專利名稱：：得自人脂肪的細(xì)胞的免疫表型和免疫原性的制作方法得自人脂肪的細(xì)胞的免疫表型和免疫原性
背景技術(shù)：
：再生醫(yī)學(xué)的新興領(lǐng)域正尋求將生物材料、生長因子和細(xì)胞組合起來，作為新型的療法用于修復(fù)受損的組織和器官。隨著該專業(yè)的發(fā)展，人們需要可靠、安全并且有效的人成體干細(xì)胞來源，用于組織工程應(yīng)用。對于調(diào)控目的而言，必須通過可計(jì)量的純度量度來界定這些細(xì)胞。對于臨床水平的實(shí)踐目的而言，這些細(xì)胞應(yīng)當(dāng)在醫(yī)護(hù)地點(diǎn)有需求時(shí)作為可立刻獲得的"現(xiàn)成(offtheshelf)"產(chǎn)品來獲得。從商業(yè)角度來看，使用同種異體(allogeneic)(而非自體)成體干細(xì)胞用于移植的能力將對產(chǎn)品開發(fā)具有顯而易見的正面作用。在這些情況下，來自一個(gè)供體的單種大量細(xì)胞可被移植給多位患者，從而降低了質(zhì)量控制和質(zhì)量保證的成本。干細(xì)胞還存在于成體生物體的組織中。最好的成體干細(xì)胞特征性例子是從骨髓和外周血分離的造血祖細(xì)胞(progenitorcell)。在沒有進(jìn)行治療時(shí)，受到致死性輻照的小鼠會死亡，這是因?yàn)樗鼈儾荒苎a(bǔ)充其循環(huán)血細(xì)胞；但是，移植來自同基因(syngeneic)供體動物的骨髓細(xì)胞會挽救宿主動物。供體細(xì)胞可用于重新增加(repopulate)循環(huán)血細(xì)胞。已進(jìn)行了研究，以證實(shí)未分化的造血干細(xì)胞能在宿主動物中再生不同的血細(xì)胞譜系(lineage)。這些研究提供了骨髄移植的基礎(chǔ)，骨髓移植是被廣泛接受的用于癌癥和先天性代謝缺陷的治療形式。直到近來，源自骨髓的造血干細(xì)胞(HSC)仍是唯一被接受的能多能分化以及自身更新的"成體"干細(xì)胞?，F(xiàn)在，支持在多個(gè)組織位點(diǎn)存在干細(xì)胞的證據(jù)在不斷積累。這些包括多能成體祖細(xì)胞(MAPC)、來自骨髓的間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)、皮膚干細(xì)胞、耳MSC、來自中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)干細(xì)胞、肝和胰腺干細(xì)胞以及來自骨骼肌的干細(xì)胞。得自脂肪的千細(xì)胞(ASC)展示出多種有利特征。得自白脂肪組織的成體干細(xì)胞能沿著脂肪細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，內(nèi)皮，造血支持，肝細(xì)胞，神經(jīng)，肌肉和造骨細(xì)胞譜系途徑體外分化(Gimbleetal.2003Curr.Top.Dev.Biol.58:137-60;Halvorsenetal.2001Metabolism50:407-13;Halvorsenetal.2001TissueEng.7:729-41;Hicoketal.2004TissueEng.10:371-80;Ericksonetal.2002Biochem.Biophys.Res.Commun.290:763-9;Saffordetal.2004Exp.Neurol.187:319-28;Saffordetal.2002Biochem.Biophys.Res.Commun.294:371-9;Zuketal.2001TissueEng.7:211-28;Zuketal.2002Mol.Biol.Cell.13:4279-95;Mizunoetal.2003J.NipponMed.Sch.70:300-6;Seoetal.2005Biochem.Biophys.Res.Commun.328:258-64)。脂肪組織容易獲得、豐富并且可被補(bǔ)充，由此為每個(gè)個(gè)體提供了潛在的成體干細(xì)胞貯存庫(reservoir)。這些發(fā)現(xiàn)代表著很多獨(dú)立工作的團(tuán)隊(duì)的成果。但是，不同實(shí)驗(yàn)室的細(xì)胞制備物并不相同。人們相信，這些獨(dú)立團(tuán)隊(duì)是通過對磨碎的脂肪組織進(jìn)行膠原酶消化接著進(jìn)行離心步驟來開始它們的細(xì)胞分離流程的。最初的細(xì)胞團(tuán)塊被定義為"基質(zhì)血管級分"(SVF)。一些團(tuán)隊(duì)的注意力僅集中于這種被最小限度加工的細(xì)胞群(popu1ation)。而另一些則對SVF細(xì)胞的塑料粘著亞群進(jìn)行擴(kuò)增(expand)，用于多次傳代；這些是被稱為ASC的細(xì)胞。哺乳動物免疫系統(tǒng)在保護(hù)個(gè)體免受感染物質(zhì)影響以及預(yù)防腫瘤生長的方面扮演中樞性角色。但是，同樣是免疫系統(tǒng)卻可能產(chǎn)生不期望看到的作用，例如對來自不相關(guān)供體的細(xì)胞、組織和器官移植體的排斥。免疫系統(tǒng)不能將有益的入侵者(例如移植的組織)和有害的那些區(qū)分開來，因此免疫系統(tǒng)會排斥移植的組織或器官。對移植器官的排斥通常由宿主中存在的同種異體反應(yīng)性(alloreactive)T細(xì)胞介導(dǎo)，這些T細(xì)胞識別供體的同種異體抗原(alloantigen)或異種抗原(xenoantigen)。在遺傳上全異的個(gè)體之間進(jìn)行細(xì)胞、組織和器官移植總是會導(dǎo)致移植物排斥的風(fēng)險(xiǎn)。幾乎所有細(xì)胞都會表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體的產(chǎn)物，MHCI類分子。此外，當(dāng)暴露給炎性細(xì)胞因子時(shí)，很多細(xì)胞類型可被誘導(dǎo)表達(dá)MHCII類分子。其它免疫原性分子包括得自次要組織相容性抗原的那些，例如Y染色體抗原，其被雌性接受者識別。對同種異體移植物的排斥主要由CD4和CD8亞類的T細(xì)胞介導(dǎo)(Rosenbergetal.，1992A畫.Rev.Immunol.10:333)。同種異體反應(yīng)性CD4十T細(xì)胞產(chǎn)生能加劇對同種異體抗原的溶細(xì)胞CD8應(yīng)答的細(xì)胞因子。在這些亞類中，細(xì)胞的竟?fàn)幮詠喨涸诳乖碳ず蟀l(fā)展，特征在于它們產(chǎn)生的細(xì)胞因子。產(chǎn)生IL-2和IFN-y的Thl細(xì)胞主要涉及同種異體移植物排斥(Mossmannetal"1989Annu.Rev.Immunol.7:145)。產(chǎn)生IL-4和IL-10的Th2細(xì)胞可以通過IL-10下調(diào)Thl應(yīng)答(Fiorentinoet.，1989J.Exp.Med.170:2081)。事實(shí)上，人們付出了很多努力，以將不期望看到的Thl應(yīng)答轉(zhuǎn)向Th2途徑。典型地，用免疫抑制藥物，例如強(qiáng)的松(prednisone)、硫峻嘌呤(azathioprine)和環(huán)孢霉素A來處理患者中不期望看到的同種異體反應(yīng)性T細(xì)胞應(yīng)答(同種異體移植物排斥、移植物抗宿主病)。不幸的是，患者通常需要終生保持這些藥物，并且，它們具有多種危險(xiǎn)的副作用，包括普遍的免疫抑制。比全盤免疫抑制好得多的手段是誘導(dǎo)針對供體細(xì)胞同種異體抗原的特異性或局部抑制，而免疫系統(tǒng)保留完整。人們相信，有多種方法可以誘導(dǎo)對于同種異體抗原的免疫耐受性，這將允許移植同種異體干細(xì)胞。不幸的是，在嚙齒類動物模型中工作良好的很多手段應(yīng)用于非人類靈長動物或人時(shí)都沒有成功。類似地，使用核轉(zhuǎn)移以制造與接受者遺傳上相同的胚胎干細(xì)胞的克隆對于高等物種來說也存在問題，雖然近來有報(bào)道對人取得了有限的成功(Hwangetal.，2004，Science303:1669)。該技術(shù)如何應(yīng)用于工程改造其它類型的干細(xì)胞，以及操作和擴(kuò)增所需的時(shí)間是否阻礙其可用性目前尚不清楚。干細(xì)胞被報(bào)道為展示出低程度的免疫原性，這可能是由于它們分化和免疫調(diào)控性質(zhì)的未成熟狀態(tài)導(dǎo)致的。大鼠的胚胎干細(xì)胞類似細(xì)胞系(embryonicstemcell-likelines)表達(dá)低水平的MHCI類抗原，它們在表達(dá)MHCII類分子和CD80(B7-l)/86(B7-2)共激分子的方面是陰性的(Fandrichetal.，2002Nat.Med.8:171)。當(dāng)注射進(jìn)門靜脈時(shí)，這些細(xì)胞移植(engraft)進(jìn)具有免疫活性的同種異體接受者大鼠的肝。移植歸因于共刺激分子的缺乏以及干細(xì)胞系對FasL的表達(dá)。被活化的T細(xì)胞表達(dá)Fas受體，由此使得它們通過干細(xì)胞系對凋亡敏感。其它胚胎干細(xì)胞系是否也具有這些性質(zhì)目前未知，因?yàn)橐浦驳牡米蕴汉团咛ジ杉?xì)胞的組織經(jīng)常被接受者的免疫系統(tǒng)排斥(Bradleyetal.，2002Nat.Rev.2:859;Kaufmanetal.，2000E-biomecU:ll)。得自嚙齒類的神經(jīng)千細(xì)胞表達(dá)低水平或可忽略水平的MHCI類或II類抗原(McLarenetal.，2001J.Neuroimmunol112:35),但是植入同種異體接受者后這些細(xì)胞通常會被排斥，除非寸吏用了免疫抑制藥物(Masonetal.，1986Neuroscience19:685;Sloanetal.,1991TrendsNeurosci.14:341;Woodetal.，1996Neuroscience70:775)。暴露給IFN家族的炎性細(xì)胞因子后MHC分子在細(xì)胞膜上被上調(diào)，之后排斥得以初始化(McLarenetal.，2001J.Neuroimmunol112:35)。器官移植的一個(gè)主要目標(biāo)是將供體器官永久移植進(jìn)去，而不會誘導(dǎo)出接受者產(chǎn)生的移植物排斥免疫應(yīng)答，同時(shí)保持接受者針對其它外來抗原的免疫活性。典型地，為了預(yù)防宿主的排斥應(yīng)答，使用非特異性免疫抑制劑，例如，環(huán)孢霉素、甲氨蝶呤、類固醇和FK506。這些抑制劑必須每日施用，如果停止施用，通常會導(dǎo)致移植物排斥。但是，使用非特異性免疫抑制劑的主要問題在于，它們通過抑制所有方面的免疫應(yīng)答來發(fā)揮功能，由此大大增加了接受者對于感染和其它疾病(包括癌癥)的易感性。此外，盡管使用了免疫抑制劑，移植物排斥仍是人類器官移植中發(fā)病率和死亡率的主要來源。大多數(shù)人類移植在10年內(nèi)失敗，移植物沒有被永久接受。僅50%的心臟移植者能存活5年，僅20%的腎移植者能存活10年(0pelzetal.，1981Lancet1:1223)。目前人們相信，成功的移植取決于對宿主對移植體的、不想要的免疫應(yīng)答(由免疫效應(yīng)器細(xì)胞介導(dǎo))的預(yù)防和/或降低，以避免宿主對供體組織的排斥。此外，消除或降低供體組織針對接受者組織的、不想要的免疫應(yīng)答(作為移植物抗宿主病已知)的方法對于成功移植來說也是有好處的。因此，人們對于能抑制或者預(yù)防與遺傳上全異的個(gè)體間的細(xì)胞、組織和器官移植相關(guān)的不想要的免疫應(yīng)答的方法存在長足需求。本發(fā)明滿足了該需求。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明包括經(jīng)分離的、得自脂肪組織的成體基質(zhì)(ADAS)細(xì)胞，其展示出非免疫原性特征，其中，所述細(xì)胞被傳代至多達(dá)至少第二代，此外，其中，所述細(xì)胞表達(dá)選自人多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABCG2)和醛脫氫酶(ALDH)的干細(xì)胞相關(guān)特征。在本發(fā)明的一個(gè)方面，ADAS細(xì)胞被傳代至多達(dá)至少第十六代。在另一個(gè)方面，外源性遺傳物質(zhì)被導(dǎo)入ADAS細(xì)胞。在又一個(gè)方面，ADAS得自人。在另一個(gè)方面，ADAS細(xì)胞對其接受者來說是同種異體的。在又一個(gè)方面，ADAS細(xì)胞對其接受者來說是異種的。本發(fā)明還包括治療移植體接受者以在接受者中降低效應(yīng)器細(xì)胞針對同種異體抗原的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括以能有效降低效應(yīng)器細(xì)胞對同種異體抗原的免疫應(yīng)答的量，向移植體接受者施用展示出非免疫原性特征的ADAS細(xì)胞，其中，所述ADAS細(xì)胞已被傳代至多達(dá)至少第二代，此外，其中，所述ADAS細(xì)胞表達(dá)選自人多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABCG2)和醛脫氬酶(ALDH)的干細(xì)胞相關(guān)特征，由此在移植體接受者中，效應(yīng)器細(xì)胞具有降低的針對同種異體抗原的免疫應(yīng)答。在一個(gè)方面，效應(yīng)器細(xì)胞是T細(xì)胞。在另一個(gè)方面，T細(xì)胞來自供體，同種異體抗原來自接受者。在又一個(gè)方面，T細(xì)胞來自接受者，同種異體抗原來自供體。在另一個(gè)方面，T細(xì)胞存在于移植體中。在又一個(gè)方面，效應(yīng)器細(xì)胞是在向接受者施用ADAS細(xì)胞之前被活化的T細(xì)胞，并且，其中，免疫應(yīng)答是供體對T細(xì)胞的再次活化。在另一個(gè)方面，向移植體接受者施用ADAS細(xì)胞，以治療接受者對于移植體的排斥。在另一個(gè)方面，ADAS細(xì)胞得自哺乳動物。優(yōu)選地，哺乳動物是人。在另一個(gè)方面，免疫抑制劑與ADAS細(xì)胞組合施用給接受者。在一個(gè)方面，ADAS細(xì)胞在移植體之前施用給接受者。在另一個(gè)方面，將ADAS細(xì)胞與移植體同時(shí)施用給接受者。在又一個(gè)方面，ADAS細(xì)胞作為移植體的一部分施用。在另一個(gè)方面，在進(jìn)行移植體的移植后，將ADAS細(xì)胞施用給接受者。在一個(gè)方面，向接受者靜脈內(nèi)施用ADAS細(xì)胞。在另一個(gè)方面，效應(yīng)器細(xì)胞是供體移植體接受者的細(xì)胞。在又一個(gè)方面，ADAS細(xì)胞經(jīng)過遺傳^"飾。本發(fā)明還包括降低效應(yīng)器細(xì)胞針對同種異體抗原的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括將效應(yīng)器細(xì)胞與展示出非免疫原性特征的ADAS細(xì)胞接觸，其中，所述ADAS細(xì)胞已被傳代至多達(dá)至少第二代，此外，其中，所述ADAS細(xì)胞表達(dá)選自人多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABCG2)和醛脫氫酶(ALDH)的干細(xì)胞相關(guān)特征，所述ADAS細(xì)胞的量是能有效降低效應(yīng)器細(xì)胞對同種異體抗原的免疫應(yīng)答的。優(yōu)選地，效應(yīng)器細(xì)胞是T細(xì)胞。本發(fā)明還包括從得自脂肪組織的細(xì)胞群分離ADAS細(xì)胞的方法，所述方法包括提供特異于ABCG2的抗體；在適于形成抗體-得自脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞復(fù)合體的條件下，將得自脂肪的細(xì)胞群與抗體接觸；以及將抗體-得自脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞復(fù)合體與得自脂肪的細(xì)胞群充分分開；由此分離出得自脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞。在一個(gè)方面，抗體與物理支持物綴合。在另一個(gè)方面，物理支持物選自微珠、磁珠、包衣表面(panningsurface)、用于密度離心的密致顆粒、吸附柱和吸附膜。在又一個(gè)方面，物理支持物選自鏈親和素珠和生物素珠。在一個(gè)方面，使用選自熒光活化細(xì)胞分選(FACS)和磁性活化細(xì)胞分選(MACS)的方法，將抗體-得自脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞復(fù)合體與得自脂肪的細(xì)胞群充分分開。本發(fā)明還包括從得自脂肪組織的細(xì)胞群富集得自脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞的方法，所述方法包括提供特異于ABCG2的抗體；在適于形成抗體-得自脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞復(fù)合體的條件下，將得自脂肪的細(xì)胞群與抗體接觸；以及將抗體-得自脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞復(fù)合體與得自脂肪的細(xì)胞群充分分開；由此分離出得自脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞。本發(fā)明還包括從得自脂肪組織的細(xì)胞群鑒定出對ALDH陽性的ADAS細(xì)胞的方法，所述方法包括向細(xì)胞群提供特異于ALDH的可切割底物，其中，當(dāng)存在于ALDH+細(xì)胞中時(shí)該底物被切割，并且，其中，被切割的底物釋放出熒光，由此鑒定出ALDH+ADAS細(xì)胞。為了闡述本發(fā)明的目的，在附圖中描繪了本發(fā)明的某些實(shí)施方式。但是，本發(fā)明不限于附圖中描繪的實(shí)施方式的精確排列和手段。圖1(包括圖1A至1D)是一系列圖像，其描繪了對得自脂肪組織的細(xì)胞進(jìn)行的菌落形成單位檢測(CFU)。這些圖描繪了代表下述菌落的染色情況(圖1A)甲苯胺藍(lán)+CFU-F;(圖1B)堿性磷酸酶+CFU-ALP;(圖1C)油紅0+CFU-Ad;和(圖1D)茜素紅+CFU-0b。圖2是描繪得自脂肪的細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)直方圖。針對選用的來自代表性供體的造血細(xì)胞、干細(xì)胞以及基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物的流式細(xì)胞術(shù)直方圖在基質(zhì)血管級分(SVF)和第2代(P2)階段被展示。在每幅圖的右上角示出了染色陽性的細(xì)胞的百分比。藍(lán)線表示陽性染色細(xì)胞，紅線表示同種型(isotype)匹配的單克隆抗體對照。圖3(包括圖3A和3B)是一系列圖表，其展示了得自脂肪的細(xì)胞的免疫表型的相對改變，這作為純化和世代的函數(shù)展示。顯示了相對于分離階段和世代數(shù)的陽性染色細(xì)胞百分比。圖3A描繪了與基質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)記CD166、CD73、CD44和CD29。