專利名稱：：用于制備包含TNFα和載體蛋白質(zhì)的抗原雜絡(luò)物的穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及包含TNFa和載體蛋白質(zhì)的抗原雜絡(luò)物的穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品，及其制備方法，所述免疫原產(chǎn)品用于在哺乳動(dòng)物中獲得體液免疫應(yīng)答，產(chǎn)生中和TNFa的生物活性的抗體。所述穩(wěn)、定的免疫原產(chǎn)品也可以稱之為抗-TNFa免疫原產(chǎn)品或者也可稱之為用于誘導(dǎo)抗-TNFa抗體的免疫原產(chǎn)品。本發(fā)明還涉及包含所述穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品的疫苗組合物及其制備方法，所述疫苗組合物包含TNFa和載體蛋白質(zhì)的抗原雜絡(luò)物。
背景技術(shù)：
：用于制備包含抗原雜絡(luò)物的穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品的通用方法，該抗原雜絡(luò)物包含一種或更多的目的抗原蛋白質(zhì)以及至少一種在以NEOVACS名義發(fā)表于申請(qǐng)?zhí)朩O2004/024189的PCT申請(qǐng)書中已有描述的載體蛋白質(zhì)。值得注意的是，該P(yáng)CT申請(qǐng)書公開了用TNFa作為目的抗原和KLH作為載體蛋白質(zhì)制備這樣的雜絡(luò)物的方法。當(dāng)實(shí)施制備包含TNFa和KLH的雜絡(luò)物時(shí)，該現(xiàn)有技術(shù)的通用方法包含以下步驟a)獲得KLH與TNFa的混合物；b)向上述混合物中加入戊二醛，至終濃度0.026M;c)通過實(shí)施透析除去過量的戊二醛；d)向已透析的溶液中加入曱醛并在48小時(shí)內(nèi)維持曱醛的存在；e)向步驟d結(jié)束時(shí)獲得的溶液中加入甘氨酸；以及f)用在步驟e結(jié)束時(shí)獲得的溶液進(jìn)行透析。PCT申請(qǐng)?zhí)朩O2004/024189中的實(shí)施例顯示合成的TNFa/KLH免疫原產(chǎn)物是穩(wěn)定的并能夠提高對(duì)天然TNFa擁有良好中和活性的抗體的產(chǎn)量。然而，隨著時(shí)間的推移，考慮到為了滿足多個(gè)衛(wèi)生當(dāng)局的高水平要求，包括在美國(guó)和歐洲，為了制備包含所述雜絡(luò)物作為主要活性成份的合適的疫苗組合物，似乎需要更有效的雜絡(luò)物。發(fā)明詳述申請(qǐng)者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在PCT申請(qǐng)?zhí)朩O2004/024189中公開的通用方法，當(dāng)應(yīng)用于包含TNFa和載體蛋白質(zhì)的雜絡(luò)物時(shí)，導(dǎo)致最終的免疫原產(chǎn)品，為了制備的抗TNFa疫苗組合物能被全世界的多個(gè)衛(wèi)生當(dāng)局批準(zhǔn)，必須改進(jìn)所述產(chǎn)品中TNFa的減活化作用和免疫原性。申請(qǐng)者還發(fā)現(xiàn)整個(gè)免疫原產(chǎn)品的穩(wěn)定性應(yīng)該改善，特別是提高貯存期間的穩(wěn)定性。申請(qǐng)者現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了用于制備穩(wěn)定的包含TNFa和載體蛋白質(zhì)的抗原雜絡(luò)物的免疫原產(chǎn)品的新方法，使所述產(chǎn)品能達(dá)至上述多種目標(biāo)。穩(wěn)定免疫原產(chǎn)品的方法。其包含步驟a)提供包含TNFa的溶液；b)向包含上述步驟a)的TNFa的溶液中加入EDTA;c)為了獲得TNFa和所述載體蛋白質(zhì)的混合液，向步驟b最終獲得的溶液中加入載體蛋白質(zhì)；d)向步驟c結(jié)束時(shí)獲得的混合液中加入戊二醛，以便TNFa分子部分共價(jià)綴合至上述載體蛋白質(zhì)并獲得TNFa與該載體蛋白質(zhì)之間的雜絡(luò)物；e)從步驟d結(jié)束時(shí)獲得的混合液中除去戊二醛，以及TNFa和該載體蛋白質(zhì)的游離分子，以便獲得含有TNFa與該載體蛋白質(zhì)之間的純化的雜絡(luò)物的溶液；f)向步驟e結(jié)束時(shí)獲得的溶液中加入甲醛，并在長(zhǎng)達(dá)96小時(shí)至192小時(shí)的時(shí)間內(nèi)維持甲醛的存在；g)向步驟f結(jié)束時(shí)獲得的含有TNFa與該載體蛋白質(zhì)之間的雜絡(luò)物的溶液中加入阻斷與甲醛反應(yīng)的試劑；以及h)為了得到包含上述穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品的溶液，該免疫原產(chǎn)品包含TNFa與該載體蛋白質(zhì)之間的雜絡(luò)物，從步驟h)結(jié)束時(shí)獲得的溶液中除去甲醛和阻斷試劑。通過實(shí)施上述方法，當(dāng)與一種或多種免疫佐劑化合物聯(lián)合施用于哺乳動(dòng)物時(shí)，產(chǎn)生的穩(wěn)定免疫原產(chǎn)品被賦予增強(qiáng)的誘導(dǎo)產(chǎn)生中和天然TNFa抗體的能力。"包含TNFa和載體蛋白質(zhì)的抗原雜絡(luò)物的穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品"，如此處所用，由誘導(dǎo)中和TNFa生物學(xué)活性的抗體的免疫原產(chǎn)品組成，該免疫原產(chǎn)品包含在(i)TNFa分子和(ii)載體分子之間的蛋白質(zhì)相互作用，其中少于40%的TNFa分子與載體分子通過共價(jià)化學(xué)鍵結(jié)合。應(yīng)用上述方法制備的穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品，因其在受試者中誘導(dǎo)抗天然TNFa的抗體，是"具有免疫原性的"，在將其注射至該受試者后，誘導(dǎo)產(chǎn)生更特異的中和TNFa生物學(xué)活性的抗體。應(yīng)用上述方法制備的免疫原產(chǎn)品是"穩(wěn)定的"，因?yàn)樵撁庖咴a(chǎn)品有自己的等電點(diǎn)，能與至少(i)TNFa或者(ii)載體分子的等電點(diǎn)相區(qū)分，并且由于所述免疫原產(chǎn)品在等電聚焦分析中作為蛋白質(zhì)帶遷移時(shí)，該蛋白質(zhì)帶與分別相應(yīng)于(i)TNFa和(ii)載體分子的兩條蛋白質(zhì)帶中至少一條不同。這意味著根據(jù)本發(fā)明的免疫原產(chǎn)品既不包含游離的未結(jié)合的TNFa分子，也不包含游離的未結(jié)合的載體蛋白質(zhì)分子。因?yàn)樗雒庖咴a(chǎn)品包含(i)抗原的TNFa和(ii)抗原的載體蛋白質(zhì)分子，它們結(jié)合到一起(a)部分通過共價(jià)鍵(少于40。/。的共價(jià)鍵)和(b)部分通過弱的非共價(jià)鍵(超過60%的非共價(jià)鍵)，包括離子相互作用、氬鍵、范德華相互作用等等，應(yīng)用上述方法制備的免疫原產(chǎn)品包含TNFa和載體蛋白質(zhì)的"抗原的雜絡(luò)物"或者"雜絡(luò)物"。該穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品，其包含TNFa和如上所定義的載體蛋白質(zhì)的抗原雜絡(luò)物，可根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行制備，在此也可以更簡(jiǎn)單的定義為在人或動(dòng)物中用于誘導(dǎo)，或者其誘導(dǎo)產(chǎn)生TNFa抗體的免疫原產(chǎn)品；或者也可稱為抗-TNFa的免疫原產(chǎn)品。根據(jù)本發(fā)明由于本方法的結(jié)合步驟，最終獲得的穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品，獲得的包含TNFa和載體蛋白質(zhì)的雜絡(luò)物，具有更高的可重復(fù)性。特別是，已發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明通過實(shí)施本方法制備的穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品的免疫原活性，從一批制品到另一批，具有很高的可重復(fù)性。正如此處的實(shí)施例所示，根據(jù)本發(fā)明通過實(shí)施本方法制備的穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品，由于其ED5o劑量大于50ng/ml，甚至大于400ng/ml(當(dāng)表示為TNFa的終濃度時(shí))，沒有在體內(nèi)和體外可檢測(cè)到的TNFa生物學(xué)活性。并且，此處顯示，除了誘導(dǎo)高滴度的抗TNFa抗體外，根據(jù)本發(fā)明通過實(shí)施本方法制備的穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品，誘導(dǎo)產(chǎn)生高中和能力的抗TNFa抗體，其具有NCso超過1/1000的中和能力。此外，根據(jù)本發(fā)明通過實(shí)施本方法制備的穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品也已顯示能夠安全地給哺乳動(dòng)物施用，由于這些產(chǎn)品不^"導(dǎo)任何不良副作用，并且具體而言，即使當(dāng)投藥量比單人治療量(SHTD)高4000倍時(shí)亦無炎癥或任何器官例如心臟、肺、肝和脾的改變。此外，根據(jù)本發(fā)明通過實(shí)施本方法制備的穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的抗TNFa的中和抗體，特別是IgG同種型，在恒河猴(Rhesusmacaque)中，其顯示這些穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品能夠打破對(duì)內(nèi)源所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的免疫耐受性，并且誘導(dǎo)有效的疫苗接種，導(dǎo)致TNFa的中和，在涉及TNFa的所有病理情形中其疫苗能夠預(yù)防TNFa過量所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明通過實(shí)施本方法制備的穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品還顯示能夠有效接種哺乳動(dòng)物防止TNFa誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎。更進(jìn)一步，其顯示出當(dāng)單獨(dú)使用時(shí)這些穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品能夠預(yù)防和/或治療TNFa誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎炎性滑膜炎和關(guān)節(jié)損傷，而無需用任何另外的抗關(guān)節(jié)炎活性成份如氨甲喋呤輔助預(yù)防或根治。按照本發(fā)明的方法制備的穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品還顯示出能夠預(yù)防和/或治療TNFa過量生成所導(dǎo)致的致命性休克。因此，按照本發(fā)明制備的穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品誘導(dǎo)抗TNFa的自身免疫保護(hù)作用，防止TNFa依賴的急性和慢性的病理癥狀，沒有可檢測(cè)到的副作用。不希望被任何具體的理論所束綽，申請(qǐng)者相信步驟a)至h)的特殊組合讓TNFa初始產(chǎn)物的空間構(gòu)像得以保留，同時(shí)促進(jìn)TNFa的主要抗原表位暴露于溶劑中，當(dāng)將穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品給哺乳動(dòng)物施用時(shí)，使得TNFa抗原有效地遞呈至免疫活性細(xì)胞。不希望被任何具體的理論所束縛，申請(qǐng)者也相信，與在PCT申請(qǐng)?zhí)朩O2004/024189中公開的方法比較，當(dāng)應(yīng)用TNFa和KLH時(shí)，步驟a)至h)的特定組合讓最終免疫原產(chǎn)物具有更好的結(jié)構(gòu)的和化學(xué)的穩(wěn)定性。通過該方法獲得的最終的穩(wěn)定免疫原產(chǎn)品的這些特定性質(zhì)，應(yīng)能使制備長(zhǎng)期貯存也十分穩(wěn)定的疫苗組合物成為可能。而且，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的方法使得制備的穩(wěn)定的免疫原終產(chǎn)品無殘留的TNFa初始產(chǎn)物的生物學(xué)活性。值得注意的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明中TNFa初始產(chǎn)物的EDs。是大約10pg/ml。通過本發(fā)明的方法獲得的穩(wěn)定的免疫原終產(chǎn)品具有的EDs。值高于50ng/ml，并且甚至在大多數(shù)情況下高于400ng/ml。同時(shí)，穩(wěn)定的免疫原終產(chǎn)品具有高免疫原性。此外，已經(jīng)顯示出按照本發(fā)明的方法獲得的免疫原產(chǎn)品保留了天然TNFa的主要構(gòu)像，因?yàn)楸M管該免疫原產(chǎn)品的生物學(xué)活性喪失，但仍然與TNFa的受體Rl和R2結(jié)合。在步驟a)中，構(gòu)成TNFa的天然TNFa選自小鼠TNFa、大鼠TNFa、兔TNFa和人TNFa組成的組。優(yōu)選TNFa由人TNFa組成。根據(jù)本發(fā)明的方法，在某些實(shí)施方案中步驟b)包含以下步驟bl)向包含步驟a)的TNFa的所述溶液中加入EDTA;以及b2)向步驟bl)結(jié)束時(shí)獲得的溶液中加入DMSO。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明在步驟b2)中加入DMSO增強(qiáng)該穩(wěn)定的免疫原終產(chǎn)品的免疫原性。