專利名稱：：用于治療乳腺癌的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物科學(xué)領(lǐng)域，更明確地，涉及癌癥研究領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明涉及包括能夠抑制A2254或A5623編碼基因表達(dá)的核酸的組合物。在一些實(shí)施方案中，該化合物是對應(yīng)于來自這些基因的亞序列的小干擾RNA(siRNA)。本發(fā)明還涉及用于鑒定可用于治療和預(yù)防癌癥的化合物的方法和試劑盒。而且，本發(fā)明還涉及治療或預(yù)防癌癥特別是乳腺癌的方法，包括施用抑制A2254與A5623之間結(jié)合的化合物，本發(fā)明還涉及包含這些結(jié)合抑制劑的組合物。
背景技術(shù)：
：乳腺癌(BRC)是一種復(fù)雜的疾病，其特征是大量基因中遺傳和表觀遺傳改變的積累(NathansonKL.，ef,NatMed,7(5):552-6,2001)。乳&泉癌發(fā)生的多步模型，即正常細(xì)胞經(jīng)由非典型導(dǎo)管增生、原位導(dǎo)管癌(DCIS)和浸潤性(invasive)導(dǎo)管癌(IDC)等階段的轉(zhuǎn)化，與其他組織中的癌發(fā)生階段相似，但是推進(jìn)乳腺癌的確切分子機(jī)制尚未知。顯然，導(dǎo)致原發(fā)乳腺癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的分子因子很可能成為預(yù)防和治療這類疾病的更好工具的開發(fā)目標(biāo)。通過cDNA微陣列分析獲得的基因表達(dá)模式可以為表征每種癌癥的本質(zhì)提供相當(dāng)大量的信息；這些信息的應(yīng)用前景在于其通過開發(fā)新型藥物改進(jìn)腫瘤病臨床治療策略的潛力(Petricoin、E.F.、3rd、"a/.、NatGenet、32Suppl:474-479、2002;BangeJ，.、NatMed、7(5):548-52、2001)。帶著這個(gè)目的，我們分析了77例乳腺腫瘤的表達(dá)模式，包括通過激光微光束顯微解剖(LMM)和代表27,648個(gè)基因的cDNA微陣列的組合方法純化的12個(gè)DCIS和69個(gè)IDC(NishidateT,&"/"IntJOncol.2004Oct;25(4)797-819)。這些實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)不僅可以提供有關(guān)乳腺腫瘤發(fā)生的重要信息，對于鑒定其產(chǎn)物可作為診斷標(biāo)志和/或作為治療乳腺癌的分子靶標(biāo)的候選基因也很具有價(jià)值。發(fā)明公開本發(fā)明是基于如下的發(fā)現(xiàn)，即A2254和A5623在乳腺癌細(xì)胞中顯著過高表達(dá)，并且抑制A2254或A5623的表達(dá)可有效抑制多種癌細(xì)胞，包括BRC涉及的癌細(xì)胞的細(xì)胞生長。本申請描述的發(fā)明即是部分地基于此發(fā)現(xiàn)。為了分離用于治療乳腺癌的新分子靶標(biāo)，本發(fā)明人組合使用cDNA陣列和激光微光束顯微解剖研究了77個(gè)絕經(jīng)期前乳腺癌病例的全基因組表達(dá)模式。在上調(diào)的基因中，本發(fā)明人鑒定了被指稱為驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員2C(X/F2C)的A2254以及被指稱為胞質(zhì)分裂蛋白調(diào)節(jié)因子(戶iCOl的A5623,它們的表達(dá)在本發(fā)明人能夠獲得表達(dá)數(shù)據(jù)的乳腺癌病例中，分別在60例中的44例和58例中的37例中有上調(diào)。隨后的半定量RT-PCR和Northern印跡分析證實(shí)，與正常人類組織包括乳腺導(dǎo)管細(xì)胞和正常乳腺相比，A2254和A5623在臨床乳腺癌樣品和乳腺癌細(xì)胞系中顯著過高表達(dá)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，外源A2254和A5623定位于COS7細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞質(zhì)器(cytoplasmicapparatus)中。特另'J地，夕卜源A5623可見于COS7細(xì)胞的中間纖維網(wǎng)絡(luò)中。用小干擾RNA(siRNAs)處理乳腺癌細(xì)胞有效抑制了A2254和A5623的表達(dá)，并分別抑制乳腺癌細(xì)胞、T47D和HBC5的細(xì)胞/腫瘤生長。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，A2254[和A5623]在HT1080細(xì)胞中瞬時(shí)過高表達(dá)可促進(jìn)劃痕測定(scratchassay)中細(xì)胞的遷移，表明這些基因在細(xì)胞遷移中均發(fā)揮關(guān)鍵作用(數(shù)據(jù)未顯示)。這些發(fā)現(xiàn)表明，乳腺腫瘤發(fā)生或轉(zhuǎn)移中可能涉及了A2254和A5623過高表達(dá)，并可能是特異性治療乳腺癌患者的有希望的策略。而且，本發(fā)明人證明，A5623能夠通過其N端側(cè)的一部分與A2254結(jié)合，并且在細(xì)胞分裂后期和胞質(zhì)分裂期間，A5623和A2254共定位于中間體。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，在乳腺癌細(xì)胞中，外源A2254在前期定位于有絲分裂紡錘體極，然后在中期和后期的早期階段定位于整個(gè)有絲分裂紡錘體。這些發(fā)現(xiàn)表明，A2254和A5623的復(fù)合物可能參與了乳腺肺瘤發(fā)生，并可能是特異治療乳腺癌患者的有希望的策略。A2254被指稱為驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員2C,它具有兩種不同的轉(zhuǎn)錄變體，分別由21和20個(gè)外顯子構(gòu)成，對應(yīng)于A2254V1(GenBank登錄號(hào)NO:AB264115,SEQIDNO:35，36)和A2254V2(GenBank登錄號(hào)NO:AY026505，SEQIDNO:37，38)(圖3A,上圖面)。因此，在本發(fā)明中，A2254包括A2254V1和A2254V2。VI變體的外顯子1和2分別是185bp和94bp,而V2變體沒有VI的外顯子1和2,而具有一個(gè)由346bp構(gòu)成的新外顯子作為外顯子1。V2變體的最后一個(gè)外顯子(外顯子20)比VI變體的最后一個(gè)外顯子(外顯子21)的3'端短537bp。A2254V1和A2254V2變體的全長cDNA序列分別含有2886和2401個(gè)核苷酸。這些變體的ORF開始于每個(gè)外顯子1內(nèi)。最終，VI和V2轉(zhuǎn)錄物分別編碼725和671個(gè)氨基酸。A5623被指稱為胞質(zhì)分裂蛋白調(diào)節(jié)因子1，它也有三種不同的轉(zhuǎn)錄變體，分別由15、14和14個(gè)外顯子構(gòu)成，對應(yīng)于A5623V1(Genbank登錄號(hào)NO:NM一003981;SEQIDNO:39、40)，A5623V2(Genbank登錄號(hào)NO:NM—199413;SEQIDNO:41、42)和A5623V3(Genbank登錄號(hào)NO:NM—199414;SEQIDNO:43、44)(圖3B，上圖面)。因此，本發(fā)明中A5623包括A5623V1、A5623V2和A5623V3。VI的外顯子13和14有可選擇的變化，其余外顯子在所有變體中均相同。V2變體沒有VI的外顯子14,在最后一個(gè)外顯子內(nèi)產(chǎn)生新的早終止密碼子。V3的外顯子14被完全刪除，并且V3的外顯子13在3，端比VI的外顯子13短77bp,也在最后一個(gè)外顯子內(nèi)產(chǎn)生一個(gè)新的早終止密碼子。A5623V1、A5623V2和A5623V3變體的全長cDNA序列分別由3128、3091和3011個(gè)核苷酸構(gòu)成。這些變體的ORF開始于每個(gè)外顯子1內(nèi)。最終，VI、V2和V3轉(zhuǎn)錄物分別編碼620、606和566個(gè)氨基酸。本發(fā)明提供了抑制細(xì)胞生長的方法。在本文提供的方法中有這樣的方法，它們包括使細(xì)胞與包含抑制A2254或A5623表達(dá)的小干擾RNA(siRNA)的組合物接觸。本發(fā)明還提供了用于抑制受試者中腫瘤細(xì)胞生長的方法。這些方法包括向受試者施用含有與來自A2254或A5623的序列特異雜交的小干擾RNA(siRNA)的組合物。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了用于抑制生物樣品細(xì)胞中A2254或A5623基因表達(dá)的方法。所述基因的表達(dá)可以通過向細(xì)胞內(nèi)引入足以抑制A2254或A5623基因表達(dá)的量的雙鏈核糖核苷酸(RNA)分子來加以抑制。本發(fā)明的另一個(gè)方面包括核酸序列和載體的產(chǎn)物，以及包含它們的組合物，它們有用于，例如，本文提供的方法。在本文提供的產(chǎn)物中有這樣的siRNA分子，它們具有在被引入到表達(dá)A2254或A5623基因的細(xì)胞內(nèi)時(shí)抑制這些基因表達(dá)的性質(zhì)。這類分子中有這樣的分子，它們包括有義鏈和反義4連，其中有義鏈包括與A2254或A5623靶序列對應(yīng)的核糖核苦酸序列，并且其中該反義鏈包括與所述有義鏈互補(bǔ)的核糖核芬酸序列。分子的有義和反義鏈彼此雜交形成雙鏈分子。本發(fā)明進(jìn)一步的方面是篩選可用于治療或預(yù)防癌癥，特別是乳腺癌的化合物的方法，所述方法包括如下步驟(a)在測試化合物的存在下，使包含A5623多肽的A2254-結(jié)合域的多肽與包含A2254多肽的A5623-結(jié)合域的多肽接觸；(b)檢測多肽間的結(jié)合；和(c)選擇可抑制多肽間結(jié)合的測試化合物。技術(shù)人員可通過本領(lǐng)域已知的用于確定蛋白相互作用域的方法確定A5623多肽的A2254-結(jié)合域或A2254多肽的A5623-結(jié)合域。例如，相互作用域可通過相互作用域作圖(interactiondomainmapping)力口以確定。例如，分別表達(dá)A2254或A5623多肽的不同部分并應(yīng)用例如酵母雙雜交系統(tǒng)篩選相互作用。由酵母雙雜交系統(tǒng)鑒定的相互作用，可通過應(yīng)用例如生物化學(xué)測定，如免疫沉淀和/或柱上相互作用，來加以確證。前面提到的用于相互作用域鑒定和/或作圖的方法決沒有限制意義，因?yàn)榧夹g(shù)人員可以容易地應(yīng)用其他本領(lǐng)域已知的用于相互作用域鑒定和作圖的方法。優(yōu)選地，在A5623多肽與A2254多肽之間結(jié)合的抑制劑的篩選方法中應(yīng)用的含A2254-結(jié)合域的多肽，包括A5623多肽，例如A5623V1(SEQIDNO:40)、A5623V2(SEQIDNO:42)或A5623V3(SEQIDNO:44)。在另一個(gè)優(yōu)選方面中，在A5623多肽與A2254多肽之間結(jié)合抑制劑的篩選方法中應(yīng)用的含A5623-結(jié)合域的多肽，包括A2254多肽，例如A2254V1(SEQIDNO:36)或A2254V1(SEQIDNO:38)。本發(fā)明的另外一個(gè)方面是用于篩選治療或預(yù)防乳腺癌的化合物的試劑盒，其中該試劑盒包括(a)包含A5623多肽的A2254-結(jié)合域的多肽；(b)包含A2254多肽的A5623-結(jié)合域的多肽；和(c)用于檢測多肽間相互作用的試劑。優(yōu)選地，所述含有A2254-結(jié)合域的多肽包括A5623多肽，或者所述含有A5623-結(jié)合域的多肽包括A2254多肽。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防受試者中乳腺癌的方法。其中該方法包括施用藥物有效量的可抑制A5623多肽與A2254多肽之間結(jié)合的化合物的步驟。而且，本發(fā)明還涉及用于治療或預(yù)防乳腺癌的組合物，其中該組合物包括藥物有效量的抑制A5623多肽與A2254多肽之間結(jié)合的化合物和藥物可接受的載體。如這里使用的，術(shù)語"生物體"是指任何由至少一個(gè)細(xì)胞構(gòu)成的活體?；畹纳矬w可以簡單到例如單個(gè)真核生物細(xì)胞，或者復(fù)雜到哺乳動(dòng)物，包括人類。如這里使用的，術(shù)語"生物樣品"是指整個(gè)生物體或者其的組織、細(xì)胞或組成部分的一部分(例如體液，包括但不僅限于，血液、粘液、淋巴液、滑液、腦脊液、唾液、羊水、羊膜臍血、尿、陰道液和精液)。"生物樣品，，進(jìn)一步指從整個(gè)生物體或其細(xì)胞、組織或組成部分的一部分制備的勻漿、裂解物、提取物、細(xì)胞培養(yǎng)物或組織培養(yǎng)物，或者其級分或部分。最后，"生物樣品"指含有細(xì)胞組分，例如蛋白質(zhì)或核酸分子的介質(zhì)，例如生物體在其中繁殖的營養(yǎng)肉湯或凝膠。本發(fā)明以抑制細(xì)胞生長的方法為特征。使細(xì)胞與A2254或A5623小干擾RNA(siRNA)的組合物接觸抑制細(xì)胞生長。細(xì)胞進(jìn)一步與轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑接觸。細(xì)胞在體外、體內(nèi)或離體提供。受試者是哺乳動(dòng)物，例如人、非人靈長動(dòng)物、小鼠、大鼠、狗、貓、馬或牛。細(xì)胞是乳腺導(dǎo)管細(xì)胞?；蛘呒?xì)胞是腫瘤細(xì)胞(也就是癌細(xì)胞)，例如上皮細(xì)胞癌(carcinoma)細(xì)胞或腺癌細(xì)胞。例如，細(xì)胞是乳腺癌細(xì)胞。"抑制細(xì)胞生長"的意思是，被處理細(xì)胞與未處理細(xì)胞相比增殖速度較低或者生存能力下降。細(xì)胞生長通過本領(lǐng)域已知的增殖測定加以測量。術(shù)語"siRNA"的意思是阻止耙mRNA翻譯的雙鏈RNA分子。使用將siRNA引入到細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，包括其中DNA是轉(zhuǎn)錄RNA的模板的技術(shù)。siRNA包括有義A2254或A5623核酸序列，反義A2254或A5623核酸序列，或者兩者。siRNA可以包括兩個(gè)互補(bǔ)的分子，或者可以被構(gòu)建使得單一轉(zhuǎn)錄物同時(shí)具有來自靶基因的有義和互補(bǔ)反義序列，例如發(fā)夾，在一些實(shí)施方案中發(fā)夾導(dǎo)致微RNA(miRNA)的產(chǎn)生。耙細(xì)胞內(nèi)siRNA與A2254或A5623轉(zhuǎn)錄物的結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞的A2254或A5623產(chǎn)生減少。寡核苷酸的長度至少為大約IO個(gè)核苷酸，并可以與天然存在的A2254或A5623轉(zhuǎn)錄物一樣長。優(yōu)選地，寡核苷酸的長度為大約19-大約25個(gè)核芬酸。最優(yōu)選地，寡核普酸的長度小于大約75個(gè)、大約50個(gè)、或者大約25個(gè)核香酸。抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)A2254或A5623表達(dá)的A2254或A5623siRNA寡核苷酸的實(shí)例包括分別含有靶序列的寡核苷酸，其中所述靶序列例如分別為SEQIDNO:21或25的核香酸，或29或33的核香酸。設(shè)計(jì)具有抑制靶細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)能力的雙鏈RNA的方法是已知的(見例如，美國專利No.6,506,559，本文引用其全部內(nèi)容作為參考)。例如，可以/人Ambion網(wǎng)點(diǎn)(http:〃www.ambion.co.jp/techlib/tb/tb—506,html)獲4尋用于"i殳計(jì)siRNA的計(jì)算機(jī)程序。該計(jì)算機(jī)程序可以從Ambion公司獲得，根據(jù)如下的方案選擇用于siRNA合成的核苷酸序列。選擇siRNA乾點(diǎn)1.從轉(zhuǎn)錄物的AUG起始密碼子開始向下游掃描AA雙核芬酸序列。記錄每個(gè)AA的出現(xiàn)及其3'側(cè)相鄰的19個(gè)核苷酸作為潛在siRNA靶點(diǎn)。Tuschl等在TargetedmRNAdegradationbydouble-strandedRNAv"ro.GewasZ)ev13(24):3191-7(1999)中不推薦針對5，和3，非翻譯區(qū)(UTR)以及鄰近起始密碼子的區(qū)域(75個(gè)堿基之內(nèi))設(shè)計(jì)siRNA，因?yàn)檫@里可能更富含調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)。UTR結(jié)合蛋白和/或翻譯起始復(fù)合物可能干擾siRNA核酸內(nèi)切酶復(fù)合物的結(jié)合。2.