如104、105或106)感染單位(例如，空斑形成單位或組織培養(yǎng)感染劑量)的無菌水溶液，通過例如皮下、肌內(nèi)或皮內(nèi)途徑給予。在一個實施方案中，嵌合黃病毒疫苗為優(yōu)選地每血清型每劑量包含l()Spfu的單價、兩價、三價或四價疫苗，并皮下給予。另外，因為黃病毒可通過粘膜途徑感染人類宿主，例如口腔途徑(Gresikova等，"Tick-borneEncephalitis(蟲皁i某月S炎)，"In77;eyi/^ovz'n^as1,￡bo/ogyoroiE;/cfem/o/ogy，Monath(ed.),CRCPress,BocaRaton,Florida,1988,VolumeIV,177-203),通過粘膜(例如，口腔)途徑給予也是預(yù)期的。任選地，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的輔料可用于本發(fā)明使用病毒的給予中。用來增加嵌合黃病毒免疫原性的輔料包含，例如toll樣受體(TLRs)的激動劑和拮抗劑。如上說明，發(fā)明通常包括給予黃熱病疫苗抹(例如，YF17D抹，如上說明)，隨后給予一種或多種嵌合黃病毒，其中每個的黃熱病毒前膜和包膜蛋白被登革熱病毒(血清型1、2、3或4)相應(yīng)的蛋白替代。黃熱病毒疫苗使用標準方法給予(例如，通過皮下、肌內(nèi)或皮內(nèi)注射，或通過使用傳輸病毒至表面皮膚的裝置經(jīng)皮給予)，劑量范圍在例如每劑量2-5(例如，3或4)logu)空斑形成單位(PFU),劑量容量一般地為皮下注射約0.5mL，皮內(nèi)注射0.1mL,或經(jīng)皮給藥0.002-0.02mL。為提供充足的時間給黃熱病疫苗誘導(dǎo)的固有免疫反應(yīng)靜止期，在至少30天和10年之間，特別在30天和5年之間，例如在30天和1-3年之間，優(yōu)選地，在給予黃熱病疫苗后30、60或90天，使用標準方法和劑量范圍從每血清型每劑量102至107,例如，從103至106,例如104、105或106感染單位(以pfu或組織培養(yǎng)感染劑量表示)給予嵌合黃病毒疫苗。另外，在給予二、三或四價制劑(見如下)的病例中，通常，這種疫苗中的每個嵌合體的量是相同的，盡管使用不同量的每個嵌合體也包含在本發(fā)明中。本發(fā)明方法可因此包含，例如，在第0天給予黃熱病毒疫苗和在第30天(或在更遲的時間，如上述說明的)給予YF/登革熱-l、YF/登革熱-2、YF/登革熱-3和/或YF/登革熱-4嵌合體。嵌合體可以單價疫苗(即，只包含一種如下嵌合病毒的疫苗YF/登革熱-l、YF/登革熱-2、YF/登革熱-3或YF/登革熱-4)、兩價制劑(例如，包含兩種上述列出的嵌合體的疫苗，例如，優(yōu)選地包含YF/登革熱-2和YF/登革熱-4，或YF/登革熱-2和YF/登革熱-3，或YF/登革熱-2和YF/登革熱-l)、三價疫苗(例如，包含三種上述列出的嵌合體的疫苗，包含YP/登革熱-2、YF/登革熱-l和YF/登革熱-4，或YF/登革熱-2、YF/登革熱-3和YF/登革熱_4的疫苗)或四價疫苗給予。本發(fā)明方法在僅一劑嵌合黃病毒疫苗后導(dǎo)致四種登革熱血清型的血清轉(zhuǎn)化(即，誘導(dǎo)中和免疫反應(yīng))。盡管嵌合黃病毒疫苗的增加劑量不是達到所需血清轉(zhuǎn)化和長效、交叉中和免疫反應(yīng)必需的，給予加強劑量嵌合黃病毒疫苗是本發(fā)明預(yù)期的。本發(fā)明嵌合疫苗的加強劑量可能是維持長時間的交叉中和免疫反應(yīng)所必需的，可在首劑登革熱嵌合疫苗后的6個月和5-10年之間給予，例如，在首劑登革熱嵌合疫苗后6個月、1年、2年、3年、4年或5年，或甚至10年。加強的嵌以上本發(fā)明方法中所給予的嵌合黃病毒疫苗的相關(guān)描述對嵌合黃病毒疫苗激發(fā)劑已作必要的修正。激發(fā)劑因此可為單價、兩價、三價或四價疫苗，相對于疫苗中的登革熱血清型。這樣，本發(fā)明方法的實施例可包含給予一劑黃熱病疫苗，隨后是一劑單價嵌合黃病毒疫苗(登革熱l、2、3或4,優(yōu)選地，登革熱2),隨后給予(i)與初次給予的嵌合體(優(yōu)選地為血清型4)相同或不同血清型的單價嵌合黃病毒疫苗，(ii)兩價嵌合黃病毒疫苗，該疫苗可包含或不包含與初次嵌合體相同的血清型(例如，優(yōu)選地登革熱1和2后登革熱3和4),(iii)三價嵌合黃病毒疫苗，該疫苗可包含或不包含與初次嵌合體相同的血清型，或(iv)四價嵌合黃病毒疫苗?？紤]其抗原組成，激發(fā)劑嵌合黃病毒疫苗優(yōu)選地相同于首次嵌合黃病毒疫苗。本發(fā)明因此也涉及在受試者誘導(dǎo)對登革熱病毒長效的，交叉中和免疫反應(yīng)的組合物，包含連續(xù)給予(i)黃熱病毒疫苗和(ii)嵌合黃病毒疫苗，其中嵌合黃熱病疫苗在給予黃熱病毒疫苗后至少30天和至多10年內(nèi)給予。