在本方法的某些實(shí)施方案中，步驟d)包含以下步驟dl)向在步驟c)結(jié)束時(shí)獲得的混合液中加入戊二醛，使TNFa分子與所述載體蛋白質(zhì)共價(jià)綴合并獲得TNFa與該載體蛋白質(zhì)之間的雜絡(luò)物；以及d2)向在步驟dl)結(jié)束時(shí)獲得的TNFa與該載體蛋白質(zhì)之間的雜絡(luò)物中加入EDTA。因此，在步驟dl)結(jié)束時(shí)獲得的溶液，其包含的產(chǎn)品含有(i)部分通過共價(jià)鍵和(ii)部分通過非共價(jià)鍵與載體分子結(jié)合的TNFa分子。根據(jù)本發(fā)明的方法包含步驟h)為了從在步驟g)結(jié)束時(shí)獲得的溶液中除去曱醛和阻斷試劑，以獲得純化的穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品，該產(chǎn)品包含TNFa和所述載體蛋白質(zhì)之間的雜絡(luò)物。在步驟h)結(jié)束時(shí),獲得的穩(wěn)定的免疫原溶液，呈無色半透明狀態(tài)，實(shí)際上沒有明顯的顆粒物質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，該方法可能還包含另外的步驟i)冷凍在步驟h)結(jié)束時(shí)獲得的溶液。在某些實(shí)施方案中，該方法可能還包含另外的步驟i)凍干在步驟h)結(jié)束時(shí)獲得的溶液，以便獲得能在使用前長(zhǎng)期保存的白色粉末。在步驟a)的優(yōu)選實(shí)施方案中，TNFa濃度范圍從0.1mg/ml至50mg/ml，以及甚至更優(yōu)選從0.5mg/ml至10mg/ml的范圍。在步驟b)的優(yōu)選實(shí)施方案中，EDTA的終濃度范圍從1mM至500mM，以及最優(yōu)選從lmM至10mM。最好將EDTA作為pH范圍從7至8.5，更優(yōu)選從7.5至8.1的緩沖溶液力口入。在步驟b2)的優(yōu)選實(shí)施方案中，DMSO終濃度范圍從0.5。/。v/v(體積比)至20%v/v，最優(yōu)選從5%v/v至20%v/v。最好步驟b2)進(jìn)行的時(shí)間長(zhǎng)度為從10分鐘至50分鐘，更優(yōu)選從20分鐘至40分鐘。在步驟c)的優(yōu)選的實(shí)施方案中，TNFcx與所述載體蛋白質(zhì)的摩爾比范圍是從5:1至100:1，并且更優(yōu)選的范圍是20:1至80:1。在步驟c)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，TNFa與所述載體蛋白質(zhì)的摩爾比的范圍是從30:1至70:1，或者從40:1至60:1。在步驟d)優(yōu)選的實(shí)施方案中，戊二醛的終濃度范圍從0.05%w/w(重量比)至0.5%w/w。戊二醛的終濃度范圍從0.02M至0.03M是適當(dāng)?shù)?，最?yōu)選的戊二醛終濃度為0.026M。最好步驟d2)進(jìn)行的時(shí)間長(zhǎng)度為從30分鐘至60分鐘，更優(yōu)選從40分鐘至50分鐘。在步驟d2)的優(yōu)選的實(shí)施方案中，EDTA的終濃度范圍從1inM至lOmM。在步驟e)的優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過實(shí)施透析、應(yīng)用滲濾的超濾或者實(shí)施正切流動(dòng)過濾(TFF)除去戊二醛。當(dāng)進(jìn)行透析時(shí)，優(yōu)選使用截留值為6-8kDa的透析膜。透析步驟優(yōu)選包括三步，包括(i)使用工作緩沖液(100mM磷酸鹽，150mMNaClpH7.8，EDTA5mM)進(jìn)行的前兩步以及(ii)使用PBS進(jìn)行的最后一步。通常，透析步驟用常規(guī)的緩沖溶液，例如磷酸鹽緩沖液(PBS)實(shí)施，使用相對(duì)于包含TNFa與該載體蛋白質(zhì)之間的雜絡(luò)物(其中TNFa部分與所用載體蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合)的溶液200至400倍的體積的緩沖液。當(dāng)實(shí)施應(yīng)用滲濾的超濾時(shí)，優(yōu)選使用截留值為10000kDa的濾膜。發(fā)現(xiàn)TNFa與該載體蛋白質(zhì)之間的雜絡(luò)物留在超濾截留物中是可以理解的。通常，用于滲濾的液體由緩沖液，例如磷酸鹽緩沖液(PBS)組成。一般用等體積的緩沖液進(jìn)行三次滲濾。在步驟f)優(yōu)選的實(shí)施方案中，曱醛的終濃度范圍從1%w/w至10%w/w，并且甚至更優(yōu)選的范圍是從2。/。w/w至5。/。w/w。在步驟f)中，在96小時(shí)至192小時(shí)的時(shí)間范圍內(nèi)維持甲醛的存在。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)與根據(jù)本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案獲得的穩(wěn)定的免疫原化合物比較，根據(jù)本發(fā)明維持甲醛與雜絡(luò)物共存的時(shí)間少于96小時(shí)將導(dǎo)致隨著時(shí)間推移最終的免疫原化合物的穩(wěn)定性顯著降低。另一方面，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明維持甲醛與雜絡(luò)物共存的時(shí)間超過192小時(shí)將導(dǎo)致最終免疫原產(chǎn)物擁有高穩(wěn)定性，但誘導(dǎo)對(duì)天然TNFa具有高中和活性的抗體的能力顯著降低。更優(yōu)選的是，在步驟f)中維持甲醛存在的時(shí)間從120小時(shí)至168小時(shí)。最優(yōu)選的是，在步驟f)中維持甲醛存在的時(shí)間從130小時(shí)至150小時(shí)。步驟f)在30。C至42。C的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行較為有利，更優(yōu)選的溫度范圍是從35。C至39。C。在步驟g)中阻斷蛋白質(zhì)分子與甲醛反應(yīng)的試劑可以由包含至少一個(gè)氨基的任何適當(dāng)?shù)幕衔锝M成，其將終止該蛋白質(zhì)分子與甲醛的化學(xué)反應(yīng)。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述阻斷試劑由甘氨酸組成。在步驟g)優(yōu)選的實(shí)施方案中，甘氨酸終濃度范圍是從0.01M至10M,以及甚至更優(yōu)選的范圍是從0.05M至2M。在步驟g)的某些其它的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述阻斷試劑由賴氨酸組成。在步驟g)優(yōu)選的實(shí)施方案中，賴氨酸終濃度范圍是從0.01M至IOM，優(yōu)選從0.05M至2M，以及最優(yōu)選從0.05M至0.5M。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使該蛋白質(zhì)分子與賴氨酸在從1小時(shí)至10天的孵育時(shí)間內(nèi)發(fā)生接觸，并且最優(yōu)選從5天至10天。與賴氨酸孵育的時(shí)間超過3天，并且最優(yōu)選至少5天導(dǎo)致終產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)的最佳不可逆性并促成其良好的免疫原性和穩(wěn)定性。當(dāng)實(shí)施步驟h)時(shí)，溶液的pH值調(diào)節(jié)到6.8至7.8的范圍內(nèi)較為有利，更優(yōu)選的范圍是從7.0至7.6,例如通過使用堿，如NaOH。在步驟h)的優(yōu)選實(shí)施方案中，通過透析、應(yīng)用滲濾的超濾或者正切流動(dòng)過濾(TFF)除去甲醛和阻斷試劑。在步驟h)中使用的透析、應(yīng)用滲濾的超濾或者正切流動(dòng)過濾(TFF)的條件通常與上述那些先前為步驟e)所確定的條件一樣，或者與此處實(shí)施例中公開的條件相一致。術(shù)語"載體蛋白質(zhì)"或"載體蛋白質(zhì)分子，，是根據(jù)其對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言的常規(guī)含義在此使用的，即一種蛋白質(zhì)，當(dāng)其與抗原分子，包括半抗原分子偶聯(lián)時(shí)能夠i秀導(dǎo)宿主生物，特別是在哺乳動(dòng)物包括人中產(chǎn)生抗該抗原分子的免疫應(yīng)答。正如此處所用，所述免疫應(yīng)答包括產(chǎn)生直接抗該抗原分子的抗體。根據(jù)本發(fā)明的方法，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言已知的廣泛而多樣的載體蛋白質(zhì)可以在步驟c)中使用。該載體蛋白質(zhì)應(yīng)該承載足夠的輔助T-細(xì)胞表位以便活化T-輔助細(xì)胞和B細(xì)胞，并誘導(dǎo)這些細(xì)胞釋放足夠的IL-1和IL-2來誘導(dǎo)B細(xì)胞克隆擴(kuò)增，該克隆將產(chǎn)生中和抗-TNFa抗體。在本發(fā)明穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品中包括的"載體蛋白質(zhì)分子"，意指至少15個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的任何蛋白質(zhì)或肽(無論其氨基,列)，并且當(dāng)其與TNFa分子部分共價(jià)結(jié)合以形成蛋白質(zhì)雜絡(luò)物時(shí)組成了本發(fā)明的免疫原產(chǎn)品，使得大量的TNFa分子被遞呈至B淋巴細(xì)胞。載體蛋白質(zhì)分子首選由一種蛋白質(zhì)或一種至少15個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的肽組成，或者也可是此種肽的寡聚物，包括能夠活化宿主生物的輔助T淋巴細(xì)胞("T輔助細(xì)胞")從而產(chǎn)生細(xì)胞因子的一種或多種輔助T表位("輔助細(xì)胞")，所述細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素2，這樣的細(xì)胞因子，反過來，活化并誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞增殖，其成熟后將產(chǎn)生抗TNFa的抗體。載體蛋白質(zhì)分子可能還在天然蛋白質(zhì)的同型寡聚物或同型多聚物中存在，從其中衍生，同樣也可以從天然蛋白質(zhì)的肽段的同型寡聚物或同聚多聚物中衍生。目的抗原蛋白質(zhì)可能也存在于異型寡聚物或異型多聚物中，其包含幾種不同肽段的組合，這些肽段最初包含在天然蛋白質(zhì)中，其由此衍生而來。當(dāng)實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的方法時(shí)，可用到的載體蛋白質(zhì)的實(shí)例包括白喉破傷風(fēng)類毒素(分別包括DT,DTCRM197，其它DT突變體，例如位置Glu-148等等[參見，如美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?,709,017、W093/25210、W095/33481等等I以及TT(和TT片斷C))、匙孔槭血藍(lán)素(KLH)、源于腦膜炎奈瑟氏球菌(7V:/M朋i7ig幼Vfc)的OMPC和純化的結(jié)核菌素蛋白質(zhì)衍生物(PDD)。載體的功能是提供細(xì)胞因子幫助以增強(qiáng)對(duì)TNFa的免疫應(yīng)答?？捎糜诒景l(fā)明的不完全的載體名單包括匙孔槭血藍(lán)素(KLH)、血清白蛋白質(zhì)例如牛血清白蛋白(BSA)、滅活的細(xì)菌毒素例如破傷風(fēng)或白喉毒素(TT和DT),或者它的重組片斷(例如，TT的片斷C的結(jié)構(gòu)域1，或者DT的易位結(jié)構(gòu)域)，或者純化的結(jié)核菌素蛋白質(zhì)衍生物(PDD)。在本方法的實(shí)施方案中，載體是來源于流感嗜血桿菌的蛋白D(EP0594610Bl)。蛋白D是來源于流感嗜血桿菌的IgD結(jié)合蛋白并且已經(jīng)被Forsgren申請(qǐng)專利(WO91/18926，已授予的專利EPO594610Bl)。在某些情況下，例如在重組的免疫原表達(dá)系統(tǒng)中可能希望使用蛋白質(zhì)D的片斷，例如蛋白質(zhì)D1/1sup.rd(包含蛋白D的N末端100-110個(gè)^J^酸(WO99/10375;WO00/50077))。因此，在本方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述載體蛋白選自由白喉毒素(DT)及其突變體、破傷風(fēng)毒素(TT)、匙孔槭血藍(lán)素(KLH),以及純化的結(jié)核菌素蛋白質(zhì)衍生物(PDD)、牛血清白蛋白(BSA)和來源于流感嗜血桿菌的蛋白質(zhì)D所組成的組。最優(yōu)選的是，該載體蛋白由匙孔槭血藍(lán)素(KLH)組成。本發(fā)明還涉及制備疫苗組合物的方法，其包含如下步驟a)通過上述方法制備穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品，其包含TNFa的抗原雜絡(luò)物；以及b)用一種或更多的免疫佐劑與所述穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品混合，所述免疫原產(chǎn)品包含在步驟a)制備的TNFa的抗原雜絡(luò)物。如此處的例子所示，該穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品，在此也可以凈皮稱為抗-TNFa免疫原產(chǎn)品，其由才艮據(jù)本發(fā)明的方法獲得的終產(chǎn)物組成，擁有特異的物理化學(xué)和生物學(xué)的特性。大體上，根據(jù)本發(fā)明抗-TNFa免疫原產(chǎn)品具有從50kDa到8000kDa(8MDa)的分子量范圍，其中占總蛋白質(zhì)量約30%的蛋白質(zhì)的分子量低于1000kDa(lMDa)。而且，根據(jù)本發(fā)明的抗-TNFa免疫原產(chǎn)品顯示的TNFa與所述載體蛋白的摩爾比范圍是從40:1至60:1。