將潛在靶點(diǎn)與合適的基因組數(shù)據(jù)庫(人、小鼠、大鼠等)進(jìn)行比較，將任何與其他編碼序列顯著同源的靶序列排除在考慮之外。建議使用BLAST(AltschulSF、d.a/.、NucleicAcidsRes.1997;25:3389-402;JMolBiol.1990;215:403-10.),其可見于NCBI服務(wù)器www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。3.選擇合格的靶序列用于合成。通常在待評估的基因的長度上選擇幾個(gè)靶序列。本發(fā)明還包括含有靶序列的核酸序列的分離核酸分子，所述靶序列例如SEQIDNO:21、25、29和33的核苷酸，或者與SEQIDNO:21、25、29和33的核苷酸的核酸序列互補(bǔ)的核酸分子。如這里使用的，"分離核酸"是從其原環(huán)境(例如，如果是自然存在的，即自然環(huán)境)移出的核酸，因而人工地(syntheticaliy)改變了其自然狀態(tài)。在本發(fā)明中，分離的核酸包括DNA、RNA及其衍生物。當(dāng)分離核酸是RNA或其衍生物時(shí)，應(yīng)當(dāng)在核苷酸序列中將堿基"t"替換為"u"。如這里使用的，術(shù)語"互補(bǔ)"是指核酸分子核香酸單元之間的Watson-Crick或Hoogsteen堿基配對，而術(shù)語"結(jié)合"是指兩個(gè)核酸或化合物、或者相關(guān)核酸或化合物、或它們的組合之間的物理或化學(xué)相互作用。互補(bǔ)核酸序列在合適的條件下雜交，形成含有極少或者沒有錯(cuò)配的穩(wěn)定雙鏈體。為了本發(fā)明的目的，兩條具有5個(gè)或者更少錯(cuò)配的序列被認(rèn)為是互補(bǔ)的。而且，本發(fā)明分離核苷酸的有義鏈和反義鏈可通過雜交形成雙鏈核苷酸或發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，這種雙鏈體在每IO個(gè)匹配中的錯(cuò)配數(shù)不超過1個(gè)。在雙鏈體鏈完全互補(bǔ)的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，這種雙鏈體沒有錯(cuò)配。對于A2254或A5623而言，核酸分子的長度分別小于2886或3128個(gè)核苷酸。例如，核酸分子的長度小于大約500、大約200、或者大約75個(gè)核苷酸。本發(fā)明還包括含有一個(gè)或多個(gè)本文所述核酸的載體，以及含有該載體的細(xì)胞。本發(fā)明的分離核酸可用于抗A2254或A5623的siRNA，或者編碼該siRNA的DNA。當(dāng)核酸用于siRNA或其編碼DNA時(shí)，有義鏈優(yōu)選地長于大約19個(gè)核香酸，更優(yōu)選地長于21個(gè)核香酸。本發(fā)明部分地基于如下的發(fā)現(xiàn)，即編碼A2254或A5623的基因在乳腺癌(BRC)中相比于在非癌性乳腺組織中過高表達(dá)。A2254V1和A2254V2的cDNA長度分別為2886和2401個(gè)核苷酸。A5623V1、A5623V2和A5623V3的cDNA長度分別為3128、3091和3011個(gè)核瞽酸。A2254V1和A2254V2的核酸和多肽序列分別如SEQIDNO:35和36、及SEQIDNO:37和38所示。A5623V1、A5623V2和A5623V3的核酸和多肽序列分別如SEQIDNO:39和40、SEQIDNO:41和42以及SEQIDNO:43和44所示。序列數(shù)據(jù)還可以從如下登錄號(hào)獲得。A2254:AY026505A5623:NM—003981、NM—199413、NM—199414抑制細(xì)胞生長的方法本發(fā)明涉及通過抑制A2254或A5623的表達(dá)而抑制細(xì)胞生長，即癌細(xì)胞生長?；蛘撸景l(fā)明涉及通過抑制A5623多肽與A2254多肽的結(jié)合而抑制細(xì)胞生長，即癌細(xì)胞生長，特別是乳腺癌的生長，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)兩種多肽可以相互作用，并且認(rèn)為它們的相互作用在癌發(fā)生，特別是乳腺癌發(fā)生中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。因此，本發(fā)明涉及通過抑制A5623多肽與A2254多肽的結(jié)合而治療或預(yù)防受試者中乳腺癌的手段和方法。而且，本發(fā)明設(shè)想了一種A5623多肽與A2254多肽的結(jié)合抑制劑，用作治療或預(yù)防癌癥，特別是治療或預(yù)防乳腺癌的藥物。A2254或A5623的表達(dá)被例如特異性靶向A2254或A5623基因的小干擾RNA(si脂A)所抑制。A2254或A5623耙標(biāo)包括例如SEQIDNO:21、25、29和33的核苷酸。在非哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，雙鏈RNA(dsRNA)顯示對基因表達(dá)具有強(qiáng)烈而特異性的沉默效應(yīng)，這稱作RNA干擾(RNAi)(SharpPA.GenesDev.1999;13(2):139-41.)。dsRNA被一種含有RNA酶III基序的酶加工成20-23個(gè)核苷酸的dsRNA，稱作小干擾RNA(siRNA)。siRNA與多組分核酸酶復(fù)合物一起特異性輩巴向互補(bǔ)mRNA(HammondSM"a/"Nature.2000;404(6775):293-6;HannonGJ.Nature.2002;418(6894):244-51.)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，由20或21聚體dsRNA構(gòu)成、具有19個(gè)互補(bǔ)核苷酸和3'端非互補(bǔ)胸香或尿苷二聚體的siRNA顯示具有基因特異性敲低(knockdown)作用，而不會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)的全局改變(ElbashirSMda/.,Nature.2001;411(6836):494-8.)。此外，含有小核RNA(snRNA)U6或聚合酶IIIHI-RNA啟動(dòng)子的質(zhì)?？捎行Мa(chǎn)生這種短RNA募集型III族RNA聚合酶III,從而能夠組成型抑制其耙mRNA(MiyagishiM."a/.，NatBiotechnol.2002;20(5):497畫500.;BrummelkampTR，da/.，Science.296(5567):550-3,2002.)。通過使細(xì)胞與含有A2254或A5623之siRNA的組合物接觸抑制細(xì)胞的生長。進(jìn)一步將細(xì)胞與轉(zhuǎn)染試劑接觸。合適的轉(zhuǎn)染試劑在本領(lǐng)域是已知的。"抑制細(xì)胞生長"的意思是，與沒有暴露于組合物的細(xì)胞相比，細(xì)胞的增殖速度較低，生存能力下降。細(xì)胞生長用本領(lǐng)域已知的方法加以測量，例如MTT細(xì)力包增殖測定。A2254或A5623的siRNA指向A2254或A5623基因序列的單個(gè)靶標(biāo)?；蛘遱iRNA指向A2254或A5623基因序列的多個(gè)靶標(biāo)。例如，組合物含有指向A2254或A5623的2、3、4或5個(gè)或者更多個(gè)靶序列的A2254或A5623的siRNA。"A2254或A5623耙序列"是指與A2254或A5623基因的一部分相同的核苷酸序列。靶序列可包括人類A2254或A5623基因的5'非翻譯(UT)區(qū)、可讀框(ORF)或3'非翻譯區(qū)?；蛘遱iRNA是與A2254或A%23基因表達(dá)的上游或下游調(diào)節(jié)子互補(bǔ)的核酸序列。上游和下游調(diào)節(jié)子的實(shí)例包括結(jié)合A2254或A5623基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子、與A2254或A5623多肽相互作用的激酶或磷酸酶，A2254或A5623啟動(dòng)子或增強(qiáng)子。與靶mRNA雜交的A2254或A5623的siRNA,通過與通常為單鏈的mRNA轉(zhuǎn)錄物相結(jié)合，從而干擾翻譯，進(jìn)而干擾蛋白質(zhì)的表達(dá)，藉此降低或抑制由A2254或A5623基因編碼的A2254或A5623多肽產(chǎn)物的產(chǎn)生。因此，本發(fā)明的siRNA分子性雜交的能力加以鑒定。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語"雜交"或"特異性雜交"用于表示兩個(gè)核酸分子在"嚴(yán)緊雜交條件下"雜交的能力。短語"嚴(yán)緊雜交條件"是指在該條件下，典型地在核酸的復(fù)雜混合物中，核酸分子與其靶序列雜交而不與其他序列發(fā)生可檢測的雜交。嚴(yán)緊條件是序列依賴性的，在不同的環(huán)境下會(huì)不同。越長的序列在越高的溫度發(fā)生特異性雜交。在下列文獻(xiàn)中可獲得核酸雜交的詳纟田指導(dǎo)Tijssen,rec/zm々wes5/oc/ze脂's^yMo/ecw/orB/o/ogy—/^n'cfeaf/owW/z7Vwc/e/c尸raZ)es，"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays"(1993)。一般地，對于特定的序列，在限定的離子強(qiáng)度pH下，嚴(yán)緊條件選擇比熱解鏈溫度(Tm)低大約5-10。C。Tm是在平衡狀態(tài)下，與靶序列互補(bǔ)的探針中的50%與靶序列雜交的溫度(在限定的離子強(qiáng)度，pH和核濃度)(因?yàn)榘行蛄羞^量存在，因此在Tm時(shí)，50%的探針被占據(jù))。嚴(yán)緊條件還可以通過添加去穩(wěn)定劑如甲酰胺實(shí)現(xiàn)。為了選擇性或特異性雜交，陽性信號(hào)至少是背景的2倍，優(yōu)選地是背景雜交的10倍。嚴(yán)緊雜交條件的實(shí)例可如下50%曱酰胺、5xSSC和1%SDS,42。C溫育,或者5xSSC、1%SDS，65。C溫育，在50°C0.2xSSC、和0.1。/。SDS中清洗。本發(fā)明siRNA的長度小于大約500、大約200、大約100、大約50、或者大約25個(gè)核芬酸。優(yōu)選地，siRNA的長度為大約19-大約25個(gè)核香酸。示例性的用于產(chǎn)生A2254或A5623siRNA的核S交序列分別包括SEQIDNO:21或25、或者29或33的核苷酸的序列作為靶序列。而且，為了提高siRNA的抑制活性，在靶序列反義鏈的3'端可以添加核苷酸"u"。所添加的"u"的數(shù)目為至少大約2個(gè)，一般大約2-大約10個(gè)，優(yōu)選地大約2-大約5個(gè)。添加的"u"在siRNA反義鏈的3'端形成單鏈。細(xì)胞是任何表達(dá)或過高表達(dá)A2254或A5623的細(xì)胞。細(xì)胞是上皮細(xì)胞，例如乳腺導(dǎo)管細(xì)胞?；蛘?，細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞，例如癌、腺癌、母細(xì)胞瘤、白血病、骨髓瘤或肉瘤。細(xì)胞是乳腺癌。A2254或A5623的siRNA以能夠結(jié)合mRNA轉(zhuǎn)錄物的形式直接引入到細(xì)胞內(nèi)?；蛘?，編碼A2254或A5623的siRNA的DNA處于載體內(nèi)。載體是通過，例如，以允許兩條鏈均表達(dá)(通過DNA分子轉(zhuǎn)錄)的方式，將A2254或A5623靶序列克隆到具有位于A2254或A5623序列的側(cè)翼的、可操作連接的調(diào)節(jié)序列的表達(dá)載體中而產(chǎn)生的(Lee、N.S.、"a/.、(2002)NatureBiotechnology20:500-5)。與A2254或A5623mRNA反義的RNA分子由第一啟動(dòng)子(例如位于克隆DNA3，側(cè)的啟動(dòng)子序列)轉(zhuǎn)錄，對A2254或A5623mRNA而言為有義鏈RNA分子由第二啟動(dòng)子(例如位于克隆DNA的5'側(cè)啟動(dòng)子序列)轉(zhuǎn)錄。有義和反義鏈在體內(nèi)雜交，產(chǎn)生用于沉默A2254或A5623基因的siRNA構(gòu)建體?；蛘呃脙蓚€(gè)構(gòu)建體產(chǎn)生siRNA構(gòu)建體的有義和反義鏈。克隆的A2254或A5623可編碼具有二級結(jié)構(gòu)例如發(fā)夾的構(gòu)建體，其中單一轉(zhuǎn)錄物同時(shí)具有來自靶基因的有義和互補(bǔ)反義序列。在有義和反義序列之間可以存在由任意核苷酸序列構(gòu)成的環(huán)序列，以形成發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。因此，本發(fā)明還提供了具有通式5'-[A]-[B]-[A，]-3，的siRNA，其中[A]是與來自A2254或A5623的mRNA或cDNA特異性雜交的序列的相應(yīng)核糖核香酸序列。在優(yōu)選實(shí)施方案中，[A]是這樣的核糖核苷酸序列，它相應(yīng)于選自SEQIDNO:21、25、29和33的核苷酸的序列。[B]是由3-23個(gè)核苷酸構(gòu)成的核糖核苷酸序列，和[A，]是由[A]的互補(bǔ)序列構(gòu)成的核糖核苷酸序列。區(qū)域[A]與[A，]雜交，然后形成由區(qū)域[B]構(gòu)成的環(huán)。環(huán)序列的長度優(yōu)選地為大約3-大約23個(gè)核芬酸。環(huán)序列可以從例如由如下序列構(gòu)成的組中選4,(http:〃www.ambion.com/techlib/tb/tb—506.html)。而且，由23個(gè)核苦酸構(gòu)成的環(huán)序列也提供活性siRNA(Jacque、J.M.da/.、(2002)Nature418:435-8.)。CCC、CCACC或CCACACC:Jacque,J.M.da/"(2002)Nature,418:435-8.UUCG:Lee、N.S.da/"(2002)NatureBiotechnology20:500-5;Fruscoloni,P.efa/.,(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA100(4):1639-44.UUCAAGAGA:Dykxhoorn、D.M.Wa/.，(2003)NatureReviewsMolecularCellBiology4:457-67.例如，具有本發(fā)明發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的優(yōu)選siRNA如下所示。在下列結(jié)構(gòu)中，環(huán)序列可以從CCC、UUCG、CCACC、CCACACC和UUCAAGAGA中選擇。優(yōu)選的環(huán)序列是UUCAAGAGA(在DNA中是"ttcaagaga")。GAGAAGAAGGCCCAGAACU隱[B]-AGUUCUGGGCCUUCUUCUC(對靶序列SEQIDNO:21)CUCUAGGACUUGCAUGAUU-[B]畫AAUCAUGCAAGUCCUAGAG(對耙序歹'JSEQIDNO:25)GGAAAGACUCAUCAAAAGC隱[B]畫GCUUUUGAUGAGUCUUUCC(對靶序列SEQIDNO:29)GCAUAUCCGUCUGUCAGAA國[B]畫UUCUGACAGACGGAUAUGC(對靶序列SEQIDNO:33)。位于A2254或A5623序列側(cè)翼的調(diào)節(jié)序列是相同或者不同的，從而它們的表達(dá)可以獨(dú)立地;波調(diào)節(jié)或者以時(shí)間或空間方式凈皮調(diào)節(jié)。通過將A2254或A5623基因模板克隆到含有例如來自小核RNA(snRNA)U6啟動(dòng)子或人HIRNA啟動(dòng)子的RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄單元的載體內(nèi)，從而在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄siRNA。為了將載體引入到細(xì)胞內(nèi)，可以使用轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑。FuGENE(RocheDiagnostices)、Lipofectamine2000(Invitrogen)、Oligofectamine(Invitrogen)和Nucleofector(WakopureChemical)可用作轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑。才艮據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，在體外測試寡核苷酸和與A2254或A5623的mRNA多個(gè)部分互補(bǔ)的寡核苷酸降低腫瘤細(xì)胞中A2254或A5623產(chǎn)生的能力(例如，使用乳腺細(xì)胞系，如乳腺癌(BRC)細(xì)胞系)。使用A225斗或A5623的特異性抗體或其他檢測策略，檢測與候選siRNA組合物接觸的細(xì)胞中A2254或A5623基因產(chǎn)物與不存在候選組合物時(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞相比的降低。