圖3B描繪了與干細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)記，人多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABCG2)和CD34(圖3A和圖3B中世代數(shù)的排列順序有所不同)。圖4是描繪作為純化和世代函數(shù)的、對得自脂肪的細(xì)胞進(jìn)行的醛脫氫酶染色的圖表。圖5是描繪得自脂肪的細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)直方圖。針對選用的來自代表性供體的造血標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)直方圖在基質(zhì)血管級分(SVF)和第2代(P2)階段被展示。在每幅圖的右上角示出了染色陽性的細(xì)胞的百分比。藍(lán)線表示陽性染色細(xì)胞，紅線表示同種型(isotype)匹配的單克隆抗體對照。圖6是描繪作為純化和世代的函數(shù)的、得自脂肪的細(xì)胞的免疫原性的圖，免疫原性是通過對得自脂肪的細(xì)胞進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)來評價(jià)的。圖5描繪了來自單供體的代表性MLR。在不存在刺激(stimulator)細(xì)胞，存在自體經(jīng)輻照PBMC(陰性對照)，存在同種異體經(jīng)輻照PBMC(陽性對照)已及存在得自脂肪的細(xì)胞(SVF，PO-P4)時(shí)測定T細(xì)胞的增殖。刺激細(xì)胞以每孔5000、10000或20000的密度存在。圖7是展示了得自人脂肪的細(xì)胞(包括人SVF細(xì)胞和ADAS細(xì)胞)在雙向(two-way)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中的免疫抑制效果的圖表。圖8是對通過MLR測量的、骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)和ADAS細(xì)胞的免疫抑制效果進(jìn)行比較的圖表。ADAS和BMSC組織間的差別不顯著(p>0.05，Student，st檢驗(yàn))。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及下述發(fā)現(xiàn)得自脂肪組織的成體基質(zhì)(ADAS)細(xì)胞具有新型的免疫表型和免疫特征。ADAS細(xì)胞的新的特征提供了分離、培養(yǎng)這些細(xì)胞以及在細(xì)胞和/或基因療法中使用這些細(xì)胞的方法。本發(fā)明包括用于分離和培養(yǎng)ADAS細(xì)胞以及將ADAS細(xì)胞移植給接受者的組合物和方法，其中，降低了宿主或移植物免疫排斥的可能性。本發(fā)明可用于通過降低和/或消除接受者自身免疫系統(tǒng)針對移植體的免疫應(yīng)答，來對移植體(例如生物相容性點(diǎn)陣(lattice)或供體組織、器官或細(xì)胞)進(jìn)行移植。如下文更為詳細(xì)描述的，ADAS細(xì)胞在抑制和/或預(yù)防移植體的同種異體移植物排斥方面發(fā)揮作用。此外，本文提供的公開內(nèi)容顯示，ADAS細(xì)胞可用于抑制和/或預(yù)防供體移植體(例如生物相容性點(diǎn)陣或供體組織、器官或細(xì)胞)針對接受者組織的不想要的免疫應(yīng)答，這是作為移植物抗宿主病已知的。因此，本發(fā)明包括用于降低和/或消除接受者中對于移植體的免疫應(yīng)答的組合物和方法，這是通過用能有效降低或抑制宿主的移植體排斥的量的ADAS細(xì)胞處理接受者來實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明還包括用于降低和/或消除宿主中外來移植體針對宿主的免疫應(yīng)答(即，移植物抗宿主病)的組合物和方法，這是通過用ADAS細(xì)胞處理供體移植體和/或移植體接受者，以抑制或降低供體移植體針對接受者的不利(adverse)應(yīng)答來實(shí)現(xiàn)的。定義下述每個(gè)術(shù)語在本文中使用時(shí)具有本章節(jié)中與其相關(guān)的含義。冠詞"a"和"an"在本文中使用時(shí)指一個(gè)至多于一個(gè)(即至少一個(gè))該冠詞的語法對象。舉例而言，"一個(gè)元件(anelement)"表示一個(gè)元件或多于一個(gè)元件。術(shù)語"大約"將是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的，其根據(jù)其上下文以一定程度變動。術(shù)語"得自脂肪組織的細(xì)胞"指來源于脂肪組織的細(xì)胞。從脂肪組織中分離出的最初的細(xì)胞群是異質(zhì)的(heterogenous)細(xì)胞群，其包括但不限于基質(zhì)血管級分(SVF)細(xì)胞。術(shù)語"得自脂肪的基質(zhì)細(xì)胞"、"得自脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞"、"得自脂肪組織的成體基質(zhì)(ADAS)細(xì)胞"或"得自脂肪的干細(xì)胞(ASCs)"在本文中使用時(shí)可互換使用，它們指來源于脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞，其可用作為干細(xì)胞類似細(xì)胞的前體，用于多種不同細(xì)胞類型，例如但不限于脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉和神經(jīng)/神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞譜系?；诒景l(fā)明的公開內(nèi)容，ADAS細(xì)胞包括具有新型的免疫原性特征(包括但不限于ABCG2和ALDH的表達(dá))的干細(xì)胞類似細(xì)胞的充分同質(zhì)的群。此外，本發(fā)明的ADAS細(xì)胞在關(guān)于誘發(fā)T細(xì)胞增殖的方面不是免疫原性的。ADAS細(xì)胞構(gòu)成得自脂肪組織的亞組群，可使用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)流程或本文公開的方法將它們與脂肪組織的其它組分分開。此外，可使用本文公開的細(xì)胞表面標(biāo)記從細(xì)胞混合物中分離ADAS細(xì)胞。術(shù)語"晚代的得自脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞"在本文中使用時(shí)指較之較早代的細(xì)胞而言展示出較少免疫原性特征的細(xì)胞。得自脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞的免疫原性對應(yīng)于世代數(shù)。優(yōu)選地，細(xì)胞已被傳代至多達(dá)至少第二代，更優(yōu)選地，細(xì)胞已被傳代至多達(dá)至少第三代，最優(yōu)選地，細(xì)胞已被傳代至多達(dá)至少第四代。"脂肪，，指任何脂肪(fat)組織。脂肪組織可以是棕脂肪組織或白脂肪組織。優(yōu)選地，脂肪組織是皮下的白脂肪組織。此類細(xì)胞可包含初級細(xì)胞培養(yǎng)物或經(jīng)固定的細(xì)胞系。脂肪組織可來自具有脂肪組織的任何生物體。優(yōu)選地，脂肪組織是哺乳動物的，最優(yōu)選地，脂肪組織是人的。人脂肪組織的方便來源是從抽脂術(shù)中獲得的。但是，脂肪組織的來源或分離脂肪組織的方法對本發(fā)明來說并不關(guān)鍵。"同種異體"指得自同一物種的不同動物的移植物。"得自同種異體脂肪的成體基質(zhì)細(xì)胞，，在本文中被定義為從與接受者相同的物種的不同個(gè)體獲得的。"同種異體抗原"是與接受者表達(dá)的抗原不同的抗原。術(shù)語"自體"在本文中使用時(shí)用來表示得自同一個(gè)體的任何材料，之后其將被再次引入該個(gè)體。"異種"指得自不同物種的動物的移植物。術(shù)語"生物相容性點(diǎn)陣"在本文中使用時(shí)用來表示能協(xié)助形成有益于組織發(fā)育的三維結(jié)構(gòu)的基底。因此，例如，可將細(xì)胞培養(yǎng)或接種到此類生物相容性點(diǎn)陣(例如包括細(xì)胞外基質(zhì)(matrix)材料、合成聚合物、細(xì)胞因子、生長因子等的點(diǎn)陣)上。點(diǎn)陣可被成型為想要的形狀，以協(xié)助組織類型的發(fā)育。此外，至少在細(xì)胞培養(yǎng)的早期階段，培養(yǎng)基和/或基底中補(bǔ)充有協(xié)助合適的組織類型和結(jié)構(gòu)發(fā)育的因子(例如，生長因子、細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)(matrix)材料等)。"供體抗原"指將被移植進(jìn)接受者的供體組織表達(dá)的抗原。"分化培養(yǎng)基"在本文中用來指這樣的細(xì)胞生長培養(yǎng)基，其包含添加劑或缺乏添加劑，使得當(dāng)在所述培養(yǎng)基中對干細(xì)胞、得自脂肪的成體基質(zhì)細(xì)胞或沒有完全分化的其它此類祖細(xì)胞進(jìn)行溫育時(shí)，所述細(xì)胞能夠發(fā)育為具有分化細(xì)胞全部或部分特征的細(xì)胞。"效應(yīng)器細(xì)胞"在本文中使用時(shí)指介導(dǎo)針對抗原的免疫應(yīng)答的細(xì)胞。當(dāng)移植體被引入接受者中的情況下，效應(yīng)器細(xì)胞可以是接受者自身的細(xì)胞，其引發(fā)針對存在于供體移植體中的抗原的免疫應(yīng)答。在其它情況下，效應(yīng)器細(xì)胞可以是移植體的一部分，由此將移植體引入接受者導(dǎo)致存在于移植體中的效應(yīng)器細(xì)胞引發(fā)了移植體針對接受者的免疫應(yīng)答。"擴(kuò)增能力"在本文中使用時(shí)用于表示細(xì)胞增殖的能力，增殖例如是數(shù)量上的擴(kuò)增，或者，在細(xì)胞群的情況下，經(jīng)歷群倍增(populationdoubling)。"移植物，，指用于移植的細(xì)胞、組織、器官或者任何生物相容性點(diǎn)陣。"生長因子"意指下述特定因子，其包括但不限于生長激素、促紅細(xì)胞生成素、血小板生成素、白細(xì)胞介素3、白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素7、巨噬細(xì)胞菌落刺激因子、c-kit配體/干細(xì)胞因子、骨保護(hù)素配體、胰島素、類胰島素生長因子、表皮生長因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、神經(jīng)生長因子、睫狀節(jié)神經(jīng)細(xì)胞營養(yǎng)因子、得自血小板的生長因子(PDGF)以及骨成型蛋白，其濃度為皮克/ml至亳克/ffll之間的水平。術(shù)語"生長培養(yǎng)基"在本文中使用時(shí)指促進(jìn)細(xì)胞生長的培養(yǎng)基。生長培養(yǎng)基通常將含有動物血清。在一些情況下，生長培養(yǎng)基可以不含動物血清。細(xì)胞的"免疫表型"在本文中用于表示細(xì)胞關(guān)于細(xì)胞表面蛋白質(zhì)情況方面的表型。"經(jīng)分離的細(xì)胞，，指已與組織或哺乳動物中天然伴隨該經(jīng)分離細(xì)胞存在的其它組分和/或細(xì)胞分開的細(xì)胞。術(shù)語"多能，，或"多能性，，在本文中使用時(shí)用來表示中樞神經(jīng)系統(tǒng)的千細(xì)胞分化為多于一種類型的細(xì)胞的能力。術(shù)語"調(diào)節(jié)"在本文中使用時(shí)用來表示生物狀態(tài)的任何改變，即，增加、減少等。術(shù)語"非免疫原性"在本文中使用時(shí)用來表示下述發(fā)現(xiàn)在MLR中ADAS細(xì)胞不誘導(dǎo)T細(xì)胞的增殖。但是，非免疫原性不應(yīng)當(dāng)被局限于MLR中的T細(xì)胞增殖，其還應(yīng)當(dāng)用于不誘導(dǎo)T細(xì)胞體內(nèi)增殖的ADAS細(xì)胞。"增殖，，在本文中被用于表示相似形式的，尤其是細(xì)胞的繁殖或倍增。即，增殖包括產(chǎn)生更大數(shù)量的細(xì)胞，可通過對細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行簡單計(jì)數(shù)、測量并入細(xì)胞的3H-胸苷等方法來對其進(jìn)行測量。"細(xì)胞周期的進(jìn)程或經(jīng)歷細(xì)胞周期的進(jìn)程"在本文中用于表示細(xì)胞通過其準(zhǔn)備和/或進(jìn)入有絲分裂和/或減數(shù)分裂的過程。經(jīng)歷細(xì)胞周期的進(jìn)程包括經(jīng)歷G1期、S期、G2期和M期的進(jìn)程。術(shù)語"前體細(xì)胞，，、"祖細(xì)胞"和"干細(xì)胞"在本領(lǐng)域和本文中可互換使用，其指潛能的(pluripotent)或不受譜系約束(lineage-uncommitted)的祖細(xì)胞，其潛在地能夠進(jìn)行無限次的有絲分裂，以自身更新或產(chǎn)生將分化為想要的細(xì)胞類型的后代細(xì)胞。與潛能干細(xì)胞不同，受譜系約束的祖細(xì)胞通常被認(rèn)為不能產(chǎn)生表型上互相有所不同的大量細(xì)胞類型。實(shí)際上，祖細(xì)胞僅能產(chǎn)生一種或者可能兩種受譜系約束的細(xì)胞類型。術(shù)語"基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基，，在本文中使用時(shí)表示用于培養(yǎng)ADAS細(xì)胞的培養(yǎng)基?；|(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基的例子是包含DMEM/Fl2Ham"、10%胎牛血清、100U青霉素/100pg鏈霉素/0.25jag兩性霉素B(Fungizone)的培養(yǎng)基。典型地，基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清和抗生素/抗真菌劑。然而，可以用沒有抗生素/抗真菌劑，但是補(bǔ)充有至少一種生長因子的基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基來培養(yǎng)ADAS細(xì)胞。優(yōu)選地，生長因子是人表皮生長因子(hEGF)。hEGF的優(yōu)選濃度是大約l-50ng/ml，更優(yōu)選地，濃度是大約5ng/ml。優(yōu)選的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是DMEM/F12(1:1)。優(yōu)選的血清是胎牛血清(FBS),但其它血清也是可用的，包括馬血清或人血清。優(yōu)選將向上述培養(yǎng)基中加入多達(dá)20%的FBS，以支持基質(zhì)細(xì)胞的生長。但是，如果FBS中對于基質(zhì)細(xì)胞生長來說必要的生長因子、細(xì)胞因子和激素被鑒定出來并且以合適的濃度提供于生長培養(yǎng)基中的話，那么可以使用限定的(defined)培養(yǎng)基。還應(yīng)認(rèn)識到，可向培養(yǎng)基中加入額外的組分。此類組分包括但不限于抗生素、抗真菌劑、清蛋白、生長因子、氨基酸和本領(lǐng)域已知用來培養(yǎng)細(xì)胞的其它組分?？杉尤肱囵B(yǎng)基的抗生素包括但不限于青霉素和鏈霉素。培養(yǎng)基中青霉素的濃度為每ml大約IO至大約200單位。培養(yǎng)基中鏈霉素的濃度為大約10至大約200^g/ml。但是，不應(yīng)以任何方式將本發(fā)明解釋為局限于用于培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞的任何一種培養(yǎng)基。事實(shí)上，能在組織培養(yǎng)中支持基質(zhì)細(xì)胞的任何培養(yǎng)基都可使用。在本文中使用時(shí)，"經(jīng)充分純化的"細(xì)胞是基本上不含其它細(xì)胞類型的細(xì)胞。因此，經(jīng)充分純化的細(xì)胞指已從其天然存在狀態(tài)下通常相結(jié)合的其它細(xì)胞類型純化出來。"移植體"指待移植的生物相容性點(diǎn)陣或供體組織、器官或細(xì)胞。移植體的一個(gè)例子可以包括但不限于組織、干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、骨髓以及實(shí)體器官，例如心臟、胰腺、腎、肺和肝。"治療有效量"在本文中使用時(shí)是足以向施用ADAS細(xì)胞的受試者提供有益效果的ADAS細(xì)胞的量。術(shù)語"治療移植體接受者，以降低接受者中效應(yīng)器細(xì)胞針對施用給接受者的同種異體抗原的免疫應(yīng)答"這一短語在本文中使用時(shí)表示通過任何方法減少接受者中針對同種異體抗原的內(nèi)源性免疫應(yīng)答，例如通過向接受者施用ADAS細(xì)胞來進(jìn)行，減少是較之沒有用ADAS細(xì)胞處理過的同樣的動物的內(nèi)源性免疫應(yīng)答而言的?？墒褂帽疚墓_的方"內(nèi)源性"在本文中使用時(shí)表示從生物體、細(xì)胞或系統(tǒng)產(chǎn)生或在生物體、細(xì)胞或系統(tǒng)中產(chǎn)生的任何物質(zhì)。"外源性"表示從生物體、細(xì)胞或系統(tǒng)引入或者在生物體、細(xì)胞或系統(tǒng)外產(chǎn)生的任何物質(zhì)。"編碼"表示多核苷酸中特定核苷酸序列(例如基因、cDM或mRNA)用作為模板在生物學(xué)過程中合成具有給定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRM)或給定的氨基酸序列以及來源于此的生物學(xué)性質(zhì)的其它聚合物或大分子的內(nèi)在性質(zhì)。因此，如果對應(yīng)于基因的mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯在細(xì)胞或其它生物學(xué)系統(tǒng)中生產(chǎn)出蛋白質(zhì)，那么該基因就編碼該蛋白質(zhì)。編碼鏈(與mRNA序列相同的核苷酸序列，其通常被提供于序列表中)和非編碼鏈(用作為模板以轉(zhuǎn)錄基因或cDM)可被稱為是編碼蛋白質(zhì)或者該基因或cDNA的其它產(chǎn)物。除非另有指明，"編碼氨基酸序列的核苷酸序列"包括互相是簡并版本并且編碼相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。編碼蛋白質(zhì)和RNA的核苷酸序列可包括內(nèi)含子。"經(jīng)分離的核酸"指已與天然存在的狀態(tài)下在其側(cè)翼的序列分開的核酸片斷或片段，即，已除去通常鄰近該片段的序列(即，在該片段天然存在的基因組中鄰近該片段的序列)的DNA片段。該術(shù)語還可用于這樣的核酸，所述核酸已與天然伴隨該核酸的其它組分(即，在細(xì)胞中天然伴隨其的RNA或DNA或蛋白質(zhì))充分純化開來。該術(shù)語因此包括重組DNA，例如，被并入載體的，并入自主復(fù)制質(zhì)?；虿《镜?