本發(fā)明也包含試劑盒，該試劑盒包含黃熱病毒疫苗和/或一種或多種嵌合黃病毒疫苗，如本文所描述。本發(fā)明試劑盒也可包含本文描述的疫苗接種方法中使用試劑盒的說明書。這些說明書包含，例如，關(guān)于疫苗給予劑量的說明和/或關(guān)于疫苗給予時間的信息。本說明書中引用的所有出版物和專利申請通過引用結(jié)合于本文，如單個出版物或?qū)＠暾埦貏e地和單獨地指明通過引用結(jié)合一樣。本發(fā)明部分地基于如下實施例中描述的實驗結(jié)果。實施例在如下說明的實施例中，所描述實驗和臨床研究顯示了預(yù)先對黃熱病毒的免疫力對后來用嵌合YF/登革熱-2疫苗(實施例l)或四價疫苗(YF/登革熱-l、YF/登革熱-2、YF/登革熱-3和YF/登革熱-4)(實施例2)接種的影響。這些研究包括對中和抗體、血清轉(zhuǎn)化、病毒血癥和T細胞反應(yīng)的分析。實施例1:ChimeriVaxTM-Den2市售YF17D疫苗(YF-VAX⑧)購自Aventis-Pasteur,Swiftwater,PA。ChimeriVax-DEN2為活的、減毒的基因工程病毒，其中編碼YF17D疫苗病毒兩種結(jié)構(gòu)蛋白(prM和E)的序列被DEN2病毒(PUO-218抹，分離自泰國曼谷的一例典型登革熱病例)的相應(yīng)序列替代。使用循環(huán)克隆的脫氧核糖核酸(cDNA)完成嵌合病毒基因組的基因構(gòu)建。全長cDNA轉(zhuǎn)錄為核糖核酸(RNA),RNA用于轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)物，該培養(yǎng)物生產(chǎn)活病毒(Guirakhoo等，J.Virol.75:7290-7304，2001)。疫苗病毒在現(xiàn)行藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(cGMP)下生產(chǎn)。根據(jù)食品和藥品管理局(FDA)哺乳細胞培養(yǎng)物衍生產(chǎn)品指南，病毒生長于來自細胞銀行的Vero(非洲綠猴)細胞中，該細胞經(jīng)外源因子測試證明無污染。從含有疫苗病毒的Vera細胞培養(yǎng)物中獲得上清液，通過過濾掉細胞碎片而澄清，以核酸酶(861^011336@)處理消化從宿主細胞得到的核酸分子。核酸酶處理過的大體積量(bulk)病毒然后通過超濾濃縮，以滲濾法純化。與人血清白蛋白(HSA)USP(2.5。/。)和乳糖USP(7.5。/o)—起制備疫苗。疫苗通過體外和體內(nèi)試驗證明無菌、無支原體、無逆轉(zhuǎn)錄病毒[通過產(chǎn)物增強逆轉(zhuǎn)錄酶(PERT)]、無外來病毒。最終疫苗小瓶檢測無菌、效價、鑒別、pH、性狀、滲透壓、HAS、乳糖、內(nèi)毒素、安全性(小鼠和豚鼠中改進的一般安全性)，和小鼠神經(jīng)毒性。猴的臨床前研究顯示在以劑量范圍2-5log1QPFU接種后，ChimeriVaxTM-DEN2為高度免疫原性和較好地耐受的(Guirakhoo等，J.Virol.74(12):5477-5485，2000)。猴疫苗接種后第一周內(nèi)發(fā)生了低度病毒血癥，與黃熱病17D疫苗誘導(dǎo)的相似。單次皮下注射2log1()PFU疫苗(最小試驗劑量)15-30天后誘導(dǎo)了中和抗體，該抗體保護受試者免受野生型DEN2病毒的攻擊。單價ChimeriVaxTM-DEN2疫苗臨床研究進行了隨機、雙盲、單中心門診病人研究。篩選后，符合條件的黃熱病(YF)幼稚型受試者隨機以低或高劑量ChimeriVaxTM-DEN2(3.0或5.0logl?？瞻咝纬蓡挝?或"-￥八乂@單次疫苗接種。也有一開放組，其中在YF-免疫型受試者中評價對高劑量ChimeriVax-DEN2疫苗接種的抗體反應(yīng)。在第1-11、21和31天跟蹤受試者的抗體反應(yīng)和安全性評估，在疫苗接種后6和12個月評估抗體反應(yīng)持久性。篩選后，42名符合條件的YF幼稚型受試者隨機均分成3個組(高或低劑量ChimeriVaxTM-DEN2或YF-VAX)。在第l、14天，受試者接受單次皮下(SC)ChimeriVaxTM-DEN2(高或低劑量)或丫？-￥八乂@疫苗接種。另外14名對YF免疫的受試者(給予登革熱嵌合疫苗前，從前次YF疫苗接種完成后6個月至5年的時間段內(nèi))接受高劑量的ChimeriVaxTM-DEN2。受試者在第2-11、21和31天返回門診。在1-31天的特定時間點進行安全性評估。在第1天(疫苗接種前)和31天測量對同源疫苗林和野生型DEN2抹的抗體反應(yīng)、對YF17D和DEN1-4原型抹的中和抗體。研究在治療階段完成后揭盲，受試者在疫苗接種后6和12個月評估抗體反應(yīng)的持久性。