此外，根據(jù)本發(fā)明的抗-TNFa免疫原產(chǎn)品，當(dāng)在變性條件下孵育時(shí)，其中的非共價(jià)鍵被除去，如在含SDS的緩沖液中，產(chǎn)生超過一種蛋白質(zhì)的產(chǎn)物，表明那里所包含的TNFa分子和載體蛋白分子至少部分通過非共價(jià)結(jié)合，例如弱鍵(包括離子相互作用、氫鍵和范德華鍵)結(jié)合到一起。而且，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明在抗-TNFa免疫原產(chǎn)品中，TNFa分子和載體蛋白分子之間的共價(jià)鍵總是表現(xiàn)出少于這些分子之間總鍵數(shù)的40%,因?yàn)樵谒隹?TNFa免疫原產(chǎn)品中總有超過其含量60%的TNFa分子作為在變性條件下未與載體蛋白結(jié)合的分子而被釋放。正如此處的例子所示，包括實(shí)施例8，根據(jù)本發(fā)明的抗-TNFa免疫原產(chǎn)品包括至少如下的蛋白質(zhì)種類-共價(jià)結(jié)合載體蛋白分子的TNFa分子；以及-通過非共價(jià)鍵結(jié)合的分子，包括-TNFa分子的單體；-TNFa分子的二聚體；-TNFa分子的三聚體；—TNFa分子的二聚體和/或三聚體的聚合物；-載體蛋白分子的單體；以及-載體蛋白分子的聚合物。重要的是，根據(jù)本發(fā)明的抗-TNFa免疫原產(chǎn)品誘導(dǎo)產(chǎn)生抗-TNFa抗體，其具有的TNFa中和能力(NC5。)超過1/1000。TNFa中和能力由中和TNFa細(xì)胞毒活性的50%的血清稀釋度構(gòu)成。本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員采用在實(shí)施例中公開的和在本說明書中進(jìn)一步細(xì)化的常規(guī)技術(shù)，對(duì)根據(jù)本發(fā)明的抗-TNFa免疫原產(chǎn)品的生物學(xué)特性，很容易進(jìn)行直接和可靠地評(píng)估。本發(fā)明的抗-TNFa免疫原產(chǎn)品的NCso值明顯不同于已發(fā)現(xiàn)的根據(jù)先前PCT申請(qǐng)?zhí)朩O2004/024189中公開的方法制備的穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品的NC5o值。特定的抗-TNFa免疫原產(chǎn)品(其中載體蛋白由KLH構(gòu)成)的NCs。值之間的比較詳見于此處的實(shí)施例中，特別是在表3中。根據(jù)本發(fā)明的TNFa-KLH免疫原產(chǎn)品由一批被稱為"K7"的產(chǎn)品組成，然而按照在先前的PCT申請(qǐng)?zhí)朩O2004/024189中公開的方法制備的相應(yīng)的穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品由一批被稱為"K10"的產(chǎn)品組成，如在表3中所見。如表3所示，按照先前在PCT申請(qǐng)?zhí)朩O2004/024189中公開的方法制備穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品，發(fā)現(xiàn)其NC5。值為1/700。根據(jù)本發(fā)明的抗-TNFa的免疫原產(chǎn)品的NCs。值為1/1200，因此大約為先前的現(xiàn)有產(chǎn)品NCs。值的一半。通過根據(jù)本發(fā)明的方法的具體特性的組合，其包括在步驟b)中使用EDTA，以及在步驟f)中從96小時(shí)至192小時(shí)維持甲醛的存在，為根據(jù)本發(fā)明的抗-TNFa免疫原產(chǎn)品的終產(chǎn)物提供了更高的TNFa中和能力。具體而言，如此處表3所示，在步驟f)中從96小時(shí)至192小時(shí)維持曱醛的存在是獲得具有最佳低NC5。值的抗-TNFa免疫原終產(chǎn)品的決定性因素。另外，如此處表3所示，在步驟f)從96小時(shí)至192小時(shí)維持甲醛的存在同樣可獲得TNFa的細(xì)胞毒活性幾乎一直被完全阻斷的抗-TNFa免疫原終產(chǎn)品，其ED5o(有效劑量5o)值大于50ng/ml，優(yōu)選大于400ng/ml，以及有時(shí)至少達(dá)10pg/ml。對(duì)根據(jù)本發(fā)明的抗-TNFa免疫原產(chǎn)品的TNFa中和能力NCs。值的評(píng)估被詳細(xì)7>布于實(shí)施例3中并摘要詳述如下。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以直接和可靠地測(cè)定抗-TNFa免疫原產(chǎn)品的TNFa中和能力(NCs。)值的一般方法包括以下步驟a)用待檢驗(yàn)的抗-TNFa免疫原產(chǎn)品與完全弗氏佐劑(CFA)的混合物通過肌肉內(nèi)途徑施用于小鼠；b)在步驟a)后第21天，用待檢驗(yàn)的抗-TNFa免疫原產(chǎn)品與不完全弗氏佐劑(IFA)的混合物通過肌肉內(nèi)途徑施用于同樣的小鼠；c)在步驟a)后第28天，從在上述步驟a)和b)處理過的每只小鼠采集血液樣品。d)測(cè)定在步驟c)收集的血液樣品的血清的哪個(gè)稀釋度抑制標(biāo)準(zhǔn)量的TNFa50%的細(xì)胞毒活性。為了實(shí)施上述NCs。值評(píng)估方法，應(yīng)用L929細(xì)胞系根據(jù)常規(guī)細(xì)胞毒性試驗(yàn)測(cè)定TNFa的細(xì)胞毒活性。在L929細(xì)胞培養(yǎng)液中優(yōu)選TNFa的標(biāo)準(zhǔn)量是終濃度20ng/ml。如在此處實(shí)施例中，特別是在此處的表3中所公開的，該EDs。值由根據(jù)本發(fā)明的抗-TNFa免疫原產(chǎn)品的終濃度構(gòu)成，其在常規(guī)的L929細(xì)胞細(xì)胞毒性試驗(yàn)中誘導(dǎo)50%的細(xì)胞毒性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的抗-TNFa免疫原產(chǎn)品區(qū)別于在PCT申請(qǐng)?zhí)朩O2004/024189中7>開的穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品的另一個(gè)特性由EDs。構(gòu)成，其大于50ng/ml，甚至大于400ng/ml，并且有時(shí)達(dá)10pg/ml，而發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)品的EDs。大約為15ng/ml。不希望被任何特定的理論所束縛，申請(qǐng)者相信根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的抗TNF免疫原產(chǎn)品具有更好的生物學(xué)特性，其包括TNFa活性的缺乏以及高免疫原性,表明根據(jù)本發(fā)明的抗TNF免疫原產(chǎn)品結(jié)構(gòu)上不同于在PCT申請(qǐng)?zhí)朩O2004/024189中公開的穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品，雖然可能不容易檢測(cè)到特異的結(jié)構(gòu)改變。本發(fā)明還涉及穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品，其包含TNFa的抗原和載體蛋白的雜絡(luò)物，所述產(chǎn)品具有一種或多種下列技術(shù)特點(diǎn)(i)其包含(l)TNFa分子和(2)載體蛋白分子，(a)通過少于40%的共價(jià)鍵和(b)通過超過60%的非共價(jià)鍵結(jié)合在一起；(ii)其展示的TNFa與所述載體蛋白的摩爾比范圍從40:l至60:1;(iii)其誘導(dǎo)產(chǎn)生具有TNFa中和能力(NCs。)小于1/1000的抗-TNFa抗體；以及(iV)其具有在L929細(xì)胞毒性試驗(yàn)中大于50ng/ml，和甚至大于橋ng/ml的EDs。值。(V)其擁有從50kDa至8000kDa(8MDa)的分子量范圍，占總蛋白質(zhì)量約30%的載體蛋白的分子量低于1000kDa(lMDa)。明顯的，本發(fā)明涉及的抗-TNFa免疫原產(chǎn)品具有上述(i)至(iv)的特點(diǎn)。在某些實(shí)施例中，載體蛋白由KLH組成。本領(lǐng)域人員容易檢測(cè)在本發(fā)明的免疫原產(chǎn)品中彼此之間通過共價(jià)鍵連接的目的TNFa蛋白質(zhì)的百分比和載體蛋白分子的百分比。例如，測(cè)定在本發(fā)明的免疫原產(chǎn)品中通過共價(jià)鍵連接至載體蛋白分子的TNFa分子的百分比，可以通過下列步驟完成(i)將溶液中的該免疫原產(chǎn)品提交至變性和還原的條件；(ii)用在步驟(ii)結(jié)束時(shí)獲得的產(chǎn)物進(jìn)行大小排阻色鐠，其間分子量逐漸降低的多種蛋白質(zhì)組分從大小排阻色鐠載體連續(xù)洗脫下來；(iii)在包含最高分子量蛋白質(zhì)組分的洗脫液部分中，測(cè)定通過共價(jià)鍵連接至載體分子的TNFa分子的數(shù)量；(iv)將在步驟(iii)中測(cè)定的TNFa數(shù)量與在起始的免疫原產(chǎn)品中最初所包含的TNFa總量進(jìn)行比較。在用于測(cè)定上述共價(jià)鍵百分比的方法的步驟(i)中，在變性和還原條件下孵育一定量(按摩爾或重量數(shù))的本發(fā)明的免疫原產(chǎn)品，導(dǎo)致彼此之間不是通過共價(jià)鍵連接的多種蛋白質(zhì)組分之間的弱鍵解離。在優(yōu)選的變性條件中有尿素存在，例如，其終濃度為8M;或者有SDS存在，例如，在包含該免疫原產(chǎn)品的溶液的總重量中，其終濃度為1%。在優(yōu)選的還原條件中有p-巰基乙醇存在，例如包含該免疫原產(chǎn)品的溶液的總體積的5%的終濃度。在用于測(cè)定彼此之間通過共價(jià)鍵連接的TNFa分子和載體蛋白質(zhì)分子的百分比的方法的步驟(ii)中，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)其技術(shù)常識(shí)選擇大小排阻色鐠載體。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用如Pharmacia公司以Superdex75TM、Superdex200TM和Superdex400TM商標(biāo)上市的色鐠載體。在步驟(ii)中，相應(yīng)于共價(jià)連接到TNFoc分子的載體分子的該分子級(jí)分，在包含游離形式的目的抗原的洗脫液部分之前首先被洗脫。以游離的形式被洗脫的TNFct的量相當(dāng)于在起始免疫原產(chǎn)品中非共價(jià)連接至載體分子的目的抗原級(jí)分。在高分子量蛋白質(zhì)級(jí)分對(duì)共價(jià)連接到載體蛋白質(zhì)分子的TNFoc的量進(jìn)行測(cè)定，例如，在免疫酶試驗(yàn)中、在放射免疫學(xué)試驗(yàn)或者免疫熒光試驗(yàn)中，直接或者間接地("夾心法")，用對(duì)TNFa特異的并且與載體蛋白質(zhì)分子無任何免疫交叉反應(yīng)的抗體進(jìn)行測(cè)定。在步驟(iii)中，如上所述測(cè)定的與載體蛋白質(zhì)分子共價(jià)連接的TNFa的量，與給定量(按摩爾或重量數(shù))的起始免疫產(chǎn)品中所包含的TNFa的初始量進(jìn)行比較，并以此計(jì)算TNFa(其在本發(fā)明的免疫原產(chǎn)品中共價(jià)連接到載體蛋白質(zhì)分子上)的百分比。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地利用包括以下步驟的次選方法，對(duì)在本發(fā)明的免疫原產(chǎn)品中彼此之間通過共價(jià)鍵連接的載體蛋白質(zhì)分子的百分含量和TNFa的百分含量進(jìn)行檢測(cè)。a)固定于抗該載體蛋白質(zhì)的特異抗體的支持物上；b)讓被固定化于步驟a)中的支持物上的抗載體蛋白質(zhì)的抗體，與包含該載體蛋白質(zhì)和TNFa的、已知分子數(shù)量的待測(cè)免疫原產(chǎn)品作用；c)借助包含一種或多種蛋白質(zhì)變性劑的緩沖溶液，除去在步驟a)中未連接至固定化的抗-載體蛋白質(zhì)抗體的免疫原產(chǎn)品的分子。d)dl)使在步驟c)中在固定化的抗-載體蛋白質(zhì)抗體和免疫原產(chǎn)品的分子之間形成的(i)免疫原復(fù)合物與(ii)特異的抗載體蛋白質(zhì)的抗體接觸；d2)與步驟dl)分開進(jìn)行，使在步驟c)中在固定化的抗-載體蛋白質(zhì)抗體和免疫原產(chǎn)品的分子之間形成的免疫原復(fù)合物與(ii)特異的抗TNFa的抗體接觸；e)el)對(duì)在步驟dl)中所加入的已經(jīng)連接至載體蛋白質(zhì)的抗體進(jìn)行定量；e2)對(duì)在步驟d2)中所加入的已經(jīng)連接至TNFa的抗體進(jìn)行定量；f)計(jì)算以下兩項(xiàng)之間比率(i)在步驟el)中測(cè)定的已結(jié)合的抗-載體蛋白質(zhì)抗體的數(shù)量；以及(ii)在步驟e2)中測(cè)定的已結(jié)合的抗-TNFa抗體的數(shù)量。該比例存在于在起始的免疫原產(chǎn)品中，彼此之間通過共價(jià)鍵結(jié)合的載體蛋白質(zhì)分子和TNFa分子的比例。在上述方法的步驟C)中，使用包含一種或多種蛋白質(zhì)變性劑的洗脫水溶液導(dǎo)致與抗-載體蛋白質(zhì)抗體結(jié)合的免疫原產(chǎn)品變性，使得與載體蛋白質(zhì)分子沒有共價(jià)結(jié)合的TNFa分子釋放到洗脫溶液中。因此，在本方法的步驟d2)中，只有與載體蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合的TNFa分子被定量。在用于步驟c)的變性緩沖液中優(yōu)選包含表面活性劑，例如Tween20，終濃度為0.1%v/v。在步驟dl)和d2)中，結(jié)合的抗體量?jī)?yōu)選分別通過將在上述每一步驟的結(jié)束所形成的抗原-抗體復(fù)合物與可檢測(cè)的分子標(biāo)記的新抗體孵育進(jìn)行測(cè)定。(i)在步驟dl)中，新抗體直接抗抗-載體蛋白質(zhì)抗體并且用可檢測(cè)的分子標(biāo)記；(ii)在步驟d2)中，新抗體直接抗抗-TNFa抗體并且用可檢測(cè)的分子標(biāo)記。放射性分子、熒光分子或者酶，這些可檢測(cè)的分子是無差別的。作為酶，過氧化物酶可能更常用到，在用鄰苯二胺(POD)底物孵育之后通過比色法，顯示其存在。以上提及的方法的詳細(xì)方案在實(shí)施例中進(jìn)行描述。