，或并入原核生物或真核生物的基因組DNA的，或者作為單獨(dú)分子(即，作為cDNA或通過PCR或限制性酶消化產(chǎn)生的基因組或cDNA片段)獨(dú)立于其它序列存在的。該術(shù)語還包括是編碼額外的多肽序列的雜交體基因的一部分的重組DNA。在本發(fā)明的上下文中，使用了下述縮寫，用于常見核酸堿基。"A"表示腺苷，"C"表示胞苷，"G"表示鳥苷，"T"表示胸苷，"U"表示尿*。短語"在轉(zhuǎn)錄控制下"或"與……可操作地相連"在本文中使用時(shí)表示，啟動子處于相對多核苷酸來說的正確位置和定向，以控制RNA聚合酶初始化以及多核苷酸的表達(dá)。術(shù)語"啟動子/調(diào)控序列，，在本文中使用時(shí)表示與所述啟動子/調(diào)控序列可操作地相連的基因產(chǎn)物表達(dá)所需的核酸序列。在一些情況下，該序列可以是核心啟動子序列，在其它一些情況下，該序列還可包括增強(qiáng)子序列和基因產(chǎn)物表達(dá)所需的其它調(diào)控元件。啟動子/調(diào)控序列可以例如是以組織特異性方式表達(dá)基因產(chǎn)物的啟動子/調(diào)控序列。"組成型"啟動子是這樣的核苷酸序列，當(dāng)其與編碼或特別指定(specify)基因產(chǎn)物的多核苷酸可操作地相連時(shí)，使得在細(xì)胞的大多數(shù)或所有生理?xiàng)l件下基因產(chǎn)物都能在細(xì)胞中產(chǎn)生。"可誘導(dǎo)"啟動子是這樣的核苷酸序列，當(dāng)其與編碼或特別指定基因產(chǎn)物的多核苷酸可操作地相連時(shí)，使得基本上僅在對應(yīng)于該啟動子的誘導(dǎo)劑存在于細(xì)胞中時(shí)，基因產(chǎn)物才會在細(xì)胞中產(chǎn)生。"組織特異性"啟動子是這樣的核苷酸序列，當(dāng)其與編碼或特別指定基因產(chǎn)物的多核苷酸可操作地相連時(shí)，使得基本上僅當(dāng)細(xì)胞是對應(yīng)于該啟動子的組織類型的細(xì)胞時(shí)，基因產(chǎn)物才會在該細(xì)胞中產(chǎn)生。"載體"是組合物，其包含經(jīng)分離的核酸，可用于將經(jīng)分離的核酸遞送至細(xì)胞內(nèi)部。本領(lǐng)域已知大量栽體，其包括但不限于線性多核苷酸、與離子性或兩性化合物相結(jié)合的多核苷酸、質(zhì)粒和病毒。因此，術(shù)語"載體"包括自主復(fù)制質(zhì)粒或病毒。該術(shù)語還將被解釋為包括協(xié)助將核酸轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞的非質(zhì)粒和非病毒化合物，例如，多熔素(polylysine)化合物、脂質(zhì)體等。病毒載體的例子包括但不限于腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等。"表達(dá)載體"指包含下述重組多核苷酸的載體，所述重組多核苷酸包含與待表達(dá)的核苷酸序列可操作相連的表達(dá)控制序列。表達(dá)栽體包含足以用于表達(dá)的順式作用元件；用于表達(dá)的其它元件可由宿主細(xì)胞提供，或者在體外表達(dá)系統(tǒng)中提供。表達(dá)載體包括本領(lǐng)域已知的全部那些，例如并入有重組多核苷酸的粘粒、質(zhì)粒(即，棵的或被含有于脂質(zhì)體中的)和病毒。描述本發(fā)明涉及下述發(fā)現(xiàn)當(dāng)將得自脂肪組織的成體基質(zhì)(ADAS)細(xì)胞與從不同個(gè)體獲得的T細(xì)胞(同種異體T細(xì)胞)接觸時(shí)，同種異體T細(xì)胞不會增殖?，F(xiàn)有技術(shù)的教誨表明，當(dāng)T細(xì)胞與任何其它細(xì)胞類型混合時(shí)，T細(xì)胞的增殖會隨之發(fā)生?；旌狭馨图?xì)胞反應(yīng)(MLR)是用于評價(jià)免疫原性(即，通過MLR測量的、細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖的能力)的檢測。本文公開的數(shù)據(jù)表明，得自一個(gè)個(gè)體的T細(xì)胞并不會應(yīng)答于從不同個(gè)體獲得的ADAS細(xì)胞。因此，基于本文提供的公開內(nèi)容，在關(guān)于呈現(xiàn)T細(xì)胞應(yīng)答的方面，ADAS細(xì)胞對于免疫系統(tǒng)來說不是免疫原性的。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，ADAS細(xì)胞的免疫表型和免疫原性與世代數(shù)是對應(yīng)的。基于本文提供的公開內(nèi)容，較之較早代的細(xì)胞而言，越晚代的細(xì)胞的免疫原性越少。優(yōu)選地，細(xì)胞已被傳代了至少兩代。優(yōu)選地，細(xì)胞已被傳代了至少三代。更優(yōu)選地，細(xì)胞已被傳代了至少四代。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，在分離之后可對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，如果合適的話，在治療性使用之前針對細(xì)胞的免疫原性和免疫表型對其進(jìn)行檢測。優(yōu)選地，使用本文公開的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)基對細(xì)胞進(jìn)行不分化的培養(yǎng)。優(yōu)選地，細(xì)胞可被傳代至至少五代，更優(yōu)選地，細(xì)胞可被傳代至至少IO代或更多代。例如，細(xì)胞可被傳代至至少15代，優(yōu)選地，至少16代，更優(yōu)選地，至少17代，還更優(yōu)選地，至少18代，優(yōu)選地，至少19代，或者甚至至少20代，而不丟失它們的多能性?；诒疚墓_的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，細(xì)胞不是免疫原性的，因此對于移植進(jìn)哺乳動物來說是有利的。除了本發(fā)明的ADAS細(xì)胞對于不同個(gè)體中T淋巴細(xì)胞的非免疫原性表型之外，基于本文提供的公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，ADAS細(xì)胞可抑制同種異體細(xì)胞間的MLR，例如，來自一個(gè)個(gè)體的T細(xì)月包和來自另一個(gè)體的外周血單核細(xì)胞(PBMC)之間的。在一個(gè)方面，ADAS細(xì)胞可主動降低T細(xì)胞和PBMC(每種都是從不同個(gè)體獲得的)之間的MLRs中同種異體T細(xì)胞應(yīng)答。此外，如本文其它地方更為詳細(xì)地討論的，ADAS細(xì)胞的免疫表型與培養(yǎng)該細(xì)胞所用的方法相關(guān)。例如，ADAS細(xì)胞的免疫表型被定義為它們的分離階段、它們的世代數(shù)、細(xì)胞是否作為粘著群培養(yǎng)以及培養(yǎng)時(shí)間長度(但并不限于這些)的函數(shù)?；诒景l(fā)明的公開內(nèi)容，ADAS細(xì)胞可成功用于細(xì)胞和/或基因療法。即，本發(fā)明的細(xì)胞被移植進(jìn)個(gè)體時(shí)，移植物宿主產(chǎn)生免疫排斥的可能性降低。此外，ADAS細(xì)胞可用作為治療劑，用于抑制宿主的移植體排斥，以及用作為治療劑，用于預(yù)防或者抑制移植后發(fā)生的移植物抗宿主病。由此，本發(fā)明包含用于產(chǎn)生可用于實(shí)驗(yàn)/治療目的的ADAS細(xì)胞的組合物和方法。I.分離和培養(yǎng)ADAS可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法來分離可用于本發(fā)明方法中的ADAS細(xì)胞。例如，此類方法被描述于美國專利No.6，153，432，其整體并入本文。在一種優(yōu)選的方法中，從哺乳動物受試者，優(yōu)選地，從人受試者分離ADAS細(xì)胞。得自脂肪的細(xì)胞的免疫原性根據(jù)培養(yǎng)流程(即，世代數(shù))逐漸改變。通過人的得自脂肪的細(xì)胞對于塑料的粘著性以及隨后的擴(kuò)增，選出了較之粗制基質(zhì)血管級分的異質(zhì)性來說相對同質(zhì)的細(xì)胞群，其中富含表達(dá)"基質(zhì)"免疫原性的細(xì)胞。ADAS細(xì)胞還表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記，其包括但不限于人多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABCG2)和醛脫氫酶(ALDH)?；诒疚牡墓_內(nèi)容，得自脂肪的細(xì)胞的免疫表型可被利用來作為針對ADAS細(xì)胞的獨(dú)特鑒定子。即，本發(fā)明的細(xì)胞上的獨(dú)特細(xì)胞表面標(biāo)記可用于從得自脂肪組織的細(xì)胞的混合群中分離出特定的細(xì)胞亞群。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，特異于細(xì)胞表面標(biāo)記的抗體可與物理支持物(即，鏈親和素珠)綴合，由此提供機(jī)會，以分離細(xì)胞表面特異性的得自脂肪的細(xì)胞。然后可使用本文公開的方法或傳統(tǒng)方法體外培養(yǎng)和擴(kuò)增經(jīng)分離的細(xì)胞。本發(fā)明的另外一種實(shí)施方式包括提取或分離自脂肪組織的細(xì)胞亞群的方法。本發(fā)明涉及下述發(fā)現(xiàn)得自脂肪組織的細(xì)胞的免疫表型是世代數(shù)的函數(shù)。由此，可通過溫育細(xì)胞的混合群中的ADAS細(xì)胞特異性結(jié)合的抗體，接著進(jìn)行分離步驟(包括但不限于磁性分離)來從得自脂肪組織的細(xì)胞的混合物中提取ADAS細(xì)胞。與ADAS細(xì)胞特異性結(jié)合的抗體的例子包括但不限于抗-ABCG2抗體。磁性分離的過程通過使用磁珠來完成，磁珠包括但不限于Dynabeads(DynalBiotech,BrownDeer,WI)。除了使用Dynabeads⑧之外，還可用MACS分離試劑(MiltenyiBiotec，Auburn，CA)來從細(xì)胞的混合群中提取ADAS細(xì)胞。作為分離步驟的結(jié)果，可獲得經(jīng)富集的ADAS細(xì)胞群。優(yōu)選地，ADAS細(xì)胞群是經(jīng)純化的細(xì)胞群。本發(fā)明的細(xì)胞的免疫表型提供了使用基于流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞分選器對特定的得自脂肪的細(xì)胞進(jìn)行分選的方法。優(yōu)選地，使用本文公開的方法分離出ADAS細(xì)胞。然后可體外培養(yǎng)經(jīng)分離的ADAS細(xì)胞，以產(chǎn)生可用于實(shí)驗(yàn)或治療目的的、希望數(shù)量的細(xì)胞。能支持細(xì)胞培養(yǎng)物中成纖雉細(xì)胞的任何培養(yǎng)基可用于培養(yǎng)ADAS。支持成纖維細(xì)胞生長的培養(yǎng)基配方包括但不限于，最小限度必要培養(yǎng)基Eagle、ADC-1、LPM(不含牛血清清蛋白)、F10(薩)、F12(HAM)、DCCM1、DCCM2、RPMI1640、BGJ培養(yǎng)基(具有及不具有Fitton-Jackson改良)、基礎(chǔ)培養(yǎng)基Eagle(BME-添加有Earle's鹽基礎(chǔ))、Dulbecco's經(jīng)改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM-不具有血清)、Yamane、IMEM-20、Glasgow改良Eagle培養(yǎng)基(GMEM)、LeibovitzL-15培養(yǎng)基、McCoy's5A培養(yǎng)基、培養(yǎng)基M199(M199E-具有Earle's鹽基礎(chǔ))、MediumM199(M199H-具有Hank's鹽基礎(chǔ))、最小限度必要培養(yǎng)基Eagle(MEM-E-具有Earle's鹽基礎(chǔ))、最小限度必要培養(yǎng)基Eagle(MEM-H-具有Hank's鹽基礎(chǔ))和最小限度必要培養(yǎng)基Eagle(MEM-NAA，具有非必要氨基酸)等。用于培養(yǎng)ADAS的優(yōu)選培養(yǎng)基是DMEM，更優(yōu)選地，是DMEM/F12(1:1)?？捎糜诒景l(fā)明的方法的培養(yǎng)基的其它非限制性例子可含有濃度為至少1%至大約30%的?；蚱渌锓N的胎血清，優(yōu)選地，至少大約5%至15%,最優(yōu)選地，大約10%。雞或其它物種的胚提取物可以以大約1%至30%的濃度存在，優(yōu)選地，至少大約5%至15%，最優(yōu)選地，大約10°/。。分離之后，在培養(yǎng)設(shè)備中的基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基中，對ADAS細(xì)胞溫育一段時(shí)間，或者直到細(xì)胞達(dá)到匯合，之后將細(xì)胞轉(zhuǎn)到另外的培養(yǎng)設(shè)備。最初的涂布之后，細(xì)胞可在培養(yǎng)物中保持大約6天的時(shí)間，以產(chǎn)生第0代(P0)群。細(xì)胞可被傳代不定數(shù)的次數(shù)，每次傳代包括培養(yǎng)細(xì)胞大約6-7天，在此期間細(xì)胞倍增時(shí)間可在3-5天的范圍內(nèi)。培養(yǎng)設(shè)備可以是常用于體外培養(yǎng)細(xì)胞的任何培養(yǎng)設(shè)備。優(yōu)選的培養(yǎng)設(shè)備是培養(yǎng)瓶，更優(yōu)選的培養(yǎng)設(shè)備是T-225培養(yǎng)瓶?？稍谘a(bǔ)充有hEGF的基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基中，不存在抗生素/抗真菌劑的情況下，對ADAS細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間，或者直到細(xì)胞達(dá)到一定水平的匯合。優(yōu)選地，匯合水平高于70%。更優(yōu)選地，匯合水平高于90%。一段時(shí)間可以是適于體外培養(yǎng)細(xì)胞的任何時(shí)間。在對ADAS細(xì)胞培養(yǎng)期間的任何時(shí)間，可替換基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基。優(yōu)選地，每3至4天替換一次基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基。然后從培養(yǎng)設(shè)備中收獲ADAS細(xì)胞，接著，ADAS細(xì)胞可立刻使用，或者可被冷凍貯存，以備后用?？赏ㄟ^胰蛋白酶處理、EDTA處理或者用于從培養(yǎng)設(shè)備中收獲細(xì)胞的任何其它流程來收獲ADAS細(xì)胞。可根據(jù)常規(guī)流程來對本文描述的ADAS細(xì)胞進(jìn)行冷凍貯存。優(yōu)選地，在含有10%匿SO的基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基中，液N2的蒸氣相下，對大約一百萬至一千萬個(gè)細(xì)胞進(jìn)行冷凍貯存?？赏ㄟ^在37'C水浴中渦旋來解凍冷凍的細(xì)胞，再將其重新懸浮于新鮮的生長培養(yǎng)基中，并按常規(guī)培養(yǎng)。本發(fā)明還涉及下述發(fā)現(xiàn)ADAS細(xì)胞的免疫表型是世代數(shù)的函數(shù)。ADAS細(xì)胞的免疫表型和免疫原性性質(zhì)被界定為培養(yǎng)流程(即，粘著性質(zhì)、世代數(shù)、培養(yǎng)時(shí)間長度)的函數(shù)。本文公開的內(nèi)容顯示，經(jīng)新鮮分離的基質(zhì)血管級分(SVF)細(xì)胞和早代的ADAS細(xì)胞能刺激PBMC，而較晚代的ADAS細(xì)胞則不是免疫原性的。觀察到，人SVF細(xì)胞和早代的得自脂肪組織的粘著細(xì)胞引發(fā)與同種異體PMBCs相當(dāng)?shù)膭┝恳蕾囆訫LR應(yīng)答。隨著逐漸的傳代，ADAS細(xì)胞引發(fā)的MLR應(yīng)答減少，其在第1代(P1)跌落至與用自體PBMC觀察到的水平相當(dāng)?shù)乃?。?xì)胞可被傳代至不定數(shù)的次數(shù)。事實(shí)上，較晚代的ADAS細(xì)胞不是免疫原性的。例如，細(xì)胞被傳代至至少P2;更優(yōu)選地，細(xì)胞被傳代至至少P3;還更優(yōu)選地，細(xì)胞被傳代至至少P4。觀察到的晚代ADAS細(xì)胞缺乏免疫原性的特征給出了如下指示向哺乳動物施用ADAS細(xì)胞用于細(xì)胞/基因療法時(shí)，宿主或移植物產(chǎn)生免疫排斥的可能性降低?；诒疚墓_的內(nèi)容，還相信，晚代細(xì)胞可能表達(dá)抑制PBMC對于已知刺激細(xì)胞的增殖性應(yīng)答的免疫抑制因子。因此，本發(fā)明的細(xì)胞可用于在它們被引入的哺乳動物中誘導(dǎo)免疫抑制效果。例如，在存在同種異體PBMC作為刺激細(xì)胞的情況下，當(dāng)將晚代細(xì)胞加入到MLRs中時(shí)，它們可以抑制增殖性應(yīng)答。如本發(fā)明所包括的，典型地，從來自人的抽脂術(shù)物質(zhì)中分離ADAS細(xì)胞。如果本發(fā)明的細(xì)胞將被移植進(jìn)人類受試者，優(yōu)選從同一受試者分離ADAS細(xì)胞，由此提供自體移植體。但是，同種異體移植體也是本發(fā)明所包括的。因此，在本發(fā)明的另一方面，施用的ADAS細(xì)胞可以是對于接受者來說同種異體的。可從是與接受者相同物種的不同個(gè)體的供體分離同種異體ADAS細(xì)胞。分離之后，使用本文公開的方法培養(yǎng)細(xì)胞，以生產(chǎn)同種異體產(chǎn)物。本發(fā)明還包括對于接受者來說是異種的ADAS細(xì)胞。II.抑制宿主的移植體排斥的療法本發(fā)明包括使用ADAS細(xì)胞作為抑制宿主的移植體排斥的療法的方法。本發(fā)明基于如下發(fā)現(xiàn)ADAS細(xì)胞不刺激同種異體T細(xì)胞增殖。由此，本發(fā)明包括使用ADAS細(xì)胞來抑制應(yīng)答于外源性器官、組織或細(xì)胞的T細(xì)胞增殖。本發(fā)明還包括以能有效降低與T細(xì)胞增殖相關(guān)的免疫應(yīng)答的量向哺乳動物施用ADAS細(xì)胞的方法。基于本文提供的公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，ADAS細(xì)胞可被利用來，包括抑制應(yīng)答于移植進(jìn)哺乳動物的、從不同個(gè)體獲得的任何類型的器官、組織或細(xì)胞的T細(xì)胞增殖。例如，可使用ADAS細(xì)胞來抑制應(yīng)答于細(xì)胞，包括但不限于神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)、肝細(xì)胞、心臟細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、腎細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等的T細(xì)胞增殖。