對于在體外基于細(xì)胞的測定或無細(xì)胞測定中降低A2254或A5623產(chǎn)生的序列，隨后測試其對細(xì)胞生長的抑制效應(yīng)。對于在體外基于細(xì)胞的測定中抑制細(xì)胞生長的序列，將其在大鼠或小鼠體內(nèi)進(jìn)行測試以確認(rèn)在患有惡性腫瘤的動(dòng)物體內(nèi)A2254或A5623的產(chǎn)生降低以及腫瘤細(xì)胞生長降低。治療惡性腫瘤的方法通過施用A2254或A5623的siRNA治療患有以A2254或A5623過高表達(dá)為特征的腫瘤的患者。siRNA治療用于抑制罹患或者有危險(xiǎn)發(fā)生例如乳腺癌的患者體內(nèi)A2254或A5623的表達(dá)。這些患者通過具體腫瘤類型的標(biāo)準(zhǔn)方法加以鑒定。乳腺癌(BRC)的診斷通過例如CT、MRI、ERCP、MRCP、計(jì)算機(jī)斷層攝影或超聲波。如果治療導(dǎo)致臨床效益，例如受試者中A2254或A5623表達(dá)降低，或者腫瘤的大小、患病率(prevalence)或轉(zhuǎn)移潛力降低，則治療是有效的。在預(yù)防性地施加治療時(shí)，"有效"是指治療可推遲或阻止腫瘤形成，或阻止或減輕腫瘤的臨床癥狀的癥狀。有效性是結(jié)合已知的用于診斷或治療特定腫瘤類型的方法來加以確定。siRNA治療的執(zhí)行是通過向受試者施用siRNA,其施用是利用編碼本發(fā)明siRNA的標(biāo)準(zhǔn)載體和/或基因輸送系統(tǒng)，例如通過輸送合成的siRNA分子。典型地，將合成siRNA分子化學(xué)穩(wěn)定化以防止體內(nèi)核酸酶降解。制備化學(xué)穩(wěn)定化的RNA分子的方法在本領(lǐng)域是公知的。典型地，這類分子含有經(jīng)過修飾的骨架和核香酸以防止核糖核酸酶作用。其他修飾也是可能的，例如膽固醇偶聯(lián)的siRNA顯示提高的藥理學(xué)性質(zhì)(SongCa/.A^weMed9:347-51(2003》。合適的基因輸送系統(tǒng)可以包括脂質(zhì)體、受體介導(dǎo)的輸送系統(tǒng)或病毒載體，例如皰滲病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒及其他。治療性核酸組合物配制在藥物可接受的載體中。治療性組合物還可以包括如上所述的基因輸送系統(tǒng)。藥物可接受的載體是適合施用于動(dòng)物的生物相容性溶媒，例如生理鹽水。化合物的治療有效量是能夠產(chǎn)生醫(yī)學(xué)上理想的結(jié)果——例如受治療動(dòng)物中A2254或A5623基因產(chǎn)物產(chǎn)生降低、細(xì)胞生長如增殖降低，或者體內(nèi)肺瘤生長降低一一的量。胃腸外給藥例如靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)和腹腔內(nèi)輸送途徑可用于輸送A2254或A5623的siRNA組合物。為了治療乳腺腫瘤，向腹動(dòng)脈、脾動(dòng)脈或肝總動(dòng)脈直接輸注是有用的。任何一個(gè)患者的劑量取決于多種因素，包括患者的身材、體表面積、年齡、待施用的特定核酸、性別、給藥的時(shí)間和途徑、一般健康狀況、以及同時(shí)施用的其他藥物。核酸的靜脈內(nèi)給藥劑量為核酸分子的大約106-1022個(gè)拷貝。多核苷酸通過標(biāo)準(zhǔn)方法給藥，例如通過注射到組織如肌肉或皮膚的間質(zhì)空間，引入到循環(huán)系統(tǒng)或者體腔，或者通過吸入或吹入。多核苷酸與藥物可接受的液體載體例如水性或部分水性的液體載體一起注射或者通過其他方式輸送給動(dòng)物。多核苷酸與脂質(zhì)體(例如陽離子或陰離子脂質(zhì)體)結(jié)合。多核苷酸包含被靶細(xì)胞表達(dá)所需的遺傳信息，例如啟動(dòng)子?；蛘呋加心[瘤，特別是乳腺腫瘤的患者可以通過施用抑制A5623多肽與A2254多肽之間結(jié)合的化合物加以治療。不受限于理論，我們相信A5623多肽與A2254多肽的相互作用的抑制劑可改變、相互影響、調(diào)節(jié)、干擾、石皮壞A5623多肽與A2254多肽的結(jié)合或者A2254多肽與A5623多肽的結(jié)合。從而，相信兩種蛋白質(zhì)均不再能夠象它們在癌細(xì)胞內(nèi)那樣相互作用。因此，進(jìn)一步相信，兩種蛋白質(zhì)在癌發(fā)生中一一特別是乳腺癌發(fā)生中，如本發(fā)明人的觀察結(jié)果所提示的——所發(fā)揮的關(guān)鍵作用可以被阻斷，從而可以實(shí)現(xiàn)癌癥特別是乳腺癌的預(yù)防或治療。除非另有定義，本文所用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的意義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中普通技術(shù)人員所共同理解的意義相同。盡管在實(shí)踐或測試本發(fā)明時(shí)可以使用與本文所公開的方法和材料相似或等價(jià)的方法和材料，但是下文仍然描述了合適的方法和材料。本文引用本文中提及的全部出版物、專利申請、專利和其他參考文獻(xiàn)的全部內(nèi)容作為參考。如有矛盾，則以包括定義在內(nèi)的本說明書為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實(shí)施例只是舉例說明，而沒有任何限制意義。減少或抑制A5623和A2254之間結(jié)合的化合物的產(chǎn)生和鑒定考慮本實(shí)施例中提供的證據(jù)，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及減少或防止A5623與A2254之間結(jié)合的測試化合物的鑒定。用于確定A5623/A2254結(jié)合的方法包括任何用于確定兩個(gè)蛋白質(zhì)間相互作用的方法。下文描述了其它方法。這些測定包括，但不限于傳統(tǒng)的方法，例如交聯(lián)、免疫共沉淀和通過梯度或色譜柱共純化。此外，可以使用基于酵母的遺傳系統(tǒng)監(jiān)^見蛋白—蛋白相互作用，該系統(tǒng)如Fields和其合作者戶斤4苗述(FieldsandSong,7Va^re340:245-6(1989);Chiend"/，7Va"88,9578-82(1991)),并如Chevray和Nathans所公開(尸rac.Ato/.JcW.5W.t/&489:5789-93(1992))。許多轉(zhuǎn)錄激活物，例如酵母GALA，由兩個(gè)物理上分離的調(diào)節(jié)域構(gòu)成，一個(gè)充當(dāng)DNA結(jié)合域，另一個(gè)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活域的作用。在先出版物中描述的酵母表達(dá)系統(tǒng)(一般稱作"雙雜交系統(tǒng)")就是利用這一性質(zhì)，并采用兩個(gè)雜合蛋白質(zhì)，在其中一個(gè)中靶蛋白與GAL4的DNA結(jié)合域融合，在另一個(gè)內(nèi)，候選激活蛋白與激活域融合。GALl-lacZ報(bào)道基因在GALA激活的啟動(dòng)子控制下的表達(dá)，取決于GAL4活性通過蛋白-蛋白相互作用的重建。含有相互作用多肽的菌落可以用(3-半乳糖苷酶的顯色底物加以檢測。用雙雜交技術(shù)鑒定兩個(gè)特定蛋白質(zhì)之間蛋白-蛋白相互作用的完整試劑盒(MATCHMAKERtm)可以從Clontech購買。這個(gè)系統(tǒng)還可以擴(kuò)展到用于參與特定蛋白相互作用的蛋白域作圖以及定位對于這些相互作用至關(guān)重要的氨基酸殘基。盡管本申請?zhí)岬降氖?A5623"或"A2254"，但是應(yīng)當(dāng)理解，在對這兩者的相互作用進(jìn)行分析或操作時(shí)，可以用這些蛋白質(zhì)之一或二者的結(jié)合部分代替這些蛋白質(zhì)的全長拷貝。通過用A5623的標(biāo)準(zhǔn)缺失分析和/或誘變以鑒定結(jié)合A2254的片段，可以容易地鑒定出結(jié)合A2254的A5623片段?？梢允褂妙愃频姆治鰜龛b定A2254的A5623結(jié)合性片段。如本文所公開的，任何測試化合物，包括例如蛋白質(zhì)(包括抗體)、突變蛋白(mutein)、多核苦酸、核酸、核酸適體、和多肽及非肽小有機(jī)分子，均可用作本發(fā)明的測試化合物。測試化合物可以從天然來源分離，合成或重組制備，或者它們的任意組合。例如，肽可以用E.Gross和J.Meienhoffer主編的《Peptides》第二版中由G.Barany和R.B.Merrifield撰寫的"SolidPhasePeptideSynthesis(固相肽合成)，,一節(jié)，AcademicPress,NewYork,N.Y.，pp.100-118(1980)中描述的固相技術(shù)合成制備。類似地，核酸也可以用Beaucage、S丄.，&Iyer,R,P.(1992)Tetrahedron,48，2223-31l;和Matthese^/.,五MS(9J，3:801-5(1984)中描述的固相技術(shù)加以合成。在鑒定抑制肽時(shí)，用各種氨基酸模擬物或非天然氨基酸修飾本發(fā)明的肽，對于提高肽在體內(nèi)的穩(wěn)定性特別有用。穩(wěn)定性可以用多種方法測定。例如，肽酶和各種生物介質(zhì)，如人血漿和血清，已經(jīng)被用于測試穩(wěn)定性。見例如Verhoef"a/.，五,J!D，Me勵(lì)泡m,h佃.11:291-302(1986)。其他本領(lǐng)域已知的有用肽修飾包括糖基化和乙?；?。重組和化學(xué)合成技術(shù)均可以用來產(chǎn)生本發(fā)明的測試化合物。例如，可通過插入到合適的載體內(nèi)產(chǎn)生測試化合物的核酸，其可以在轉(zhuǎn)染到感受態(tài)細(xì)胞中后表達(dá)?；蛘?，可以利用PCR技術(shù)或者在合適宿主中表達(dá)來擴(kuò)增核酉臾(見i"列嗩口Sambrookda/.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,1989、ColdSpringHarborLaboratory、NewYork、USA)。肽和蛋白質(zhì)還可以用本領(lǐng)域公知的重組技術(shù)進(jìn)行表達(dá)，例如通過用重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞，如Morrison,J.Bact.，132:349-51(1977);禾口Clark-Curtiss&Curtiss，MethodsinEnzymology，101:347-362(Wua/.，eds,1983)所述?？笰5623和抗A2254抗體在本發(fā)明的一些方面中，測試化合物是抗A5623或抗A2254抗體。在一些實(shí)施方案中，抗體是嵌合抗體，包括但不僅限于人源化抗體。在一些情況下，本發(fā)明的抗體實(shí)施方案在這些蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)結(jié)合的界面上結(jié)合A5623或A2254。在一些實(shí)施方案中，在生理?xiàng)l件下，這些抗體結(jié)合A5623或A2254的Ka至少為大約105mor1、106mol"或者更大、107mol"或者更大、1()Smol"或者更大、或者1(^mol"或者更大。這些抗體可以從商業(yè)來源購得，例如Chemicon公司(TemeculaCalif.),或者可以用例如基本上純化的A5623或A2254蛋白，例如人蛋白或其片段，作為免疫原來激發(fā)產(chǎn)生。由給定免疫原制備單克隆和多克隆抗體的方法在本領(lǐng)域是公知的。關(guān)于特定免疫原抗體的純化技術(shù)和鑒定方法見例如PCT/US02/07144(WO/03/077838),本文引用其內(nèi)容作為參考。用例如抗體親和基質(zhì)形成親和柱來純化抗體的方法在本領(lǐng)域是公知的，并可商業(yè)上獲得(AntibodyShop、Copenhagen,Denmark)。能夠破壞A5623/A2254結(jié)合的抗體的鑒定，使用下文詳述的一^:測試化合物的測試方法進(jìn)行。轉(zhuǎn)換酵(convertingenzymes)轉(zhuǎn)換酶可以用作本發(fā)明的測試化合物。在本發(fā)明的上下文中，轉(zhuǎn)換酶是對A5623或A2254之一或者它們兩者進(jìn)行共價(jià)翻譯后修飾的分子催化劑。本發(fā)明的轉(zhuǎn)換酶將以下面所述的方式共〗tf務(wù)飾A5623和/或A2254的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基其導(dǎo)致被修飾蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生別構(gòu)變化，或者改變被修飾蛋白的A5623/A2254分子結(jié)合位點(diǎn)化學(xué)或結(jié)構(gòu)從而干擾A5623與A2254之間的結(jié)合。干擾兩個(gè)分子之間的結(jié)合，是指相對于在30。C、離子強(qiáng)度O.l和不存在去垢劑的條件下測得的蛋白間的Ka,使結(jié)合Ka降低至少25%、30%、40%、50%、60%、70%或者更多。本發(fā)明的轉(zhuǎn)換酶實(shí)例包4舌激酶、磷酸酶、酰胺酶、乙?；浮⑻窍忝傅?。構(gòu)建測試化合物文庫盡管測試化合物文庫的構(gòu)建在本領(lǐng)域是公知的，本部分仍然提供了在鑒定測試化合物并構(gòu)建這些化合物的文庫，用于篩選A5623/A2254相互作用的有效抑制劑的的額外指導(dǎo)。下文提供關(guān)于化合物文庫的進(jìn)一步指導(dǎo)。分子建模對具有目標(biāo)性質(zhì)的化合物的分子結(jié)構(gòu)和/或?qū)Υ种瓢蟹肿蛹碅5623和A2254的分子結(jié)構(gòu)的知識(shí)，方便了測試化合物文庫的構(gòu)建。預(yù)篩選適于進(jìn)一步評估的測試化合物的方法之一，是對測試化合物與其靶標(biāo)的相互作用進(jìn)行計(jì)算機(jī)建模。在本發(fā)明中，A5623與A2254相互作用的建模提供了對相互作用本身細(xì)節(jié)的認(rèn)識(shí)，并提示了干擾該相互作用的可能策略，包括相互作用的潛在分子抑制劑。計(jì)算機(jī)建模技術(shù)為所選分子的三維原子結(jié)構(gòu)的可視化以及與該分子相互作用的新化合物的合理設(shè)計(jì)提供了可能。三維構(gòu)建典型地依賴于從所選分子的x-射線晶體分析或NMR成像而來的數(shù)據(jù)。分子動(dòng)力學(xué)需要力場數(shù)據(jù)。計(jì)算機(jī)圖形系統(tǒng)為預(yù)測新化合物如何連接靶分子，以及實(shí)驗(yàn)操作化合物和靶分子的結(jié)構(gòu)以優(yōu)化結(jié)合特異性提供了可能。為了預(yù)測當(dāng)分子之一或二者中產(chǎn)生細(xì)小改變對分子-化合物相互作用是什么樣的，需要分子力學(xué)軟件和計(jì)算密集型計(jì)算機(jī)，它們通常關(guān)聯(lián)著分子設(shè)計(jì)程序和用戶之間的用戶友好的、菜單驅(qū)動(dòng)的界面。上文一般性描述的分子建^f莫系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)例，是由CHARMm和QUANTA程序構(gòu)成，PolygenCorporation,Waltham，Mass。CHARMm#丸4亍能量最小化和分子動(dòng)力學(xué)功能。QUANTA執(zhí)行構(gòu)建、圖形建模和分子結(jié)構(gòu)分析。QUANTA為分子相互行為的分析、可視化、修飾和相互作用性構(gòu)建提供了可能。大量文獻(xiàn)綜述了與特定蛋白質(zhì)相互作用的藥物的計(jì)算機(jī)建模，例如Rotivinen,a/.爿加尸/zar應(yīng)cew"caFe朋/ca97,159-166(1988);Ripka,臉w5Wew//W54-57(Jun.16、1988》McKinlayandRossmann,^"肌尸/zar應(yīng)co/.7b;dc/o/.29,111-122(1989);PerryandDavies，ProgClinBiolRes,291:189-93(1989》LewisandDean,尸亂i.Soc.說o/5W.236，125-40和141-62(1989);以及關(guān)于核酸組分的模型受體，有Askew、"a/.，/爿w.C7ze肌111、1082-90(1989)。其他篩選和圖形描述化學(xué)物質(zhì)的計(jì)算機(jī)程序可以例如BioDesignInc.,Pasadena,Calif"AllelixInc.,Mississauga,Ontario,Canada和HypercubeInc.,Cambridge,Ontario等/>司獲得。見例如DesJarlais(1988)J,Med.Chem,31:722-9;Mengdo/.(1992)J.ComputerChem.13:505-24;Mengda/.(1993)Proteins17:266-78;Shoichet"a/.(1993)Science259:1445-50。