測定了對代表四種登革熱血清型的不同株的中和抗體產(chǎn)生水平>1:10的受試者比例。分析了在接受高劑量ChimeriVax-DEN2的YF-免疫型和YF幼稚型組中預(yù)先YF免疫對DEN2血清轉(zhuǎn)化率的影響。在疫苗接種后直至12個月的多個時間間隔內(nèi)，測量每個治療組中和對所有四種登革熱血清型的幾何平均中和抗體滴度。病毒血癥循環(huán)于血液中的病毒(病毒血癥)是測量研究中使用的不同減毒活疫苗復(fù)制的量度標準。病毒血癥通過Vero細胞的空斑測定法來測定。在疫苗接種后11天內(nèi)發(fā)生病毒血癥的受試者數(shù)量(截至檢查當天)于表1中顯示。在一個或多個研究日中，接種ChimeriVaxTM-DEN2的YF幼稚型受試者發(fā)生病毒血癥的數(shù)量多于接種^-￥八乂@的受試者:ChimeriVaxTM-DEN25.0logl。PFU組中有8例(57%)，ChimeriVaxTM-DEN23.0log1()PFU組中有9例(64%)，相比之下YF-VAX⑧組中僅2例(14%)。與YF幼稚型受試者相比，數(shù)量稍多的YF-免疫型受試者在接種ChimeriVaxTM-DEN25.0log1QPFU后發(fā)生了病毒血癥(YF-免疫型受試者的11/14[79%]對比YF幼稚型受試者的8/14[57%])，但差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(p^).4724)。多數(shù)受試者在5-7天發(fā)生病毒血癥。定量病毒血癥檢測(平均峰、平均持續(xù)時間、AUC)也是YF免疫組高，但也無統(tǒng)計學(xué)顯著性差異，并且重要地是未觀察到對安全性曲線圖的影響。表1.病毒血癥簡要檢測<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>PFU=空斑形成單位，測量于Vero細胞曲線下面積YF幼稚型與YF免疫受試者的CWmeriVax-DEN25.0logTM配對比較中和抗體三種不同的登革熱2型野生型抹(16681,JAH和PR-159)，以及同源疫苗抹(ChimeriVaxTM-DEN2)，用于中和試驗。異源登革熱血清型1(16007)、3(16562)和4(1036)的野生型林也用來檢測中和抗體反應(yīng)的幅度。檢測了受試者血清轉(zhuǎn)化(表示第1天和第30天之間中和抗體滴度至少高于或等于1:10)的比例。另外，檢測了幾何平均中和抗體滴度。用于CVD2、PR-159和JAH的空斑減少中和試驗(PRNT50),包含如下步驟連續(xù)兩倍稀釋熱滅活的血清，與等體積病毒混合至30-50pfu/孑L。血清-病毒混合物在4。C孵育18+/-2小時，然后加入12-孔培養(yǎng)板的Vero單層細胞中。孵育60+/-10分鐘后，單層用含0.84%羧曱基纖維素的生長培養(yǎng)基覆蓋。平板然后在5。/。C02下于37。C孵育3-5天。單層用7.4%福爾馬林固定，然后用2.5%脫脂奶粉的PBS-吐溫20溶液(加0.5°/。TritonX-100)封閉和透化?？?登革熱2—抗(3H5，1:5000)醉育60+/-10分鐘，隨后是羊抗鼠IgG堿性磷酸酯酶(l:500)。孵育60+/-10分鐘后，力卩入底物(含有0.36mM左旋咪唑的BCIP-NBT)。發(fā)生充分的染色后終止反應(yīng)。計數(shù)空斑，檢測PRNT5o滴度。PRN丁5o滴度定義為空斑計數(shù)等于或少于陰性對照空斑計數(shù)的50%的首次血清稀釋(度)。當如此檢測的中和抗體滴度為至少高于或等于1:10時，認為血清是陽性的，表示存在中和抗體。對其它抹，在另一個實驗室依據(jù)以下Russell等描述的方法(J.Immunol.99:285-2卯，1967)進行了PRNTs。測定。使用LLC-MK2空斑測定單層覆蓋技術(shù)測定空斑計數(shù)。解凍血清，稀釋，在恒溫箱中于56。C熱滅活30分鐘。制備系列4倍稀釋的血清(1:5、1:10、1:40、1:160和1:640)。等體積稀釋登革熱病毒至含約40-60pfli,加入至每個血清稀釋管。在37。C孵育60分鐘后，從每管中取0.2mL，接種到裝在6孔板中一式三份的3孔匯合LLC-MK2上。每孔在37°C孵育90分鐘，然后單層用4mL的1。/。羧曱基纖維素/Earle's改進培養(yǎng)基覆蓋。平板在37°C于5%C02下孵育7天。然后計數(shù)空斑，使用對數(shù)概率紙檢測PRNT5G。繪制在每個稀釋水平的空斑減少百分比來測定50%減少滴度使用15%和85%之間的空斑減少點。結(jié)果以稀釋(度)的倒數(shù)表示。當如此檢測的中和抗體滴度為至少高于或等于1:10時，認為血清是陽性的，表示中和抗體存在。疫苗接種后30天的反應(yīng)在第31天，在所有接種ChimeriVaxTM-DEN2組中對抗登革熱2型病毒的血清轉(zhuǎn)化率高。