本發(fā)明包括降低和/或消除接受者中對移植體的免疫應(yīng)答的方法，所述方法通過向移植體的接受者施用能有效降低或抑制宿主的移植體排斥的量的ADAS細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)。在不希望被任何特定理論束縛的情況下，施用給移植體接受者的ADAS細(xì)胞能抑制接受者T細(xì)胞的活化和增殖。移植體包括待移植的生物相容性點(diǎn)陣或供體組織、器官或細(xì)胞。移植體的例子包括但不限于干細(xì)胞、皮膚細(xì)胞或組織、骨髄以及實(shí)體器官，例如心臟、胰腺、腎、肺和肝。優(yōu)選地，移植體是人NSC?；诒疚奶峁┑墓_內(nèi)容，可從任何來源獲得ADAS細(xì)胞，例如從組織供體、移植體接受者或者不相關(guān)的來源(全然不同的個(gè)體或物種)獲得。ADAS細(xì)胞可以是相對T細(xì)胞來說自體的(從同一宿主獲得)或者相對T細(xì)胞來說同種異體的。當(dāng)ADAS細(xì)胞是同種異體的時(shí)候，ADAS細(xì)胞可以相對T細(xì)胞應(yīng)答的移植體來說是自體的，或者，可從與T細(xì)胞來源和T細(xì)胞應(yīng)答的移植體來源都是同種異體的個(gè)體獲得ADAS細(xì)胞。此外，ADAS細(xì)胞可以與T細(xì)胞異種(從不同物種的動物獲得)，例如可用大鼠ADAS細(xì)胞來抑制人T細(xì)胞的活化和增殖。在另外一種實(shí)施方式中，可從任何哺乳動物物種(包括但不限于人、小鼠、大鼠、猿、長臂猿、牛)的脂肪組織分離用于本發(fā)明的ADAS細(xì)胞。優(yōu)選地，從人、小鼠或大鼠分離ADAS細(xì)胞。更優(yōu)選地，從人分離ADAS細(xì)胞。本發(fā)明的另一實(shí)施方式包括向移植體接受者施用ADAS細(xì)胞的途徑?？赏ㄟ^適用于放置移植體(即，待移植的生物相容性點(diǎn)陣或供體組織、器官或細(xì)胞)的途徑來施用ADAS細(xì)胞。ADAS細(xì)胞可全身性施用，即通過靜脈注射非腸道應(yīng)用，或者可以靶向特定組織或器官?？赏ㄟ^皮下植入或通過將細(xì)胞注射進(jìn)結(jié)締組織(例如肌肉)來施用ADAS細(xì)胞。可將ADAS細(xì)胞以大約0.01至大約5XlQe個(gè)細(xì)胞/ml的濃度懸浮于合適的稀釋劑中。用于注射溶液的合適賦形劑是與ADAS細(xì)胞及與接受者生物學(xué)上以及生理學(xué)上都相容的那些，例如經(jīng)緩沖鹽水溶液或者其它合適的賦形劑?？砂凑兆裱_無菌或穩(wěn)定性的標(biāo)準(zhǔn)方法，來配制、制造和貯藏用于施用的組合物。ADAS細(xì)胞的劑量在寬的限度內(nèi)變動，在每種特定情況下，可針對個(gè)體需求對其加以調(diào)節(jié)。使用的細(xì)胞的數(shù)量取決于接受者的重量和狀況、施用數(shù)和/或頻度以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它變量?？上騻€(gè)體施用每100kg體重大約105至大約1013個(gè)ADAS細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，每100kg體重施用大約1.5X106至大約1.5X1012個(gè)ADAS細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，每100kg體重施用大約1X109至大約5XIO"個(gè)ADAS細(xì)胞。在其它一些實(shí)施方式中，每100kg體重施用大約4X109至大約2XIO"個(gè)ADAS細(xì)胞。在其它還有一些實(shí)施方式中，每100kg體重施用大約5X108至大約1X1(T個(gè)ADAS細(xì)胞。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，在移植體之前或與移植體同時(shí)將ADAS細(xì)胞施用給接受者，以降低和/或消除宿主的移植體排斥。在不希望被束縛為任何特定理論的情況下，ADAS細(xì)胞可用于調(diào)理(condition)接受者對移植體的免疫系統(tǒng)，這是通過在移植體移植之前或同時(shí)向接受者施用能有效降低、抑制或消除接受者T細(xì)胞針對移植體的免疫應(yīng)答的量的ADAS細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)。ADAS細(xì)胞對接受者的T細(xì)胞造成影響，使得伴隨移植體存在的T細(xì)胞應(yīng)答被降低、抑制或消除。由此，可通過在移植之前或同時(shí)向接受者施用ADAS細(xì)胞，來避免宿主的移植體排斥，或者降低其嚴(yán)重性。在又一實(shí)施方式中，可在施用移植體之后向移植體的接受者施用ADAS細(xì)胞。此外，本發(fā)明包含對正在經(jīng)歷對移植體的不利免疫應(yīng)答(也被稱為宿主的移植體排斥)的患者進(jìn)行治療的方法，所述方法通過以能降低、抑制或消除對移植體的免疫應(yīng)答的量向患者施用ADAS細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)。III.抑制移植后的移植物抗宿主病的療法本發(fā)明包括使用ADAS細(xì)胞作為抑制移植后的移植物抗宿主病的療法的方法。本發(fā)明基于下述發(fā)現(xiàn)ADAS細(xì)胞不刺激同種異體T細(xì)胞增殖。可以預(yù)想，ADAS細(xì)胞可抑制MLR反應(yīng)中的T細(xì)胞增殖。本發(fā)明還包括以能有效降低與T細(xì)胞增殖相關(guān)的免疫應(yīng)答的量向哺乳動物施用ADAS細(xì)l包的方法。本發(fā)明還提供了降低和/或消除供體移植體針對其接受者的免疫應(yīng)答(即，移植物抗宿主病)的方法。因此，本發(fā)明包括在移植體移植進(jìn)接受者之前將供體移植體(例如生物相容性點(diǎn)陣或供體組織、器官或細(xì)胞，優(yōu)選地，神經(jīng)干細(xì)胞)與ADAS細(xì)胞接觸的方法。ADAS細(xì)胞作用于改善、抑制或降低供體移植體針對接受者的不利應(yīng)答的方法。如本文其它地方所討論的，ADAS細(xì)胞可從任何來源獲得，例如，從組織供體、移植體接受者或者不相關(guān)的來源(全然不同的個(gè)體或物種)獲得，用于消除或降低移植體針對移植體接受者的、不想要的免疫應(yīng)答。因此，ADAS細(xì)胞可以是相對組織供體、移植體接受者或者是不相關(guān)來源來說自體的、同種異體的或異種的。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，在將移植體移植進(jìn)接受者之前，將移植體暴露給ADAS細(xì)胞。在這種情況下，任何同種異體反應(yīng)性接受者細(xì)胞導(dǎo)致的針對移植體的免疫應(yīng)答被移植體中存在ADAS細(xì)胞抑制。ADAS細(xì)胞對于接受者來說是同種異體的，其可從供體或從既非供體又非接受者的來源獲得。在一些情況下，可用對于接受者來說是自體的ADAS細(xì)胞來抑制針對移植體的免疫應(yīng)答。在另一種情況下，ADAS細(xì)胞可以是對于接受者來說異種的，例如可用小鼠或大鼠ADAS細(xì)胞來抑制人中的免疫應(yīng)答。但是，在本發(fā)明中優(yōu)選使用人的ADAS細(xì)胞。除了在將移植體移植進(jìn)接受者之前用ADAS細(xì)胞處理移植體之外，可在移植之前，用來自接受者的細(xì)胞或組織"預(yù)調(diào)理"或"預(yù)處理"供體移植體，以活化可能與移植體相關(guān)的T細(xì)胞。用來自接受者的細(xì)胞或組織處理移植體之后，可從移植體移走細(xì)胞或組織。然后再將經(jīng)處理的移植體與ADAS細(xì)胞接觸，以降低、抑制或消除通過來自接受者的細(xì)胞或組織的處理被活化的T細(xì)胞的活性。在用ADAS細(xì)胞對移植體的這種處理之后，可在移植到接受者中之前，從移植體移走ADAS細(xì)胞。但是，一些ADAS細(xì)胞可能與移植體粘著，因此，可能隨著移植體被引入接受者。在這種情況下，引入接受者的ADAS細(xì)胞能抑制與移植體相關(guān)的、任何細(xì)胞造成的針對接受者的免疫應(yīng)答。在不希望被任何特定理論束縛的情況下，在移植體移植進(jìn)接受者之前用ADAS細(xì)胞對移植體進(jìn)行的處理用于降低、抑制或消除被活化的T細(xì)胞的活性，由此預(yù)防T細(xì)胞被隨后來自接受者組織和/或細(xì)胞的抗原性刺激再次刺激，或者由此誘導(dǎo)T細(xì)胞對隨后來自接受者組織和/或細(xì)胞的抗原性刺激的應(yīng)答減弱?；诒景l(fā)明的公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在移植之前進(jìn)行的預(yù)調(diào)理或預(yù)處理可降低或消除移植物抗宿主病。例如，在骨髓或外周血干細(xì)胞(造血干細(xì)胞)移植的相關(guān)情況下，可通過使用本文公開的預(yù)處理方法，對供體髓進(jìn)行預(yù)處理，以降低移植物針對接受者的免疫原性，來降低、抑制或消除移植物的宿主攻擊。如本文其它地方所述的，可以在將供體髓移植進(jìn)接受者之前，用來自任何來源的ADAS細(xì)胞，優(yōu)選用接受者ADAS細(xì)胞，對供體髓進(jìn)行體外預(yù)處理。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，首先將供體髓暴露給接受者組織或細(xì)胞，然后用ADAS細(xì)胞對其進(jìn)行處理。在不希望被任何特定理論束縛的情況下，我們相信，供體髓與接受者組織或細(xì)胞最初的接觸起到了活化供體髓中T細(xì)胞的作用。用ADAS細(xì)胞處理供體髓誘導(dǎo)了T細(xì)胞對隨后的抗原刺激的應(yīng)答減弱，或者預(yù)防了對于T細(xì)胞被隨后的抗原刺激再次刺激，由此降低、抑制或消除了供體髓在接受者上誘導(dǎo)的不利影響。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，可通過向接受者施用ADAS細(xì)胞來治療正遭受移植物抗宿主病的移植體接受者，以降低、抑制或消除移植物抗宿主病的嚴(yán)重性，其中，以能有效降低或消除移植物抗宿主病的量施用ADAS細(xì)胞。在本發(fā)明的該實(shí)施方式中，優(yōu)選地，可在移植之前從接受者獲得接受者的ADAS細(xì)胞，可將其貯藏和/或在培養(yǎng)中擴(kuò)增，以提供數(shù)量足夠治療進(jìn)行中的移植物抗宿主反應(yīng)得ADAS細(xì)胞儲備。但是，如本文其它地方所討論的，可從任何來源獲得ADAS細(xì)胞，例如，從組織供體、移植體接受者或其它不相關(guān)來源(全然不同的個(gè)體或物種)獲得。IV.使用ADAS細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)基于本文提供的公開內(nèi)容，可以預(yù)見，本發(fā)明的ADAS細(xì)胞可用于與目前的模式(例如使用免疫抑制藥物療法)聯(lián)合使用，用于治療宿主對供體組織的排斥或移植物抗宿主病。在移植中聯(lián)合使用ADAS細(xì)胞與免疫抑制藥物的優(yōu)點(diǎn)在于，通過使用本發(fā)明的方法改善了移植體接受者中免疫應(yīng)答的嚴(yán)重性，因此，可以降低使用的免疫抑制藥物的量和/或降低免疫抑制藥物的施用頻度。降低免疫抑制藥物的使用的益處在于，廣譜免疫抑制和與免疫抑制藥物相關(guān)的不想要的副作用得以減輕。在一種實(shí)施方式中，在無需免疫抑制藥物的情況下使用本發(fā)明的細(xì)胞。還考慮到，本發(fā)明的細(xì)胞可作為"一次"療法施用給接受者，用于治療宿主對供體組織的排斥或移植物抗宿主病。ADAS細(xì)胞向移植體接受者的一次施用消除了對長期的免疫抑制藥物療法的需求。但是，如果需要的話，也可以多次使用ADAS細(xì)胞。本文描述的本發(fā)明還包括預(yù)防或治療移植體排斥和/或移植物抗宿主病的方法，所述方法通過以用于預(yù)防、治療或改善宿主的移植體排斥和/或移植物抗宿主病的預(yù)防有效量或治療有效量施用ADAS細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)?；诒疚墓_的內(nèi)容，ADAS細(xì)胞的"治療有效量"是使得被活化的T細(xì)胞的數(shù)量較之沒有施用ADAS細(xì)胞時(shí)被活化的T細(xì)胞的數(shù)量而言得到抑制或減少的ADAS細(xì)胞量。在宿主的移植體排斥的情況下，ADAS細(xì)胞的有效量是使得移植體接受者中被活化的T細(xì)胞的數(shù)量較之施用ADAS細(xì)胞之前接受者中被活化的T細(xì)胞的數(shù)量而言得到抑制或減少的量。在移植物抗宿主病的情況下，ADAS細(xì)胞的有效量是能抑制或減少移植體中存在的被活化的T細(xì)胞的數(shù)量的量?？赏ㄟ^下述方法來確定ADAS細(xì)胞的有效量將施用ADAS細(xì)胞之前接受者或移植體中被活化的T細(xì)胞的數(shù)量與施用ADAS細(xì)胞之后接受者或移植體中存在的被活化的T細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行比較。移植體的接受者，或者移植體自身中被活化的T細(xì)胞的數(shù)量與ADAS細(xì)胞的施用相關(guān)性地減少或者沒有增加，指示施用的ADAS細(xì)胞的數(shù)量是ADAS細(xì)胞的治療有效量。遺傳修飾本發(fā)明的細(xì)胞還可用于表達(dá)用于治療目的的外來蛋白質(zhì)或分子，或者用于跟蹤它們在接受者中的同化(assimilation)和/或分化情況的方法。因此，本發(fā)明包括將外源性DNA引入ADAS細(xì)胞使得外源性DNA在ADAS細(xì)胞中一起表達(dá)的載體和方法。用于在細(xì)胞中引入和表達(dá)DNA的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，其包括例如Sambrooketal.(2001，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,NewYork),andinAusubeletal.(1997，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NewYork)中描述的那些。經(jīng)分離的核酸分子可編碼下述分子，所述分子用于在ADAS細(xì)胞一旦被引入接受者之后跟蹤ADAS細(xì)胞的移動、同化和生存?？捎糜诟櫦?xì)胞的蛋白質(zhì)包括但不限于綠色熒光蛋白(GFP)、任何其它熒光蛋白(例如增強(qiáng)的綠色、青色、黃色、藍(lán)色和紅色熒光蛋白；Clontech，PaloAlto，CA)或其它標(biāo)簽蛋白(例如LacZ、FLAG-標(biāo)簽、Myc、His6等)。對本發(fā)明的ADAS細(xì)胞的移動、同化和/或分化進(jìn)行跟蹤并不局限于施用載體或病毒表達(dá)的可探測分子。還可使用協(xié)助移植的ADAS細(xì)胞在哺乳動物中定位的一系列探針來評估細(xì)胞的移動、同化和/或分化。還可使用針對本文其它地方詳細(xì)描述的細(xì)胞特異性標(biāo)記(例如但不限于ABCG2、ALDH等)的抗體或核酸探針，來完成對ADAS細(xì)胞移植體的跟蹤。術(shù)語"遺傳修飾"在本文中使用時(shí)表示有意引入外源性DNA導(dǎo)致的ADAS細(xì)胞基因型的穩(wěn)定的或瞬時(shí)的變化。DNA可以是合成的或天然獲得的，其可含有基因、基因的部分或者其它有用的DNA序列。術(shù)語"遺傳修飾"在本文中使用時(shí)不意味著包括天然發(fā)生的變化，例如通過天然病毒活性、天然遺傳重組等發(fā)生的。可使用病毒載體(逆轉(zhuǎn)錄病毒、經(jīng)修飾的皰疹病毒、皰疹病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒等)或者通過直接的DM轉(zhuǎn)染(脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖、電穿孔等)將外源性DNA引入ADAS細(xì)胞。當(dāng)對細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾的目的是產(chǎn)生生物活性物質(zhì)時(shí)，該物質(zhì)通常將是可用于治療給定病癥的物質(zhì)。例如，可能想對細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，使得它們能分泌某種生長因子產(chǎn)物?？赏ㄟ^將外源性遺傳物質(zhì)引入細(xì)胞，來對本發(fā)明的細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，以生產(chǎn)對于細(xì)胞培養(yǎng)來說有益的分子(例如營養(yǎng)因子、生長因子、細(xì)胞因子等)。此外，通過對細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾以生產(chǎn)此類分子，使得細(xì)胞得以在移植進(jìn)需要其的患者中時(shí)向患者提供額外的治療效果。術(shù)語"生長因子產(chǎn)物"在本文中使用時(shí)表示對細(xì)胞具有生長、增殖、分化或營養(yǎng)作用的蛋白質(zhì)、肽、促分裂原(mitogen)或其它分子。例如，可用于治療CNS病癥的生長因子產(chǎn)物包括但不限于神經(jīng)生長因子(NGF)、得自腦的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)素(NT-3、NT-4/NT-5)、睫狀節(jié)神經(jīng)細(xì)胞營養(yǎng)因子(CNTF)、雙調(diào)蛋白(amphiregulin)、FGF-1、FGF-2、EGF、TGFoc、TGFPs、PDGF、IGFs和白細(xì)胞介素；IL-2、IL-12、IL-13。還可修飾細(xì)胞，以表達(dá)某生長因子受體，其包括但不限于p75低親和性NGFr、CNTFr、神經(jīng)營養(yǎng)素受體的trk家族(trk、trkB、trkC)、EGFr、FGFr和雙調(diào)蛋白受體?？蓪?xì)胞進(jìn)行工程改造，使其產(chǎn)生多種神經(jīng)遞質(zhì)或它們的受體，例如，5-羥色胺、L-多巴、多巴胺、去甲腎上腺素腎上腺素、速激肽、P物質(zhì)、內(nèi)啡肽、腦啡肽、組胺、N-甲基D-天冬氨酸鹽、甘氨酸、谷氨酸鹽、GABA、ACh等。有用的非神經(jīng)遞質(zhì)合成基因包括TH、多巴脫羧酶(DDC)、DBH、PNMT、GAD、色氨酸羥化酶、ChAT和組氨酸脫羧酶。編碼多種可能在治療CNS病癥中被證明為有用的神經(jīng)肽的基因包括P物質(zhì)、神經(jīng)肽-Y、腦啡肽、后葉加壓素、VIP、胰高血糖素、鈴蟾肽、膽嚢收縮素(CCK)、促生長素抑制素、降鈣素基因相關(guān)的肽等。還可對本發(fā)明的細(xì)胞加以修飾，以表達(dá)細(xì)胞因子。細(xì)胞因子優(yōu)選(但并非排除性地)選自IL-12、TNFoc、IFNoc、IFNP、IFNy、IL-7、IL-2、IL-6、IL-15、IL-21和IL-23。