一旦鑒定了A5623/A2254相互作用的假定抑制劑，就可以根據(jù)已鑒定的假定抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)使用組合化學(xué)技術(shù)構(gòu)建任何數(shù)目的變體，如下文所述。對于最終的假定抑制劑或"測試化合物"文庫可使用本發(fā)明的方法進(jìn)行篩選，以鑒定該文庫中干擾A5623/A2254結(jié)合的測試化合物。組合化學(xué)合成測試化合物的組合文庫可作為涉及在已知A5623/A2254相互作用抑制劑中存在的核心結(jié)構(gòu)的知識(shí)的合理藥物設(shè)計(jì)程序的一部分而產(chǎn)生。這種方法使文庫保持合理的大小，便于高通量篩選。或者可通過簡單合成構(gòu)成該庫的分子家族的全部排列構(gòu)建簡單的，特別是短的聚合物分子文庫。后一種方法的實(shí)例是由長度為6個(gè)氨基酸的全部肽構(gòu)成的文庫。這種肽文庫可包括每一個(gè)6氨基酸序列排列。這種類型的文庫稱作線性組合化學(xué)文庫。組合化學(xué)文庫的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，并可通過化學(xué)或生物合成產(chǎn)生。組合化學(xué)庫包括，但不限于肽文庫(見例如美國專利5,010,175，F(xiàn)urka,/"f./A尸ra/.L37:487-93(199l)和Houghtenda/.，淑臟354:84-6(1991))。也可以采用其他用于產(chǎn)生化學(xué)多樣性庫的化學(xué)。這類化學(xué)包括，但不僅限于肽(例如PCT公開第WO91/19735號(hào))，被編碼的肽(例如PCR公開第WO93/20242號(hào))，隨機(jī)生物寡聚體(例如PCT公開第WO92/00091號(hào))，苯并二氮卓(benzodiazepine)(例如美國專利第5,288,514號(hào))，diversomers如乙內(nèi)酰脲類(hydantoins),苯并二氮卓類(benzodiazepines)和二肽(dipeptides)(DeWittefa/.,尸rac.Ato/.爿cw/.5W.90:6909-13(1993》，插婦(vinylogous)多肽(Hagihara"、《/^merOze肌5bc.114:6568-70(1992))，具有葡萄糖骨架的非肽性肽模擬物(HirschmannWa/.，《/^ww.C7ze肌Soc.114:9217-8(1992)),小化合物文庫的類似有機(jī)合成(Chen"a/.，《/Jmw.Soc.116:2661(1994》，寡聚氨基曱酸酯(oligocarbamates)(Cho"a/.,5We"ce261:1303(1993))，和/或肽基膦酸鹽或酯(peptidylphosphonate)(CampbellWa/.，59:658(1994)),核酸文庫(見Ausubel，andSambrook,全部見上文)，肽核酸文庫(見例如美國專利5,539,083),抗體文庫(見例如Vaughanda/.，脂訓(xùn)腸fec/wo/ogy，14(3):309畫14(1996)和PCT/US96/10287)，糖文庫(見例如Liang"a/.、5We"ce、274:1520-2(1996)和美國專利5,593,853),小有機(jī)分子庫(見例如，苯并二氮卓，GordonEM.CurrOpinBiotechnol.1995Dec1;6(6):624-31.;類異戊二烯，美國專利5,569,588;p塞峻啉酉同類(thiazanones)和間p塞哇啉酮類(metathiazanones)，美國專利5，549,974;吡咯烷類，美國專利5,525,735和5,519,134;嗎啉代化合物，美國專利5,506,337;苯并二氮卓、5,288,514等)。下文提供了關(guān)于組合化學(xué)合成進(jìn)一步的指導(dǎo)。噬菌體展示另一種方法使用重組噬菌體產(chǎn)生文庫。使用"噬菌體方法"(ScottandSmith,5Wewce249:386-90、1990;Cwirla,"iVoc.iVw/.5W.、87:6378-82、1990;Devlinda/.，5We"ce，249:404-6,1990)可以構(gòu)建非常大的文庫(例如106-108個(gè)化學(xué)實(shí)體)。第二種方法主要^f吏用化學(xué)方法，其實(shí)例是Geysen法(Geysenefa/.，Mo/ecw/ar7wmw"o/ogy23:709-15，1986;GeysenWa/.■//附mw"o/og/cMeAod102:259-74，1987)和Fodor等人的方法(5We"ce251:767-73，1991)。Furka等(第14屆國際生物化學(xué)會(huì)議，第5巻，摘要FR:013、1988;Furka、/"f./尸rate/"/仏37:487-493,1991),Houghten(美國專利No.4,631,211,1986年12月公開)和Rutter等(美國專利No.5,010,175，1991年4月23日公開)描述了產(chǎn)生能夠作為激動(dòng)劑或拮抗劑加以測試的肽混合物的方法。制備組合文庫的設(shè)備可以商業(yè)獲得(見例如357MPS、390MPS、AdvancedChemTech，LouisvilleKY，Symphony,Rainin，Woburn，MA，433AAppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA,9050Plus,Millipore,Bedford,MA)。此外，大量組合文庫本身也可商業(yè)獲得(見例如ComGenex,Princeton,N丄,Tripos,Inc.,St.Louis,MO，3DPharmaceuticals,Exton，PA,MartekBiosciences,Columbia,MD，等)。測試化合物文庫的篩選本發(fā)明的篩選方法可針對具有干擾A5623/A2254結(jié)合的高可能性的測試化合物提供高效而快速的鑒定。一般地，任何確定測試化合物干擾A5623/A2254結(jié)合能力的方法均適用于本發(fā)明。例如，可以采用ELISA樣式的竟?fàn)幮院头蔷範(fàn)幮砸种茰y定。應(yīng)當(dāng)進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn)以確定系統(tǒng)的最大結(jié)合能力(例如在下文的實(shí)例中，^使結(jié)合的A5623與A22544妄觸，并確定與A5623結(jié)合的A2254的量)。下面提供了篩選測試化合物文庫的進(jìn)一步指導(dǎo)。竟?fàn)幮詼y定樣式竟?fàn)幮詼y定可用于篩選本發(fā)明的測試化合物。作為實(shí)例，竟?fàn)幮訣LISA樣式可以包括與固體支持物結(jié)合的A5623(或A2254)。結(jié)合的A5623(或A2254)與A2254(或A5623)及測試化合物共溫育。經(jīng)過足夠的時(shí)間使測試化合物和/或A2254(或A5623)結(jié)合A5623(或A2254)，清洗底物以除去未結(jié)合材料。然后確定與A5623結(jié)合的A2254的量。這可以用本領(lǐng)域已知的多種方法中的任何一種來實(shí)現(xiàn)，例如使用帶有可檢測標(biāo)記作為標(biāo)簽的A2254(或A5623)種類，或者使已清洗的底物與標(biāo)記的抗A2254(或A5623)抗體接觸。與A5623(或A2254)結(jié)合的A2254(或A5623)的量將與測試化合物干擾A2254/A5623結(jié)合的能力成反比。關(guān)于蛋白質(zhì)——包括但不僅限于抗體一一的才示"i己，長口下面的文獻(xiàn)戶斤"i己載Harlow&Lane,Antibodies,ALaboratoryManual(1988)。在一種變化形式中，用親和標(biāo)簽標(biāo)記A5623(或A2254)。然后，將標(biāo)記的A5623(或A^54)與測試化合物和A2254(或A5623)—起溫育，然后進(jìn)行免疫沉淀。然后用抗A2254(或A5623)抗體對免疫沉淀物進(jìn)行Western印跡。與前面的竟?fàn)幮詼y定樣式一樣，被發(fā)現(xiàn)與A5623(或A2254)結(jié)合的A2254(或A5623)的量與測試化合物干擾A2254/A5623結(jié)合的能力成反比。非競爭測定形式對于構(gòu)建樣式不適于立即利用竟?fàn)幮詼y定加以篩選的測試化合物文庫，如本文所述的那些文庫而言，非竟?fàn)幮越Y(jié)合測定作為初始篩選可能也是有用的。上述文庫的實(shí)例是噬菌體展示庫(見例如Barret，&a/.(1992)Anal.Biochem204，357-364)。噬菌體文庫有用之處在于能夠快速產(chǎn)生工作量的很多種不同重組肽。噬菌體文庫不適于本發(fā)明的竟?fàn)幮詼y定，但是可以以非竟?fàn)帢邮礁咝У剡M(jìn)行篩選，確定何種重組肽測試化合物結(jié)合A5623或A2254。然后可以制備已鑒定為結(jié)合性的測試化合物，并用竟?fàn)幮詼y定樣式加以篩選。噬菌體和細(xì)胞展示文庫的產(chǎn)生和篩選在本領(lǐng)域是公知的，在例如如下文獻(xiàn)中有討論Ladnerea/.，WO88/06630;Fuchsda/.(1991)Biotechnology9:1369畫72;GowardeM/.(1993)TIBS18:136-40;CharbiteM/.(1986)EMBOJ5,3029-37;Cull&a/.(1992)PNASUSA89:1865-9;Cwirla,&a/.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87,6378-82。示例性的非竟?fàn)幮詼y定遵循與上述竟?fàn)幮詼y定相似的程序，只是不添加其中一種組分(A5623或A2254)。然而，由于非竟?fàn)帢邮酱_定的是測試化合物對A5623或A2254的結(jié)合，需要對于每個(gè)候選物確定測試化合物結(jié)合A5623和A2254二者的能力。因此，例如，可通過下列步驟確定測試化合物與固定A5623的結(jié)合清洗掉未結(jié)合的測試化合物；從支持物洗脫結(jié)合的測試化合物，隨后通過例如質(zhì)譜，蛋白測定(Bradford或Lowry測定，或280nm吸光度的定)對洗脫物進(jìn)行分析?；蛘呖梢允÷韵疵摬襟E，通過監(jiān)測支持物表面上有機(jī)層光譜學(xué)性質(zhì)的變化確定測試化合物的結(jié)合。監(jiān)測表面光譜學(xué)性質(zhì)的方法包括，但不限于吸光度、反射率、透光度、雙折射、折光率、衍射、表面等離子體共振、橢圓偏振測量、共振鏡(resonantmirror)技術(shù)、光柵耦合波導(dǎo)技術(shù)和多極共振光譜，所有這些對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的。在測定中還可使用標(biāo)記的測試化合物，從而省去洗脫步驟。在這種情況下，洗去未結(jié)合材料后與支持物結(jié)合的標(biāo)記的量與測試化合物的結(jié)合成正比。已經(jīng)開發(fā)了大量公知的機(jī)器人系統(tǒng)，用于溶液相化學(xué)。這些系統(tǒng)包括自動(dòng)工作站，如TakedaChemicalIndustries^>司(Osaka,Japan)開發(fā)的自動(dòng)合成裝置，以及許多利用機(jī)器手的機(jī)器人系統(tǒng)(ZymateII、Zymark公司、Hopkinton,Mass.;Orca，HewlettPackard,PaloAlto,Calif.),它們才莫擬化學(xué)技術(shù)人員的手工合成操作。上面的任何一種設(shè)備均適合于利用本發(fā)明。為使其能夠如本文所述地工作而對這些設(shè)備所作的修改(如果有的話)的性質(zhì)和實(shí)施，對于相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。此外，可以商業(yè)獲4尋大量的組合文庫(見例如ComGenex，Princeton、N丄，Asinex,Moscow,Ru，Tripos,Inc.，St.Louis,MO、ChemStar,Ltd,Moscow,RU，3DPharmaceuticals,Exton，PA，MartekBiosciences,Columbia,MD,等)。轉(zhuǎn)換酶篩選對于是轉(zhuǎn)換酶的測試化合物，可以在非竟?fàn)帢邮较?，用待測定轉(zhuǎn)換酶特異性的輔因子和輔助底物加以測定。給定待研究的轉(zhuǎn)換酶類型后，這些輔因子和輔助底物對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的。用于轉(zhuǎn)換酶的一個(gè)示例性篩選程序包括首先在輔因子和輔助底物的存在下，優(yōu)選在生理?xiàng)l件下，使A5623和/或A2254與轉(zhuǎn)換酶接觸，其中所述輔因子和輔助底物對于轉(zhuǎn)換酶的特征性蛋白的共價(jià)修飾是必需的。然后測試被修飾的蛋白結(jié)合其結(jié)合配偶體的能力(即A5623對A2254的結(jié)合)。然后比較被修飾的蛋白與其結(jié)合配偶體的結(jié)合與未修飾對照對的結(jié)合，確定如上所述的必要Ka變化是否得以實(shí)現(xiàn)。為了在執(zhí)行測定時(shí)便于蛋白質(zhì)的檢測，可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)將一種或多種蛋白用上述的可才會(huì)測標(biāo)記加以標(biāo)記。篩選方法上述的篩選實(shí)施方案適合于高通量確定適于進(jìn)一步研究的測試化合物。特別地，本發(fā)明的篩選優(yōu)選地包括如下檢測步驟(a)在測試化合物的存在下，使包含A5623多肽的A2254-結(jié)合域的多肽與包含A2254多肽的A5623-結(jié)合域的多肽接觸；(b)檢測多肽間的結(jié)合；和(c)選擇可抑制多肽間結(jié)合的測試化合物?；蛘呦蛘谠鲋车募?xì)胞添加所研究的測試化合物，并且相對于未提供測試化合物的對照群的增殖監(jiān)測該處理細(xì)胞的增殖。根據(jù)本文所提供的教導(dǎo)，適于篩選測試化合物的細(xì)胞系對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。對于體內(nèi)測試，可以將測試化合物施用于可接受的動(dòng)物模型。將基因?qū)氲絼?dòng)物細(xì)胞內(nèi)以表達(dá)外來基因，可根據(jù)任何方法，例如電穿孔法(Chu，efa/.，NucleicAcidsRes15:1311-26(1987))，磷酸釣法(ChenandOkayama,MolCellBiol7:2745-52(1987))，DEAE葡聚糖法(Lopatada/.,NucleicAcidsRes12:5707-17(1984)，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(lipofectin)法(DerijardB，"al.Cell7:1025-37(1994);Lamb"a/.，NatureGenetics5:22-30(1993):Rabindran/，Science259:230-4(1993))等來實(shí)施。基因可以表達(dá)與標(biāo)簽(例如HA或Myc)融合的蛋白質(zhì)。用免疫組織化學(xué)染色考察A5623和A2254的亞細(xì)胞定位。用標(biāo)簽-A5623、標(biāo)簽-A2254或其組合轉(zhuǎn)染細(xì)胞?？梢岳蔑@微鏡例如焚光顯微鏡獲得定位圖像。在優(yōu)選實(shí)施方案中，可以通過將A2254和A5623基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入合適的細(xì)胞系而獲得同時(shí)表達(dá)A2254和A5623的細(xì)胞。例如，可以使用HEK293、SW480或COS7細(xì)胞作為細(xì)胞系。而且，檢測試劑優(yōu)選地是識(shí)別A2254的抗體?；蛘撸?dāng)A2254或A5623表達(dá)為與標(biāo)簽的融合蛋白時(shí)，可使用任何可識(shí)別蛋白質(zhì)所融合的標(biāo)簽的抗體作為檢測試劑。在本發(fā)明的試劑盒中，抗體可以用熒光劑(例如FITC、TAMRA或GFP)標(biāo)記。特別地，如本文所述，本發(fā)明人觀察到A5623多肽與A2254多肽相互作用。因此，相信兩種多肽的相互作用在癌癥發(fā)生，特別是乳腺癌發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，我們意圖篩選可用于治療或預(yù)防癌癥，特別是乳腺癌的化合物，其抑制A5623多肽與A2254多肽的相互作用或者其相反的相互作用。即，在測試化合物的存在下，使包含A5623多肽的A2254-結(jié)合域的多肽與包含A2254多肽的A5623-結(jié)合域的多肽接觸，檢測兩個(gè)多肽間的結(jié)合，并選擇抑制兩個(gè)多肽間結(jié)合的測試化合物。當(dāng)然，作為選擇，還可以在測試化合物的存在下，使包含A2254多肽A5623-結(jié)合域的多肽與包含A5623多肽A2254-結(jié)合域的多肽接觸。優(yōu)選地，含有A2254結(jié)合域的多肽包括A5623多肽，含有A5623結(jié)合域的多肽包括A2254多肽。術(shù)語"使......