在以高或低劑量接種ChimeriVaxTM-DEN2的YF幼稚型受試者中觀察到對異源DEN血清型1、3和4的低血清轉(zhuǎn)化率。在5.0和3.0log10PFU劑量組，對DEN1血清轉(zhuǎn)化率分別為23%和23%(表2);對DEN3分別為15%和23%;對DEN4分別為0%和0%。相對地，接種ChimeriVaxTM-DEN2的YF-免疫型受試者100%對所有異源的DEN血清型血清轉(zhuǎn)化。在YF幼稚型受試者中，ChimeriVaxTM-DEN2疫苗誘導(dǎo)非常低的對異源血清型1、3和4的交叉中和抗體滴度(表3)。對于受試者體內(nèi)在第31天對抗異源的登革熱血清型的幾何平均中和抗體滴度，接種ChimeriVaxTM-DEN2的YF-免疫型受試者顯著高于YF幼稚型受試者。對DEN1，接種5.0log10PFUChimeriVaxTM-DEN2的YF-免疫型受試者和接種5.0或3.0log10PFUChimeriVaxTM-DEN2的YF幼稚型受試者的幾何平均抗體滴度分別為79對IO和12(p<0.0001)。相似地，對DEN3，滴度為73對13和12(pO.0001)(表3)。沒有YF幼稚型受試者對DEN4血清轉(zhuǎn)化。在YF-免疫型受試者中對DEN4的幾何平均中和抗體滴度為57。表2.第31天治療組血清轉(zhuǎn)化率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>表3.第31天治療組幾何平均抗體滴度<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>疫苗接種后6個月的反應(yīng)疫苗接種后6個月的反應(yīng)列于下表4和5。在6個月，在以高或低劑量接種ChimeriVaxTM-DEN2的YF幼稚型受試者中觀察到低的對異源的DEN血清型1、3和4的血清陽性率。在5.0和3.01og,。PFU劑量組對DEN1的血清轉(zhuǎn)化率分別為23%和31%(表4);對DEN3分別為15%和23%;對DEN4分別為8%和8%。相對地，接種ChimeriVaxTM-DEN2的YF-免疫型受試者100%對DEN1和3血清陽性，64%對DEN4血清陽性。在YF幼稚型受試者中，ChimeriVax-DEN2疫苗誘導(dǎo)4氐的對異源血清型1、3和4的交叉反應(yīng)中和抗體滴度(表5)。在6個月時，接種ChimeriVaxTM-DEN2的YF-免疫型受試者的對抗異源的登革熱血清型幾何平均中和抗體滴度高于YF幼稚型受試者。對DENl,接種5.0log1()PFUChimeriVaxTM-DEN2的YF-免疫型受試者和接種5.0或3.0log1QPFUChimeriVaxTM-DEN2的YF幼稚型受試者的幾何平均抗體滴度分別為285對<10和14。相似地，對DEN3,滴度為268對<10和<10(表5)。表4.各治療組血清陽性比例(％)，6個月<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>表5.各治療組幾何平均抗體滴度，6個月<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>疫苗接種后1年的反應(yīng)在第12個月，在接種ChimeriVax-DEN2的YF-免疫組對抗登革熱2型病毒血清陽性率最高。當兩種DEN2抹PR-159和JAH被考慮時，這是特別明顯的。這兩種抹來自Americas,屬于兩種截然不同的變異體組(distinctvariantgroups)(分別為AmericaI和11)。在以高或低的劑量ChimeriVaxTM-DEN2接種的YF幼稚型受試者中，觀察到低的對異源的DEN血清型1、3和4的血清陽性率。在5.0和3.0log1()PFU劑量組，對DENl血清轉(zhuǎn)化率分別為23%和31%(表6);對DEN3分別為8%和23%;對DEN4分別為8%和0%。相對地，接種ChimeriVax-DEN2的YF-免疫型受試者100%對DEN1和3血清陽性，29%對DEN4血清陽性。YF幼稚型受試者中，ChimeriVaxTM-DEN2疫苗誘導(dǎo)低的對DEN2抹JaH和PR-159和對異源血清型1、3和4的交叉反應(yīng)中和抗體滴度(表7)。在第12個月，接種ChimeriVaxTM-DEN2的YF-免疫型受試者中對抗異源登革熱血清型的幾何平均中和抗體滴度顯著高于YF幼稚型受試者。對DEN1，接種5.0log,oPFUChimeriVaxTM-DEN2的YF畫免疫型受試者和接種5.0或3.0log1()PFUChimeriVaxTM-DEN2的YF幼稚型受試者的幾何平均抗體滴度分別為89對10和13(p<0.0001)。相似地，對DEN3，滴度為72對〈10和〈10(pO.0001)(表7)。