根據(jù)本發(fā)明，向ADAS細(xì)胞中引入包含編碼異源蛋白的核苷酸序列的基因構(gòu)建體。即，對細(xì)胞進(jìn)行遺傳改造，以引入其表達(dá)在個(gè)體中有治療效果的基因。根據(jù)本發(fā)明的一些方面，可對來自待治療個(gè)體或來自另一個(gè)體或來自非人類動物的ADAS細(xì)胞進(jìn)行遺傳改造，以替換有缺陷的基因和/或引入其表達(dá)在被治療的個(gè)體中有治療效果的基因。向細(xì)胞中轉(zhuǎn)染進(jìn)基因構(gòu)建體的所有情況下，異源基因都與實(shí)現(xiàn)該基因在細(xì)胞中的表達(dá)所需的調(diào)控序列可操作地相連。典型地，此類調(diào)控序列包括啟動子和聚腺苷化信號。優(yōu)選地，基因構(gòu)建體作為表達(dá)載體提供，所述表達(dá)載體包括針對異源蛋白的編碼序列，其與必要調(diào)控序列可操作地相連，使得當(dāng)載體被轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞時(shí)，編碼序列將4皮細(xì)胞表達(dá)。編碼序列與在細(xì)胞中表達(dá)該序列所必需的調(diào)控元件可操作地相連。編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列可以是cDNA、基因組DNA、合成的DNA或其雜交體或RNA分子(例如mRM)。基因構(gòu)建體包括編碼有益蛋白的核苷酸序列，其與調(diào)控元件可操作地相連，基因構(gòu)建體可在細(xì)胞中作為有機(jī)能的(functioning)胞質(zhì)分子、有機(jī)能的游離分子保持存在于細(xì)胞中，或者其可整合進(jìn)細(xì)胞的染色體DNA?？蛇@樣將外源性遺傳物質(zhì)引入細(xì)胞，在所述細(xì)胞中，其保持為質(zhì)粒形式的單獨(dú)遺傳物質(zhì)。或者，可將能整合進(jìn)染色體的線性DNA引入細(xì)胞。當(dāng)將DNA引入細(xì)胞時(shí)，可以加入促進(jìn)DNA整合進(jìn)染色體的試劑。還可在DNA分子中包括進(jìn)可用于促進(jìn)整合的DNA序列?；蛘?，可將RNA引入細(xì)胞。用于基因表達(dá)的調(diào)控元件包括啟動子、起始密碼子、終止密碼子和聚腺苷化信號。優(yōu)選地，這些元件在本發(fā)明的細(xì)胞中是可操作的。此外，優(yōu)選地，這些元件與編碼蛋白的核苷酸序列可操作地相連，使得核苷酸序列得以在細(xì)胞中表達(dá)，以及由此生產(chǎn)出蛋白。通常，起始密碼子和終止密碼子被認(rèn)為是編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的一部分。但是優(yōu)選地，這些元件在細(xì)胞中具有功能。類似地，所用的啟動子和聚腺苷化信號必須在本發(fā)明的細(xì)胞中具有功能?？捎糜趯?shí)踐本發(fā)明的啟動子的例子包括但不限于在很多細(xì)胞中具有活性的啟動子，例如巨細(xì)胞病毒啟動子、SV40啟動子和逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動子?？捎糜趯?shí)踐本發(fā)明的啟動子的其它例子包括但不限于組織特異性啟動子，即，在一些組織中具有功能但在另一些中沒有的啟動子；還有，在有或沒有特異性或一般性增強(qiáng)子序列時(shí)都在細(xì)胞中正常表達(dá)的基因的啟動子。在一些實(shí)施方式中，使用有或沒有增強(qiáng)子序列時(shí)都在細(xì)胞中組成型表達(dá)基因的啟動子。必要或者想要的時(shí)候，在此類實(shí)施方式中提供增強(qiáng)子序列?？墒褂帽绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員易于獲得的公知方法，對本發(fā)明的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)方法將外源性基因引入細(xì)胞，其中，細(xì)胞表達(dá)該基因編碼的蛋白。在一些實(shí)施方式中，通過磷酸苷沉淀轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、化學(xué)物質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、配體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移或者重組病毒載體轉(zhuǎn)移來轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，用重組腺病毒載體來將具有想要的序列的DNA引入細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，用重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將具有想要的序列的DM引入細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，用標(biāo)準(zhǔn)CaP04、DEAE葡聚糖或脂類云載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)來將想要的DNA并入分裂中的(dividing)細(xì)胞?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)抗生素抗性選擇技術(shù)來鑒定或選擇轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，通過顯微注射將DNA直接引入細(xì)胞。類似地，可使用公知的電穿孔或顆粒轟擊技術(shù)將外來DNA引入細(xì)胞。通常有第二基因與治療基因共轉(zhuǎn)染或相連。第二基因通常是選擇性抗生素抗性基因?？赏ㄟ^在能殺死沒有獲取該選擇性基因的細(xì)胞的抗生素中培養(yǎng)細(xì)胞來選出被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。在大多數(shù)情況下，兩個(gè)基因不相連并被共轉(zhuǎn)染，在抗生素處理下存活的細(xì)胞兩個(gè)基因都具有并且兩個(gè)基因都表達(dá)。應(yīng)當(dāng)理解，本文描述的方法可以以多種方式來進(jìn)^f亍，并且本領(lǐng)域公知對其進(jìn)行的多種改良和置換(permutation)。還可認(rèn)識到，在關(guān)于作用模式或者細(xì)胞類型間的相互作用方面示出任何理解都不應(yīng)被理解為以任何方式對本發(fā)明加以限制，其被展現(xiàn)出來僅是為了使本發(fā)明的方法能被更好理解。V.移植本發(fā)明包括向動物(包括人)施用ADAS細(xì)胞，以治療下述疾病的方法，所述疾病中，引入新的、未受損的細(xì)胞將提供一定形式的治療成果。技術(shù)人員將易于理解，ADAS細(xì)胞可被移植進(jìn)接受者，其中，在接收到來自周圍環(huán)境的信號和提示時(shí)，細(xì)胞可在體內(nèi)進(jìn)一步分化為由鄰近的細(xì)胞環(huán)境規(guī)定的成熟細(xì)胞。或者，ADAS細(xì)胞可體外分化為想要的細(xì)胞類型，可將分化的細(xì)胞施用給需要其的動物。本發(fā)明還包括將ADAS細(xì)胞的移植與其它治療流程組合，來治療身體(包括CNS、皮膚、肝、腎、心臟、胰腺等)的疾病或損傷。由此，ADAS細(xì)胞可與對患者施加有益效果的其它細(xì)胞共移植，所述其它細(xì)胞是經(jīng)遺傳修飾的或者未經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞。因此，本文公開的方法可與其它治療流程組合，一旦有本文提供的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠理解這點(diǎn)?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的技術(shù)，例如，即，美國專利Nos.5,082,670和5，618，531(每份都通過引用并入本文)所述的，將本發(fā)明的ADAS細(xì)胞移植進(jìn)患者，或者移植進(jìn)體內(nèi)其它任何合適位點(diǎn)。可使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)以及本文所述的技術(shù)和未來開發(fā)的技術(shù)，來完成對本發(fā)明細(xì)胞的移植。本發(fā)明包含將細(xì)胞移植(transplanting)、移植(grafting)、注入或者引入噴享L動物(優(yōu)選地，人)的方法。本文示例性給出了將細(xì)胞移植進(jìn)多種哺乳動物心血管組織的方法，但是本發(fā)明并不限于此類解剖學(xué)位點(diǎn)或者這些哺乳動物。此外，與骨移植體相關(guān)的方法是本領(lǐng)域公知的，其被描述于，例如美國專利No.4，678，470中，胰腺細(xì)胞移植體被描述于美國專利No.6，342,479和美國專利No.5，571，083中，其教導(dǎo)了將細(xì)胞移植到體內(nèi)任何解剖學(xué)位置的方法。還可按照已知的封裝(encapsulation)技術(shù)，包括微封裝(microencapsulationX見例如美國專利Nos.4，352，883、4，353，888和5，084，350，它們通過引用并入本文)或巨封裝(macroencapsulation)(見侈'J:ft口美國專矛JNos.5,284,761、5,158,881、4,976,859和4，968，733;以及國際/〉開文本Nos.W092/19195、W095/05452，所有這些都通過引用并入本文)，對細(xì)胞進(jìn)行封裝，用其遞送生物學(xué)活性分子。對于巨封裝而言，設(shè)備中的細(xì)胞數(shù)可以變動，優(yōu)選地，每個(gè)裝置含有大約103-109個(gè)細(xì)胞，最優(yōu)選地，大約105-107個(gè)細(xì)胞?？稍诨颊咧兄踩攵鄠€(gè)巨封裝裝置。用于巨封裝和植入細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域公知的，其被描述于，例如美國專利6,498,018中。ADAS細(xì)胞的劑量在寬的限度內(nèi)變動，在每種特定情況下，可針對個(gè)體需求對其加以調(diào)節(jié)。使用的細(xì)胞的數(shù)量取決于接受者的重量和狀況、施用數(shù)和/或頻度以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它變量。向患者施用的ADAS細(xì)胞的量可與，例如脂肪組織加工后的細(xì)胞產(chǎn)量相關(guān)。細(xì)胞總量中的一部分可留下來以備后用或者被冷凍貯存。此外，遞送的劑量取決于將細(xì)胞遞送給患者的途徑。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，向患者遞送的細(xì)胞的數(shù)量預(yù)計(jì)為大約5.5x104個(gè)細(xì)胞。但是，可對該數(shù)量進(jìn)行數(shù)量級的調(diào)節(jié)，以獲得想要的治療效果。向患者施用本發(fā)明的細(xì)胞的模式可根據(jù)多種因素變化，所述因素包括被治療疾病的類型、哺乳動物的年齡、細(xì)胞是否已分化、細(xì)胞是否具有引入其中的異源DNA等。可通過直接注射，或者通過本領(lǐng)域中用來引入施用給遭受特定疾病或病癥的患者的化合物的任何其它手段，將細(xì)胞引入想要的位點(diǎn)?？梢远喾N方式施用ADAS細(xì)胞。優(yōu)選的施用模式是血管內(nèi)、腦內(nèi)、非腸道、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、硬膜外、脊柱內(nèi)、腦池內(nèi)(intraste歸l)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑液內(nèi)、鞘內(nèi)、動脈內(nèi)、心臟內(nèi)或肌內(nèi)的。還可將ADAS細(xì)胞與添加劑一起應(yīng)用，以增強(qiáng)、控制或指導(dǎo)想要的治療效果。例如，在一種實(shí)施方式中，可使用抗體介導(dǎo)的陽性和/或陰性細(xì)胞選擇來進(jìn)一步純化細(xì)胞，所述選擇用于富集細(xì)胞群，以增加療效、降低發(fā)病率或者協(xié)助流程容易進(jìn)行。類似地，可將細(xì)胞與生物相容性基質(zhì)(matrix)—起應(yīng)用，所述基質(zhì)能通過支持和/或指導(dǎo)植入細(xì)胞的命運(yùn)來協(xié)助體外組織工程。在向患者施用ADAS細(xì)胞之前，可使用質(zhì)粒、病毒或其它替代性載體策略，用感興趣的核酸對細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定或瞬時(shí)的轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)?？稍谶z傳操作之后再施用細(xì)胞，使得它們表達(dá)用來促進(jìn)細(xì)胞提供的治療性應(yīng)答的基因產(chǎn)物。ADAS細(xì)月包用于治療疾病、病癥或癥〗矣(condition)的用途提供了額外的優(yōu)點(diǎn)一—可將ADAS細(xì)胞引入接受者而無需免疫抑制劑。人們相信，細(xì)胞的成功移植需要供體細(xì)胞永久移植進(jìn)去，并且不誘導(dǎo)接受者產(chǎn)生的移植物排斥免疫應(yīng)答。典型地，為了預(yù)防宿主排斥應(yīng)答，使用非特異性的免疫抑制劑，例如環(huán)孢菌素、甲氨蝶呤、類固醇和FK506。這些藥劑每日施用，如果停止施用，通常會導(dǎo)致移植物排斥。但是，使用非特異性免疫抑制劑的不想被看到的后果在于，它們通過抑制所有方面的免疫應(yīng)答來發(fā)揮功能(廣譜免疫抑制)，由此大大增加了接受者對于感染和其它疾病的易感性。本發(fā)明提供了通過向接受者引入ADAS細(xì)胞或經(jīng)分化的ADAS細(xì)胞來治療疾病、病癥或癥候的方法，該方法無需免疫抑制劑。本發(fā)明包括向接受者施用同種異體或異種ADAS細(xì)胞，或者與接受者遺傳上全異的ADAS細(xì)胞，以向接受者提供益處。本發(fā)明提供了使用ADAS細(xì)胞或經(jīng)分化的ADAS細(xì)胞來治療疾病、病癥或癥候的方法，該方法無需在向接受者施用細(xì)胞時(shí)使用免疫抑制劑。因此，移植的ADAS細(xì)胞或經(jīng)分化的ADAS細(xì)胞的接受者招致感染或其它疾病(包括與免疫抑制療法相關(guān)聯(lián)的癌癥相關(guān)癥候)的易感性降低。下述實(shí)施方式將進(jìn)一步闡述本發(fā)明的多個(gè)方面。但是，它們并非是以任何方式對本文示出的本發(fā)明的公開內(nèi)容或教導(dǎo)的限制。實(shí)施例現(xiàn)在將參照下述實(shí)施例來描述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅是作為闡述目的提供的，本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例，其還包括根據(jù)本文提供的教導(dǎo)顯而易見的所有變化。使用基于流式細(xì)胞術(shù)的檢測，進(jìn)行了下述實(shí)驗(yàn)，以定義人的得自脂肪的細(xì)胞(包括人SVF細(xì)胞和ADAS細(xì)胞)在多個(gè)分離、純化和擴(kuò)增階段的免疫表型。此外，在體外混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中，對人的得自脂肪的細(xì)胞(包括人SVF細(xì)胞和ADAS細(xì)胞)的免疫原性進(jìn)行了檢測。本文公開的結(jié)果顯示，ADAS細(xì)胞的同種異體移植作為用于細(xì)胞和/或基因療法的手段是可行的。本文公開的結(jié)果表明，通過對ADAS細(xì)胞的分離和擴(kuò)增選出了相對于最初的SVF來說相對同質(zhì)的細(xì)胞群。體外MLR檢測顯示，將同種異體ADAS細(xì)胞移植進(jìn)宿主，提供作為醫(yī)師和患者可在醫(yī)護(hù)地點(diǎn)獲得的"現(xiàn)成"產(chǎn)品的成體干細(xì)胞的臨床用途是可行的。實(shí)施例1:人的得自脂肪的細(xì)胞的免疫表型基質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物隨時(shí)間的改變脂肪組織代表著豐富并且可獲得的、用于組織工程應(yīng)用的多能成體干細(xì)胞的來源。但是，并非所有實(shí)驗(yàn)室都使用處于等同的分離和傳代階段的細(xì)胞。考慮到一些研究者使用新鮮分離的基質(zhì)血管級分(SVF)細(xì)胞用于組織工程目的，因此進(jìn)行本文提供的實(shí)驗(yàn)，以比較作為粘著性和世代函數(shù)的、人的得自脂肪的細(xì)胞(包括人SVF細(xì)胞和ADAS細(xì)胞)的免疫表型。將新鮮分離的得自人脂肪組織的基質(zhì)血管級分細(xì)胞(SVF)的免疫表型與經(jīng)過順序傳代的ADAS細(xì)胞相比。最初的SVF含有頻度為1:30的菌落形成單位-成纖維細(xì)胞(CFU-F)。菌落形成單位-脂肪細(xì)胞(CFU-Ad)和菌落形成單位-成骨細(xì)胞(CFU-0b)在SVF中以相當(dāng)?shù)念l度存在(分別為1:40和1:12)。基于流式細(xì)胞術(shù)的ADAS細(xì)胞免疫表型隨著粘著性和傳代逐漸改變。例如，在SVF上，基質(zhì)細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記(CD13、CD29、CD44、CD63、CD73、CD90、CD166)最初很低，但其隨著連續(xù)傳代顯著增加。千細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記CD34在SVF和/或早代ADAS細(xì)胞中處于峰水平，在整個(gè)培養(yǎng)期間都保持存在，雖然水平有所降低。我們觀察到，SVF和ADAS細(xì)胞以可探測到的水平表達(dá)醛脫氫酶(ALDH)和多藥抗性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABCG2)這二者均是被用于鑒定和表征造血干細(xì)胞的。SVF表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物(CD31、CD144或VE-鈣粘素、VEGF受體2、vonWillebrand因子)，但該標(biāo)記物不隨順序傳代顯著改變。因此，在補(bǔ)充有胎牛血清的培養(yǎng)基中，通過人ADAS細(xì)胞對塑料的粘著性和隨后的擴(kuò)增選出了相對同質(zhì)的細(xì)胞群，其中富集表達(dá)"基質(zhì)"免疫表型的細(xì)胞，這是較之粗制基質(zhì)血管級分的異質(zhì)性而言的?，F(xiàn)在描述本文公開的的實(shí)驗(yàn)中使用的材料和方法。ADAS細(xì)胞分離和擴(kuò)增從在當(dāng)?shù)卣瓮饪茩C(jī)構(gòu)經(jīng)歷選擇流程的男性和女性受試者獲得來自皮下脂肪組織位點(diǎn)的抽脂術(shù)吸取物。