通過圖解說明，根據(jù)本發(fā)明，應(yīng)用上述第一或者第二種定量方法已顯示在包含KLH載體分子和人TNFa分子之間的雜絡(luò)物的免疫原產(chǎn)物中，少于40%的TNFa分子是與KLH載體蛋白質(zhì)分子共價(jià)結(jié)合的。為了制備本發(fā)明的免疫原的或疫苗的組合物，將根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品調(diào)節(jié)至適當(dāng)?shù)臐舛?，任選與合適的疫苗佐劑混合并包裝備用。本發(fā)明還涉及免疫原組合物，其包含(i)穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品，該產(chǎn)品包含TNFa和用此處公開的方法制備的載體蛋白質(zhì)的抗原雜絡(luò)物，或者(ii)包含TNFa和上述載體蛋白質(zhì)的抗原雜絡(luò)物與一種或多種藥物可接受的賦形劑組合的穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品。本發(fā)明還涉及疫苗組合物，其包含(i)穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品，該產(chǎn)品包含TNFoc和用此處公開的方法制備的載體蛋白質(zhì)的抗原雜絡(luò)物，或者(ii)包含TNFoc和上述載體蛋白質(zhì)的抗原雜絡(luò)物與一種或多種免疫佐劑結(jié)合的穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品。正如此處所用，術(shù)語"佐劑"是指其通常含義，即任何與之混合增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的物質(zhì)。在本發(fā)明中有用的佐劑包括，但非意在限制，弗氏、礦物膠例如氫氧化鋁和表面活性物質(zhì)例如溶血卵磷脂、聚醚多元醇、多聚陰離子、肽、油乳膠、匙孔槭血藍(lán)素和二硝基苯酚。BCG(卡介苗)和短小棒狀桿菌是潛在的有用佐劑。任何在本領(lǐng)域中已知的佐劑可以用于上述疫苗組合物，包括油性佐劑例如弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑、基于霉菌酸酯的佐劑(例如，海藻糖二霉菌酸酯)、細(xì)菌的脂多糖(LPS)、肽聚糖(例如，胞壁質(zhì)、粘肽或者糖蛋白質(zhì)例如N-Opaca、胞壁酰二肽MDP，或者M(jìn)DP類似物)、蛋白聚糖(例如提取自肺炎克雷伯桿菌)、鏈球菌制劑(例如OK"2)、必思添(例如01K2),EP109942、EP180564和EP231039的免疫刺激復(fù)合物、氬氧化鋁、急角戒、DEAE-葡聚糖、中性油(例如miglyol)、植物油(例如arachid油)、月旨質(zhì)體、Pluronic.RTM.多元醇、Ribi佐劑系統(tǒng)(參見，例如GB-A-2189141)，或者白介素，特別是那些刺激細(xì)胞介導(dǎo)免疫的物質(zhì)。可替代的佐劑由細(xì)菌屬放線菌目的Amycolata的抽提物組成，已經(jīng)在美國(guó)專利第4,877,612號(hào)述及。此外，所有的佐劑混合物皆可商購(gòu)。所用佐劑一定程度上視受體生物而定。所施用佐劑的量將視動(dòng)物的類型和大小而定。最佳劑量可以用常規(guī)方法容易的測(cè)定。合適的佐劑包括但不限制于表面活性劑，例如十六烷基胺(hexadecylamine)、十八胺、溶血卵磷脂、溴化二甲基雙十八烷基銨、N，N畫雙十八烷基-N，-N-甲叉(2-羥乙基-丙烷二胺)、曱氧基十六烷基-甘油和普盧蘭尼克多元醇；polanions,例如吡喃、硫酸葡聚糖、多聚免疫復(fù)合物、聚丙烯酸、聚羧乙烯、肽，例如胞壁酰二肽、MPL、aimethylglycine、吞喧刺激肽、油乳膠、明礬及其混合物。其它的潛在佐劑包括大腸桿菌(E.coli)的B肽亞基、霍亂毒素的不耐熱毒素。McGhee，J.R.，等人."Onvaccinedevelopment,"Sem.Hematol.，30:3-15(1993).由于其能夠提高對(duì)免疫原的抗體滴度，皂角甙的佐劑特性已經(jīng)久為人知。如此處所用，術(shù)語"皂角戒"是指一組植物來源的表面活性苷類，由與甾類或者三萜類結(jié)構(gòu)的疏水區(qū)相連接的親水區(qū)(通常幾個(gè)糖鏈)組成。雖然皂角甙可從不同來源獲得，具有有用的佐劑活性的皂角甙已經(jīng)從南美皂樹(Quillaja)肥皂草屬(Molina)得到。從這些來源得到的皂角戒被用于分離得到"均一的，，用"QuilA，，表示的級(jí)分(Dalsgaard,K"(1974),Arch.GesamteVirusforsch.44:243》對(duì)疫苗制劑中QuilA的獸醫(yī)的和人類的用途主要關(guān)心的是劑量-位點(diǎn)反應(yīng)性。一種避免QuilA的這種毒性的方法是使用免疫刺激復(fù)合物(以ISCOM.TM.為人熟知，免疫刺激復(fù)合物的縮寫)。這主要是因?yàn)楫?dāng)摻入免疫刺激復(fù)合物時(shí)QuilA的反應(yīng)性較小，由于它與復(fù)合物中膽固醇的締合作用降低其與細(xì)胞膜中膽固醇的結(jié)合，因而降低它的細(xì)胞裂解效應(yīng)。此外，產(chǎn)生類似水平的佐劑效應(yīng)需要較少量的QuilA。當(dāng)其被摻入免疫刺激復(fù)合物時(shí)，QuilA鬼角戒的免疫調(diào)節(jié)特性和從這些皂角甙得到的另外的益處，在多種出版物中已有描述，例如Cox和Cox,J.C.和Coulter,A.R.AdvancesinAdjuvantTechnologyandApplicationinAnimalParasiteControlUtilisingBiotechnology,第4章，Yong，W.K.編輯，CRCPress(1992);Cox,J.C.和Coulter,A.R.(1997)Vaccine,15(3):248-256;Cox，J.C.和Coulter,A.R.(1999)BioDrugs12(6):439-453);Dalsgaard，(1974)(supra);Morein等人，(1989)"Immunostimulatingcomplex(ISCOM)，'，In"Vaccines:RecentTrendsandProgress".G.Gregoriadis，A.C.Allison和G.Poster(編輯).PleniumPress,NewYork,p.153;AustralianPatentSpecificationsNos.558258，589915,590904and632067.經(jīng)典的免疫刺激復(fù)合物ISCOM是通過結(jié)合膽固醇、皂角戒、磷脂和免疫原，例如病毒包裝蛋白質(zhì)而形成的。免疫刺激復(fù)合物基質(zhì)組合物(稱為ISCOMATRIX.TM.)是同樣形成的，但沒有病毒蛋白質(zhì)。免疫刺激復(fù)合物似乎既刺激體液的又刺激細(xì)胞的免疫應(yīng)答。已經(jīng)用多種病毒來源的蛋白質(zhì)制成了免疫刺激復(fù)合物，包括HSV-1、CMV、EBV、乙型肝炎病毒(HBV)，狂犬病毒和流感病毒。參見例如I.G.Barr等Adv.DrugDeliveryReviews,32:247-271(1998)。已經(jīng)觀察到來源于傳染物質(zhì)的棵露DNA或者多肽當(dāng)通過它們自己給藥時(shí)免疫原差，包含于免疫刺激復(fù)合物內(nèi)部已增強(qiáng)了它們的免疫原性。用免疫刺激復(fù)合物按配方制備的多種蛋白質(zhì)主要在嚙鼠動(dòng)物模型中已經(jīng)顯示出i秀導(dǎo)CTL。Ber-zofsky，(1991)，Biotechnol.Ther.2:123-135;Hsu等，(1996),Vaccine14:1159-1166;Lipford等，(1994)，Vaccine12:73-80;Mowat等.，(1991)，Immunology72:317-322;Osterhaus等，(1998)，Dev.Biol.Stand.92:49-58;Rimmelzwaan等"(1997)，J.Gen.Virol.78(pt,4):757畫765;Sambhara等，(1998)，J.Infect.Dis.177:1266-1274;Sambhara等，(1997)，Mech.AgingDev.96:157-169;Sjolander等，(1997)，Vaccine15:1030-1038;Sjolander等，(1998)，丄Leukoc.Biol.64:713-723;Takahashi等，(1990)，Nature344:873-875;Tarpey等，(1996)，Vaccine14:230-236;Trudel等，(1987)，Vaccine10:107-112;Verschoor等，(1999)，J.Virol.73:3292-3300;Villacres畫Eriksson，(1995)，Clin.Exp.Immunol.102:46-52;Zugd等，(1995),Eur.J.Immunoll.25:451-458.一般認(rèn)為通過本發(fā)明的方法獲得的穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品和佐劑的結(jié)合對(duì)誘導(dǎo)最佳免疫應(yīng)答十分重要。許多研究證實(shí)了該假設(shè)，包括用病毒小體和ISCOMs.TM.進(jìn)行的研究已經(jīng)完成。(Ennis，RA.，Crux，J.，Jameson,J.，Klein,M.，Burt，D.和Thipphawong，J.1999.Virology259:256-261.，Zurbriggen,R"Novak-Hofer，I"Seelig，A.和Gluck，R.(2000)，ProgressinlipidResearch39:3畫18"Voeten，J.T.M.,Meuwkoop，N.J.，Lovgren-Bengtsson，K.,Osterhaus,D.M.E.和Rimmelzwaan,(iF,2000.EuroJImm(Submitt-ed))。通常在ISCOM.TM.和抗原之間的結(jié)合，通過在其形成過程中摻入兩性抗原至ISCOM.TM.結(jié)構(gòu)中已經(jīng)獲得成功。(Morein，B"B.Sundquist，S.Hoglund，K.Dalsgaard，和A.Osterhaus.1984.Nature308:457)。該摻入通過疏7JC相互作用完成。已經(jīng)與此不同的是，最近的方法是利用螯合的和靜電相互作用將抗原與預(yù)先形成的無蛋白質(zhì)免疫刺激復(fù)合物(ISCOMATRIX.TM.)結(jié)合(國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/AU98/00080-WO98/36772和PCT/AU00/00110)。根據(jù)本發(fā)明在某些疫苗組合物的實(shí)施方案中，所述疫苗組合物包括，如藥物賦形劑，一種或多種帶電無機(jī)載體。帶電有機(jī)載體的實(shí)例(其為適用于本發(fā)明的佐劑)包括，但不限制于，皂角甙、皂角甙復(fù)合物、稱為ISCOMATRIX.TM.的皂角戒、膽固醇和脂類的免疫刺激復(fù)合物的任何一種或者多種成份(例如皂角甙組分和/或磷脂組分)、脂質(zhì)體或水包油型乳劑。(ISCOMATRIX.TM.的組分和制備詳細(xì)描述于國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/SE86/00480，澳大利亞專利號(hào)558258和632067，以及歐洲專利出版第0180564號(hào)，其公開內(nèi)容在這里引入作為參考)。另外的佐劑實(shí)例包括，4旦不限于，那些在Cox和Coulter,1992，1997和1999的出版物中詳述的例子。應(yīng)當(dāng)理解受試的有機(jī)載體可能是天然產(chǎn)生的或者可能是合成的或者是重組4汙生的。疫苗組合物可能還包括另外的佐劑以增強(qiáng)組合物的有效性。合適的佐劑包括，但不限于(l)鋁鹽(鋁)，例如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等等；(2)水包油型乳劑制劑(有或者無其它的特定的免疫刺激劑例如，胞壁酰(基)肽(見下)或者細(xì)菌細(xì)胞壁成分),例如(a)MF59(PCT公開號(hào)WO卯/14837)，包含5%的角篁烯、0.5%的吐溫80和0.5%司盤85(任選包含不同量的胞壁酰三肽磷酯酰乙醇胺(見下)，雖為非必須)按配方制造成亞耀^立，(b)SAF,包含10。/。的角鯊烯、0.4%吐溫80、5%普盧蘭尼克阻斷的多聚物和thr-MDP(見下)，或者微觀流體化成為亞微細(xì)粒乳劑或者渦旋震蕩產(chǎn)生大顆凈立乳劑，以及(c)Ribi.TM.佐劑系統(tǒng)(RAS)，(RibiImmunochem,Hamilton]\10111.)包含2%的角1:烯、0.2%吐溫80以及一種或多種細(xì)菌細(xì)胞壁的組分，其來源于由單磷酸類脂A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和細(xì)胞壁骨架(CWS)組成的組，優(yōu)選MPL+CWS(Detox.TM.);(3)急角戒佐劑，例如Stimulon.TM.(CambridgeBioscience,Worcester,Mass.);(4)完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA);(5)細(xì)胞因子，例如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干擾素(例如？干擾素)、巨謹(jǐn)細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)等等；(6)細(xì)菌ADP-核糖基化毒素的去毒的突變體例如霍亂毒素(CT)、百日咳毒素(PT)或者大腸桿菌(E.coli)不耐熱毒素(LT),特別是LT-K63、LT-R72、CT-S109、PT-K9/G129;參見，如WO93/13302和W092/19265;(7)其它作為免疫刺激劑的物質(zhì)以增強(qiáng)組合物的功效；以及(8)如國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/US99/17308所描述的吸附了大分子的微粒。優(yōu)選鋁和MF59。如上所述，適合的胞壁酰肽包括，但不限于，N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-normauramyl-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰基-L-丙氨酸-2-(l，-2，-二軟脂酰-s-正-甘油-3-羥基磷酰氧基)-氨基乙烷(MTP-PE)等。