表6.各治療組血清陽性比例(％)，12個月<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>表7.各治療組幾何平均抗體滴度，12個月<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>黃熱病j元體反應(yīng)意外地，接種ChimeriVax-DEN2的14名YF免疫型受試者中，只有2名(14%)有YF抗體增強。這就是說，在ChimeriVaxTM疫苗接種后預(yù)先存在的YF免疫力加強了對登革熱血清型1-4的反應(yīng)的同時，交互加強的情況并未出現(xiàn)(即，ChimeriVaxTM-DEN2未加強對黃熱病毒的抗體)。這種結(jié)果出乎意料，因為在接受ChimeriVaxTM-DEN2(共享黃熱病和登革熱包膜蛋白之間的抗原決定簇)的黃熱病免疫患者中，根據(jù)擴大的對登革熱抗體的反應(yīng)的機理，人們預(yù)期在接種ChimeriVaxTM-D2后會出現(xiàn)黃熱病抗體加強。結(jié)果說明對黃熱病毒交叉保護免疫反應(yīng)的不可預(yù)期性，并構(gòu)成了本發(fā)明的新穎性。T細力包反應(yīng)T細胞反應(yīng)通過響應(yīng)在培養(yǎng)物上清液中病毒抗原的IFNy產(chǎn)生來評價。受試者用滅活的病毒細胞溶解物篩選，該溶解物顯示產(chǎn)生對疫苗的主要的CD4+T細胞反應(yīng)，但也產(chǎn)生一些CD8+細胞(Mangada等，J.Immunol.Methods284:89-97,2004)。#發(fā)才法在第1天和第31天，通過用滅活病毒抗原激發(fā)培養(yǎng)物中的PBMC并測量PBMC產(chǎn)生的IFNy的產(chǎn)量來評價T細胞反應(yīng)。在第1和31天用Vacutainer細胞制劑管(CPT，BDBiosciences)收集全血，送至Acambis公司以分離和深低溫保藏PBMC。細胞在RPMI1640中洗滌，深低溫保藏于熱滅活的含10%DMSO的人AB血清(SeraCare,OceansideCA),儲存于液氮中，臨試驗前融化。為測量IFNy產(chǎn)量，PBMC與3種不同的戊二醛滅活病毒抗原:(l)ChimeriVaxTM-DEN2病毒(生長于Vero細胞)，(2)登革熱2PU0218抹病毒(野生型登革熱2病毒，生長于C^/兀細胞)，和("YF病毒(生長于Vero細胞)，用孔平底板以1.5x105細胞/孔于37°C下培養(yǎng)7天。對照由滅活的，支-感染Vero或C6/36細胞組成。以1:100(15)濃度加入滅活的病毒抗原或?qū)φ占毎乖Ｒ惨?(ig/mlConA激發(fā)PBMC作為試驗陽性對照。通過ELISA,使用在第7天收集的培養(yǎng)物上清液檢測IFNy的產(chǎn)量。層y根據(jù)生產(chǎn)商說明書，通過間接ELISA測定法分析培養(yǎng)物上清液IFNy含量(OpffiIATM人IFNy試劑盒，BDBiosciences畫Pharmingen,Cat#555142)。層y勿應(yīng)肝,量通過檢測對滅活病毒抗原的反應(yīng)，在研究的第l天和第31天(疫苗接種前和疫苗接種后第30天)對比IFNy細胞因子的產(chǎn)量。測試了給予的疫苗(ChimeriVaxTM-DEN2)、母代野生型登革熱-2病毒(PU0218)和給予的對照病毒(YF-VAX)。生長于Vero細胞的ChimeriVaxTM-DEN2在0天時有很低的背景，而生長于C6/36細胞的登革熱-2病毒在一些受試者中產(chǎn)生反應(yīng)。然而，在四個疫苗組每組中所有這些抗原都使IFNY的產(chǎn)量增加。滅活的YF-VAX⑧在任何受試者中免疫原性都不是非常強，但其確實在第31天相對第1天顯示出增加，特別是在YF接種的受試者中。使用第31天和第1天的值之間的差值進行疫苗接種組之間的比較(圖1)。所有組都對每個滅活的抗原響應(yīng)。接受103或105PFUChimeriVaxTM-DEN2疫苗的受試者有等價的IFNy水平。在IFNyELISA測定中，接種ChimeriVaxTM-Den2的受試者比接種YF的受試者的反應(yīng)稍高(無顯著性)(圖1)。YF預(yù)先免疫的受試者反應(yīng)者數(shù)量上和平均IFNy水平上有所增加(圖1)。表8總結(jié)了顯示作為總體的分數(shù)的反應(yīng)者數(shù)的結(jié)果。約65%接種ChimeriVaxTM-DEN2和YF的受試者對作為試驗抗原給予的疫苗有陽性IFNy反應(yīng)，而約卯％接種ChimeriVaxTM-DEN2的YF預(yù)先免疫受試者有陽性反應(yīng)(表8)。表8.