用經(jīng)磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)對組織洗3-4次，將其懸浮于預(yù)熱至371C的等體積PBS(補(bǔ)充有1%牛血清和0.1%I型膠原酶)中。將組織放置于37C的振蕩水浴中，在持續(xù)攪動下水浴60分鐘，再在室溫下以300-500Xg離心5分鐘。吸取出含有成熟脂肪細(xì)胞的上清液。沉淀團(tuán)塊被確定為基質(zhì)血管級分(SVF)。將部分SVF重新懸浮于冷凍貯存培養(yǎng)基(10。/。二甲亞砜、10%DMEM/F12Ham's、80%胎牛血清)中，于-80。C在外有乙醇套管的封閉容器中冷凍，隨后貯藏于液氮中。在本文公開的菌落形成單位檢測中使用部分SVF。將剩余的SVF細(xì)胞懸浮于基質(zhì)培養(yǎng)基(DMEM/F12Ham's、10%胎牛血清(Hyclone,Logan，UT)、100U青霉素/100jag鏈霉素/0.25jLig兩性霉素B)中，并以0.156ml組織消化物/平方cm表面積的密度立即在T225瓶中涂布，用于擴(kuò)增和培養(yǎng)。初級細(xì)胞培養(yǎng)物的最初代被稱為"第0代"(P0)。在37C于5°/。C02下溫育最初的48小時(shí)后，用PBS洗培養(yǎng)物，將培養(yǎng)物保持在基質(zhì)培養(yǎng)基中，直到它們達(dá)到75-90%匯合(大約培養(yǎng)6天)。通過胰蛋白酶(0.05%)消化對細(xì)胞進(jìn)行傳代，將其以5，000個(gè)細(xì)胞/cn^的密度涂布("第l代")。和數(shù)量。達(dá)到、75^90%的密度后(i^養(yǎng)大約6天)，重復(fù)進(jìn)'行細(xì)胞傳代，直到第4代。脂肪發(fā)生通過用脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基(包含DMEM/F-12，具有3%FBS，33pM生物素，17jaM泛酸鹽，1/aM牛胰島素，1juM地塞米松，0.25raM異丁基甲基黃嘌呤(IBMX)，5pM羅格列酮和100U青霉素/100pg鏈霉素/0.25jug兩性霉素B)替換基質(zhì)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)初級ADAS細(xì)胞的匯合培養(yǎng)物經(jīng)歷脂肪發(fā)生。三天后，將培養(yǎng)基換為脂肪細(xì)胞保持培養(yǎng)基，除了缺少IBMX和羅格列酮之外其與誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同。將細(xì)胞在培養(yǎng)物中保持多達(dá)9天，每三天替換90%的保持培養(yǎng)基。用PBS潤洗培養(yǎng)物，在福爾馬林溶液中固定，通過用油紅O進(jìn)行中性脂類染色來測定脂肪細(xì)胞分化。骨發(fā)生通過用骨發(fā)生誘導(dǎo)培養(yǎng)基(包含DMEM/F-12Ham's，具有10%FBS，lOmMp-甘油磷酸，50yg/ml2-磷酸抗壞血酸鈉，100U青霉素/100>ig鏈霉素/0.25jig兩性霉素B)替換基質(zhì)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)初級ADAS細(xì)胞的匯合培養(yǎng)物經(jīng)歷骨發(fā)生。在多至三周的一段時(shí)間內(nèi)，每3-4天向培養(yǎng)基中補(bǔ)加新鮮的骨發(fā)生誘導(dǎo)培養(yǎng)基。在0.9%NaCl中潤洗培養(yǎng)物，在70%乙醇中固定，通過用萏素紅針對磷酸鉤染色來測定骨發(fā)生分化。菌落形成單位(CFU)檢測采用如下假設(shè)祖細(xì)胞數(shù)量遵循泊松分布(Bellowsetal.1989Dev.Biol.133:8-13)，通過有限稀釋檢測來確定菌落形成單位的頻度。用等同于25ml抽脂術(shù)組織吸取物的一部分SVF來進(jìn)行有限稀釋檢測，以確定CFUs的頻度。將SVF團(tuán)塊懸浮于補(bǔ)充有1。/。BSA的20mlPBS中，濾經(jīng)經(jīng)高壓滅菌的金屬篩，以除去大的組織片段。將400ial的一部分細(xì)胞懸浮液移到2ml離心管中，于室溫在3,000rpm離心3分鐘，然后將沉淀團(tuán)塊重新懸浮于400|i1的紅細(xì)胞裂解緩沖液(Sigma，St.Louis，M0)中。5分鐘的裂解期后，將體積為20ja1的裂解物與等體積的臺盼藍(lán)混合，通過血球計(jì)計(jì)數(shù)來確定有核細(xì)胞的數(shù)量。于室溫以300Xg對剩余的SVF細(xì)胞離心5分鐘，將得到的沉淀團(tuán)塊以每ml2X105個(gè)細(xì)胞的終濃度重新懸浮于基質(zhì)培養(yǎng)基中。按照每孔100pi基質(zhì)培養(yǎng)基制備四塊96孔板。沿著每塊板的12條柱對SVF細(xì)胞懸浮液進(jìn)行順序兩倍稀釋，得到含有從每孔大約104至4個(gè)細(xì)胞的柱。在371C、5%0)2下對96孔板進(jìn)行9天溫育。此時(shí)，用四塊板中的一塊進(jìn)行CFU-成纖維細(xì)胞(CFU-F)檢測。用PBS潤洗該板，在福爾馬林中固定，用福爾馬林沖的0.ly。曱苯胺藍(lán)染色20分鐘，用水潤洗，針對每種細(xì)胞濃度測定陰性孔數(shù)量(即，不含>20個(gè)曱苯胺藍(lán)+細(xì)胞的菌落的那些)。按照下述公式用該數(shù)據(jù)來確定CFU-F的數(shù)，公式為F。-e和u=-InF。，其中F。是沒有菌落的孔的分?jǐn)?shù)(fraction),u是每孔中前體的平均數(shù)。由此，當(dāng)沒有菌落的孔的分?jǐn)?shù)為"0.37"時(shí)，每孔前體細(xì)胞的平均數(shù)就為"1"。用第二塊板進(jìn)行CFU-堿性磷酸酶(CFU-ALP)檢測。用PBS潤洗該板，在100%乙醇中固定，在存在包含36mM偏硼酸鈉、0.46mM5-溴-4-氯-3-羥基吲哚磷酸、1.2mM氮藍(lán)四唑和8.3mM硫酸鎂的溶液(pH9.3)中溫育1小時(shí)，用水潤洗，針對每種細(xì)胞濃度測定陰性孔數(shù)量(即，不含>20個(gè)ALP+細(xì)胞的菌落的那些)。按照上式用該數(shù)據(jù)來確定CFU-ALP的數(shù)。按照本文所述，誘導(dǎo)剩下的兩塊96孔板分別經(jīng)歷脂肪發(fā)生和骨發(fā)生。通過在誘導(dǎo)后9天進(jìn)行油紅0染色來測定CFU-脂肪細(xì)胞(CFU-Ad)。通過在誘導(dǎo)后M4天進(jìn)行茜素紅染色來測定CFU-成骨細(xì)胞(CFU-0)。流式細(xì)胞術(shù)在來自SVF的細(xì)胞以及來自0至4代的經(jīng)培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞上進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。針對落入三大類(造血、基質(zhì)和干細(xì)胞)的表型標(biāo)記物以及搭脫氫酶(A固)活性(StemCellTechnologies,Seattle,WA)來對細(xì)胞加以分析。使用綴合的和未綴合的小鼠單克隆來分析細(xì)胞。簡言之，從每個(gè)群獲得大約4-8x106。取1x106個(gè)細(xì)胞用于ALDH分析，取1-2x106個(gè)細(xì)胞用于用未綴合單克隆進(jìn)行的染色。每個(gè)抗體組獲得10，000個(gè)事件，使用CELLQuest查詢軟件(BectonDickinson)在BectonDickinsonFACSCaliber流式細(xì)胞儀上進(jìn)行的ALDH檢測獲得了最少25，000個(gè)事件。使用FlowJo分析軟件(TreeStar)來進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。綴合的單克隆抗體在流洗滌緩沖液(1XDPBS、0.5%BSA和0.1%疊氮化鈉)中對細(xì)胞進(jìn)行一次洗滌，將細(xì)胞重新懸浮于封閉緩沖液(具有25lig/ml小鼠IgG的洗滌緩沖液)中，在冰上孵育10分鐘。每管裝入100jal細(xì)胞懸浮液(大約5x105個(gè)細(xì)胞)等分試樣，加入經(jīng)適當(dāng)標(biāo)記的mAbs,用于三色分析(FITC、PE和APC)。進(jìn)行合適的同種型對照組合，以反映單克隆同種型組合。如無特別指明，針對下述抗原(目錄#)的抗體購自BD-Pharmingen，按照供貨商推薦的量來使用它們CD13PE(#555394)、CD29FITC(Caltag#CD2901)、CD31FITC(Caltag涯CD3101)、CD34PE(#348057)、CD44FITC(CellSciences#852.601.010)、CD49aPE(#559596)、CD63FITC(#557288)、CD73PE(#550257)、CD90FITC(#555595)、CD105PE(Caltag#MHCD10504)、CD144(Chemicon#MAB1989)、CD146PE(#550315)、CD166PE(#559263)、ABCG2FITC(Chemicon#MAB4155F)、VEGFr2(Chemicon腿B1667)和vonWillebrand因子(ChemiconMAB3442)。所有管都在冰上孵育并被遮光保護(hù)30分鐘。在洗滌緩沖液中對細(xì)胞洗一次，將細(xì)胞固定于200ully。低聚曱醛中。未綴合的單克隆抗體按上文所述對細(xì)胞進(jìn)行洗滌，在含有5%山羊血清的洗滌緩沖液中對細(xì)胞進(jìn)行封閉，孵育IO分鐘，分裝為100jil的等分試樣。加入一抗(CD144、抗VEGFR2[KDR]和抗血管性血友病氏因子)(10jJg/ml)，在冰上對細(xì)胞進(jìn)行30分鐘孵育。在洗滌緩沖液中對細(xì)胞洗一次，重新懸浮于不含血清的洗滌緩沖液中。向含有一抗的懸浮液以及"僅含二抗"的對照懸浮液中加入山羊抗小鼠綴合有PE的二抗(5yg/ml)。細(xì)胞在水上孵育并被遮光保護(hù)15分鐘。然后在流洗滌緩沖液中洗細(xì)胞，用1%低聚甲醛固定?，F(xiàn)在將描述這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。細(xì)胞產(chǎn)量通過膠原酶消化和差異離心，對從總共44個(gè)供體獲得的皮下脂肪組織抽脂吸取物進(jìn)行加工。44個(gè)供體的年齡(平均值±S.D;41±10，范圍是18至64)和BMI(平均值±S.D;26.1±4.8，范圍是19.9至39.2)以及性別分布(84%女性；16%男性)與以前的研究中所報(bào)道的相當(dāng)(Austetal.2004Cytotherapy6:7-14;Senetal.2001J.Cell.Biochem.81:312-9)。為評估脂肪組織中祖細(xì)胞的頻度，基質(zhì)血管級分中存在的有核細(xì)胞數(shù)的平均值被測定為對每ml抽脂吸取物組織而言，308,849(表1A)。基于這些計(jì)算，通過有限稀釋檢測在96孔板中建立了CFU檢測，以基于組織化學(xué)染色特征確定針對特定譜系表型的CFU頻度(表2)。培養(yǎng)9天后，含有對甲苯胺藍(lán)或堿性磷酸酶染色陽性細(xì)胞的孔的數(shù)量被分別用于確定CFU-F和CFU-ALP(圖1)。此時(shí)，誘導(dǎo)相同的板經(jīng)歷脂肪發(fā)生或骨發(fā)生。額外的分別9天或>14天后，測定對油紅0(針對中性脂類)染色陽性或茜素紅(針對磷酸鈣)染色陽性的孔的數(shù)量。得到的平均CFU頻度如下所述CFU-F,1:30;CFU-ALP，1:285;CFU-Ad,1:40以及CFU-0b,1:12(表2)。表1A:每ral抽脂吸取物組織的細(xì)胞產(chǎn)量<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>最初的涂布之后，在培養(yǎng)物中對細(xì)胞進(jìn)行平均6天的保持(表1B)，以產(chǎn)生第0代(P0)群。通過胰蛋白酶消化進(jìn)行收獲后，每ml原始抽脂吸取物組織獲得了平均247,401個(gè)粘著P0細(xì)胞(表1B)。這些值與以前的研究相當(dāng)(Austetal.2004Cytotherapy6:7—14)。對細(xì)胞再連續(xù)傳4代，6至7天進(jìn)行一次。在每次傳代期間，細(xì)胞倍增時(shí)間在3.6至4.7天之間(表1B)。表1B:平均細(xì)胞倍增時(shí)間和世代長度<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>免疫表型在每個(gè)純化和傳代階段后冷凍貯存的細(xì)胞上進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析(表3);圖2顯示了代表性的流式細(xì)胞術(shù)直方圖。最初的SVF細(xì)胞含有對于一組內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物來說陽性的細(xì)胞亞組，所述標(biāo)記物包括CD31、CD144(VE-鉀粘素)、VEGF-受體2和血管性血友病因子(vonwillebrandfactor)(表3和圖2)。這些標(biāo)記物的水平直到第4代也沒有顯著改變(P4)。<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>3數(shù)據(jù)表達(dá)n-3個(gè)供體的平均值。承通過Student，st檢驗(yàn)，相對于SVF細(xì)胞，P值<0.05;**通過Student，st檢驗(yàn)，相對于SVF，P值〈一0.01;***通過Student'st檢驗(yàn)，相對于SVF，P值<-0.001。最初的SVF細(xì)胞群中僅一個(gè)亞組表達(dá)基質(zhì)細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記(表3和圖3)。SVF中不到1%表達(dá)活化的淋巴細(xì)胞共有粘著分子(ALCAM,CD166)，而63%的SVF都表達(dá)透明質(zhì)酸鹽受體(CD44);CD29、CD73、CD90和CD105的水平介于這些值之間。隨著連續(xù)的傳代，對于這些標(biāo)記的每種來說，染色陽性細(xì)胞的百分比都有所增加，第4代時(shí)升到69%(CD166)至98%(CD44)之間。最初的SVF含有對于干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物來說呈陽性的細(xì)胞亞群。平均60%的SVF都表達(dá)造血干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物CD34、唾液黏蛋白和L-選擇蛋白配體(Shailubhaietal.,1997Glycobiology7:305-14)。PO群中CD34的水平仍保持為與前述相當(dāng)?shù)乃?，然后其在連續(xù)傳代中顯著降低(圖3)。每個(gè)世代中，CD34+群的大d、一直都比造血細(xì)胞群(基于泛造血標(biāo)記物一一CD45的表達(dá))的大小要高。平均有31%的SVF顯示出有ABCG2——多藥抗體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其負(fù)責(zé)于Hoescht染料的流出，用于鑒定造血干細(xì)胞的側(cè)向散射群(Goodelletal.，1996J.Exp.Med.183:1797-806)。雖然這些水平在PO和Pl世代間增加，在隨后的世代中減少，但是改變相對SVF來說并非統(tǒng)計(jì)上顯著的。高水平的醛脫氫酶(ALDHbr)已被證明為用于鑒定和分離造血干細(xì)胞的新穎標(biāo)記(Stormsetal.，1999Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:9118-23;FalIonetal.，2003Br.J.Haematol.122:99-108;Stormsetal.，2005Blood)?；谑褂脽晒獾孜锏牧魇郊?xì)胞術(shù)分析，得自脂肪的細(xì)胞含有ALDHbr亞群(表3，圖4)。雖然SVF細(xì)胞中ALDH水平較低，但在P0至P4世代之間，ALDHbr的百分比達(dá)到>70%，平均熒光強(qiáng)度為114至306。當(dāng)在培養(yǎng)物中將細(xì)胞保持至多至P9時(shí)，ALDHbrADAS細(xì)胞的百分比降至10%。本文公開的以及來自其它團(tuán)隊(duì)的結(jié)果顯示了塑料粘著性ADAS細(xì)胞在第2代或更晚代的免疫表型(Gronthosetal.2001J.Cell.Physiol.189:54-63;Austetal.2004Cytotherapy6:7-14;Zuketal.2002Mol.Biol.Cell.13:4279-95)。ADAS細(xì)胞展示出類似于得自骨髄的基質(zhì)細(xì)胞或MSC的表面蛋白分布情況(Pittengeretal.1999Science284:143-7)，并且ADAS細(xì)胞可沿著多種i普系途徑分化(Gimbleetal.2003Curr.Top.Dev.Biol.58:137-60)。事實(shí)上，對人ADAS細(xì)胞進(jìn)行的環(huán)克隆分析已顯示，擴(kuò)增至第4代的克隆中〉50。/。能沿著兩種或多種鐠系特異性途徑分化(Gimbleetal.2003Curr，Top.Dev.Biol.58:137-60)。由此，脂肪組織展現(xiàn)為用于潛能再生醫(yī)藥應(yīng)用的成體干細(xì)胞的易獲得的、豐富的替代性來源。使用分離自51名成人受試者的骨髄MSC進(jìn)行的研究確定CFU-F的頻度為大約1:10，000STRO-r細(xì)胞(Stenderupetal.，2001J.BoneMiner.Res.16:1120-9)。鑒于這些作者使用了用STR0-1抗體進(jìn)行的富集步驟，因此這些值比目前針對人脂肪組織報(bào)道的值要小至少三個(gè)數(shù)量級。因此，脂肪組織中CFU-F的豐度遠(yuǎn)高于骨髓的。脂肪組織中CFU-Ad和CFU-0b的頻度與CFU-F的相當(dāng)；但是，CFU-ALP的出現(xiàn)率要低大約1個(gè)數(shù)量級。堿性磷酸酶活性已被用作為骨髓成骨細(xì)胞祖細(xì)胞和Westin-Bainton基質(zhì)細(xì)胞的定義性特征(Friedenstein，1968Clin.Orthop.Relat.Res.59:21-37;Westenetal.，1979J.Exp.Med.150:919-37)。目前的研究測量了培養(yǎng)9天后的堿性磷酸酶活性，但茜素紅染色在額外的14至"天后進(jìn)行。因?yàn)閺?qiáng)烈的堿性磷酸酶染色與多層架構(gòu)的細(xì)胞層相關(guān)(圖1),因此我們相信如果是在延伸培養(yǎng)期評估的話，CFU-ALP的頻度將更接近CFU-F和CFU-Ob。多個(gè)團(tuán)隊(duì)已在分離得自脂肪的細(xì)胞，用于體外和體內(nèi)應(yīng)用；但是，關(guān)于在研究中細(xì)胞群分離和表征的方面，各實(shí)驗(yàn)室之間的一致性并不清楚。近來的研究集中于分離早期的得自脂肪組織的細(xì)胞，集中于早世代數(shù)的SVF或粘著細(xì)胞。