接觸"包括在測試化合物的存在下，通過使用測試化合物的領(lǐng)域已知的技術(shù)和方法，使包含A5623多肽的A2254-結(jié)合域的多肽與包含A2254多肽的A5623-結(jié)合域的多肽接觸，或者使包含A2254多肽的A5623-結(jié)合域的多肽與包含A5623的多肽A2254-結(jié)合域的多肽接觸。例如，可應(yīng)用基于細(xì)胞的測定或無細(xì)胞測定來篩選A5623多肽與A2254多肽的結(jié)合抑制劑。在基于細(xì)胞測定的一個(gè)實(shí)例中，可以使用表達(dá)含A5623結(jié)合域的多肽和含A2254結(jié)合域的多肽的細(xì)胞進(jìn)行篩選。在無細(xì)胞測定的一個(gè)實(shí)例中，可以使用部分或完全純化的含A5623結(jié)合域的多肽和部分或完全純化的含A2254結(jié)合域的多肽。當(dāng)然，也可以使用表達(dá)含A5623結(jié)合域的多肽和含A2254結(jié)合域的多肽的細(xì)胞的提取物。上文描述了試驗(yàn)測定和方法的進(jìn)一步的實(shí)例。術(shù)語"測試化合物，，或"待測試化合物"是指作為A5623和A2254相互作用的假定抑制劑，將要通過本發(fā)明的一種或多種篩選方法加以測試的分子或物質(zhì)或化合物或組合物或藥劑，或其任意組合。測試化合物可以是任何化學(xué)物質(zhì)，例如無機(jī)化學(xué)物質(zhì)、有機(jī)化學(xué)物質(zhì)、蛋白質(zhì)、肽、糖、脂類、或其任意組合，或者本文所述化合物、組合物或藥劑的任何一種。應(yīng)當(dāng)理解，術(shù)語"測試化合物，，當(dāng)用于本發(fā)明上下文中時(shí)，可以和術(shù)語"測試分子"、"測試物質(zhì)"、"潛在候選物"、"候選物"或上文提到的術(shù)語互換使用。因此，我們設(shè)想了將小肽或類肽分子用于相互作用抑制劑的篩選方法中。這種小肽或類肽分子結(jié)合并占據(jù)A5623結(jié)合域或A2254結(jié)合域之一的相互作用域或者它們二者的相互作用域，藉此分別使得A5623或A2254結(jié)合域不能被A2254多肽或A5623多肽觸及。而且，設(shè)想任何生物或化學(xué)組合物或物質(zhì)均可作為相互作用抑制劑。抑制劑的抑制功能可以用本領(lǐng)域已知的方法加以測量。這些方法包括相互作用測定，如免疫沉淀測定、ELISA、RIA。同樣，在篩選A5623與A2254結(jié)合或者相反結(jié)合的抑制劑時(shí)優(yōu)選要使用的潛在候選分子或候選分子混合物，可以是，典型地，化學(xué)或生物來源的物質(zhì)、化合物或組合物，其是自然存在的和/或合成、重組和/或化學(xué)產(chǎn)生的。因此，候選分子可以是與A5623和/或A2254多肽結(jié)合和/或相互作用的蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、肽、氨基酸和/或其衍生物，或者其他化合物，例如離子。合成化合物文庫可以從MaybridgeChemicalCo.(Trevillet,Cornwall,UK)、Comgenex(Princeton,N丄)、BrandonAssociates(Merrimack,N.H.)和Microsource(NewMilford.Conn.)商購。稀有化學(xué)文庫可以從Aldrich(Milwaukee,Wis.)獲得?；蛘?，細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物提取物形式的天然化合物文庫可以,人例如PanLaboratories(Bothell.Wash.)或MycoSearch(N.C.)獲得，或者可以容易地生產(chǎn)。此外，天然和合成產(chǎn)生的文庫和化合物可以容易地通過常規(guī)化學(xué)、物理或生物化學(xué)方法進(jìn)行^f'務(wù)飾。此外，化學(xué)文庫的產(chǎn)生在本領(lǐng)域是公知的。例如，使用組合化學(xué)產(chǎn)生要在本文所述測定中加以篩選的化合物文庫。組合化學(xué)文庫通過組合大量的化學(xué)"構(gòu)成單位"(buildingblock)試劑通過化學(xué)合成或生物合成產(chǎn)生的各種化學(xué)化合物的集合。例如，線性組合化學(xué)文庫如多肽文庫的形成是通過組合每種可能的氨基酸組合來產(chǎn)生給定長度的肽。通過這種化學(xué)構(gòu)成單位的組合混合，理論上可以合成數(shù)百萬種化合物。例如，一位評論者認(rèn)為，系統(tǒng)、組合地混合100個(gè)可互換的化學(xué)構(gòu)成單位，可以理論上合成1億種四聚體化合物或者100億種五聚體化合物(GallopA、da/.JournalofMedicinalChemistry、37(9)1233-51(1994))。也可以使用本領(lǐng)域已知的其他化學(xué)文庫，包括天然產(chǎn)物文庫。一旦組合文庫產(chǎn)生，便對其進(jìn)行篩選，尋找具有期望生物學(xué)性質(zhì)的化合物。在本發(fā)明的上下文中，篩選化合物文庫以鑒定發(fā)揮A5623和A2254多肽結(jié)合抑制劑作用的化合物。例如，首先，用本領(lǐng)域公知的組合文庫形成方法產(chǎn)生小分子文庫。美國專利NOs.5,463,564和5,574,656就是兩個(gè)這樣的教導(dǎo)。然后對文庫的化合物進(jìn)行篩選以鑒定具有期望結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的化合物。美國專利No.5,684,711討論了用于篩選文庫的方法。舉例說明篩選過程將含有A2254結(jié)合域的多肽與含有A5623結(jié)合域的多肽以及文庫中的化合物相混合，并使之彼此相互作用。然后進(jìn)一步觀察所述化合物是否抑制這兩種多肽的結(jié)合。作為實(shí)例，只要兩種多肽相互作用可產(chǎn)生熒光信號(hào)，而該信號(hào)在測試化合物抑制多肽間結(jié)合時(shí)會(huì)減少和/或消失，則可以應(yīng)用FRET技術(shù)。相應(yīng)地，兩種多肽均可以包含適合于FRET的標(biāo)簽。這類標(biāo)簽在本領(lǐng)域是眾所周知的。將每個(gè)文庫化合物的特征加以編碼，使得在多肽結(jié)合的抑制中表現(xiàn)活性的化合物能夠被分析，并且已鑒定的各種化合物的共同特征能夠被分離并其組合到文庫的進(jìn)一步迭代(interation)中。一旦篩選了一個(gè)化合物文庫，即用在第一輪篩選中顯示具有抗相互作用活性的化學(xué)構(gòu)成單位生成后繼文庫。使用這種方法，隨后的候選化合物迭代將具有越來越多的抑制相互作用必需的結(jié)構(gòu)和功能特征，直到能夠發(fā)現(xiàn)一組對抑制兩種多肽間結(jié)合具有高度特異性的抑制劑。然后可以進(jìn)一步測試這些化合物用作動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物中的藥物時(shí)的安全性和效力。很容易意識(shí)到，這種特定的篩選方法學(xué)只是舉例。其他的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。例如，候選藥劑包括許多種類的化學(xué)物質(zhì)，但典型地它們是有機(jī)分子，優(yōu)選地為分子量大約50且小于大約2500道爾頓，優(yōu)選地小于大約750道爾頓，更優(yōu)選地小于大約350道爾頓的有機(jī)小分子。候選藥劑還可能包含與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的相互作用特別是氫鍵所必需的功能基團(tuán)，典型地包含至少一個(gè)胺基、羰基、羥基或羧基，優(yōu)選地至少兩個(gè)功能化學(xué)基團(tuán)。候選試劑經(jīng)常含有碳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)和/或被一個(gè)或多個(gè)上述功能基團(tuán)取代的芳香或聚芳香結(jié)構(gòu)。候選藥劑的示例性種類可包括雜環(huán)、肽、糖類、類固醇等。這些化合物可以接受修飾以提高效力、穩(wěn)定性、藥物相容性等?？梢岳盟巹┑慕Y(jié)構(gòu)鑒定來鑒定、產(chǎn)生或篩選其它藥劑。例如，當(dāng)鑒定肽試劑時(shí)，為了提高其穩(wěn)定性可以用各種方法對它們進(jìn)行修飾，例如使用非天然氨基酸如D-氨基酸特別是D-丙氨酸，使氨基或羧基末端功能化，例如對于氨基進(jìn)行酰化或烷基化，對于羧基進(jìn)行酯化或酰胺化等。其他穩(wěn)定化方法可以包括包封，例如包封在脂質(zhì)體中等。如上所述，候選藥劑還在生物分子中，包括肽、氨基酸、糖類、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶、核酸及書f生物、結(jié)構(gòu)類似物或其組合中被發(fā)現(xiàn)。候選藥劑從廣泛的來源獲得，包括合成或天然化合物的文庫。例如，有很多方法，包括隨機(jī)化的寡核苷酸和寡肽的表達(dá)，可以用來隨機(jī)和定向合成多種多樣的有機(jī)化合物和生物分子?；蛘?，細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物提取物形式的天然化合物文庫是現(xiàn)有可用的或者可以容易地產(chǎn)生。此外，天然或合成產(chǎn)生的文庫和化合物可容易地通過常規(guī)化學(xué)、物理和生物化學(xué)方法進(jìn)行修飾，并可用于產(chǎn)生組合文庫。可以對已知的藥理學(xué)藥劑進(jìn)行定向或隨機(jī)化學(xué)修飾，例如?；?、烷化、酯化、酰胺化等，以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類似物。其他的測試化合物可以是適體、抗體、affybody、trinectin或anticalin,或類似化合物。當(dāng)然，對A5623或A2254特異性的適體、抗體、affybody、trinectin或anticalin自身可能已經(jīng)是A5623與A2254之間結(jié)合的抑制劑，因此可以容易地用于治療或預(yù)防癌癥，特別是乳腺癌的方法。通過本文所述的用于篩選A5623多肽與A2254多肽結(jié)合抑制劑的方法所鑒定的化合物可用于預(yù)防或治療癌癥，特別是乳腺癌。因此，抑制劑具有這樣的性質(zhì)直接或間接與A2254結(jié)合域和/或A5623結(jié)合域相互作用，藉此，如本文所述的，影響這些域的相互作用，使它們不再能夠像在癌細(xì)胞，特別是乳腺癌細(xì)胞中那樣相互作用。例如，抑制劑可以是抗A2254結(jié)合域或A5623結(jié)合域的抗體。這種抑制劑的另一種實(shí)例是affybody、適體、anticalin或trinectin。篩選和治療試劑盒在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于篩選可用于治療或預(yù)防乳腺癌的制品或試劑盒，其中該試劑盒包括(a)A5623多肽的A2M1結(jié)合域；(b)A2254多肽的A5623-結(jié)合域；和(c)檢測這兩種多肽間相互作用的試劑。如上文討論的，含有A2254結(jié)合域的多肽可以包括全長的A5623多肽或其A2254結(jié)合部分。類似地，含有A5623結(jié)合域的多肽可以包括全長的A2254多肽或其A5623結(jié)合部分。在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案中，提供了制品和試劑盒，其含有可用于治療本文所述病理狀況的材料。該制品可以包括本文所述藥劑的容器和標(biāo)簽。合適的容器包括例如瓶、小瓶和試管。容器可以用各種材料形成，例如玻璃或塑料。在本發(fā)明的上下文中，容器容納具有活性劑的組合物，該活性劑可有效治療細(xì)胞增殖性疾病例如乳腺癌。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物中的活性劑是已鑒定為能夠在體內(nèi)破壞A5623/A2254結(jié)合的測試化合物(例如抗體、小分子等)。容器上的標(biāo)簽應(yīng)當(dāng)指明該組合物用于治療一種或多種以異常細(xì)胞增殖為特征的狀況。標(biāo)簽還可以給出施用和監(jiān)測技術(shù)，例如本文所述的技術(shù)的指導(dǎo)。除了上述容器之外，本發(fā)明的試劑盒還可以任選地包括容納藥物可接受稀釋劑的第二容器。它可以進(jìn)一步包括其他商業(yè)和用戶角度看理想的材料，包括其他緩沖劑、稀釋劑、過濾器材、針頭、注射器和帶有使用指導(dǎo)的說明書。如果期望的話，組合物可以存在于包裝或分配裝置內(nèi)，包裝或分配裝置可以包含一個(gè)或多個(gè)含有活性成分的單位劑型。包裝可以例如包括金屬或塑料箔，例如泡殼包裝。包裝或分配設(shè)備可以和施用指導(dǎo)放在一起。還可以制備在相容性藥物載體中配制的包含本發(fā)明化合物的組合物，放在合適的容器內(nèi)，并標(biāo)記用于治療指定病癥的標(biāo)簽。附圖筒述圖1顯示了在來源于乳腺癌患者(上圖面)的腫瘤細(xì)胞(3T、31T、149T、175T、431T、453T、491T、554T、571T、709T、772T和781T)、乳腺癌細(xì)胞系(HBC4、HBC5、HBLIOO、HCC1937、MCF7、MDA畫MB-231、SKBR3、TWD、YMB1)(下圖面)和正常人組織中(A)A2254和(B)A兄23表達(dá)的半定量RT-PCR結(jié)果。圖2顯示了在各種人組織(上圖面)和乳腺癌細(xì)胞系及正常人生命器官圖3顯示了(A)A2254和(B)A5623的基因組結(jié)構(gòu)。A2254具有2個(gè)不同的變體，指稱為VI和V2,A5623也具有3個(gè)不同的變體(V1、V2和V3)。上圖；基因組結(jié)構(gòu)，下圖；對每種變體特異性的半定量RT-PCR結(jié)果。圖4A是通過Western印跡分析顯示的A2254蛋白的外源表達(dá)。圖4B顯示了A2254蛋白的亞細(xì)胞定位。圖4C通過Western印跡分析顯示了A5623V1、A5623V2和A5623V3蛋白的外源表達(dá)。圖4D-F顯示了(D)A5623V1、(E)A5623V2和(F)A5623V3蛋白的亞細(xì)胞定位。圖5顯示了設(shè)計(jì)用于降低乳腺癌細(xì)胞中A2254表達(dá)的小干擾RNA(siRNAs)的生長抑制效果。圖5A顯示了在乳腺癌細(xì)胞系T47D(左圖面)和HBC5(右圖面)中A2254內(nèi)源表達(dá)受抑制的半定量RT-PCR。G^PDH用作內(nèi)部對照。圖5B顯示的是MTT測定，其表明通過敲低T47D(左圖面)和HBC5(右圖面)細(xì)胞中的A^5斗降低了集落的數(shù)目。圖5C顯示的是集落形成測定，其表明通過敲低T47D(左圖面)和HBC5(右圖面)細(xì)胞中的A2254降低了集落的數(shù)目。圖6顯示了設(shè)計(jì)用于降低乳腺癌細(xì)胞中A5623表達(dá)的小干擾RNA(siRNAs)的生長抑制效果。圖6A顯示了在乳腺癌細(xì)胞系T47D(左圖面)和HBC5(右圖面)中A%23內(nèi)源表達(dá)受抑制的半定量RT-PCR。Gl4尸Z)i/用作內(nèi)部對照。圖6B顯示的是MTT測定，其表明通過敲低T47D(左圖面)和HBC5(右圖面)細(xì)胞中的A5623降低了集落的數(shù)目。圖6C顯示的是集落形成測定，其表明通過敲4氐T47D(左圖面)和HBC5(右圖面)細(xì)胞中的A5623降低了集落的數(shù)目。圖7。A5623和A2254在乳腺癌細(xì)胞系和組織切片中的表達(dá)。圖7A，乳腺癌細(xì)胞系中的內(nèi)源A5623和A2254表達(dá)與HMEC細(xì)胞系中的比較，其是用抗A5623抗體或抗A2254抗體進(jìn)行Western印跡分析而考察的。圖7B，在乳腺癌細(xì)胞系中，內(nèi)源A5623蛋白或A2254蛋白在細(xì)胞周期中的亞細(xì)胞定位。使用親和純化的抗-A5623多克隆抗體或抗-A2254多克隆抗體(綠色)，對HBC4、HBC5和MCF-7細(xì)胞進(jìn)行A5623的免疫組織化學(xué)染色，對HBC5細(xì)胞進(jìn)行A2254的免疫組織化學(xué)染色，并用DAPI(藍(lán)色)染色以區(qū)分細(xì)胞核(見材料和方法)。白色箭頭指示末期細(xì)胞中間體中A5623的定位。圖7C,乳腺癌和正常組織切片(正常乳腺組織、肺、心臟、肝臟、腎和睪丸)的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果。內(nèi)源A5623蛋白用抗-A5623抗體染色。正常乳腺組織(樣品No.10441)中幾乎不可檢測到表達(dá)，但是在所有研究的癌組織中癌細(xì)胞均被強(qiáng)烈染色，包括實(shí)性管狀癌(sold-tubularcarcinoma)(樣品No.234)、乳頭管狀癌(papillotubularcarcinoma)(樣品No.240)和硬癌(樣品No.179)。代表性圖來自于原始放大倍數(shù)x200的顯微鏡觀察。圖8A5623與A2254間的相互作用。圖8A,通過半定量RT-PCR檢測的A5623和A2254在乳腺癌細(xì)胞系(HBC4、HBC5、HBL100、HCC1937、MCF7、MDA-MB-231、SKBR3、T47D、YMB1)和正常人組織(N，正常乳腺導(dǎo)管細(xì)胞；MG,乳腺；LUN,肺；LIV，肝；HEA，心臟；KID，腎；以及BM，骨髓)中的表達(dá)。