根據(jù)本發(fā)明用于誘導(dǎo)粘膜或者抗免疫原化合物的全身應(yīng)答的另外的佐劑可以是那些在Vogel等人的書中所描述的化合物(VogelF.R.，PowellM.F.和AlvingC.R.，《Acompendiumofvaccineadjuvantsandexcipients;第2版；VogelKR.和PowellMF，1995,Asummarycompendiumofvaccineadjuvantsandexcipients.In:PowellMF，NewmanMJ編輯,《Vaccinedesign:thesubunitandadjuvantapproach.NewYork:Plenumpublishing,1995:141-228)))。一般地，根據(jù)本發(fā)明可能包含于疫苗組合物中的佐劑包括，但不限于(i)凝膠型佐劑，例如氫氧化鋁或砩酸鋁(GlennyAT等人，1926;JPatholBacteriol;第29巻38-45;GuptaRK和SiberGR，1994;Biologicals5第22巻53-63)5(ii)微生物的佐劑，例如-DNACpG基序(ChuRS等人，199;JExpMed;第186巻1623-1631);單礴酰脂質(zhì)A(SchneersonR等人，1991;JImmunol;第147巻:2136-2140);霍亂毒素(HolmgrenJ等人，1993;Vaccine;第11巻:1179-1184;OkahashiN等人，1996;InfectImmun;第64巻1516-1525);-大腸桿菌不耐熱毒素(LyckeN等人，1992;EurJImmunol;第22巻:2277-2281;deHaanL等人，1996;Vaccine;第14巻260-266;ChongC等人，1998.Vaccine;第16巻:732-740);國(guó)百日咳毒素(RobertsM等人，1995;InfectImmun;第63巻2100-2108;MuHH和SewdlWA,1994;Immunology;第83巻639-645);-胞壁酰二肽(EllouzF等人；1974;BiochemBiophysResCommun;第59巻1317-1325);CohenLY等人，1996;CellImmunol;第169巻75-84);(iii)油乳劑和基于乳化劑的佐劑，例如隱弗氏不完全佐劑(DhimanN等人，1997;MedMicrobiolImmunol(Berlin);第186巻45-51;PutkonenP等人，1994;JMedPrimatol;第23巻89-94);-MF59(DupuisM等人，1998;CellImmunol;Vol.186:18-27;KahnJO等人，1994;JinfectDis;Vol.170:1288-1291;OttG等人，1995;Vaccine.Vol.13:1557-1562);-SAF(AllisonAC;1998;DevBiolStand;Vol.92:3-11;GuptaRK等人，1993;Vaccine;Vol.11:293-306;ByarsNE等人，1994;Vacine;Vol.12:200-209);(iv)孩i粒佐劑，例如-免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)(PutkonenP等人，1994;JMedPrimatol;Vol.23:89-94;;GuptaRK等人，1993;Vaccine;Vol.11:293-306;SjolanderA等人，1997;CellImmunol;Vol.177:69-76);一脂質(zhì)體(RichardsRL等人，1998;InfectImmun;Vol.66:2859-2865;FernandesI等人，1997;MolImmunol;Vol.34:569-576);誦生物可降解的微球體(MenY等人，1996;Vaccine;Vol.14:1442-1450;ShahinR等人，1995;InfectImmun;Vol.63:1195-1200;陽(yáng)皂角甙(QS國(guó)21)(NewmanMJ等人，1992;JImmunol;Vol.148:2357-2362;NeuzilKM等人，1997;Vaccine.Vol.15:525-532);(v)合成佐劑，例如-非離子的阻斷共聚物(HunterRL等人，1994;AIDSResHumRetroviruses;Vol.10(S叩l2);S95國(guó)S98;NewmanMJ等人,1997;MechAgeingdev;Vol.93:189-203);-胞壁酰肽類似物(CohenLY等人，1996;CellImmunol;Vol.169:75-84;FastDJ和VosikaGJ，1997;Vaccine;Vol.15:1748-1752;BahrGM等人，1995;IntJImmunopharmacol;Vol.17:117-131);誦聚膦腈(PayneLG等人，1998;Vaccine;Vol.16:92-98);國(guó)合成的多核苷酸(JohnsonAG,1994;ClinMicrobiolRev;Vol.7:277-289;HarringtonDG等人，1979;InfectImmun;Vol.24:160-166);以及(vi)細(xì)J包因子，例如-免疫應(yīng)答性纖維結(jié)合素-y(IFN-y)(OdeanMJ等人，l"0;InfectImmun;Vol.58:427-432);-白細(xì)胞介素隱2(NunbergJ等人，1989;ProcNatlAcadSciUSA;Vol.86:4240-4243);-白細(xì)胞介素-12(LuisC等人，1994;Science;Vol.263:235-237;BlissJ等人,1996;JImmunol;Vol.156:887-894;JankovicD等人，1997,JImmunol;Vol.159:2409-2417).本發(fā)明的另一方面因此涉及利用以上定義的疫苗組合物的穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，包括體液免疫應(yīng)答，其中的抗體能中和天然細(xì)胞因子的免疫抑制劑、凋亡或^jk管生成的特性。本發(fā)明的另一目標(biāo)由用于誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的方法組成，該抗體中和哺乳動(dòng)物中天然TNFa的活性，包括的步驟為向該哺乳動(dòng)物施用(i)如上所公開的疫苗組合物或(ii)將如上所述包含TNFa和載體蛋白質(zhì)的抗原雜絡(luò)物的穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品連同一種或多種免疫佐劑一起施用。該疫苗組合物可任意包括疫苗適用的、藥物可接受的(即無菌的和無毒的)液體、半固體或者固體稀釋劑，其用作制藥的運(yùn)載工具、賦形劑或介質(zhì)?？梢詰?yīng)用在本領(lǐng)域已知的任何稀釋劑?？勺鳛榉独南♂寗┌?，但并非限定于，聚氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯、硬脂酸鎂、羥基苯甲酸甲酯和羥基苯曱酸丙酯、滑石粉、藻酸鹽、淀粉、乳糖、蔗糖、右旋糖、山梨醇、甘露醇、阿拉伯膠、磷酸鈞、礦物油、可可豆脂和可可油。根據(jù)本發(fā)明疫苗組合物可能還包括一種或多種可藥用的載體和/或稀釋劑，這樣的載體包括其本身對(duì)接受組合物的個(gè)體不誘導(dǎo)產(chǎn)生有害反應(yīng)的任何載體。適合的載體一般是大的、代謝慢的大分子例如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、M酸共聚物、脂類聚集物(例如油滴或脂質(zhì)體)和滅活的病毒顆粒。這樣的載體為本領(lǐng)域的那些普通專業(yè)技術(shù)人員所熟知。根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物一般可能還包括稀釋劑，例如水、鹽、甘油、乙醇等等。此外，輔助物，例如濕潤(rùn)劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等可能出現(xiàn)在組合物中。本發(fā)明的疫苗的合適制劑包括可注射的液體溶液或者可注射的懸浮液。也可以制備固體形式，其適合于在注射前的液態(tài)可藥用載體中溶解或者懸浮。疫苗制劑可以被乳化?？梢园诳捎糜诒痉椒ǖ漠a(chǎn)品中的另外的物質(zhì)包括，但不限于一種或多種防腐劑，例如乙二胺四乙酸(EDTA)的二鈉或四鈉鹽、硫柳汞等。該疫苗組合物可任選的包括疫苗適用的可藥用的(即無菌的和無毒的)液體、半固體或者固體稀釋劑，其用作制藥的運(yùn)載工具、賦形劑或介質(zhì)。可以應(yīng)用任何在本領(lǐng)域已知的稀釋劑?？勺鳛榉独南♂寗┌?，但不限于，聚氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯、硬脂酸鎂、羥基苯甲酸甲酯和羥基苯甲酸丙酯、滑石粉、藻酸鹽、淀粉、乳糖、蔗糖、右旋糖、山梨醇、甘露醇、阿拉伯膠、磷酸鉤、礦物油、可可豆脂和可可油。疫苗組合物可以以便于輸送的形式包裝。組合物可包裝于膠嚢、小膠嚢、嚢劑、扁嚢劑、明膠、紙或其它容器中。當(dāng)與免疫原組合物進(jìn)入受體生物相適應(yīng)時(shí)，并且，特別是，當(dāng)免疫原組合物以單位劑量進(jìn)行輸送時(shí)優(yōu)選這些遞送形式。該劑量單位可以被包裝于，例如片劑、膠嚢、栓劑或扁膠嚢中。適于注射使用的形式包括無菌水溶液(在此可溶于水)或分散體和用于臨時(shí)制備無菌可注射溶液或^t體的無菌粉劑。它們?cè)谥圃旌蛢?chǔ)存條件下必須是穩(wěn)、定的，并且必須防腐保存防止微生物例如細(xì)菌和真菌的污染作用?？梢酝ㄟ^多種抗細(xì)菌和抗真菌試劑達(dá)到預(yù)防微生物的活動(dòng)，例如對(duì)羥苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在許多例子中，優(yōu)選包含等滲劑，例如蔗糖或氯化鈉。通過應(yīng)用延遲吸收的試劑組合物，例如單硬脂酸鋁和明膠，可以使得可注射的組合物延時(shí)吸收。無菌可注射溶液可以通過將以上例舉的多種其它組份按照需要在適當(dāng)?shù)娜軇┲幸运枇繐饺牖钚曰衔?，隨后過濾滅菌來制備。一般地，通過將多種已滅菌的活性成分摻入無菌載體制備分散體，所述載體含有基本的分散介質(zhì)和以上例舉的那些必需的其它組份。至于用于制備無菌可注射溶劑的無菌粉劑，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，其產(chǎn)生活性成分以及從先前的過濾滅菌溶液而來的任何另外想要的成分的粉劑。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的活性免疫原化合物應(yīng)該受到保護(hù)時(shí)，它可能被口服施用，例如，用惰性稀釋劑或用可同化的可食用載體，或它可以被包于硬殼或軟殼的明膠膠嚢中，壓縮進(jìn)片劑中，或直接摻入々欠食的食物中。對(duì)口服的治療用藥，根據(jù)本發(fā)明的活性的免疫原化合物可以與賦形劑混合，并以可吸收的片劑、含片、糖錠、膠嚢、酏劑、懸浮液、糖漿劑、薄脆餅等形式使用。按照活性免疫原化合物重量計(jì)，這樣的疫苗組合物和制劑應(yīng)該含有至少1%。該組合物和制劑的百分比當(dāng)然可以是不同的，并且可以方使_地在單位重量的大約5%至約80%之間。在這樣的治療上有用的疫苗組合物中，活性的免疫原化合物的數(shù)量是獲得的合適劑量。根據(jù)本發(fā)明制備優(yōu)選的疫苗組合物或制劑以便計(jì)量單位形式含有介于大約0.1g和2000mg之間的活性免疫原化合物。根據(jù)本發(fā)明適合于口服用藥的疫苗組合物也可以以液體溶液，包括液態(tài)氣溶制劑的形式制備。液態(tài)氣溶制劑含有在生理學(xué)上可接受的稀釋劑中的免疫原產(chǎn)品和分散劑。本發(fā)明的干粉氣溶制劑由分得很細(xì)的固體形式的免疫原產(chǎn)品和分散劑組成。使用液態(tài)或千粉氣溶制劑，該制劑必須纟皮氣霧化。就是說，它必須被分解成液體或固體顆粒，從而確保該氣霧化的劑量實(shí)際到達(dá)鼻道或肺的粘膜。術(shù)語"氣溶膠粒子"此處用于描述適合鼻或肺用藥，即能到達(dá)粘膜的液體或固體的顆粒。其它的考慮，例如建造輸送裝置、該制劑中的另外的成分和顆粒特性是重要的。藥物經(jīng)肺給藥的這些方面是在本領(lǐng)域眾所周知的，并且制劑操作、氣霧化方法和建造輸送裝置至多要求本領(lǐng)域普通技術(shù)人員進(jìn)行的常規(guī)實(shí)驗(yàn)。在具體的實(shí)施方案中，質(zhì)量中位動(dòng)力學(xué)(themassmediandynamic)參數(shù)將是5微米或更小以便確保藥物顆粒到達(dá)肺泡[Wearley，L.L.，Crit.Rev.inTher.DrugCarrierSystems8:333(1991)。氣溶膠傳輸系統(tǒng)，例如壓力定量吸入裝置和干粉吸入裝置公開于Newman,S.P"(AerosolsandtheLung,Clarke,S.W.和Davia,D.編輯，第19卜22頁(yè))并可與本發(fā)明結(jié)合使用。根據(jù)本發(fā)明該疫苗組合物可以通過任何常規(guī)方法向待免疫的受試者施用，所述方法包括，例如，通過口、靜脈注射、皮內(nèi)、肌內(nèi)、乳房?jī)?nèi)、腹膜內(nèi)或者皮下的注射；通過口服、經(jīng)皮膚、舌下、鼻內(nèi)、肛門或陰道輸送。該處理可以由施用一段時(shí)間的單一劑量或復(fù)合劑量組成。本發(fā)明還通過以下的圖和實(shí)施例予以圖解說明。圖1由圖解"i兌明根據(jù)本發(fā)明制造穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品的一般程序的方案組成。圖2說明在用(A)KLH單獨(dú)或(B)如在實(shí)施例1中所公開的制造穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品免疫的小鼠中的體液應(yīng)答。橫坐標(biāo)個(gè)體；縱坐標(biāo)IgG抗TNFa抗體滴度。圖3說明通過(A)KLH單獨(dú)或(B)如在實(shí)施例1中所公開的制造的穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品免疫小鼠，產(chǎn)生的血清抗體的抗-TNFa中和活性。每條曲線對(duì)應(yīng)于來自一只小鼠的血清。橫坐標(biāo)TNFa活性的中和百分比；縱坐標(biāo)血清稀釋度。