對疫苗反應(yīng)的受試者數(shù)(基于IFNy反應(yīng))免疫接種組YFCVD2Den2PU0218CVD21032/149/148/14CVD21051/149/147/14YF1053/149/144/14YF-CVD21050/1413/147/14陽性反應(yīng)定義為5倍背景，或在第30天^50pg/ml(如果第1天低于10pg/ml(低于靈敏度))。本研究結(jié)果顯示大約65%接種ChimeriVaxTM-DEN2和YF的受試者對作為試驗抗原給予的疫苗有陽性T細胞反應(yīng)，而~90%接種ChimeriVaxTM-DEN2的YF預(yù)先免疫受試者有陽性反應(yīng)(通過IFNy反應(yīng)限定)。ChimeriVaxTM-DEN2疫苗病毒激發(fā)的IFNy產(chǎn)量為最大。此臨床試驗中的T細胞反應(yīng)與中和抗體反應(yīng)的一致之處在于所有劑量的疫苗都激發(fā)了相似的T細胞免疫反應(yīng)，并且對黃熱病毒的預(yù)先免疫力未抑制對ChimeriVaxTM-DEN2的T細胞反應(yīng)。兩劑ChimeriVaxTM-DEN2(103和105pfli)的IFNy反應(yīng)實質(zhì)上相同。對ChimeriVaxTM-DEN2的IFNy反應(yīng)未被預(yù)先黃熱病毒疫苗接種所降低，甚至有更多數(shù)量的反應(yīng)者，提示在YF預(yù)先免疫受試者有增強T細胞免疫力的趨勢。用于測定法的滅活抗原鑒別了最強的反應(yīng)者，但未明確產(chǎn)生免疫反應(yīng)的特異性蛋白。由于使用了滅活登革熱抗原，所以可能主要檢測出CD4+反應(yīng)。實施例2:四價登革熱疫苗研究設(shè)計和方法在本實施例中，我們評價了人類受試者在給予黃熱病17D疫苗后給予四種(4)嵌合黃熱病毒(每種包含互不相同的登革熱血清型的膜和包膜蛋白(ChimeriVaxTM-DEN四價))連續(xù)免疫的免疫反應(yīng)。研究的第一階段為評價包含血清型DEN1、2、3和4的四價ChimeriVaxTM-DEN疫苗較之于黃熱病(YF)疫苗(YF-丫八乂@)和安慰劑的安全性、耐受性和免疫原性。試驗第二階段評價連續(xù)給予YF-VAX/四價ChimeriVax-DEN較之于以5-9個月間隔的兩劑四價ChimeriVaxTM-DEN的安全性和免疫原性。研究包含首次疫苗接種前3-21天的篩選期、首次疫苗接種后1個月的雙盲治疔期、第二個3-21天的篩選期(在首次疫苗接種后，30天的開放標簽治療期開始之前5-9個月)。計劃在第12個月隨訪。在研究的第一階段，三組33名健康成人男性和女性受試者接受四價ChimeriVaxTM-DEN(組1)、YF-VAX⑧(組2)或安慰劑(YF-VAX⑧稀釋劑-組3),共99名受試者。在進行任何試驗相關(guān)程序前，受試者簽署知情同意書。在篩選期間，通過病史、體檢、重要體征、臨床化學(xué)、血液學(xué)和血清學(xué)(包括女性受試者的血清妊娠檢查)，和尿液分析的尿樣來評估合格性。在第1天，受試者在三角肌區(qū)域接受雙盲皮下疫苗接種，然后在第3、5、7、9、11、13、15、17、19和21天到門診進行不良事件(AE)檢查并收集測病毒血癥的血液樣品。另外，在第5、9、11和15天，受試者提供血液樣品用于臨床實驗室評估。在第11和31天，和第5-9個月，受試者提供血液樣品用于抗體分析。在第5-9個月，評估連續(xù)的合格性，記錄中間時期的醫(yī)療史。合格的受試者在三角肌區(qū)域接受第二次皮下疫苗接種(四價ChimeriVax-DEN疫苗)。受試者在第2、4、6、8、10、12、14、16、18和20天后到門診進行AE檢查并收集測病毒血癥的血樣。第二次疫苗接種后第10和30天獲得抗體檢測血樣。所有受試者在初次疫苗接種后12個月返回門診(第二次疫苗接種后3-7個月)進行抗體^r測。研究設(shè)計見表9和10。表9.第一天給予的處理組安慰劑ChimeriVaxTM-DEN四價logI0TCID50/劑YF-VAXlogl()PFU/劑N<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>每種血清型準確的四價ChimeriVax-DEN劑量通過TCID5()測定法檢測為3.7/3.1/3.8/3.2TCID5Q(分別對應(yīng)血清型1、2、3和4)。評<介免疫反應(yīng)的標準如下免疫原性的首要終點為在第31天對登革熱血清型1-4的血清轉(zhuǎn)化率，使用如實施例1所述進行的恒量(constant)-病毒、血清-稀釋50。/?？瞻?減少中和檢測(PRNT5。)。這種分析定義了對所有四種登革熱血清型和對單個血清型的血清轉(zhuǎn)化率。處于基線的血清陰性(<1:10)的受試者需要PRNT5G滴度>1:10來達到血清轉(zhuǎn)化標準。