圖8B、C，A5623與A2254的免疫共沉淀。對來自轉(zhuǎn)染了HA標(biāo)簽A2254和Flag標(biāo)簽A5623蛋白的COS7細(xì)胞的細(xì)胞裂解物用抗HA或抗Flag免疫沉淀。免疫沉淀物用單克隆抗HA或抗Flag抗體進(jìn)行免疫印跡。圖8D，內(nèi)源A5623或A2254在穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。左圖面顯示在穩(wěn)定表達(dá)A2254的細(xì)胞中，內(nèi)源A5623蛋白(紅色)與外源A2254蛋白(綠色)共定位，而右圖面顯示在穩(wěn)定A5623細(xì)胞中，內(nèi)源A2254(紅色)與外源A^B(綠色)共定位。外源A2254蛋白(紅色)與外源A5623蛋白共定位(右圖)。圖9外源A2254在NIH3T3細(xì)胞中的促生長或浸潤作用。圖9A,表達(dá)高水平或中等水平外源A2254的細(xì)胞或者模擬載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的Western印跡分析。用抗HA標(biāo)簽單克隆抗體確認(rèn)了A2254表達(dá)的外源引入。用卩-肌動(dòng)蛋白用作上樣對照。圖9B，NIH3T3-A2254細(xì)胞的體外生長。用A2254(NIH3T3-A2254-#1、-#2、-#3、和-#4)和模擬物(NIH3T3-模擬-弁l、-#2、-#3)轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，通過MTT測定加以測量。圖9C,Matrigel浸潤測定證實(shí)NIH3T3-A2254—#3、和-#4和MH3T3-模擬-弁l可增強(qiáng)浸潤。計(jì)算遷移通過Matrigel包被濾膜的細(xì)胞數(shù)目。每次一式三孔進(jìn)行3次測定。實(shí)施本發(fā)明的最佳模式在下面的實(shí)施例中將對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述，它們并不限制由權(quán)利要求所述的本發(fā)明的范圍。[一般方法]細(xì)胞系和臨床材料人乳腺癌細(xì)胞系HBC4、HBC5、MDA-MB-Ml由Yamori博士(財(cái)團(tuán)法人癌研究會(huì)，東京)惠贈(zèng)，BT-549、MCF-7、T47D、SKBR3、HCC1937、MDA-MB-435S、YMB1、HBL100和COS7從ATCC獲得。全部細(xì)胞培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)基中，即BT-549、HBC4、HBC5、SKBR3、T47D、YMB1、和HCC1937用RPMI-1640(Sigma、St.Louis、MO)(含2mML-谷氨酰胺)；HBL100、COS7用Dulbecco修飾的Eagle培養(yǎng)基(Invitrogen、Carlsbad、CA);MCF-7用含0.1mM必需氨基酸(Roche),lmM丙酮酸鈉(Roche)、0.01mg/ml胰島素(Sigma)的EMEM(Sigma),MDA-MB-231和MDA-MB-435S用L-15(Roche)。每種培養(yǎng)基均添加10。/。胎牛血清(Cansera)和1%抗生素/抗真菌劑溶液(Sigma)。MDA-MB-231和MDA-MB-435S細(xì)胞維持在37。C無C02的濕潤氣氛中。其他的細(xì)胞系維持在37。C含5。/。C02的濕潤氣氛中。臨床樣品(乳腺癌和正常乳腺導(dǎo)管)從外科標(biāo)本獲得，并獲得了所有患者的相關(guān)知情同意。4//7的cDA^凝萍/li:^"54和爿56W的i^《摩/七襲的新入類差^的為Sf為了檢測在乳腺癌中通常被上調(diào)的基因，對微陣列上27,648個(gè)基因的全部表達(dá)圖式進(jìn)行了篩選，以選擇分別在>50%的i)全部77個(gè)絕經(jīng)前乳腺癌病例，ii)69個(gè)浸潤性導(dǎo)管癌，iii)31個(gè)高度低分化損害、iv)14個(gè)中等低分化損害或v)24個(gè)低分化損害的病例中表達(dá)比>3.0的基因。在全部493個(gè)在肺瘤細(xì)胞中表現(xiàn)為上調(diào)的基因中，我們著眼于內(nèi)部標(biāo)識(shí)號(hào)為A2254和A5623的基因，因?yàn)樗诔^50%的提供信息的乳腺癌病例中的表達(dá)比大于3.0，而通過正常人組織表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)它在包括心臟、肺、肝和骨髓在內(nèi)的正常組織中過低表達(dá)。羊定量ir-尸C7為、#我們從激光捕獲細(xì)胞的各個(gè)群體中提取總RNA，然后進(jìn)行基于T7的擴(kuò)增和反轉(zhuǎn)錄，如前文所述(OnoK、"a/.、CancerRes.、60、5007-11、2000)。我們通過監(jiān)測甘油醛-3-磷酸脫氫酶(01PZ)^)作為定量內(nèi)部對照，制備了每種單鏈cDNA的合適的稀釋物，用于隨后的PCR擴(kuò)增。PCR引物序列如下5'-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3'(SEQIDNO;l)和5'畫GGTTGAGCACAGGGTACTTTATT畫3'(SEQIDNO;2)用于04尸￡>//;5，-AACTTAGAGGTGGGAGCAG-3，(SEQIDNO:45)和5，-CACAACCATGCCTTACTTTATC-3，(SEQIDNO:46)用于々2MG;5'畫ACTCTAGGACTTGCATGATTGCC畫3'(SEQIDNO;3)和5'-TGGGTGTCAAACCAAACAGA-3'(SEQIDNO;4)用于A2254V1,5'-GTTAGAACTTGTTTCCTCCTCCG-3'(SEQIDNO;5)和5'-ATCCTCAATGGTATTTCAGC-3'(SEQIDNO;6)用于A2254V2,5'畫GTGGTCCTAGGAGACTTGGTTTT畫3'(SEQIDNO;7)和5'國TACATGCATACCCCCAACAA-3'(SEQIDNO;8)用于A5623的共有區(qū)域，5'國GCTTCAGCGAGAACTTTC-3'(SEQIDNO;9)和5'-CAACTGTAACACTCATTCACATC-3'(SEQIDNO;10)用于A5623V1,5'畫CTATTCTGAGTTTGCGCGAGAAC-3'(SEQIDNO;1l)和5'-CAACTGTAACACTCATTCACATC-3'(SEQIDNO;10)用于A5623V2,5'畫CATCCTGAGTGCGAGAACTTTC-3'(SEQIDNO;12)和5'陽CAACTGTAACACTCATTCACATC-3'(SEQIDNO;10)用于A5623V3。7Vor^ze/72-6/o/#浙根據(jù)制造商的說明書，用Rneasy試劑盒(QIAGEN)從所有乳腺癌細(xì)胞系中提取了總RNA。用DNaseI(NipponGene、Osaka、Japan)處理后，用mRNA純化試劑盒(AmershamBiosciences)根據(jù)制造商的說明書分離mRNA。將l-昭等份的每種mRNA與從正常成人乳腺(Biochain)、肺、心臟、肝、腎、骨髓(BD、Clontech，PaloAlto，CA)分離的聚A(+)RNA—起在1%變性瓊脂糖凝膠上分離，并轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(乳腺癌-Northem印跡)。將乳腺癌-和人多組織Northern印跡(Clontech，PaloAlto,CA)與[a32p]-dCTP-標(biāo)記的A2254和A5623PCR產(chǎn)物雜交，該P(yáng)CR產(chǎn)物通過RT-PCR制備(見下文)。根據(jù)供應(yīng)商的推薦進(jìn)行預(yù)雜交、雜交和清洗。印跡用增感屏在-80。C放射自顯影14天。針對A2254(548bp)和A5623(454bp)的特異性探針使用如下引物組通過PCR制備5'-ACTCTAGGACTTGCATGATTGCC-3'(SEQIDNO;3)和5'隱TGGGTGTCAAACCAAACAGA陽3'(SEQIDNO;4)用于A2254的共有區(qū)域，5'畫GTGGTCCTAGGAGACTTGGTTTT-3'(SEQIDNO;7)和5'-TACATGCATACCCCCAACAA-3'(SEQIDNO;8)用于A5623的共有區(qū)域。此外，A2254V1的特異性探針(350bp)用如下的特異性引物組通過PCR制備5'-CTGGAAGAGCAGGCTAGCAG誦3'(SEQIDNO;13)和5'-GCTGCGGAGAAAGCTCTATG-3'(SEQIDNO;14)。襲這裁謬的詢建為了構(gòu)建A5623和A2254表達(dá)載體，用KOD-PlusDNA聚合酶(Toyobo，Osaka,Japan)通過PCR擴(kuò)增PRC1cDNA的整個(gè)編碼序列。引物組為A5623-正向，5'畫CCGGAATTCTCCGCCATGAGGAGAAGTGA-3'(SEQIDNO:47)(下劃線表示EcoRI位點(diǎn))和A5623-反向，5'扁TTGCCGCTCGAGGGACTGGATGTTGGTTGAA-3'(SEQIDNO:48)(下劃線表示Xhol位點(diǎn))，A2254-正向，5，-CCGGAATTCATGGCCATGGACTCGTCG隱3，(SEQIDNO:49)和A2254-反向，5'-GCTCCGCTCGAGCTGGGGCCGTTTCTT-3'(SEQIDNO:50)。將PCR產(chǎn)物插入到pCAGGS-nHA或pCAGGS-Flag表達(dá)載體的EocRI和XhoI位點(diǎn)中。戎-562J-謦我體和戎-225謦我沐使用pET21載體(Novagen、Madison、WI)制備質(zhì)粒，這些質(zhì)粒被設(shè)計(jì)用于分別表達(dá)A5623兩個(gè)片段(179-360和234-360位氨基酸)或A2254的兩個(gè)片段(86-239和124-239位氨基酸)，其中所述片段的C端帶有His標(biāo)簽標(biāo)記的表位。分別在大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21codon-plus抹(Stratagene、LaJolla、CA)中表達(dá)重組肽，并用Ni-NTA樹脂瓊脂糖(Qiagen)根據(jù)供應(yīng)商的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行純化。將純化的重組蛋白混合在一起，然后免疫接種到兔子體內(nèi)。將免疫血清在親和柱上根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)純化。將親和純化的抗-A5623抗體或抗A2254抗體用于Western印跡、免疫沉淀和免疫細(xì)胞染色，如下文所述。我們通過Western印跡分析證實(shí)，這些抗體可以分別特異性識(shí)別MCR7乳腺癌細(xì)胞中的內(nèi)源A5623蛋白或A2254蛋白。^瘦勿應(yīng)必孝豸惑為了r查內(nèi)源A5623蛋白或A2254蛋白在乳腺癌細(xì)胞系MCF7、HBC4和HBC5中的亞細(xì)胞定位，我們以每孔lxl05個(gè)細(xì)胞4妾種細(xì)胞(Lab-TekII腔室玻片、NalgenNuncInternational、Naperville、IL)。溫育24小時(shí)后，細(xì)胞用含有4°/。多聚甲醛的PBS(-)固定15分鐘，并用含有0.1%TritonX-100的PBS(-)于4°C處理2.5分鐘以使其可滲透。隨后，在4°C用含3%BSA的PBS(-)覆蓋細(xì)胞12小時(shí)，以封閉非特異性雜交，隨后用1:1000稀釋的兔抗A5623多克隆抗體或1:1000稀釋的抗A2254多克隆抗體溫育。用PBS(-)清洗后，將細(xì)胞用1:1000稀釋的Alexa488-偶聯(lián)的抗兔第二抗體(MolecularProbe,Eugene,OR)染色。用4',6，-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸(4',6'-diamidine-2'-phenylindolendihydrochrolide)(DAPI)3于細(xì)刀包核復(fù)染色。在TCSSP2AOBS(Leica,Tokyo,Japan)下獲得熒光圖像。我們用FuGENE6轉(zhuǎn)染試劑(Roche)根據(jù)制造商說明書分別將l|ugpCAGGS誦A2254陽HA、pCAGGS隱A5623Vl-HA、pCAGGS畫A5623V2-HA或pCAGGS-A5623V3-HA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到COS7細(xì)胞內(nèi)。將細(xì)胞裂解物在10%SDS聚丙烯酰胺凝膠上分離，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后與1:1000稀釋的作為第一抗體的小鼠抗HA抗體(Roche)溫育。與作為第二抗體的綿羊抗小鼠IgG-HRP(AmershamBiosciences"顯育后，用ECL^式劑盒(AmershamBiosciences)使信號(hào)可視化。而且，為了檢測乳腺癌細(xì)胞系(BT-474、BT-549、HBC4、HBC5、HBL-100、MCF-7、MDA-MB-231、SKBR3和T47D)和HMEC(人乳腺上皮細(xì)胞)中的內(nèi)源A5623蛋白或A2254蛋白，將細(xì)胞在含有0.1%蛋白酶抑制劑合劑III(Calbiochem,SanDiego，CA)的裂解緩沖液(50mMTris-HCl,pH8.0/150mMNaCl/0.5。/。NP-40)中裂解。用蛋白測定試劑盒(Bio-Rad、Hercules、CA)估計(jì)總蛋白量，然后將蛋白與SDS-上樣緩沖液混合，煮沸，然后加載到10%SDS-PAGE凝膠。電泳后，將蛋白點(diǎn)樣到硝酸纖維素膜(GEHealthcare)上。將含有蛋白的膜用封閉液封閉，然后與抗A5623多克隆抗體或抗A2254多克隆抗體一起溫育，用于檢測內(nèi)源A5623蛋白或A2254蛋白。最后將膜與HRP偶聯(lián)的第二抗體溫育，并通過ECL檢測試劑(GEHealthcare)使蛋白條帶可視化。對(3-肌動(dòng)蛋白進(jìn)行實(shí)驗(yàn)作為上樣對照。^瘦勿/g必孝糴悉為了檢查A2254或A5623V1、A5623V2和A5623V3的亞細(xì)胞定位，我們對于所有4個(gè)構(gòu)建體以每孔lxl()S個(gè)細(xì)胞接種C0S7細(xì)胞。24小時(shí)后，使用FuGENE6轉(zhuǎn)染試劑(Roche)根據(jù)制造商說明書分另'J以l嗎pCAGGS誦A2254畫HA、pCAGGS畫A5623Vl-HA、pCAGGS-A5623V2-HA或pCAGGS-A5623V3-HA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞。然后，用含有4%多聚曱醛的PBS固定細(xì)胞15分鐘，并用含有0.1%TritonX-100的PBS4°C處理2.5分鐘以使其可滲透。隨后，于4。C將細(xì)胞用含3。/。BSA的PBS覆蓋12小時(shí)以封閉非特異性雜交。接著，將每種被構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的COS7細(xì)胞與1:1000稀釋的大鼠抗HA抗體(Roche)—起溫育。用PBS清洗后，用1:1000稀釋的Alexa594-偶聯(lián)的抗大鼠第二抗體(MolecularProbe)對所有轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行染色。用4'，6-二脒基-2-苯基巧l哚二鹽酸(4',6'畫diamidine-2'-phenylindolendihydrochrolide)(DAPI)對細(xì)胞核復(fù)染色。在TCSSP2AOBS(Leica,Tokyo,Japan)顯微鏡下獲得熒光圖像。我們根據(jù)先前的報(bào)道(WO2004/076623)用psiU6BXsiRNA表達(dá)載體建立了基于載體的RNAi系統(tǒng)。通過將表1中的雙鏈寡核苷酸克隆到psiU6BX3.0載體的5&I位點(diǎn)中制備針對A2254(psiU6BX-A2254)和A5623(psiU6BX-A5623)的siRNA表達(dá)載體。對照質(zhì)?！猵siU6BX-模擬，是通過將如下的雙鏈寡核香酸克隆到psiU6BX3.0載體的萬fel位點(diǎn)中制備的GCTTC-3，(SEQIDNO;15)和GCTTC-3，(SEQIDNO;16》針對A2254和A5623小干擾RNA的寡核苷酸序列如下所示。表1.針對A2254和A5623小干擾RNA的寡核苷酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>下劃線指示特異性siRNA序列。爿"M和^5仍的^踏兄默效^將人乳腺癌細(xì)胞系T47D和HBC5涂布在10-cm培養(yǎng)皿上(lx106個(gè)細(xì)胞/皿)，并用FuGENE6試劑根據(jù)供應(yīng)商的推薦(Roche)以psiU6BX-模擬(作為陰性對照)、psiU6BX-A2254或psiU6BX-A5623進(jìn)行轉(zhuǎn)染。