圖4說明用(A)KLH單獨(dú)或(B)如實(shí)施例1公開的所制造的20jig穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)物，以及(C)如實(shí)施例l公開的所制造的80照穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)物免疫恒河猴的體液反應(yīng)。橫坐標(biāo)在第一次注射后的天數(shù)；縱坐標(biāo)IgG抗-TNFoc抗體滴度。圖5說明用(A)KLH單獨(dú)或(B)如實(shí)施例1公開的所制造的20fig穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)物，以及(C)如實(shí)施例1公開的所制造的80照穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)物免疫恒河猴產(chǎn)生的血清抗體的抗-TNFoc中和活性。橫坐標(biāo)TNFa活性的中和百分比；縱坐標(biāo)血清稀釋度。圖6說明用(A)對(duì)照PBS緩沖液，(B)KLH單獨(dú)，(C)如實(shí)施例1公開的所制造的穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)物和(D)如實(shí)施例1公開的所制造的穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)物與氨甲喋呤組合來免疫轉(zhuǎn)基因huTNFaB6.S幾-Tg(r^F)N2小鼠的體液應(yīng)答。橫坐標(biāo)個(gè)體；縱坐標(biāo)IgG抗-TNF抗體滴度。圖7說明在轉(zhuǎn)基因huTNFaB6.S幾-Tg(77VF)N2小鼠中測(cè)定的關(guān)節(jié)炎臨床評(píng)估值，對(duì)其注射使用-氯化鈉[令；國(guó)KLH單獨(dú)[IM;-如實(shí)施例1中所公開同樣制造的穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品[A;以及-如實(shí)施例1中所公開同樣制造的穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品與氨甲蝶呤組合[■橫坐標(biāo)第一次注射之后的天數(shù)；縱坐標(biāo)關(guān)節(jié)炎臨床評(píng)估值。圖8說明hTNFa-Kinoid的特性。圖8-a)1:RPN800分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物，2:KLH(0.8照)，3:hTNFa(0.8照)，4:3figKinoid，上樣在12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。通過銀染或蛋白質(zhì)印跡法顯影。圖8-b)放射自顯影圖l:分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物；2:125I-hTNFa;3:標(biāo)記在hTNFa上的Kinoid;4:標(biāo)記在KLH上的Kinoid;5:125I-KLH。圖8國(guó)c)Kinoid(50jig)在superose6柱上(10x300)濾過。用0.2mlDBPS洗脫。柱子先用一系列的分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物校準(zhǔn)。圖S-d)在L929細(xì)胞中TNFa(令)和kinoid(^)生物學(xué)活性的對(duì)比評(píng)價(jià)。e)比較TNFa對(duì)受體I(令)和II(B)的結(jié)合，以及kinoid對(duì)受體I(O)和II(□)的結(jié)合。圖9說明在TTg和Balb/c小鼠中的抗體應(yīng)答。圖9-a)與Balb/c小鼠比較，在kinoid、失活的TNFa(iTNFa)或KLH免疫的TTg中的血清抗-TNFa抗體滴度。圖9-b)至9-e):在kinoid(O)和KLH(令)免疫小鼠中評(píng)估的圖9-b)按照血清稀釋的中和能力，圖9-c)作為時(shí)間函數(shù)的血清中和能力，圖9-d)血清hTNFa對(duì)受體I結(jié)合的抑制，圖9-e)IgG中和能力，圖9-f)IgG對(duì)TNFa受體I結(jié)合的抑制。1-免疫方案2次肌肉注射，間隔3周注射20照并加強(qiáng)免疫(6周時(shí)5照)；2:2次肌肉注射，注射10叫并加強(qiáng)免疫5^ig。圖10表明小鼠脾細(xì)胞對(duì)hTNFa的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。從KLH(n=3)(令)和kinoid(n=2)(O)免疫的小鼠純化的脾細(xì)胞。在第1、8、29天對(duì)Balb/c和TTg小鼠免疫。在第90天進(jìn)行加強(qiáng)免疫并在(第120天)處死取脾臟。脾細(xì)胞在體外用a)hTNFa，b)鼠TNFa(muTNFa)和c)KLH抗原刺激96小時(shí)。通過3H-胸腺嗜咬脫氧核苷摻入并且表示為刺激指數(shù)(圖IO-A)或者分別在44小時(shí)和72小時(shí)之后在培養(yǎng)上清液中測(cè)量IL2(圖IO-B)和IFN-￥(圖IO-C)產(chǎn)物來測(cè)定特定的細(xì)胞增殖(參見材料和方法部分)。圖11顯示用hTNFakinoid接種改善在huTNFa轉(zhuǎn)基因小鼠中的臨床關(guān)節(jié)炎。七周齡的小鼠在第1、7和28天用KLH-TNFa(開環(huán))(n二8)或KLH(閉環(huán))(對(duì)照組，11=7)免疫。對(duì)任一參數(shù)組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性圖11-3):從試驗(yàn)開始起體重增加的*。PO.05(方差分析)；圖ll-b):患肢數(shù)。PO.0001(方差分析)；圖ll-c):關(guān)節(jié)炎臨床評(píng)分。PO.0001(方差分析)；圖ll-d):關(guān)節(jié)炎每日患病率(百分比)顯示在已接種組中該疾病的逆轉(zhuǎn)(PO.01，方差分析)。這個(gè)試驗(yàn)重復(fù)兩次得到類似結(jié)果。實(shí)施例實(shí)施例1至7實(shí)施例1:根據(jù)本發(fā)明制造穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品的方法。A.材料表l:化合物和試劑<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>表2:消耗品描述供應(yīng)商應(yīng)用Slide-a-Lyzer表達(dá)盒7kDaMWCO(0.5-3mL)Perbio;66370透析PelliconXLPES膜(5或10kDaMWCO)微孑L;PXB010A50正切流動(dòng)過濾50mL試管Nunc;362696樣品容器聚丙烯廣口瓶(150mL)VWR;215-0520樣品容器聚丙烯廣口瓶C2S0mL)VWR;215-5683樣品容器冷凍管(3.5mL&2mL)Sigma;V1138;V9637樣品容器附帶500mL丙蜂酸樹脂容器的實(shí)驗(yàn)室規(guī)格的TFF單元微孔；XX42LSS13正切流動(dòng)過濾B.方法詳述在這個(gè)實(shí)施例中公開的操作說明本發(fā)明方法的實(shí)施方案，其用于制備包含TNF和KLH的抗原雜絡(luò)物的穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品。此外，在下文詳述的方法是為制備一批120mg的穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品而i殳計(jì)的。歩驟a)畫取30.05ml的TNFa(濃度為4.2mg/ml)并讓其在4。C過夜解凍(注意需要126.21mgTNFa)。步驟b〗(或步驟bl)在該方法的某些實(shí)施方案中)畫加90.15ml的"稀釋緩沖液，，以獲得"工作緩沖液"溶液且TNFa為1mg/ml(±10%)。畫稀釋緩沖液-130mM磷酸氫二鈉，133mMNaCl，6.6mMEDTA，pH7.8誦工作緩沖液-100mM磷酸氫二鈉，150mMNaCl，5mMEDTA，pH7.8歩驟b2)誦向保留的120ml的lmg/mlTNFa(±10%)中加入1.2mlDMSO。該混合物于室溫放置30分鐘。每10分鐘攪拌混勻并盡量避免產(chǎn)生泡沫。國(guó)加61.34ml的"工作緩沖液"至混合物中。通過顛倒容器輕輕混合并盡量避免產(chǎn)生泡沫。步驟c)曙加入51.6mg的KLH。注意對(duì)于9.81mg/ml的KLH溶液加入5.26ml。通過顛倒容器輕輕混合。此時(shí)總體積為187.8ml。步驟d)國(guó)用"工作緩沖液,，將25%的戊二醛貯存液稀釋至2.5%。用前即刻完成。-加入20.86ml稀釋的2.5%的戊二醛溶液。注意此時(shí)總體積為208.56ml。通過顛倒容器輕輕混合。-封閉瓶子并于室溫孵育45分鐘。每15分鐘輕輕顛倒瓶子。步驟e)將該溶液用正切流動(dòng)過濾(TFF)對(duì)工作緩沖液滲濾。-對(duì)20倍體積的pH7.6，含150mMNaCl的10mM砩酸鹽緩沖液透析3次。體積1=透析2小時(shí)體積2=透析2小時(shí)體積3=透析過夜步驟f)畫用"工作緩沖液，,將甲醛貯存液(37%)稀釋10倍以獲得3.7%的溶液。用前即刻完成。歸向TNFa誦KLH溶液中加入稀釋的3.7%的甲醛以獲得0.2%的終濃度。例如，如果回收的體積為200ml,那么所加入的3.7%甲醛的量將是11.43ml。-封閉瓶子并于37。C孵育6天。每天顛倒瓶子一次。步驟g)-6天后，加入2M甘氨酸(配制于WFI中)至0.1M的終濃度。于室溫孵育l小時(shí)，其間輕輕顛倒瓶子。歩驟h)-檢查用于滲濾的DPBS(Sigma)的pH，如果需要，用0.1MNaOH調(diào)節(jié)至最終卩117.3±0.2。通常應(yīng)該無需調(diào)節(jié)pH。-用正切流動(dòng)過濾(TFF)對(duì)DPBS滲濾該溶液。使用2x5kDaMWCOTFF膜。使用LabscaleTFF系統(tǒng)上的500ml(丙烯酸樹月旨)容器。通過將濃縮物(超濾保留)引流至預(yù)稱重的聚丙烯瓶從膜上回收原料。實(shí)施例2:通過根據(jù)本發(fā)明的方法獲得穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品的試驗(yàn)搡作在實(shí)施例2中公開的試驗(yàn)操作可以被本領(lǐng)域技術(shù)人員參考。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以根據(jù)公布于此的多個(gè)實(shí)施例中的任何一個(gè)試驗(yàn)操作進(jìn)行試驗(yàn)。2丄通過比色計(jì)的總蛋白質(zhì)含量測(cè)定Bradford試驗(yàn)的實(shí)例應(yīng)用Bradford技術(shù)測(cè)定蛋白質(zhì)含量(Bradford,M.Anal.Biochem.1976.72，248-254)。簡(jiǎn)言之，通過吸取0、10、20、30、40jil溶于PBS中的0.2mg/mlBSA溶液至一系列的試管中，用牛血清白蛋白(BSA)建立校準(zhǔn)曲線。隨后，通過加入相應(yīng)體積的DI水使每管體積最終達(dá)500jd。然后每管加入500piBradford試劑。用200^PBS配制兩個(gè)空白。于室溫反應(yīng)5分鐘之后，每管內(nèi)容物渦旋振蕩并于595nm讀數(shù)。200|Lil適當(dāng)稀釋的待測(cè)蛋白質(zhì)溶液與如上所述Bradford試劑進(jìn)行反應(yīng)。KLH-TNFoc中TNFa蛋白質(zhì)含量ELISA將從4個(gè)小瓶中所取的4個(gè)KLH-TNFa樣品在pH7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)中稀釋至5ng/ml。這些稀釋物被用于包被微量滴定板(Costar3590),每孔iooni。在讓其4。c包被過夜后，用含o.:r/。吐溫20的PBS沖洗該平板，并將該孔用2。/。胎牛血清(FCS)溶液(溶于100jilPBS-吐溫中)于37。C飽和2小時(shí)。在用PBS-吐溫沖洗該平板之后，吸取系列稀釋的抗-TNFa血清100nl至每個(gè)孔中并將該平板于37。C孵育2小時(shí)，此后將其徹底沖洗干凈，并在每孔加入100jil辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗-IgG抗血清之后再次于37。C孵育2小時(shí)。孵育后，沖洗該平板并向每孔中加入100jil鄰苯二胺(OPD)溶液。3分鐘后，每孔加入IOOfil的2N疏酸，該平板用多掃描光度計(jì)于4卯nm讀數(shù)。2.2.KLH-TNFa免疫原的純度級(jí)別等電聚焦(IEF)+蛋白質(zhì)印跡在1%的瓊脂糖平板上，在3至10的pH梯度內(nèi)，通過等電聚焦(IEF)通過使KLH-TNFa免疫原在單獨(dú)的KLH和單獨(dú)的TNFot旁邊遷移，評(píng)估免疫原的純度級(jí)別。在將每個(gè)樣品適當(dāng)稀釋至250pg/ml后，用快速凝膠電泳系統(tǒng)裝置(AmershamPharmacia)在下列條件下進(jìn)行電泳。第一步(預(yù)遷移)500V,2.5mA，2.5W，15°C，5aVh第二步(應(yīng)用)200V，2.5mA,2.5W,15。C，5aVh第三步(遷移)1500V,2.5mA,2.5W,15°C,450aVh遷移后，通過孩支-毛細(xì)管作用將該蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜并通過蛋白質(zhì)印跡將該蛋白質(zhì)顯影。蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)通過將硝酸纖維素膜浸泡于5。/。的牛奶-TBS吐溫20中，在室溫下過夜，使其被飽和，此后用稀釋于10。/。牛奶-TBS吐溫20中的多克隆抗-TNFoc(人)第一抗體或者抗-KLH第一抗體室溫下孵育l小時(shí)。隨后，在S分鐘內(nèi)用TBS-吐溫20洗膜4次，之后用10。/o牛奶-TBS吐溫20稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體室溫孵育l小時(shí)。再次，用TBS-吐溫20洗膜4次，并用ECL增強(qiáng)試劑盒(AmershamPharmacia)通過化學(xué)發(fā)光顯示該斑點(diǎn)。3.在穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品中TNFoc-KLH共價(jià)鍵的百分比3.1.方法1:在變性和還原條件下的大小排阻色譜將待測(cè)的kinoid溶液置于導(dǎo)致非共價(jià)鍵解離的變性(8M終濃度的尿素)和還原(5%終濃度的P-巰基乙醇)條件下。所得溶液通過裝填了Superdex20()TM(Pharmacia)的大小排阻柱洗脫，Superdex200是因其600kDa的級(jí)分限制遠(yuǎn)低于KLH和共價(jià)的KLH-TNFot構(gòu)建體的分子量而被選擇的。只有那些與KLH共價(jià)結(jié)合的細(xì)胞因子分子留在排阻體積中。用夾心酶聯(lián)免疫分析技術(shù)用與KLH沒有交叉免疫應(yīng)答的抗-TNFa抗體測(cè)定后者的TNFa(特異的TNFa抗原)。該結(jié)果以在起始溶液中TNFa滴度的百分比表達(dá)，其通過同樣的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)定。這個(gè)百分比等于在TNFakinoid中的。/oTNFa畫KLH共價(jià)鍵。3.2.方法2:應(yīng)用吐溫洗滌的雙-夾心酶聯(lián)免疫分析A使用溶于PBS(10mMpH7.3，NaCl150mM)中的lmg/ml的抗-KLH多克隆抗體包被微量滴定板(Costar，高結(jié)合量)，每孔100jU,37。C2小時(shí)。在用PBST(含0.1%v/v吐溫20的PBS)洗3次之后，每孔用含2%胎牛血清的PBS飽和1.5小時(shí)。該孔用PBST再洗3次。然后將兩個(gè)相同的系列稀釋的待測(cè)kinoid(10、5、0.156jig/ml)加至孔中并孵育2小時(shí)。將該孔用PBST洗3次，其解離作用(通過吐溫20)清除與KLH非共價(jià)結(jié)合的所有分子，后者KLH被固定于包被支持物的捕獲抗體。第一系列的測(cè)試稀釋液與抗-KLH抗體孵育，且第二系列與抗-TNFa抗體孵育。在37卩孵育1.5小時(shí)之后，如上沖洗各孔，然后與特異的過氧化物酶偶聯(lián)的第二抗體孵育。加入OPD(過氧化物酶底物)，使能夠?qū)Φ谝幌盗羞M(jìn)行固定的抗-TNFa抗體的定量比色檢測(cè)，以及對(duì)第二系列進(jìn)行固定的抗-KLH抗體的定量比色檢測(cè)。兩個(gè)系列之間固定的抗體比率給出在kinoid中TNFa共價(jià)結(jié)合KLH的百分比。4.KLH-TNFaKINOID的免疫學(xué)活性抗原性測(cè)試酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)這個(gè)測(cè)試的目的在于測(cè)定免疫原(或者抗原衍生物，或者與載體蛋白質(zhì)結(jié)合的抗原)與天然抗原相關(guān)的特異抗體的結(jié)合能力。該測(cè)試基本上以反向ELISA為主。將試驗(yàn)中一系列稀釋度增高的免疫原分配到聚苯乙烯微量滴定板孔中。讓針對(duì)該待測(cè)蛋白質(zhì)的特異多克隆抗體與固定于孔內(nèi)的免疫原反應(yīng)。在通過洗板清除未反應(yīng)的過量抗體之后，通過讓#:孔內(nèi)抗原所固定的抗體與辣根過氧化物酶標(biāo)記的針對(duì)第一抗體的抗體反應(yīng)進(jìn)行定量顯示。通過加入適當(dāng)?shù)孜锼@的黃色與所固定的蛋白質(zhì)的量直接成正比。用微板光度計(jì)測(cè)定每孔的光密度(OD)。從校準(zhǔn)曲線測(cè)得待測(cè)樣品的蛋白質(zhì)含量。5.KINOID的免疫原性免疫原制劑的免疫原性是-l-其誘導(dǎo)特異的抗-TNFot多克隆抗體形成的能力水平(體內(nèi)測(cè)定)；以及-2-它的中和能力。后者是在體外通過定量從免疫小鼠取樣的抗血清抑制TNFa的特異生物學(xué)活性的能力而測(cè)量的。-l-為此，20組7周齡的Balb/c小鼠，體重18-20g，每5只動(dòng)物關(guān)在一個(gè)單獨(dú)的籠舍中，用標(biāo)準(zhǔn)的丸狀食物以及不限制飲水進(jìn)行飼養(yǎng)，在第0、7、14和21天通過肌內(nèi)注射O.lml(10照)在ISA51中的待測(cè)免疫原(l:lv/v乳劑于ISA51中)進(jìn)行免疫。第60天，注射5iig免疫原(0.1ml，1:1乳劑于ISA51中)給予加強(qiáng)免疫。在開始免疫2天之前通過眼眶后穿刺取血樣，并在最后一次注射后12天再次取血樣，用于通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)抗體水平。三只對(duì)照小鼠接受l:lv/vPBS于IFA中的乳劑。血清抗體滴度表示為產(chǎn)生OD〉0.3的稀釋度的倒數(shù)。6.免疫毒性-體外使用多種kinoid劑量處理并且通過PPD/TT抗原刺激的T細(xì)胞的增殖(通過3H-胸腺嘧"^應(yīng)氧核苷)的測(cè)試。通過聚蔗糖梯度離心分離血液，從健康供體得到新近分離的外周血單核細(xì)胞。將細(xì)胞接種至含10。/。胎牛血清的RPMIc培養(yǎng)基的圓底96孔板中，每孔15，000個(gè)細(xì)胞。將kinoid加至濃度lng/ml至100ng/m1,然后加PPD或TT至0.16%。將平板方文在37。C5。/。C02中孵育6天。孵育結(jié)束前18小時(shí)加入氮標(biāo)記的胸腺嘧咬脫氧核苷，0.5nCi/孔。用p閃爍計(jì)數(shù)器分析細(xì)胞增殖。放線菌素D存在下鼠L929細(xì)胞的細(xì)胞溶解材料丄929小鼠成纖維細(xì)胞系(入1(:(:商品號(hào)<:<:1^1);klh-tnfoi(小鼠或人)kinoid溶于PBS(標(biāo)準(zhǔn))中，NEOVACS-重組鼠TNF-aPeprotech(315-01A)或人TNF-aPeprotech(300-01A);培養(yǎng)基(補(bǔ)充10。/。胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素-鏈霉素的RPMI)畫測(cè)定用培養(yǎng)基(補(bǔ)充2%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素國(guó)鏈霉素的RPMI)-預(yù)孵育培養(yǎng)基補(bǔ)充2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素-鏈霉素的HLl-96孔平底培養(yǎng)板(<:(^31"，3595)-放線菌素D,1000fig/ml，保存于4。C(避光)國(guó)MTT溶液(Sigma，M5655)，溶于PBS的5mg/ml等分試樣貯存液于-:2(TC保存(避光)-DMSO(SIGMA，471267)試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間24小時(shí)孵育l小時(shí)測(cè)定準(zhǔn)備方法1.將KLH-TNFa鼠或人kinoid和標(biāo)準(zhǔn)品在96孔板每孔50ftl的分析培養(yǎng)基中稀釋，留下第l排作為空白，從適當(dāng)?shù)南♂尪乳_始，從第2排至第11排進(jìn)行一系列的二倍稀釋。2.在補(bǔ)充1叫/ml的放線菌素D(避光保存)的分析培養(yǎng)基中，制備密度為7.5105/ml的L929細(xì)胞懸液。3.將平板在增濕保溫箱中于37。C5。/。C02孵育24小時(shí)。4.用不含Ca2+、Mg2+的PBS漂洗兩次。5.每孔加入50nlMTT溶液到分析培養(yǎng)基中至400/0,在增濕保溫箱中于37°C5%<:02孵育4小時(shí)。6.倒空平板并且每孔加入50jilDMSO。7.于550-630nm讀板8.分析數(shù)據(jù)。實(shí)施例3:多種KLH-TNFa(人)kinoid制劑的比較研究由人TNFa與特異的載體蛋白質(zhì)KLH復(fù)合組成的人TNFakinoid的多種制劑已經(jīng)完成。更精確地說，通過同樣的一般程序已經(jīng)生產(chǎn)了KLH-TNFa(人)的多種制劑，該程序公布于實(shí)施例l中但在(i)DMSO的百分比，(ii)戊二醛濃度(2.5或22.5mM)以及(iii)中間產(chǎn)物與曱醛孵育的時(shí)間期限(從0,2至6天的孵育時(shí)間期限)有變化。然后，已經(jīng)測(cè)定了人TNFa生物學(xué)活性的喪失。并且，已經(jīng)通過(i)人TNFa在L929細(xì)胞系中的細(xì)胞毒性測(cè)定，以及(ii)通過公布于此的本實(shí)施例中的免疫原性測(cè)定檢測(cè)了在最終的kinoid產(chǎn)物中構(gòu)象上B-表位的保存。A.材料和方法A.l在KLH-TNFa(人)kinoid中對(duì)TNFa生物學(xué)活性缺失的測(cè)定人TNFa,在放線菌素D存在下，對(duì)L929細(xì)胞系的鼠成纖維細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，通過細(xì)胞存活試驗(yàn)用MTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基卜2，5-聯(lián)二苯-四唑鹽溴化物)評(píng)估其細(xì)胞毒性。該測(cè)定方法是基于MTT被活細(xì)胞的線粒體NAPDH還原酶還原為還愿態(tài)產(chǎn)物甲臢，其具有蘭紫色。在該測(cè)定方法中，細(xì)胞的代謝活性使得能夠評(píng)估其生存能力。該KLHTNF-akinoi'd生物學(xué)活性的評(píng)估包括在逐漸減少(從50ng/ml至0ng/ml)量的所述kinoid產(chǎn)品與D放線菌素(1照/ml)混合存在下于微培養(yǎng)板平底孔中孵育L929細(xì)胞。在含5%C02的濕潤(rùn)空氣中于37°C在24小時(shí)時(shí)間期限內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。在培養(yǎng)24小時(shí)后，棄去該細(xì)胞培養(yǎng)上清液并替換為MTT測(cè)試液。在37。C與MTT孵育4小時(shí)之后，棄去MTT溶液并加入DMSO。在混合均勻之后，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)570nm處測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液的光密度。用57011111處的光密度(0.0.)表示該結(jié)果。平行地，將細(xì)胞培養(yǎng)物與從O至10ng/ml范圍的TNFa進(jìn)行孵育，作為對(duì)照。最終結(jié)果以半數(shù)致死劑量表示，也稱為L(zhǎng)D5。，其為誘導(dǎo)50。/o的L929培養(yǎng)細(xì)胞溶胞的劑量。A.2在用戊二醛和甲醛進(jìn)行化學(xué)處理后，在最終的KLH-TNFa(人)kinoid中人TNFa構(gòu)像B-表位保存的測(cè)定免疫原性測(cè)定在重量為18-20g的C57Bl/6中進(jìn)行免疫原活性的測(cè)試，在化學(xué)處理后對(duì)最終的KLH-TNFa(人)kinoid中人TNFa的B表位構(gòu)像的保存進(jìn)行研究。在第0天，通過肌內(nèi)途徑給同組的三只小鼠注射完全弗氏佐劑(CFA)中的乳劑0.21111(50fig)。在第21天，用不完全弗氏佐劑中的kinoid產(chǎn)品25jig給予第二次注射。在第一次注射之前和在第28天時(shí)進(jìn)行每只小鼠的眶后血樣采集。收集每組小鼠的血清。通過檢測(cè)免疫小鼠的血清中直接抗人-TNFa的IgG同種型抗體對(duì)體液應(yīng)答進(jìn)行測(cè)定。體液應(yīng)答是通過酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行測(cè)定的并用抗體滴度表示(稀釋度-1，給出大于0.3的光密度)。如后所述，通過在L929細(xì)胞上對(duì)TNFa細(xì)胞毒的檢測(cè)已經(jīng)從用KLH-TNFa(人)kinoid免疫的小鼠中測(cè)定了血清的中和能力。用從在第-2天和第28天采樣的血清庫(kù)(稀釋度從l/100至l/12800)得到的多種稀釋度處理L929細(xì)胞，然后于室溫下一直孵育40分鐘，接著與20ng/ml的人TNFa于4。C孵育20分鐘。在含5%(:02的濕潤(rùn)空氣中于37。C繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)。在細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清液并替換為MTT溶液。在于37。C孵育4小時(shí)后，棄去MTT并加入DMSO。在混合均勻之后，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)570nm處測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液的光密度。用細(xì)胞培養(yǎng)上清液的光密度(O.D.)表示該結(jié)果。將細(xì)胞培養(yǎng)物與從O至10ng/ml范圍的TNFa進(jìn)行平行孵育，以作為對(duì)照。中和TNFa細(xì)胞毒性的血清避免了其對(duì)L929細(xì)胞的細(xì)胞毒性。該結(jié)果表示為50%中和能力或NCso,其相當(dāng)于中和50%的人TNFa細(xì)胞毒性的血清稀釋度。B:結(jié)果表3用根據(jù)多種化學(xué)處理制備的最終KLHTNFa(人)kinoW獲得的結(jié)果如下所示。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>用包括化學(xué)處理(i)用濃度為1%的DMSO和(ii)用濃度為22.5mM的戊二醛，然后(iii)用甲醛化學(xué)處理6天的制造KLHTNFa(人)kinoi'd的方法獲得的最好的結(jié)果，如上表3所示。產(chǎn)生的最終KLH-TNFa(人)產(chǎn)品去除了人TNFa的細(xì)胞毒性并誘導(dǎo)產(chǎn)生中和天然人TNFa的生物學(xué)活性的多克隆抗體。因此，根據(jù)公布于上述表3中K7條件的制造程序使包含于其中的保留構(gòu)象上B-表位的人TNFa細(xì)胞因子失活。根據(jù)上述表3中稱為"K7"的條件制備的KLH-TNFa(人)終產(chǎn)品與根據(jù)上述實(shí)施例l制備的相同。