這些細(xì)胞展示出針對VEGF受體的標(biāo)記、Flk-l、CD31、VE-釣粘素、血管性血友病氏因子和內(nèi)皮細(xì)胞鐠系相關(guān)的其它標(biāo)記。得自脂肪的SVF細(xì)胞已被用于重構(gòu)經(jīng)過致死性輻照的小鼠的骨髓。SVF群被報(bào)道含有針對巨噬細(xì)胞(以及潛在地，其它造血語系)的祖細(xì)胞。類似地，本文公開內(nèi)容表明，SVF細(xì)胞群包括造血鐠系細(xì)胞，這基于它們對CDll、CD14、CD45和其它標(biāo)記的表達(dá)。但是，它們的表達(dá)隨著逐漸的傳代丟失，這暗示它們不是針對粘著細(xì)胞群的。"干細(xì)胞，，相關(guān)標(biāo)記物(CD34、ABCG2、ALDHbr)的水平在培養(yǎng)的最早階段(0/1世代)達(dá)到其峰水平。本文展示的結(jié)果顯示了線粒體ALDH的存在，這是通過對未分化的和經(jīng)脂肪細(xì)胞分化的人ADAS細(xì)胞進(jìn)行的串聯(lián)質(zhì)鐠蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示的。是ALDHbr的ADAS細(xì)胞的百分比遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過未分化骨髓中探測到的ALDHbr細(xì)胞的百分比，骨髓中其跌落至或低于總細(xì)胞群的1°/"Stormsetal.，1996Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:9118—23;Fallonetal.，2003Br.J.Haematol.122:99-108)。其它團(tuán)隊(duì)已使用了這些相同的"干細(xì)胞"相關(guān)標(biāo)記物中的若干(CD34和ABCG2)與CD31組合，以表征和界定得自脂肪的細(xì)胞群中的內(nèi)皮細(xì)胞祖細(xì)胞(Miranvilleetal.，2004Circulation110:349-55)。如果該小組內(nèi)的抗原或酶標(biāo)記的亞組可以用來以類似于現(xiàn)在用于表征和分離來自骨髄的造血干細(xì)胞的方法排他性地界定得自脂肪組織的干細(xì)胞的話，那么其有待被測定。在分離的最早階段，基質(zhì)血管級分(SVF)的干細(xì)胞展示出低水平的"基質(zhì)，，相關(guān)標(biāo)記物(CD13、CD29、CD44、CD73、C謂、CD105、CD166)。在培養(yǎng)的較晚階段(第3/4世代)，細(xì)胞呈現(xiàn)更為同質(zhì)的情況，它們具有一致高水平的"基質(zhì)，，標(biāo)記?？傮w而言，這種時(shí)間表達(dá)模式類似于針對人得自骨髓的MSC所報(bào)道的情況。在14天體外培養(yǎng)期間，骨髓MSC逐漸增加它們對被鑒定為SH2和SH3的標(biāo)記(分別對應(yīng)于內(nèi)皮因子(endoglin)(CD105)和5'-外核苷酸酶(CD73))的表面表達(dá)。到第4代，"基質(zhì)標(biāo)記"中的五個(gè)(CD13、CD29、CD44、CD73、CD90)都一致存在于>90%的ADAS細(xì)胞群中。額外的"基質(zhì)標(biāo)記物"，例如CD10也可能在顯示該群的同質(zhì)性方面具有價(jià)值。這些發(fā)現(xiàn)與目前在多個(gè)分離和擴(kuò)增階段對得自脂肪的細(xì)胞進(jìn)行的免疫表型分析一致。本實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)被設(shè)計(jì)來基于粘著性特征和免疫表型檢查得自人脂肪組織的細(xì)胞。觀察到，最初分離的基質(zhì)血管級分細(xì)胞是異質(zhì)性的。但是，事實(shí)上僅大約1/30的細(xì)胞粘著，被用于隨后對被稱為得自脂肪的干細(xì)胞的這些細(xì)胞進(jìn)行的擴(kuò)增。基質(zhì)血管級分中脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞祖細(xì)胞的頻度與粘著的細(xì)胞群相當(dāng)。CFU-F、CFU-Ad和CFU-Ob數(shù)據(jù)間的這種緊密聯(lián)系與顯示人脂肪組織中存在雙能或三能克隆細(xì)胞的其它證據(jù)相符(Zuketal.,200213:4279-95)。觀察到，經(jīng)典"基質(zhì)，，細(xì)胞標(biāo)記物(CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166)在最初的基質(zhì)血管級分細(xì)胞中的僅0.8%至54%中存在。而到了晚世代，基質(zhì)標(biāo)記存在于多達(dá)98%的得自脂肪的干細(xì)胞群中。這些表達(dá)上的時(shí)間改變類似于針對人骨髓MSC所報(bào)道的情況。人ADAS細(xì)胞還表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物，例如CD34、ABCG2和醛脫氫酶。因此，本文展現(xiàn)的結(jié)果表明，在得自脂肪的細(xì)胞群中，發(fā)生了顯著的改變，這是對它們進(jìn)行的分離和培養(yǎng)的函數(shù)，暗示了人脂肪組織作為用于再生醫(yī)藥療法的成體干細(xì)胞來源的潛在用途。實(shí)施例2:人得自脂肪的細(xì)胞的免疫原性再生醫(yī)藥技術(shù)需要在醫(yī)護(hù)地點(diǎn)可容易獲得的人成體干細(xì)胞的豐富來源。在不希望被任何理論束縛的情況下，我們相信，同種異體干細(xì)胞可達(dá)到此目的。因?yàn)橹窘M織代表著人細(xì)胞的未使用的(untapped)貯存庫，設(shè)計(jì)了下述實(shí)驗(yàn)，來比較新鮮分離的、人的得自脂肪的基質(zhì)血管級分細(xì)胞(SVF)與經(jīng)傳代ADAS細(xì)胞的比較。本文展現(xiàn)的結(jié)果表明，得自脂肪的細(xì)胞上造血相關(guān)標(biāo)記物(CDlla、CD14、CD45、CD86、HLA-DR)的表達(dá)隨著傳代減少。此外觀察到，在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLRs)中，SVF和早代ADAS細(xì)胞都能刺激同種異體應(yīng)答者T細(xì)胞的增殖。而相反，傳代過Pl世代的ADAS細(xì)胞就不能引發(fā)T細(xì)胞的應(yīng)答。此外還觀察到，晚代ADAS細(xì)胞抑制MLR應(yīng)答。因此，基于免疫表型和免疫原性，通過人得自脂肪的細(xì)胞對塑料的粘著性和隨后的擴(kuò)增，選出了相對同質(zhì)的細(xì)胞群。這些結(jié)果支持了在移植中使用同種異體人ADAS細(xì)胞的可行性。現(xiàn)在描述本文公開的實(shí)驗(yàn)中使用的材料和方法。BMSC細(xì)胞分離和擴(kuò)增在關(guān)于從得自脂肪組織的細(xì)胞(包括但不限于SVF和ADAS細(xì)胞)觀察到的結(jié)果方面，用骨髓基質(zhì)(BMSC)細(xì)胞作為對照用于下述實(shí)驗(yàn)。簡言之，從CambrexBioscience(Walkersvi1le，MD)或AllCells，LLC(Berkeley,CA)購買人骨髄。用肝素收集骨髓吸取物，在1.073g/ml密度梯度上分級分離(LymphocyteSeparationMedium[LSM]，CambrexBioSciences,Walkersvi1le，MD)，將在界面上收集的單核細(xì)胞涂布到含有10%FBS(JRHBiosciences,Lenexa，KS)的Dulbecco's改良Eagles培養(yǎng)基-低葡萄糖(HyQDME/低葡萄糖，HyClone，Logan，UT)上，F(xiàn)BS是基于其支持BMSC擴(kuò)增的能力被選用的。將有核細(xì)胞以每T185-cW瓶30x107個(gè)細(xì)胞的密度涂布。細(xì)胞在初級培養(yǎng)物(P0)中被培養(yǎng)12至17天，每3至4天換一次培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞變得匯合時(shí)，使用0.05%胰蛋白酶(GIBC0，GrandIsland,NY)對培養(yǎng)物進(jìn)行傳代，以除去粘著的細(xì)胞，并作為PI細(xì)胞以每T185-cm2瓶lx106個(gè)細(xì)胞重新涂布。從這個(gè)時(shí)間點(diǎn)開始，每7天對BMSC進(jìn)行一次傳代，每3至4天換一次培養(yǎng)基。在最終收獲時(shí)，用在勃脈力(plasmalyte，BaxterHealthCare，Deerfield，IL)中含有10謹(jǐn)SO(EdwardsLifeSciences,Irvine,CA)和5。/。人血清清蛋白(JRHBiosciences)的冷凍溶液對BMSC進(jìn)行冷凍貯存。經(jīng)擴(kuò)增的BMSC(P2-P4)代表了這樣的同質(zhì)群其外觀上是成纖維性的，造血標(biāo)記(CD45、CD14、CD3、MHCII類抗原)陰性，基質(zhì)標(biāo)記(CD13、CD29、CD44、CD90、CD105)陽性。BMSC在P2和P4時(shí)是多能的，這由它們沿著骨發(fā)生和脂肪發(fā)生語系分化的能力所示。流式細(xì)胞術(shù)按照本文其它地方所述來進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)。除非另有指明，針對下述抗原(目錄#)的抗體購自BD-Pharmingen，按照供貨商推薦的量來使用它們CDllaAPC(#550852)、CD14APC(#555394)、CD40APC(#555591)、CD45FITC(#555482)、CD54APC(#559771)、CD80FITC(Caltag#MHCD8001)、CD86PE(Caltag#MHCD8601)、HLA-ABCAPC(#555555)、HLA-DRAPC(#559868)?；旌狭馨图?xì)胞反應(yīng)(MLR)人淋巴細(xì)胞群通過在LSM密度梯度上對白細(xì)胞減少的(leukopheresed)外周血細(xì)胞(AllCells，LLC)進(jìn)行離心，制備外周血單核細(xì)胞(PBMC)。通過使用磁珠進(jìn)行陰性選擇，從PBMC的一部分中純化出T細(xì)胞。簡言之，用選用來于單核細(xì)胞(抗-CD14;克隆UCHM1)、B細(xì)胞(抗CD19;克隆LT19)、天然殺手細(xì)胞(抗CD56;克隆ERIC-1)和表達(dá)匪C11類抗原的細(xì)胞(抗MHCII類DR;克隆HL-39)結(jié)合的單克隆抗體(mAbs，都來自Serotec，Inc.,Raleigh，NC)的混合物來處理PBMC。將PBMC與包覆有抗小鼠IgG抗體(DynalCorp,LakeSuccess,NY)的磁珠混合。使用磁力除去與珠結(jié)合的細(xì)胞，留下經(jīng)純化的T細(xì)胞的群(使用抗CD3mAb通過流式細(xì)胞術(shù)，〉9(^的T細(xì)胞)。將PBMC和經(jīng)純化的T細(xì)胞都分為等分試樣，在液氮中冷凍貯存。免疫原性檢測用單向MLR檢測來測定得自脂肪的細(xì)胞群的免疫原性。使用補(bǔ)充有丙酮酸鈉、非必要氨基酸、抗生素/抗真菌劑、2-巰基乙醇(所有試劑都來自GIBC0，GrandIsland,NY)和5%人AB血清(Pel-FreezBiologicals，Rogers,AK)的Iscove's改良Dulbecco's培養(yǎng)基(IMDM)，在96孔微滴定板中進(jìn)行MLR。以2x105個(gè)細(xì)胞/供體/孔涂布得自2個(gè)不同供體的經(jīng)純化T細(xì)胞。使用不同供體，使得至少一種T細(xì)胞群與得自脂肪的測試細(xì)胞具有大的錯配的機(jī)會最大化。用于該檢測的刺激細(xì)胞包括自體PBMC(基線應(yīng)答)、同種異體PBMC(陽性對照應(yīng)答)和得自脂肪的細(xì)胞測試群。再以多種數(shù)量(典型地，每孔5000-20,000個(gè)細(xì)胞的范圍內(nèi))加入到培養(yǎng)孔之前，用銫輻照器發(fā)出的5000倫琴的Y輻照來輻照刺激細(xì)胞。額外的對照培養(yǎng)物由涂布于僅培養(yǎng)基(無刺激細(xì)胞)中的T細(xì)胞構(gòu)成。對于每種處理進(jìn)行三份重復(fù)培養(yǎng)。培養(yǎng)物在37。C、5%C02中溫育6天，用出-胸苷(1uCi/孔，AmershamBiosciences,Piscataway，NJ)脈沖16小時(shí),使用Skatron96孑L細(xì)胞收荻器(MolecularDevicesCorp.,Sunnyvale,N"，將細(xì)胞收獲到玻璃纖維過濾墊上。使用閃爍計(jì)數(shù)器(MicrobetaTriluxScintillationandLuminescenceCounter,WallacInc.,Gaithersburg，MD)來測定加入到過濾器上沉積的分裂中T細(xì)胞中的放射活性。在對細(xì)胞群免疫活性的評估中采用三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。它們是l)T細(xì)胞增殖性應(yīng)答(CPM)相對自體PBMC所誘導(dǎo)的而言，統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差異(p〈0.05，Student'st檢驗(yàn))；2)與向自體PBMC誘導(dǎo)的應(yīng)答至少750CPM的差異；以及3)至少3.0的刺激指數(shù)(測試群誘導(dǎo)的CPM除以自體PBMC誘導(dǎo)的CPM)。全部3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)都及格的測試群被認(rèn)為是免疫原性的。抑制檢測用雙向MLR檢測來評估得自脂肪的細(xì)胞群的抑制。簡言之，在96孔微滴定板中，以2x105個(gè)細(xì)胞/供體/孔在完全培養(yǎng)基中混合來自兩個(gè)不同供體的PBMC。將得自脂肪的細(xì)胞以5，000、10，000和20，000個(gè)細(xì)胞/孔加入到MLRs中。對照MLR培養(yǎng)物中沒有加入得自脂肪的細(xì)胞，或者，以用于ADAS細(xì)胞的數(shù)量加入人脾成纖維細(xì)胞(CRL-7433,AmericanTypeCultureCollection,Manassas,VA)。在分析過的成纖維細(xì)胞類型中，脾成纖維細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)具有最小抑制性，其被用于這些實(shí)驗(yàn)，以界定在檢測中適合用來計(jì)算ADAS細(xì)胞導(dǎo)致的抑制的細(xì)胞劑量；即，不介導(dǎo)對對照MLR超過10%的抑制的脾成纖維細(xì)胞的最高劑量。通過下述式子來計(jì)算抑制百分比抑制=(1-[測試+MLRcpm+MLRcpm])x100。使用Student'st檢驗(yàn)來評價(jià)對照和測試培養(yǎng)物之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。下面描述實(shí)驗(yàn)結(jié)果。免疫表型在每個(gè)純化和傳代階段之后，在冷凍貯存的細(xì)胞上進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析(表l,圖5)。最初的SVF和PO細(xì)胞含有看起來是單核細(xì)胞的細(xì)胞亞組，因?yàn)樗鼈儗υ煅獦?biāo)記小組(包括常用的白細(xì)胞抗原CD45、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞標(biāo)記CDlla和CD14、MHCII類DR組織相容性抗原和共激分子，CD86)呈陽性。該群在P1代消失，這是根據(jù)上述標(biāo)記中大多數(shù)的表達(dá)都減少來判斷的。該群中單核細(xì)胞的存在是顯而易見的，因?yàn)檫@些細(xì)胞是免疫原性的，并且能誘導(dǎo)排斥應(yīng)答。其它造血相關(guān)標(biāo)記展示出類似于"基質(zhì)細(xì)胞"相關(guān)標(biāo)記的趨勢。CD40、CD54(ICAM-1)和匪CI類ABC組織相容性抗原的表面水平在SVF和P3ADAS細(xì)胞群之間顯著增加(表4)。改變的范圍在從CD40的1.3°/。至66%到HLA-ABC的67%至92%之間變動。高水平的I類抗原表達(dá)和中等至高水平的共激活性相關(guān)分子(CD40、CD54、CD80)結(jié)合起來暗示，這些細(xì)胞可能在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中作為抗原呈遞細(xì)胞發(fā)揮作用。按照下文所述對此進(jìn)行了研究。表4:人得自脂肪的細(xì)胞在分離和傳代的進(jìn)展階段的表型特征1<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>2數(shù)據(jù)表達(dá)n=4個(gè)供體的平均值。*通過Student，st檢驗(yàn)，相對于SVF細(xì)i包，P值<0.05;**通過Student，st檢驗(yàn)，相對于SVF，P值<0.01;***通過Student，st檢驗(yàn)，相對于SVF，P值<0.001。免疫原性用單向MLR檢測來評估人得自脂肪的細(xì)胞(包括人SVF細(xì)胞和ADAS細(xì)胞)的免疫原性。T細(xì)胞的增殖基于存在劑量逐漸增加的經(jīng)輻照刺激細(xì)胞的情況下3H-胞苷的并入來測量。自體和同種異體PBMC分別用作為陰性和陽性刺激細(xì)胞對照。觀察到，人SVF細(xì)胞引發(fā)了與同種異體PBMC相當(dāng)?shù)膭┝恳蕾囆訫LR應(yīng)答(圖6)。隨著逐漸傳代，ADAS細(xì)胞引發(fā)的應(yīng)答減少，其在Pl跌至與自體PBMC觀察到的水平相當(dāng)?shù)乃?。?顯示了來自多個(gè)供體的、得自脂肪的細(xì)胞(包括人SVF細(xì)胞和ADAS細(xì)胞)群的免疫原性。免疫原性的陽性和陰性判定基于本文其它地方描述的標(biāo)準(zhǔn)，其顯示為每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中最高的細(xì)胞劑量，這在20，000個(gè)細(xì)胞/孔(供體902-917)至30，000個(gè)細(xì)胞/孔(供體407-611)的范圍內(nèi)?；谝粋€(gè)或兩個(gè)T細(xì)胞群的陽性應(yīng)答，下述群是具有免疫原性的SVF細(xì)胞(4/7個(gè)供體)、P0細(xì)胞(7/9個(gè)供體)和Pl細(xì)胞(4/7個(gè)供體)。除了來自一個(gè)供體的P2細(xì)胞之外，其余經(jīng)傳代的細(xì)胞群(P2-P4)沒有在MLR檢測中誘導(dǎo)出T細(xì)胞增殖。