第二終點包括首次疫苗接種后5-9個月和首次疫苗接種后12個月(即第二次，加強疫苗接種后3-7個月)對各登革熱血清型的幾何平均中和抗體滴度和血清轉(zhuǎn)化率的分析。比較接受(a)單劑量ChimeriVaxTM-DEN四價；(b)兩劑ChimeriVaxTM-DEN四價，或(c)一劑黃熱病17D疫苗(YF-VAX),然后5-9個月后給予一劑ChimeriVax-DEN四價的受試者的這些血清學(xué)反應(yīng)。結(jié)果評價研究對象在不同免疫方式后對所有四種登革熱血清型的免疫反應(yīng)幅度。免疫人類受試者對抗登革熱病毒疾病的目標是盡可能達到廣泛的交叉中和抗體反應(yīng)。所有受試者(在基線為登革熱和黃熱病幼稚型)在第二研究治療劑量后30天的免疫反應(yīng)見表ll(對抗野生型抹結(jié)果)。54名受試者(在基線為登革熱和黃熱病幼稚型)在第1天接受單劑量的ChimeriVaxTM-DEN四價，或在第1天接受安慰劑，然后在5-9個月接受單劑量的ChimeriVaxTM-DEN四價。這些組接受活疫苗30天后的中和抗體反應(yīng)合并后列于表11的最右欄。少數(shù)接受單劑量ChimeriVaxTM-DEN四價接種的受試者有對3或4登革熱血清型的交叉反應(yīng)免疫反應(yīng)。只有43%和17%的接受單劑量ChimeriVaxTM-DEN四價的受試者分別產(chǎn)生對至少3或4登革熱血清型的中和抗體。27名受試者(在基線為登革熱和黃熱病幼稚型)在第1天和5-9個月接受兩劑ChimeriVaxTM-DEN四價(組1)。中和抗體反應(yīng)見表11。組1的中和抗體反應(yīng)幅度比只接受單劑ChimeriVaxTM-DEN四價的受試者高。55.60/。和40.7%接受兩劑ChimeriVaxTM-DEN四價的受試者分別產(chǎn)生對3或4登革熱血清型的中和抗體。26名受試者(在基線為登革熱和黃熱病幼稚型)在第1天接受黃熱病疫苗(￥^八乂@),隨后在第5-9個月接受單劑量的ChimeriVax-DEN四價(組2)。組2中的中和抗體反應(yīng)見表11。組2中的中和抗體反應(yīng)幅度高于接受無論一劑ChimeriVax-DEN四價或兩劑被5-9個月分開的ChimeriVaxTM-DEN四價的受試者。92%和65%接受連續(xù)黃熱病疫苗和ChimeriVax-DEN四價疫苗免疫的受試者分別產(chǎn)生對至少3或4登革熱血清型的中和抗體。結(jié)果清楚地顯示連續(xù)免疫方式(其中黃熱病疫苗先于ChimeriVaxTM-DEN四價疫苗給予)所致的對登革熱更強的免疫反應(yīng)(對登革熱血清型廣泛的交叉反應(yīng))，高于單獨的單劑或兩劑試驗的ChimeriVaxTM-DEN四i"介疫苗所致反應(yīng)。盡管為清晰理解的目的，通過說明和實施例相當詳細地描述了以上發(fā)明，很明顯的是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明技術(shù)可在不偏離附加的權(quán)利要求的精神或范圍內(nèi)作某些改變和改進。以上所有引用文獻通過引用結(jié)合于本文。疫苗接種前和第二次疫苗接種(首次劑量后個5-9個月給予)后10和30天抗體抗體反應(yīng)。各治療組對抗登革熱抹(l-4型)至少一種血清型，至少兩種血清型，至少三種血清型和四種血清型。接種后時間[l]血清陽性[2]組1:ChimeriVaxTM-DEN—組2:合并的單劑量<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>否4C14.8%)2(7.7%)12(22.2%)缺失0(0.0%)0(0.0%)0(0.0%)至少三種0天曰疋8(29.6%)1(3.8%)0(0.0o/o)血清型否19(70.4%)25(96.2%)54(100.0%)缺失0(0.0%)0(0.0%)0(0.0%)10天15(55.6%)(7.7%)1(1.9%)否10(37.0%)22(84.6%)51(94.4%)缺失2(7.4%)2(7.7%)2C3.7%)30天是15(55.6%)24(92.3%)23(42.6%)否12(44.4%)2(7.7%)31(57.4%)缺失0(0.0%)0(0.0%)0(O夠全部四種0天4(14.8%)0(0.0%)0C0.0%)血清型否23(85.2%)26(跳0%)54(100.0%)缺失0(0.0%)0(0.0%)0C0.0%)10天是7(25.9%)1(3.8%)0(0.0%)否18(66.7%)23(88.5%)52(96.3%)缺失(7.4%)(7.7%)2C3.7%)30天是11(40.7%)17(65.4%)9C16.7%)否16(59.3%)9(34.6%)45(83.3%)缺失0(0.0%)0(0.0%)0C0.0%)[1]第O天為第5-9個月給予第二次疫苗接種的那一天。