每種構(gòu)建體轉(zhuǎn)染后7天，從細(xì)胞提取總RNA,然后用上述針對A2254和A5623共有區(qū)域的特異性引物通過半定量RT-PCR確認(rèn)siRNA的敲低效應(yīng)。作為內(nèi)部對照的04尸Z)/f的引物如下5'-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3'(SEQIDNO;l)和5'-GGTTGAGCACAGGGTACTTTATT-3'(SEQIDNO;2)。另夕卜，將使用T47D和HBC5細(xì)胞系表達(dá)siRNA的轉(zhuǎn)染子在含有0.7mg/ml新霉素的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)28天。用4%多聚曱醛固定后，將轉(zhuǎn)染細(xì)胞用Giemsa溶液染色，以評估集落形成。進(jìn)行MTT測定以定量細(xì)胞生存能力。在含有新霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12天后，添加MTT溶液(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物)(Sigma)，濃度為0.5mg/ml。37。C溫育2.5小時(shí)后，添加酸-SDS(0.01NHCl/10。/。SDS);劇烈混合懸浮液，然后37。C溫育過夜以溶解深藍(lán)色晶體。用MicroplateReader550(BioRad)測量570nm吸光度。,H定養(yǎng),他m伊遂將細(xì)胞在裂解緩沖液(50mMTris-HCL(pH8.0)、150mMNaCL、0.5%NP-40和蛋白酶抑制劑合劑組III(Calbiochem、SanDiego、CA))中裂解。將等量的總蛋白與1mg大鼠抗HA抗體(Roche)或小鼠抗Flag抗體(SantaCruz)在4。C共溫育1小時(shí)。將免疫復(fù)合物與蛋白G-Sepharose(ZymedLaboratories,SouthSanFrancisco,CA)共溫育1小時(shí)，然后用裂解緩沖液清洗。共沉淀蛋白通過SDS-PAGE進(jìn)行分離。將SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后與大鼠抗HA抗體或小鼠抗Flag抗體(SantaCruz)共溫育，在與偶聯(lián)HRP的第二抗體共溫育之后，用ECL試劑盒(AmershamBiosciences)使信號(hào)可視化。^jfl;t襲迷J56W成^2254的JV/i/Jr3勿/《如上所述，用FUGENE6將A5623或A2254表達(dá)載體或4莫擬載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入NIH3T3細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在含有0.9mg/ml遺傳霉素(G418)(Invitrogen)的培養(yǎng)基中溫育。將克隆NIH3T3細(xì)胞通過有限稀釋進(jìn)行亞克隆。用抗HA單克隆抗體通過Western印跡分析對帶HA標(biāo)簽的A5623或A2254的表達(dá)進(jìn)行評估。最后，建立了數(shù)個(gè)克隆，并命名為A5623-NIH3T3或A2254-NIH3T3。為了研究A2254的促生長作用，我們將4種獨(dú)立的A2254-NIH3T3細(xì)胞和3種獨(dú)立的MOCK-NIH3T3細(xì)胞每種接種了5000個(gè)細(xì)胞，并通過MTT測定每天記錄細(xì)胞數(shù)目，經(jīng)過6天。這些實(shí)驗(yàn)按一式三份進(jìn)行。而且，我們研究了A2254-NIH3T3細(xì)胞(A2254-NIH3T3-3和-4)浸潤通過matrigel的能力。簡而言之，我們將2種獨(dú)立的A2254-NIH3T3細(xì)胞(A2254-NIH3T3-3和-4)和一種獨(dú)立的模擬-NIH3T3細(xì)胞分別接種了10000個(gè)細(xì)胞，并且將細(xì)胞在含有10%FCS的DMEM中培養(yǎng)到匯合。將細(xì)胞通過胰蛋白酶處理加以收集，在不加血清或蛋白酶抑制劑的DMEM中清洗，并以lXl()S個(gè)細(xì)胞/mL的濃度懸浮在DMEM中。在制備細(xì)胞懸液前，在室溫下用DMEM只十Matrigel基質(zhì)(BectionDickinsonLabware、Bedford,MA)干燥層再水化2小時(shí)。向24孔Matrigel浸潤小室的每個(gè)下部小室添加含有10%FBS的DMEM，并向每個(gè)上部小室的插入片(insert)添加0.5mL(5X104個(gè)細(xì)胞)細(xì)胞懸液。將板在37。C溫育22小時(shí)。溫育后，對小室進(jìn)行處理，將浸潤通過matrigel包被的插入片的細(xì)胞加以固定，并用Giemsa染色，以上步驟均按照供應(yīng)商(BectionDickinsonLabware)的說明。名瘦jg織化夢染悉用抗A5623兔多克隆抗體研究A5623蛋白在乳腺癌和正常組織中的表達(dá)圖式。簡而言之，將石蠟包埋的標(biāo)本用二曱苯和乙醇處理，并用蛋白封閉試劑(DakoCytomation,Carpinteria,CA)封閉。添加抗體稀釋溶液(1:100)中的多克隆抗體，然后用底物-色原(DAKOliquidDABchromogen、DakoCytomation)染色。最后，將組織標(biāo)本用蘇木精染色以區(qū)分細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。[結(jié)果]謇;t^2254和爿56W力#乙靡^勿/《中的J:濕差西當(dāng)我們用代表27,648個(gè)人類基因的cDNA微陣列分析來自77位絕經(jīng)前乳腺癌患者的癌細(xì)胞的基因表達(dá)模式時(shí)，我們鑒定了493個(gè)在乳腺癌細(xì)胞中普遍上調(diào)的基因。在它們中，我們關(guān)注了下面兩種基因一種內(nèi)部編號(hào)為A2254,被指稱為驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員2C(X/F2C)(SEQIDNO;35、36),另一種內(nèi)部編號(hào)為A5623,被指稱為胞質(zhì)分裂蛋白調(diào)節(jié)子1(Genebank登錄號(hào)No.NM—003981;SEQIDNO;39、40)。在微陣列上，與正常乳腺導(dǎo)管細(xì)胞相比，A2254和A5623基因的表達(dá)分別在60例乳腺癌中的44例和58例乳腺癌中的37例中有所升高。為了確認(rèn)這些上調(diào)基因的表達(dá)，我們進(jìn)行了半定量RT-PCR分析來比較乳腺癌標(biāo)本與含有正常乳腺導(dǎo)管細(xì)胞的正常人組織之間的表達(dá)水平。首先，我們發(fā)現(xiàn)，與正常乳腺導(dǎo)管細(xì)胞和正常人組織，包括乳腺、肺、心臟、肝、腎和骨髓相比，A2254的表達(dá)在12例臨床乳腺癌標(biāo)本(低分化型)中的7例中有所升高(圖1A,上圖面)。此外，該基因在全部9種乳腺癌細(xì)胞系中均過高表達(dá)(圖1A，下圖面)。接著，我們還發(fā)現(xiàn)，與正常人組織，特別是正常乳腺導(dǎo)管細(xì)胞(圖1B，上圖面)相比，A5623的表達(dá)在12例乳腺癌標(biāo)本(低分化型)中的7例中有所升高，并且在我們檢查的全部9種乳腺癌細(xì)胞系中均過高表達(dá)(圖1B，下圖面)。為了進(jìn)一步檢查這些基因的表達(dá)圖式，我們用A2254和A5623的cDNA片段作為探針對多種人組織和乳腺癌細(xì)胞系進(jìn)行了Northern印跡分析(見材料和方法)。A2254在除睪丸和胸腺外的正常人組織無表達(dá)或者表達(dá)無法檢測(圖2A,上圖面)，而與除骨髓之外的其他正常組織相比，其在乳腺癌細(xì)胞系中令人驚訝地過高表達(dá)(圖2A，下圖面)。A5623也僅在睪丸中表達(dá)(圖2B，上圖面)，而與除骨髓之外的其他正常組織相比，特別是與正常人乳腺相比，在所有乳腺癌細(xì)胞系中顯著過高表達(dá)(圖2B,下圖面)。因此，我們關(guān)注這些乳腺癌特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物。為了獲得A2254和A5623的完整cDNA序列，我們用乳腺癌細(xì)胞系T47D作為模板進(jìn)行RT-PCR。A2254由21個(gè)外顯子構(gòu)成，指稱為驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員2C(X/F2C)，位于染色體lp34.1上。A2254的全長mRNA序列包含2886個(gè)核苷酸，編碼725個(gè)氨基酸。A2254具有兩種不同的轉(zhuǎn)錄變體，它們分別由21和20個(gè)外顯子構(gòu)成，分別對應(yīng)于A2254V1(GenBank登錄號(hào)NO:AB264115,SEQIDNO:35,36)和A2254V2(GenBank登錄號(hào)NO:AY026505,SEQIDNO:37，38)(圖3A，上圖面)。VI變體的外顯子1和2分別是185bp和94bp，而V2變體沒有VI的外顯子1和2，而具有一個(gè)由346bp構(gòu)成的新外顯子作為外顯子1。V2變體的最后一個(gè)外顯子(外顯子20)比VI變體的最后一個(gè)外顯子(外顯子21)的3，端短537bp。A2254V1和A2254V2變體的全長cDNA序列分別含有2886和2401個(gè)核苷酸。這些變體的ORF開始于每個(gè)外顯子1內(nèi)。最后，VI和V2轉(zhuǎn)錄物分別編碼725和671個(gè)氨基酸。為了進(jìn)一步確認(rèn)每種變體在乳腺癌標(biāo)本和正常人組織中的表達(dá)圖式，我們用識(shí)別每種變體的引物組進(jìn)行半定量RT-PCR。結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)，與V2變體的表達(dá)相比，A2254V1變體主要在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)，而V2變體僅在睪丸中表達(dá)(圖3A;下圖面)。因此，我們關(guān)注A2254VI變體。A5623也有三種不同的轉(zhuǎn)錄變體，它們分別由15、14和14個(gè)外顯子構(gòu)成，分別對應(yīng)于A5623V1(Genbank登錄號(hào)NO:NM—003981;SEQIDNO:39，40),A5623V2(Genbank登錄號(hào)NO:NM—199413;SEQIDNO:41,42)和A5623V3(Genbank登錄號(hào)NO:NM—199414;SEQIDNO:43，44)(圖3B,上圖面)。VI的外顯子13和14有可選擇的變化形式，其余外顯子在所有變體中保持相同。V2變體沒有VI的外顯子14,在最后一個(gè)外顯子內(nèi)產(chǎn)生新的早期終止密碼子。V3的外顯子14被完全缺失，并且V3的外顯子13比VI的外顯子13在3'端短77bp,在最后一個(gè)外顯子內(nèi)也產(chǎn)生一個(gè)新的早期終止密碼子。A5623V1、A5623V2和A5623V3變體的全長cDNA序列分別由3128、3091和3011個(gè)核苷酸構(gòu)成。這些變體的ORF開始于每個(gè)外顯子l內(nèi)。最后，VI、V2和V3轉(zhuǎn)錄物分別編碼620、606和566個(gè)氨基酸。為了進(jìn)一步確認(rèn)每種變體在乳腺癌標(biāo)本和正常人組織中的表達(dá)模式，我們用識(shí)別每種變體的引物組進(jìn)行了半定量RT-PCR。結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)，與正常人組織相比，所有變體在乳腺癌細(xì)胞細(xì)胞中高度過高表達(dá)(圖3B;下圖面)。因此，我們進(jìn)一步對A5623的全部變體進(jìn)行了功能分析。^2254和J562J的亞勿/《;t位為了進(jìn)一步考察A2254和A5623的特征，我們檢查了這些基因產(chǎn)物在COS7細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。首先，當(dāng)我們將表達(dá)A2254蛋白(pCAGGS-A2254-HA)的質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到COS7細(xì)胞中時(shí)，我們通過Western印跡分析觀察到了具有預(yù)期大小的81KD-A2254蛋白(圖4A)。此外，免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示外源A2254在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中位于質(zhì)膜下(圖4B)。令人驚訝的是，免疫細(xì)胞化學(xué)染色中的陽性信號(hào)在細(xì)胞-細(xì)胞附著的膜中消失，提示該基因可能在細(xì)胞-細(xì)胞相互作用或細(xì)胞極性中發(fā)揮關(guān)鍵作用。接著，當(dāng)我們又將表達(dá)A5623V1、V2和V3蛋白(pCAGGS-A5623-HA)的質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到COS7和T47D細(xì)胞中時(shí)，通過Western印跡分析觀察到了具有各自預(yù)期大小的外源A5623VI、V2和V3蛋白(圖4C)。而且，免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，A5623的全部變體蛋白在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中均作為中間纖維定位于細(xì)胞質(zhì)器(圖4D、E、F)，提示A5623可能也在細(xì)胞-細(xì)胞相互作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用。我們開發(fā)了抗A5623或A2254的多克隆抗體，然后通過Western印跡分析，用HMEC(人乳腺上皮細(xì)胞)作為實(shí)驗(yàn)對照，研究了A5623蛋白或A2254蛋白在來自乳腺癌細(xì)胞系BT-474、BT-549、HBC4、HBC5、HBL-100、MCF-7、MDA-MB-231、SKBR3和T47D的細(xì)胞裂解物中的內(nèi)源表達(dá)。全部乳腺癌細(xì)胞系均顯示了高水平的A5623或A2254表達(dá)，而HMEC細(xì)胞顯示非常微弱的表達(dá)。隨后用抗A5623多克隆抗體對乳腺癌細(xì)胞系HBC4、HBC5和MCF7進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)分析顯示，內(nèi)源A5623主要定位于中期細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核器中。特別地，觀察到內(nèi)源A5623位于所有乳腺癌細(xì)胞系的中間纖維網(wǎng)絡(luò)。當(dāng)細(xì)胞經(jīng)歷有絲分裂時(shí)，A5623發(fā)生顯著的再分布。在前期，它與有絲分裂紡錘體極共定位，然后從中期到后期的早期階段與整個(gè)有絲分裂紡錘體共定位。到中后期為止，A5623在細(xì)胞的后期紡錘體中間區(qū)集中成為一系列窄帶(圖7B)。隨后用抗A2254多克隆抗體對乳腺癌細(xì)胞系、HBC5進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色表明，內(nèi)源A2254被觀察到主要定位于中期細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)器中，盡管外源A2254位于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的質(zhì)膜下。當(dāng)細(xì)胞經(jīng)歷有絲分裂時(shí)，A2254經(jīng)歷顯著的再分布。盡管A2254在中期細(xì)胞中仍然定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，但是A2254在細(xì)胞的后期紡錘體中間區(qū)集中成為一系列窄帶(圖7B)。最后，該蛋白積累在末期細(xì)胞的中間體。這些發(fā)現(xiàn)提示，在乳腺癌細(xì)胞以及先前描述的HeLa細(xì)胞中(MollinariC、etal.JCellBiol、2002;157;1175—86.;MollinariC、etal.MolBiolCell.2005;16;1043-55.)，A5623和A2254在胞質(zhì)分裂中發(fā)揮重要作用。為了進(jìn)一步研究A5623在乳腺癌和正常組織切片中的表達(dá)，我們用抗A5623抗體進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色。我們確認(rèn)在三種不同組織亞型的乳腺癌即管內(nèi)癌、乳頭管癌和硬癌的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中有強(qiáng)烈染色，但是其表達(dá)在正常乳腺組織中幾乎才企測不到(圖7C，上圖面)。