表5:在針對得自兩個(gè)不同供體的T細(xì)胞的MLR檢測中評估的得自脂肪的細(xì)胞群的免疫活性<table>complextableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>+=免疫原性(滿足"方法，，中描述的全部3個(gè)標(biāo)準(zhǔn))-=非免疫原性("方法"中描述的3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中>1個(gè)不滿足)ND=未做免疫抑制在不希望被任何理論束縛的情況下，我們相信，經(jīng)傳代AMS細(xì)胞不能刺激T細(xì)胞應(yīng)答可能是由于內(nèi)在的低免疫原性，由于ADAS細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制機(jī)制或者由于這兩種性質(zhì)的組合。為確定得自脂肪的細(xì)胞是否是免疫抑制性的，將它們以5000、10,000或20，000個(gè)細(xì)胞/孔加入到MLR培養(yǎng)物中。對照MLR培養(yǎng)物沒有加入的細(xì)胞，或者以本文其它地方描述的數(shù)量加入無抑制性的人脾成纖維細(xì)胞，以對由于細(xì)胞擁擠導(dǎo)致的抑制作出對照。如圖7所示，脾成纖維細(xì)胞僅在最高劑量(20,000個(gè)細(xì)胞/孔)才抑制MLR培養(yǎng)物。使用較低的兩個(gè)劑量作為有效數(shù)據(jù)(無人工抑制)，除了SVF群之外，所有ADAS細(xì)胞世代都介導(dǎo)了顯著的抑制。P0-P4ADAS細(xì)胞介導(dǎo)的對對照MLR應(yīng)答(無細(xì)胞加入)的百分比抑制在33-63%的范圍內(nèi)。這是從表6中4個(gè)供體得到的。在最低的細(xì)胞劑量(5000個(gè)細(xì)胞/孔)下測定百分比抑制，因?yàn)樵谌魏芜@些實(shí)驗(yàn)中，脾成纖維細(xì)胞處于該劑量下時(shí)對MLR都沒有任何抑制。SVF群的平均抑制最小(10%),而P0-P4細(xì)胞的抑制平均為32.0+3.2%。鑒于這些培養(yǎng)物中ADAS細(xì)胞的百分比較低(1.3%)，因此該抑制程度是顯著的。將ADAS細(xì)胞的抑制性質(zhì)與BMSC的相比是令人感興趣的，因?yàn)锽MSC具有與ADAS細(xì)胞類似的表型特征和分化潛能(Gimbleetal.，2003CurrTopDevBiol58:137-60)。以3300-10，000個(gè)細(xì)胞/孔的劑量加入時(shí)，兩種細(xì)胞類型均抑制MLR(圖8)。ADAS細(xì)胞的抑制量超過BMSCs多達(dá)13%。表6:來自四個(gè)不同供體的得自脂肪的細(xì)胞群對MLR培養(yǎng)物的百分比抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>*該值沒有包括在平均值中，因?yàn)榇婊盍μ?<50%)。隨時(shí)間的改變本文展現(xiàn)的結(jié)果表明，新鮮分離的SVF細(xì)胞能在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中引發(fā)與同種異體外周血單核細(xì)胞等同的T細(xì)胞增殖應(yīng)答。這種免疫原性應(yīng)答在早代(PO、PI)ADAS細(xì)胞中降低，對于較晚代的ADAS細(xì)胞(P2-P4)來說基本消失。在關(guān)于同種異體反應(yīng)性的內(nèi)容中，細(xì)胞群的免疫原性主要通過群中抗原呈遞細(xì)胞(APCs)的存在來測定。經(jīng)典的APC是造血細(xì)胞，典型地，樹突細(xì)胞或巨噬細(xì)胞，其除了表達(dá)共激分子(例如CD80和CD86)之外還表達(dá)MHCI類分子和MHCII類分子。值得注意，SVF和得自脂肪的細(xì)胞的PO(被發(fā)現(xiàn)具有免疫原性的)含有很像單核細(xì)胞的APC細(xì)胞亞群(對于CD45、CDlla、CD14、CD86和MHCII類抗原陽性)，而不含單核細(xì)胞的Pl-P4群通常則非免疫原性的。在不希望被任何理論束縛的情況下，我們相信，ADAS細(xì)胞可能可以自身作為APCs來作用，因?yàn)樗鼈儽磉_(dá)同種異體抗原(MHCI類抗原)和能展示出共激活性的大量細(xì)胞表面分子(包括CD54、CD40、CD80和CD86)。有趣的是，ADAS細(xì)胞對這些分子中的大多數(shù)的表達(dá)直到至少P4，暗示這些蛋白并不足以賦予ADAS細(xì)胞APC的功能，或者，其它機(jī)制，例如主動免疫抑制可能壓制(override)免疫原性。在該研究中，已經(jīng)顯示，ADAS細(xì)胞再M(fèi)LR中顯著抑制了T細(xì)胞增殖。該性質(zhì)在P0-P4細(xì)胞中有(平均32%的抑制)，但在SVF群中沒有(平均10%的抑制)。為避免人工干擾結(jié)果，即，由于細(xì)胞擁擠導(dǎo)致的抑制，在非常高比例的MLR中應(yīng)答細(xì)胞對測試細(xì)胞(80:1)下進(jìn)行抑制實(shí)驗(yàn)。對照用的脾成纖維細(xì)胞在該比例下沒有抑制性。將ADAS細(xì)胞導(dǎo)致的抑制與BMSC相比，因?yàn)檫@兩種細(xì)胞類型具有相似的表型和功能特征，BMSC已顯示為免疫抑制性的，因?yàn)樗鼈兙哂性贛LR檢測中抑制T細(xì)胞增殖的能力以及促有絲分裂刺激的能力。事實(shí)上確實(shí)觀察到了ADAS細(xì)胞和BMSC展示出相似的抑制量級。本文展現(xiàn)的結(jié)果驗(yàn)證和擴(kuò)展了Puissantetal.，(2005Br.J.Haematol.129:118-29)近來所報(bào)道的。BMSC已被報(bào)道為能制造抑制性分子，包括肝細(xì)胞生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子beta、前列腺素和吲哚胺-2，3-加雙氧酶。已經(jīng)提供了若干種不同機(jī)制，用于解釋BMSC介導(dǎo)的對淋巴細(xì)胞增殖的抑制。這些包括通過抑制細(xì)胞周期蛋白D2的表達(dá)，使得被活化的T細(xì)胞和B細(xì)胞的分裂受阻，調(diào)控性T細(xì)胞或APCs的引入以及對樹突細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞成熟的干擾。在不希望被任何理論束縛的情況下，我們相信，ADAS細(xì)胞介導(dǎo)的抑制可能具有與BMSC相似的機(jī)制。本文展現(xiàn)的免疫學(xué)數(shù)據(jù)顯示，經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)增的得自脂肪的細(xì)胞不會刺激同種異體反應(yīng)性的T細(xì)胞增殖，相反，其會主動抑制這種增殖，這表明，這些細(xì)胞可以越過經(jīng)典的組織相容性障礙被移植。BMSC已被報(bào)道能在具有免疫活性的同種異體和異種接受者中存活得比預(yù)計(jì)時(shí)間更長。由于SVF群的免疫原性本質(zhì)，有可能SVF細(xì)胞的抑制將僅限于自體應(yīng)用，雖然對移植物操作除去單核細(xì)胞可能降低該群的免疫原性。但是，在關(guān)于用于臨床實(shí)踐的成體干細(xì)胞的易于獲得性，以及其生產(chǎn)及品質(zhì)保證的實(shí)踐及商業(yè)方面，使用同種異體ADAS細(xì)胞作為用于組織修復(fù)或替換的細(xì)胞的來源具有重要意義。本文展現(xiàn)的結(jié)果顯示，得自人脂肪組織的細(xì)胞的特征作為體外粘著性和擴(kuò)增的函數(shù)改變。通過膠原酶消化和差異離心分離的基質(zhì)血管級分細(xì)胞在關(guān)于經(jīng)典造血標(biāo)記表達(dá)的方面是異質(zhì)的。這些最初的細(xì)胞中有8.1%至17.6%表達(dá)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和pan-造血抗原CDlla、CD14、CD45、CD86和HLA-DR。四次連續(xù)傳代后，粘著的得自脂肪的干細(xì)胞中僅不到1。/。表達(dá)CD14、CD45或CD86,而僅有3%或更少的細(xì)胞表達(dá)CDlla或HLA-DR。這些免疫表型改變與混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中人得自脂肪多細(xì)胞所展示的免疫原性水平相關(guān)。雖然基質(zhì)血管級分細(xì)胞和早代得自脂肪的干細(xì)胞(P0/P1)會引發(fā)來自同種異體T細(xì)胞的增殖應(yīng)答，但晚代細(xì)胞則不會這樣。事實(shí)上，向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中加入得自脂肪的干細(xì)胞抑制了T細(xì)胞對同種異體刺激細(xì)胞的增殖性應(yīng)答。本文展現(xiàn)的結(jié)果表明，可以越過傳統(tǒng)的組織相容性障礙來移植得自脂肪的干細(xì)胞。實(shí)施例3:對ADAS細(xì)胞的選擇本文公開內(nèi)容顯示，ADAS細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記，所述標(biāo)記包括但不限于人多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABCG2)和醛脫氫酶(ALDH)。關(guān)于ALDH的方面，ALDH是可用來選擇ADAS細(xì)胞的胞內(nèi)酶。在不希望被任何理論束縛的情況下，我們相信，可向ADAS細(xì)胞提供可切割底物，其中，當(dāng)?shù)孜锎嬖谟贏LDH+ADAS細(xì)胞中時(shí)，其可被切割，導(dǎo)致經(jīng)切割的底物發(fā)出ADLH+ADAS細(xì)胞存在的信號。此類信號可以是熒光形式的，其可用于分選ALDH+ADAS細(xì)胞。本文引用的每份和所有專利、專利申請和公開文本的公開內(nèi)容都通過引用整體并入本文。雖然本發(fā)明的公開參照了一些實(shí)施方式，但是顯而易見地，在不偏離本發(fā)明的真正精神和范圍的情況下，本領(lǐng)域其它技術(shù)人員可想出其它實(shí)施方式和變化。所附的權(quán)利要求將被解釋為包括所有此類實(shí)施方式和等同變化。權(quán)利要求1.經(jīng)分離的、得自脂肪組織的成體基質(zhì)(ADAS)細(xì)胞，其展示出非免疫原性特征，其中，所述細(xì)胞被傳代多達(dá)至少第二代，此外，其中，所述細(xì)胞表達(dá)選自人多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABCG2)和醛脫氫酶(ALDH)的干細(xì)胞相關(guān)特征。2.權(quán)利要求l的細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞被傳代多達(dá)至少第十六代。3.權(quán)利要求l的細(xì)胞，其中，外源性遺傳物質(zhì)被導(dǎo)入所述細(xì)胞。4.權(quán)利要求l的細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞得自人。5.權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞對其接受者來說是同種異體的。6.權(quán)利要求l的細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞對其接受者來說是異種的。7.用于治療移植體接受者，以在所述接受者中降低效應(yīng)器細(xì)胞針對同種異體抗原的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括以有效降低效應(yīng)器細(xì)胞對同種異體抗原的免疫應(yīng)答的量，向移植體接受者施用展示出非免疫原性特征的、經(jīng)分離的、得自脂肪組織的成體基質(zhì)(ADAS)細(xì)胞，其中，所述ADAS細(xì)胞已被傳代多達(dá)至少第二代，進(jìn)一步地，其中所述ADAS細(xì)胞表達(dá)選自人多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABCG2)和醛脫氫酶(ALDH)的干細(xì)胞相關(guān)特征，由此在所述移植體接受者中，所述效應(yīng)器細(xì)胞具有降低的針對所述同種異體抗原的免疫應(yīng)答。8.權(quán)利要求7的方法，其中，所述效應(yīng)器細(xì)胞是T細(xì)胞。9.權(quán)利要求8的方法，其中，所述T細(xì)胞來自供體，所述同種異體抗原來自接受者。10.權(quán)利要求8的方法，其中，所述T細(xì)胞來自接受者，所述同種異體抗原來自供體。11.權(quán)利要求8的方法，其中，所述T細(xì)胞存在于所述移植體中。12.權(quán)利要求7的方法，其中，所述效應(yīng)器細(xì)胞是在向接受者施用所述ADAS細(xì)胞之前被活化的T細(xì)胞，并且進(jìn)一步地，其中所述免疫應(yīng)答是來自所述供體的T細(xì)胞的再次活化。13.權(quán)利要求7的方法，其中，向所述移植體接受者施用所述ADAS細(xì)胞，以治療所述接受者對于所述移植體的排斥。14.權(quán)利要求7的方法，其中，所述ADAS細(xì)胞得自哺乳動物。15.權(quán)利要求14的方法，其中，所述哺乳動物是人。16.權(quán)利要求7的方法，還包括向所述接受者施用免疫抑制劑。17.權(quán)利要求7的方法，其中，所述ADAS細(xì)胞在所述移植體之前施用給所述接受者。18.權(quán)利要求7的方法，其中，將所迷ADAS細(xì)胞與所述移植體同時(shí)施用給所述接受者。19.權(quán)利要求7的方法，其中，所述ADAS細(xì)胞作為所述移植體的一部分施用。20.權(quán)利要求7的方法，其中，在進(jìn)行所述移植體的所述移植后，將所述ADAS細(xì)胞施用給所述接受者。21.權(quán)利要求7的方法，其中，向所述接受者靜脈內(nèi)施用所述ADAS細(xì)胞。22.權(quán)利要求7的方法，其中，所述效應(yīng)器細(xì)胞是所述供體移植體的所述接受者的細(xì)胞。23.權(quán)利要求7的方法，其中，所述ADAS細(xì)胞經(jīng)過遺傳修飾。24.降低效應(yīng)器細(xì)胞針對同種異體抗原的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括將效應(yīng)器細(xì)胞與展示出非免疫原性特征的、經(jīng)分離的、得自脂肪組織的成體基質(zhì)(ADAS)細(xì)胞接觸，其中，所述ADAS細(xì)胞已被傳代多達(dá)至少第二代，進(jìn)一步地，其中，所述ADAS細(xì)胞表達(dá)選自人多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABCG2)和醛脫氬酶(ALDH)的干細(xì)胞相關(guān)特征，所述ADAS細(xì)胞是以有效降低所述效應(yīng)器細(xì)胞對所述同種異體抗原的免疫應(yīng)答的量施用。25.權(quán)利要求24的方法，其中，所述效應(yīng)器細(xì)胞是T細(xì)胞26.從得自脂肪組織的細(xì)胞群分離得自脂肪組織的基質(zhì)(ADAS)細(xì)胞的方法，所述方法包括提供特異于ABCG2的抗體；在適于形成抗體-得自脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞復(fù)合體的條件下，將所述得自脂肪的細(xì)胞群與所述抗體接觸；以及將所述抗體-得自脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞復(fù)合體與所述得自脂肪的細(xì)胞群充分分開；由此分離出所述得自脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞。27.權(quán)利要求26的方法，其中，所述抗體與物理支持物綴合。28.權(quán)利要求27的方法，其中，所述物理支持物選自微珠、磁珠、包衣表面、用于密度離心的密致顆粒、吸附柱和吸附膜。29.權(quán)利要求27的方法，其中，所述物理支持物選自鏈親和素珠和生物素珠。30.權(quán)利要求26的方法，其中，使用選自焚光活化細(xì)胞分選(FACS)和磁性活化細(xì)胞分選(MACS)的方法，將所述抗體-得自脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞復(fù)合體與所述得自脂肪的細(xì)胞群充分分開。31.從得自脂肪組織的細(xì)胞群富集得自脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞的方法，所述方法包括提供特異于ABCG2的抗體；在適于形成抗體-得自脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞復(fù)合體的條件下，將所述得自脂肪的細(xì)胞群與所述抗體接觸；以及將所述抗體-得自脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞復(fù)合體與所述得自脂肪的細(xì)胞群充分分開；由此分離出所述得自脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞。32.權(quán)利要求31的方法，其中，所述抗體與物理支持物綴合。33.權(quán)利要求32的方法，其中，所述物理支持物選自微珠、磁珠、包衣表面、用于密度離心的密致顆粒、吸附柱和吸附膜。34.權(quán)利要求32的方法，其中，所述物理支持物選自鏈親和素珠和生物素珠。35.權(quán)利要求31的方法，其中，使用選自熒光活化細(xì)胞分選(FACS)和磁性活化細(xì)胞分選(MACS)的方法，將所述抗體-得自脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞復(fù)合體與所述得自脂肪的細(xì)胞群充分分開。36.—種用于從得自脂肪組織的細(xì)胞群鑒定出對ALDH陽性的得自脂肪組織的基質(zhì)(ADAS)細(xì)胞的方法，所述方法包括向所述細(xì)胞群提供特異于ALDH的可切割底物，其中，當(dāng)存在于ALDH+細(xì)胞中時(shí)所述底物被切割，進(jìn)一步地，其中，所述被切割的底物釋放出熒光，由此鑒定出ALDH+ADAS細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明包括用于產(chǎn)生經(jīng)分離的、得自脂肪組織的下述基質(zhì)細(xì)胞的組合物和方法，所述基質(zhì)細(xì)胞展示出低水平的免疫原性。本發(fā)明包括用于降低與移植相關(guān)的免疫應(yīng)答的組合物和方法，這是通過向接受者施用一定量的得自脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)的，所述的量能有效降低或抑制宿主排斥或者移植物抗宿主病。文檔編號A61K35/12GK101374945SQ200680029985公開日2009年2月25日申請日期2006年7月14日優(yōu)先權(quán)日2005年7月15日發(fā)明者J·B·米切爾二世,J·M·金貝爾,K·R·麥辛托什申請人:同源治療學(xué)公司;路易斯安那州州立大學(xué)及農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)院管理委員會