此時間點測量的抗體為5-9個月前首次疫苗接種的結(jié)果。[2]中和抗體滴度SIO。200680037391.8轉(zhuǎn)溢也械32/32權(quán)利要求1.一種在受試者體內(nèi)誘導(dǎo)對登革熱病毒長效、交叉中和免疫反應(yīng)的方法，該方法包含給予受試者(i)一劑黃熱病毒疫苗，和(ii)一劑嵌合黃病毒疫苗，該疫苗包含至少一種嵌合黃病毒，該病毒包含黃熱病毒骨架，其中編碼黃熱病毒包膜蛋白的序列由編碼登革熱病毒包膜蛋白的序列替代，其中嵌合黃病毒疫苗在給予黃熱病疫苗后至少30天至10年內(nèi)給予。2.權(quán)利要求1的方法，其中嵌合黃病毒包含黃熱病毒骨架，其中編碼黃熱病毒膜和包膜蛋白的序列由編碼登革熱病毒膜和包膜蛋白的序列替代。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中登革熱包膜和/或登革熱膜蛋白為改組蛋白。4.權(quán)利要求1的方法，其中嵌合黃病毒疫苗在給予黃熱病疫苗后30、60或90天給予受試者。5.權(quán)利要求l的方法，其中嵌合黃病毒包含YF17D病毒骨架。6.權(quán)利要求1的方法，其中黃熱病毒疫苗包含YF17D疫苗林17D-204、17D-213或17DD。7.權(quán)利要求l的方法，其中一種嵌合黃病毒包含黃熱病毒骨架，其中編碼黃熱病毒膜和包膜蛋白的序列由編碼登革熱血清型i病毒膜和包膜蛋白的序列替代。8.權(quán)利要求l的方法，其中一種嵌合黃病毒包含黃熱病毒骨架，其中編碼黃熱病毒膜和包膜蛋白的序列由編碼登革熱血清型2病毒膜和包膜蛋白的序列替代。9.權(quán)利要求l的方法，其中一種嵌合黃病毒包含黃熱病毒骨架，其中編碼黃熱病毒膜和包膜蛋白的序列由編碼登革熱血清型3病毒膜和包膜蛋白的序列替代。10.權(quán)利要求1的方法，其中一種嵌合黃病毒包含黃熱病毒骨架，其中編碼黃熱病毒膜和包膜蛋白的序列由編碼登革熱血清型4病毒膜和包膜蛋白的序列替代。11.權(quán)利要求l的方法，其中嵌合黃病毒疫苗為單價疫苗。12.權(quán)利要求l的方法，其中嵌合黃病毒疫苗為4價疫苗。13.權(quán)利要求l的方法，該方法進一步包含在首劑嵌合黃病毒疫苗后6個月至10年，給予如權(quán)利要求1的(ii)中所定義的加強劑量嵌合黃病毒疫苗。14.一種試劑盒，該試劑盒包含(i)黃熱病毒疫苗，和(ii)嵌合黃病毒疫苗，該疫苗包含至少一種嵌合黃病毒，該病毒包含黃熱病毒骨架，其中編碼黃熱病毒包膜蛋白的序列由編碼登革熱病毒包膜蛋白的序列替代。15.權(quán)利要求14的試劑盒，其中嵌合黃病毒包含黃熱病毒骨架，其中編碼黃熱病毒膜和包膜蛋白的序列由編碼登革熱病毒膜和包膜蛋白的序列替代。16.權(quán)利要求14或權(quán)利要求15的試劑盒，其中登革熱包膜和/或登革熱膜蛋白為改組蛋白。17.權(quán)利要求14的試劑盒，其中黃熱病毒疫苗包含YF17D抹。18.權(quán)利要求14的試劑盒，其中嵌合黃病毒包含YF17D病毒骨恕木。19.權(quán)利要求14的試劑盒，其中嵌合黃病毒疫苗包含一種嵌合黃病毒，該病毒包含黃熱病毒骨架，其中編碼黃熱病毒膜和包膜蛋白的序列由編碼登革熱血清型1病毒膜和包膜蛋白的序列替代。20.權(quán)利要求14的試劑盒，其中嵌合黃病毒疫苗包含一種嵌合黃病毒，該病毒包含黃熱病毒骨架，其中編碼黃熱病毒膜和包膜蛋白的序列由編碼登革熱血清型2病毒膜和包膜蛋白的序列替代。21.權(quán)利要求14的試劑盒，其中嵌合黃病毒疫苗包含一種嵌合黃病毒，該病毒包含黃熱病毒骨架，其中編碼黃熱病毒膜和包膜蛋白的序列由編碼登革熱血清型3病毒膜和包膜蛋白的序列替代。22.權(quán)利要求14的試劑盒，其中嵌合黃病毒疫苗包含一種嵌合黃病毒，該病毒包含黃熱病毒骨架，其中編碼黃熱病毒膜和包膜蛋白的序列由編碼登革熱血清型4病毒膜和包膜蛋白的序列替代。23.權(quán)利要求14的試劑盒，該試劑盒進一步包含至少一種加強劑量的嵌合黃病毒疫苗。24.疫苗(i)和(ii)在受試者體內(nèi)誘導(dǎo)對登革熱病毒長效、交叉中和免疫反應(yīng)的用途，(i)一劑黃熱病毒疫苗，和(ii)一劑嵌合黃病毒疫苗，該疫苗包含至少一種嵌合黃病毒，該病毒包含黃熱病毒骨架，其中編碼黃熱病毒包膜蛋白的序列由編碼登革熱病毒包膜蛋白的序列替代，其中嵌合黃病毒疫苗在給予黃熱病疫苗后至少30天至IO年內(nèi)給予。全文摘要本發(fā)明涉及對抗登革熱病毒感染疫苗接種中使用的方法和試劑盒。文檔編號A61K39/193GK101287490SQ200680037391公開日2008年10月15日申請日期2006年8月9日優(yōu)先權(quán)日2005年8月10日發(fā)明者F·圭拉庫,J·朗,N·坎薩-塔桑,R·富拉,T·H·埃爾馬克,T·P·莫納思申請人:阿坎姆比斯公司;賽諾菲巴斯德有限公司