而且，與Northen印跡分析結(jié)果一致，在睪丸中檢測到其表達(dá)，而在心臟、肺、肝和腎中均未見表達(dá)(圖7C，下圖面)。說V"力膠效^"54*^5(5"羞這的'/、i挽'iA^&7A^j的ji為了評估A2254和A5623的促生長作用，我們以基于哺乳動(dòng)物載體的RNA干擾(RNAi)技術(shù)(見上文)為手段，敲低了已顯示A2254和A5623過高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系T47D和HBC5中內(nèi)源A2254和A5623的表達(dá)。通過半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢查了A2254和A5623的表達(dá)水平。如圖5和6所示，與對照siRNA構(gòu)建體(psiU6BX-模擬)相比，這兩個(gè)基因各自的siRNA構(gòu)建體——A2254(si2和si5)和A5623(sil和si2)特異性siRNA，顯著抑制了各自基因的表達(dá)(圖5A，6A)。為了確認(rèn)A2254和A5623特異性siRNAs的細(xì)胞生長抑制，我們分別實(shí)施了集落形成和MTT測定。A2254(si2和si5)(圖5B、C)和A5623(sil和si2)(圖6B、C)構(gòu)建體的引入抑制了T47D和HBC5細(xì)胞的生長，與上文降低表達(dá)的結(jié)果一致。每個(gè)結(jié)果都得到了3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。這些發(fā)現(xiàn)提示，A2254和A5623在乳腺癌細(xì)胞生長中具有重要的功6匕叱。」2254的致癥活嫂為了進(jìn)一步證實(shí)A2254的促生長作用，我們建立了穩(wěn)定表達(dá)外源A2254的NIH3T3-衍生細(xì)胞(NIH3T3-A2254-1、-2、-3和-4細(xì)胞)。Western印跡分析表明在三個(gè)衍生克隆(NIH3T3-A2254-l、-2和-3)中有高水平的外源A2254蛋白，在一個(gè)克隆(A2254-4)中有低水平的A2254(圖9A)。隨后的MTT測定顯示，外源A2254的過高表達(dá)對細(xì)胞生長無顯著提高(圖9B)。這些發(fā)現(xiàn)提示，盡管單是A2254基因過高表達(dá)不具有促生長活性，但該基因產(chǎn)物缺乏對于乳腺癌細(xì)胞的存活具有重要影響。而且，因?yàn)槲覀兪状斡^察到外源A2254位于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的質(zhì)膜下，所以我們進(jìn)行matrigel浸潤測定以確定A2254在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性中是否發(fā)揮某種作用。穩(wěn)定表達(dá)外源A2254的NIH3T3-衍生細(xì)胞(NIH3T3-A2254-3和-4細(xì)胞)通過matrigel的浸潤，相比于模擬穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞(NIH3T3-模擬)顯著提高，且根據(jù)Western印跡結(jié)果顯示該提高依賴于A2254蛋白表達(dá)(圖9C)，這表明A2254基因可能在肺瘤細(xì)胞浸潤中也具有關(guān)鍵作用。為了進(jìn)一步研究A5623在乳腺癌細(xì)胞中的生理功能，我們嘗試了鑒定其相互作用蛋白。我們發(fā)現(xiàn)驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員2C/有絲分裂-著絲粒-相關(guān)驅(qū)動(dòng)蛋白(KIF2c/MCAK)蛋白(A2254)是可能的候選A5623-相互作用蛋白，因?yàn)樵摰鞍滓阎谕砗笃诨蚰┢诩?xì)胞中定位于中間體中或收縮環(huán)附近，并且在中間區(qū)形成和胞質(zhì)分裂中發(fā)揮作用。此外，有報(bào)道稱A5623與數(shù)種驅(qū)動(dòng)蛋白家族蛋白相互作用(KurasawaY，"a/.EMBOJ2004;23;3237-48.;ZhuC,&a/.ProcNatlAcadSciUSA2005;102;343—8.;GrunebergU，"2006;172;363-72.)。我們首先通過半定量RT-PCR分析研究A2254在乳腺癌病例中的表達(dá)圖式，發(fā)現(xiàn)A2254和A5623在乳腺癌病例中共上調(diào)(圖8A)。隨后，我們用共轉(zhuǎn)染到C0S7細(xì)胞中的Flag-標(biāo)簽A5623和HA-標(biāo)簽A2254進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。利用抗Flag和抗HA抗體，我們確認(rèn)Flag-標(biāo)簽A5623與HA-標(biāo)簽A2254共沉淀(圖8B),并且HA-標(biāo)簽A2254反過來與Flag-標(biāo)簽A5623共沉簽(圖8C),表明這兩種蛋白相互作用。隨后，我們建立了穩(wěn)定表達(dá)外源A5623和A2254的NIH3T3-衍生細(xì)胞(NIH3T3-A5623和NIH3T3-A2254細(xì)胞)。免疫細(xì)胞化學(xué)分析顯示，內(nèi)源小鼠A5623和穩(wěn)定表達(dá)的外源A2254在NIH3T3細(xì)胞中在晚后期共定位于中間區(qū)形成物(圖8D，左圖面)，內(nèi)源A2254和穩(wěn)定表達(dá)的外源A5623在NIH3T3細(xì)胞中在晚后期共定位于中間區(qū)形成物(圖8D)。盡管還需要進(jìn)一步研究內(nèi)源A5623和內(nèi)源A2254在乳腺癌細(xì)胞中的共定位，但是這些結(jié)果強(qiáng)烈提示A5623和A2254的構(gòu)像(conformation)可能在癌細(xì)胞的胞質(zhì)分裂中發(fā)揮關(guān)鍵作用。[討論]通過利用全基因組cDNA微陣列技術(shù)的乳腺癌的精確表達(dá)^^莫式，我們分離了新基因A2254和A5623,與正常人組織相比，它們在乳腺癌細(xì)胞中顯著過高表達(dá)。而且，Northern印跡分析顯示，A5623和A2254的表達(dá)在除睪丸和骨髓之外的所檢查的任何正常人組織中幾乎不能檢測到。而且，利用抗A5623多克隆抗體或抗A2254多克隆抗體進(jìn)行的免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)清晰地表明，A5623或A2254的表達(dá)在乳腺癌組織切片中上調(diào)。這些結(jié)果顯示，該基因可能成為開發(fā)乳腺癌抗癌劑的有價(jià)值的靶標(biāo)。我們的免疫細(xì)胞化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)顯示，A5623在分裂間期的乳腺癌細(xì)胞中定位于細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核，在晚后期定位于中間區(qū)，在末期定位于收縮環(huán)。進(jìn)一步，我們證實(shí)，用siRNA處理乳腺癌細(xì)胞，有效抑制了所有三種靶基因A2254和A5623的表達(dá)，并顯著抑制了乳腺癌細(xì)胞/腫瘤的生長。這些發(fā)現(xiàn)提示，A2254和5623可能在腫瘤細(xì)胞生長增殖中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并可作為具有前景的用于開發(fā)抗癌藥物的靶標(biāo)。我們證實(shí)，通過siRNA敲低內(nèi)源A5623誘使乳腺癌細(xì)胞中胞質(zhì)分裂失敗，造成多核細(xì)胞的積累和隨后細(xì)胞死亡。這些發(fā)現(xiàn)提示，A5623也在乳腺癌細(xì)胞的胞質(zhì)分裂中發(fā)揮作用。A5623據(jù)報(bào)道還與幾種驅(qū)動(dòng)蛋白家族蛋白相互作用(KurasawaY，a/.E固OJ2004;23;3237—48.;ZhuC,d<a/.ProcNatlAcadSciUSA2005;102;343-8.;GrunebergU,"2006;172;363-72.)。根據(jù)報(bào)道，A5623能夠與幾種分子，例如與有絲分裂事件，特別是胞質(zhì)分裂相關(guān)的KIF4或KIF14相互作用(KurasawaY，da/.EMBOJ2004;23;3237~48.;ZhuC,"a/.ProcNatlAcadSciUSA2005;102;343-8,)。然而，在我們的整個(gè)乳腺癌表達(dá)模式中，KIF4和KIF14在乳腺癌中均不表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，我們進(jìn)一步通過鑒定A5623的相互作用蛋白考察了其在乳腺癌細(xì)胞中的生物學(xué)作用，并且鑒定A2254(驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員2C/有絲分裂-著絲粒相關(guān)驅(qū)動(dòng)蛋白)蛋白作為候選相互作用蛋白，因?yàn)樵摰鞍滓阎谕砗笃诨蚰┢诩?xì)胞中定位于中間體中或收縮環(huán)附近，并且在中間區(qū)形成和胞質(zhì)分裂中發(fā)揮作用。如圖8所示，我們證實(shí)了細(xì)胞周期中，特別是在末期細(xì)在乳腺癌病例中的證據(jù)提示，它們的相互作用在乳腺癌發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用。而且，我們確定了A5623與A2254的結(jié)合區(qū)(51-70和200-4卯氨基酸)(數(shù)據(jù)未顯示)。盡管還需要進(jìn)一步分析A5623的功能，但是所提供的數(shù)據(jù)應(yīng)當(dāng)有助于更加深入地理解乳腺癌的發(fā)生和開發(fā)乳腺癌的新型治療方法。工業(yè)適用性本發(fā)明人已證明特異性靶向A2254或A5623基因的小干擾RNA(siRNA)抑制細(xì)胞生長。因此，這種新型的siRNA是用于開發(fā)抗癌藥物的有用靶標(biāo)。例如，阻斷A2254或A5623表達(dá)或者阻止其活性的藥劑可用作抗癌劑，特別是用于治療乳腺癌(BRC)的抗癌劑。本發(fā)明參考其特定的實(shí)施方案進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明精神和范圍的前提下顯然知道可以作出各種變化和修改。權(quán)利要求1.一種治療或預(yù)防受試者中乳腺癌的方法，包括向所述受試者施用組合物，所述組合物含有抑制A2254(SEQIDNO35或37)或A5623(SEQIDNO39，41或43)表達(dá)的小干擾RNA(siRNA)。2.權(quán)利要求l的方法，其中所述siRNA包括有義核酸序列和反義核酸序列，所述反義核酸序列與來自A2254或A5623的序列特異雜交。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述siRNA包含如下所述的核糖核苷酸序列作為靶序列該核糖核苷酸序列對應(yīng)于選自SEQIDNO:21、25、29和33的序列。4，權(quán)利要求3的方法，其中所述siRNA具有通式5，-[A]-[B]-[A，]-3，，其中[A]是與從SEQIDNO:21、25、29和33的核苷酸中選擇的序列對應(yīng)的核糖核苷酸序列；[B]是由3-23個(gè)核苷酸構(gòu)成的核糖核苷酸環(huán)序列，[A，]是由[A]的互補(bǔ)序列構(gòu)成的核糖核苷酸序列。5.權(quán)利要求l的方法，其中所述組合物包括轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑。6.—種雙鏈分子，包括有義鏈和反義鏈，其中有義鏈包括與從SEQIDNO:21、25、29和33中選擇的靶序列對應(yīng)的核糖核苷酸序列，其中反義鏈包括與所述有義鏈互補(bǔ)的核糖核苷酸序列，其中所述有義鏈和所述反義鏈彼此雜交形成所述雙鏈分子，并且其中所述雙鏈分子在被引入到表達(dá)或」5623基因的細(xì)胞內(nèi)時(shí)抑制所述基因的表達(dá)。7.權(quán)利要求6的雙鏈分子，其中所述靶序列包括來自從SEQIDNO:35、37、39、41和43中選"f奪的核苷酸序列的至少大約IO個(gè)連續(xù)核苷酸。8.權(quán)利要求7的雙鏈分子，其中所述靶序列包括來自從SEQIDNO:35、37、39、41和43中選擇的核苷酸序列的大約19至大約25個(gè)連續(xù)核苷酸。9.權(quán)利要求8的雙鏈分子，其中所述雙鏈分子是單一核糖核苷酸轉(zhuǎn)錄物，包括通過單鏈核糖核苷酸序列連接的有義鏈和反義鏈。10.權(quán)利要求7的雙鏈分子，其中該雙鏈分子是長度小于大約100個(gè)核苦酸的寡核苷酸。11.權(quán)利要求10的雙鏈分子，其中該雙鏈分子是長度小于大約75個(gè)核苦酸的寡核苷酸。12.權(quán)利要求11的雙鏈分子，其中該雙鏈分子是長度小于大約50個(gè)核芬酸的寡核香酸。13.權(quán)利要求12的雙鏈分子，其中該雙鏈分子是長度小于大約25個(gè)核苷酸的寡核苷酸。14.權(quán)利要求13的雙鏈分子，其中該雙鏈分子是長度為大約19-大約25個(gè)核苷酸的寡核芬酸。15.—種編碼權(quán)利要求7的雙鏈分子的載體。16.權(quán)利要求15的載體，其中該載體編碼轉(zhuǎn)錄物，所述轉(zhuǎn)錄物具有二級結(jié)構(gòu)并且包括有義鏈和反義鏈。17.權(quán)利要求16的載體，其中該轉(zhuǎn)錄物進(jìn)一步包括連接所述有義鏈和所述反義鏈的單鏈核糖核香酸序列。18.—種包含多核苷酸的載體，該多核芬酸包括有義鏈核酸和反義鏈核酸的組合，其中所述有義鏈核酸包括SEQIDNO:21、25、29和33的核苷酸序列，所述反義鏈核酸由與有義鏈互補(bǔ)的序列構(gòu)成。19.權(quán)利要求18的載體，其中所述多核苷酸具有通式5，-[A]-[B]-[A，]-3，其中[A]是SEQIDNO:21、25、29和33的核苷酸序列；[B]是由3-23個(gè)核苷酸構(gòu)成的核苷酸序列；[A，]是與[A]互補(bǔ)的核芬酸序列。20.—種用于治療或預(yù)防乳腺癌的藥物組合物，包括作為活性成分的藥物有效量的小干擾RNA(siRNA)和藥物可接受的載體，其中該siRNA可抑制A2254或A5623的表達(dá)。21.權(quán)利要求20的藥物組合物，其中該siRNA包含從SEQIDNO:21、25、29和33選擇的核苷酸序列作為靶序列。22.權(quán)利要求21的組合物，其中該siRNA具有通式5'-[A]-[B]-[A，]-3，其中[A]是相應(yīng)于SEQIDNO:21、25、29和33的核苷酸序列的核糖核苷酸序列；[B]是由3-23個(gè)核苷酸構(gòu)成的核糖核苷酸序列；[A，]是與[A]互補(bǔ)的核糖核普酸序列。23.—種篩選用于治療或預(yù)防乳腺癌的化合物的方法，所述方法包括如下步驟(a)在測試化合物的存在下，使包含A5623多肽的A2254-結(jié)合域的多肽與包含A2254多肽的A5623-結(jié)合域的多肽接觸；(b)檢測多肽間的結(jié)合；和(C)選擇抑制多肽間結(jié)合的測試化合物。24.權(quán)利要求23的方法，其中該含有A2254-結(jié)合域的多肽包括A5623多肽。25.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中該含有A5623-結(jié)合域的多肽包括A2254多肽。26.篩選可用于治療或預(yù)防乳腺癌的化合物的試劑盒，其中該試劑盒包括(a)包含A5623多肽AM54-結(jié)合域的多肽；(b)包含A2254多肽A5623-結(jié)合域的多肽；和(c)用于檢測多肽間相互作用的試劑。27.根據(jù)權(quán)利要求26的試劑盒，其中該含有A2254-結(jié)合域的多肽包括A5623多肽。28.根據(jù)權(quán)利要求26的試劑盒，其中該含有A5623-結(jié)合域的多肽包括A2254多肽。29.用于治療或預(yù)防受試者中乳腺癌的方法，其中該方法包括施用藥物有效量的抑制A5623多肽與A2254多肽結(jié)合的化合物的步驟。30.用于治療或預(yù)防乳腺癌的組合物，其中該組合物包括藥物有效量的抑制A5623多肽與A2254多肽結(jié)合的化合物和藥物可接受的載體。全文摘要本發(fā)明展示了一種通過使細(xì)胞與可抑制A2254或A5623表達(dá)的siRNA組合物接觸抑制癌細(xì)胞生長的方法。本發(fā)明還包括治療癌癥的方法。本發(fā)明還展示了用于所提供方法的產(chǎn)品，包括核酸序列、載體以及由它們構(gòu)成的組合物。本發(fā)明還提供了用于抑制腫瘤細(xì)胞，例如乳腺癌細(xì)胞，生長的方法，以及用于鑒定可降低或防止A5623與A2254結(jié)合的化合物的方法。而且，本發(fā)明還涉及治療或預(yù)防癌癥，特別是乳腺癌，的方法，包括施用可抑制A2254與A5623結(jié)合的化合物，并涉及含有這些結(jié)合抑制劑的組合物。文檔編號(hào)A61K38/00GK101273132SQ20068003539公開日2008年9月24日申請日期2006年7月21日優(yōu)先權(quán)日2005年7月25日發(fā)明者中村佑輔,中鶴修一,片桐豐雅申請人:腫瘤療法科學(xué)股份有限公司