這種最好的TNFakinoi'd產(chǎn)品已經(jīng)在以下實(shí)施例中進(jìn)行了研究，特別是在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，考慮到研究其誘導(dǎo)多克隆抗體的能力，該抗體中和自體系統(tǒng)中天然的TNFa。實(shí)施例4:小鼠中KLH-TNFW人)kinoid的急性毒性的研究^研究的目的是將根據(jù)本發(fā)明的包含KLH-TNFa(人)kinoid的疫苗組合物的特性，定義為用作廣i普治療疫苗以用于治療癌性惡病質(zhì)和/或多種自身免疫疾病(例如關(guān)節(jié)炎、克隆病和4艮屑病)。特別是，對(duì)疫苗組合物關(guān)于耐受性和無危險(xiǎn)的特性已經(jīng)進(jìn)行了研究。因此，已經(jīng)在SWISS小鼠中進(jìn)行了初次的毒性研究。A.材料和方法將四十六(46)只雌性SWISS小鼠分配于(i)一組4只未處理的動(dòng)物和(ii)三組十四只動(dòng)物，其分別接受a)對(duì)照組(佐劑載體)n=14在大腿部經(jīng)肌內(nèi)途徑注射(IM)磷酸鹽緩沖液(PBS);對(duì)照組被用于評(píng)估配方中所用佐劑的局部的和系統(tǒng)的反應(yīng)性。b)治療組(第一次劑量人單次治療劑量的2.000倍，STHD°/N+14)按照50照/小鼠在大腿部經(jīng)肌內(nèi)途徑注射(IM)溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中的KLH-TNFa(人)kinoid。cV治療組(第二次劑量人單次治療劑量的4000倍，STHD):n=14按照100jig/鼠在大腿部經(jīng)肌內(nèi)途徑注射(IM)溶于砩酸鹽緩沖液(PBS)中的KLH-TNFa(人)kinoid。d)包括在^研究中的未處理的首次用于試驗(yàn)的小鼠組(11=4)對(duì)涉及人使用的單次劑量進(jìn)行劑量計(jì)算，其為80ng/注射/個(gè)體1SHTD(人單次治療劑量)，即，1.15jig/kg。在實(shí)驗(yàn)的第五天(D5)已經(jīng)完成KLH-TNFa(人)kinoid的注射。根據(jù)下列參數(shù)已經(jīng)測(cè)試了動(dòng)物對(duì)上述治療的應(yīng)答a-立即的、短期的和長(zhǎng)期的最終死亡數(shù)目(注射后10天的觀察期)b-對(duì)于該治療的局部或系統(tǒng)的反應(yīng)性。c-曲線顯示注射KLH-TNFa(人)kinoid(D15)后一直到第10天該動(dòng)物的總體狀態(tài)和體重。在觀察期之后五(5)天(D20),將存活的動(dòng)物處死并且進(jìn)行對(duì)下列對(duì)照的處理。d-顯微鏡下病理解剖檢查注射位點(diǎn)處的肌肉，用以評(píng)估局部耐受性。e-測(cè)定肺、心、肝和脾的重量，作為對(duì)施用免疫刺激物質(zhì)的器官應(yīng)答的指數(shù)值。B.結(jié)果當(dāng)以大大提高的劑量(每只小鼠中人單次治療劑量的大約4000倍)施用于小鼠，在整個(gè)10天的觀察期內(nèi)，并且對(duì)每個(gè)試驗(yàn)組而言，該KLH-TNFa(人)kinoid并未導(dǎo)致任何不良反應(yīng)，其通過以下得以說明1)無立即或中間發(fā)生的死亡；2)在注射位點(diǎn)無局部反應(yīng)，也沒有任何系統(tǒng)反應(yīng)；3)在任何試驗(yàn)組中，對(duì)小鼠的生長(zhǎng)曲線沒有影響。此外，在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)(D20)對(duì),皮處死的動(dòng)物的器官進(jìn)行宏觀檢查，沒有顯示出器官的改變或者任何脾和肝體積的增大。而且，對(duì)整組測(cè)試動(dòng)物而言，其心、肺、肝和脾的重量以類似的方式變化。實(shí)施例5-在適于人TNF的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中研究該KLH-TNFa〖人)kinoid的免疫源性。與KLH的免疫原性比較，KLH-TNFa(人)kinoid制劑的免疫原性(體液)，已經(jīng)在5周齡(一組10只小鼠)的小鼠B6.S幾-Tg(rA^)N2中進(jìn)行了研究。這些小鼠由Taconic公司(美國(guó))提供并包括人TNFa基因的轉(zhuǎn)基因(半合子)小鼠。A.材料和方法在第0天和第7天，小鼠(一組10只小鼠)已經(jīng)通過肌內(nèi)根部接受0.2ml(30照)ISA51中乳劑的注射。在第28天給予25照ISA51中乳劑的第二次注射。然后，在第35天對(duì)每只小鼠進(jìn)行眼窩后血樣采集。B.結(jié)果l.體液應(yīng)答體液應(yīng)答是通過已免疫小鼠的血清中直接抗人TNFa的IgG型抗體的存在來測(cè)定的；體液應(yīng)答通過ELISA測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定并以抗體滴度(稀釋度"給出大于0,3的光密度)表示。圖2說明所獲得的抗體滴度。用根據(jù)實(shí)施例l獲得的KLH-TNFa(人)終產(chǎn)品免疫小鼠，來源于該小鼠的血清具有高水平的IgG型抗體滴度，而來源于用KLH免疫的小鼠的血清缺乏這些抗體。用TNFa細(xì)胞毒性測(cè)定法在L929細(xì)胞中測(cè)量這些抗體的中和活性。其結(jié)果呈現(xiàn)于圖3中。KLH-TNFa(人)kinoid制品誘導(dǎo)的抗體具有高水平的中和活性。實(shí)施例6-在恒河猴中對(duì)KLH-TNFa(人)kinoid的免疫原性的研究與單獨(dú)的KLH的免疫原活性比較，KLH-TNFa(人)kinoid的體液免疫原活性，已經(jīng)在由MDSpharma(里昂-法國(guó))提供的恒河猴中進(jìn)行了研究。值得注意的是恒河猴天然生成的TNFa與人TNFa有98.1。/。的氨基酸同源性。A.材料和方法在第O天、第21天和第49天，恒河猴已經(jīng)接受了0.5ml溶于ISA51中的kinoid的乳劑通過肌內(nèi)途徑的注射，包括(i)80或者20jig的KLH-TNFa(人)kinoid制劑，或者(ii)單獨(dú)的KLH。在第28天、第56天和第68天已經(jīng)完成每只動(dòng)物的血樣采集。B.結(jié)果l-體液應(yīng)答通過檢測(cè)已免疫的恒河猴的血清中直接抗人TNFa的IgG同種型抗體的存在對(duì)體液應(yīng)答進(jìn)行測(cè)量。已經(jīng)使用ELISA測(cè)定法對(duì)體液應(yīng)答進(jìn)行了測(cè)定并表示為抗體滴度(稀釋度"給出大于(U的光密度)。所獲得的抗體滴度的結(jié)果報(bào)告于圖4中。來源于用KLH-TNFa(人)制劑免疫的恒河猴的血清具有抗-TNFa的IgG同種型抗體滴度，而來源于用單獨(dú)的KLH免疫的恒河猴的血清缺乏這些抗體。在接受了80fig的KLH-TNFa(人)kinoid的恒河猴血清中，其抗-TNFa抗體滴度更高。用TNFa細(xì)胞毒性測(cè)定法在L929細(xì)胞中已經(jīng)測(cè)定了該抗體的中和活性。這些測(cè)定的結(jié)果報(bào)告于圖5中。該KLH-TNFa(人)kinoid誘導(dǎo)的抗體具有很高的中和活性。實(shí)施例7-在huTNFa轉(zhuǎn)基因小鼠中抗TNFa自動(dòng)免疫接種的治療效果的評(píng)估在Taccmic公司(美國(guó))提供的5周齡的轉(zhuǎn)基因小鼠huTNFaB6.S幾-Tg(riV"N2中，對(duì)使用KLH-TNFa(人)kinoid制劑作為活性成份的抗TNFa的自動(dòng)免疫接種策略的治療功效進(jìn)行評(píng)估。這些TNFa轉(zhuǎn)基因小鼠在4至5周齡發(fā)生自發(fā)的多關(guān)節(jié)炎。A-材料和方法1-免疫接種小鼠在第0天、第7天和第28天通過肌內(nèi)途徑接受0.2mlISA中的乳劑注射。對(duì)四組的IO只小鼠已經(jīng)進(jìn)行的處理詳述如下-A組PBS:200filPBS陽(yáng)B組KLH:200piKLH-C組KLH畫TNF:200filKLH-TNF-D組KLH-TNF+MTX:200jilKLH:TNF和氨甲喋呤(lmg/kg),從免疫接種N。1開始和直到處死，一周三次(腹腔注射，每次注射200ji1)。小鼠已經(jīng)接受(i)在第0天和第7天30照的KLH-TNFa(人)kinoid制劑以及(ii)在第28天15嗎的同樣制劑的處理。在第35天，進(jìn)行每只小鼠的眼眶后血樣采集。在第57天，將小鼠處死的時(shí)候，也進(jìn)行血樣采集。2-關(guān)節(jié)炎的臨床檢查和定量評(píng)估在試驗(yàn)開始時(shí)已經(jīng)進(jìn)行了臨床檢查，并且隨后一周兩次進(jìn)行臨床檢查。由對(duì)所施處理一無所知的觀察者進(jìn)行評(píng)估。通過從0至4變化的分值屬性，對(duì)各個(gè)關(guān)節(jié)(手指、跗骨、踝關(guān)節(jié)、carpe)處關(guān)節(jié)炎的臨床嚴(yán)重程度進(jìn)行定量，其中0=正常；1=紅斑；2=腫脹；3=變形；和4=大部分變形或壞死。為了獲得每只動(dòng)物的關(guān)節(jié)炎分值，每天對(duì)這些分值已進(jìn)行總計(jì)。計(jì)算治療每天的每組平均值。3-關(guān)節(jié)炎的組織學(xué)檢查和定量評(píng)估在試驗(yàn)開始后笫57天處死所有的動(dòng)物。將后爪取下，固定于曱醛溶液中，脫鈣，然后脫水以及隨后包埋于石蠟塊中。然后，用切片機(jī)制備5jtm厚的組織切片。為了確保對(duì)該關(guān)節(jié)病變進(jìn)行正確的立體評(píng)估至少對(duì)每只爪進(jìn)行連續(xù)切片。然后用蘇木精和伊紅對(duì)載玻片標(biāo)本進(jìn)行染色并隨后在光學(xué)顯微鏡下觀察。根據(jù)3個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的尺度(0=正常；3=嚴(yán)重)對(duì)每塊切片進(jìn)行損傷的定量評(píng)估。這種組織學(xué)上的得分可以劃分為兩個(gè)參數(shù)一方面，軟骨的破壞和骨的破壞(軟骨的厚度以及骨的厚度、不規(guī)則性以及侵蝕的存在)；另一方面，炎癥(滑液增多、細(xì)胞炎癥性浸潤(rùn))。4國(guó)統(tǒng)計(jì)該結(jié)果數(shù)值以平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)離均差(SDM)給出。student，s檢驗(yàn)以及方差分析(ANOVA)已經(jīng)完成。B.結(jié)果l-體液應(yīng)答通過檢測(cè)已免疫的恒河猴的血清中直接抗人TNFa的IgG同種型抗體的存在對(duì)體液應(yīng)答進(jìn)行測(cè)量。通過ELISA測(cè)定法對(duì)體液應(yīng)答進(jìn)行測(cè)定并表示為抗體滴度(稀釋度"給出大于0.3的光密度)。所獲得的抗體滴度的結(jié)果報(bào)告于圖6中。2-關(guān)節(jié)炎的臨床檢查和定量評(píng)估臨床評(píng)分隨時(shí)間的變化臨床評(píng)分隨時(shí)間的變化報(bào)告于圖7中。恒河猴的治療(i)用KLH-TNFa(人)kinoid或(ii)組合應(yīng)用KLH-TNFa(人)kinoid和甲氨蝶呤(MTX)誘導(dǎo)通過臨床檢查評(píng)定的關(guān)節(jié)炎分值大部分在統(tǒng)計(jì)上顯著降低。通過比較，用KLH或PBS緩沖液處理的對(duì)照動(dòng)物所測(cè)定的關(guān)節(jié)炎分值低得多。疾病發(fā)生和病情惡化參數(shù)的評(píng)估疾病發(fā)生和病情惡化的評(píng)估報(bào)告于以下表4中。-通過臨床檢查已經(jīng)確定每只動(dòng)物疾病發(fā)生的天數(shù)。未患該病的動(dòng)物不予考慮。-分值"AMAX"相應(yīng)于試驗(yàn)期間每只動(dòng)物所得最高分。分值"AMAX"代表疾病嚴(yán)重性的參數(shù)。-發(fā)病率是指考慮每組動(dòng)物的總數(shù)目，試驗(yàn)結(jié)束之前發(fā)生關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物數(shù)目。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>*p<0.01相對(duì)于KLH**p<0.001相對(duì)于KLH弁p〈0.02相對(duì)于PBS##p<0.001相對(duì)于PBS(Studentt檢驗(yàn))該結(jié)果顯示通過KLH-TNFa和KLH-TNFa+曱氨蝶呤(MTX)的處理以統(tǒng)計(jì)上顯著的方式i秀導(dǎo)-與用單獨(dú)的KLH或PBS處理的對(duì)照動(dòng)物比較，推遲關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。-關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度下降；以及-患病動(dòng)物數(shù)量減少。3-關(guān)節(jié)炎的組織學(xué)檢查和定量評(píng)估結(jié)果報(bào)告于以下表5中。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>*p<0.01相對(duì)于KLH和相對(duì)于PBS**:p<0.001相對(duì)于KLH和相對(duì)于PBS(Studentt檢驗(yàn))通過KLH-TNFa和KLH-TNFa+甲氨蝶呤(MTX)的治療，以統(tǒng)計(jì)上顯著的方式，誘導(dǎo)組織學(xué)改變(破壞和關(guān)節(jié)炎癥參數(shù))的減少。C-結(jié)論根據(jù)實(shí)施例1用KLH-TNFa(人)kinoid制劑對(duì)huTNFa轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫接種，明顯保護(hù)動(dòng)物以避免炎癥和關(guān)節(jié)損壞，如臨床和組織學(xué)分析結(jié)果所示。用KLH-TNFa(人)kinoid制劑處理的動(dòng)物組，在關(guān)節(jié)保護(hù)方面，無法與組合應(yīng)用KLH-TNFa(人)kinoid制劑和甲氨蝶呤(MTX)治療的動(dòng)物組區(qū)分；這些結(jié)果可以用這樣的事實(shí)來解釋，即在這些試驗(yàn)條件下，單獨(dú)的KLH-TNFa(人)kinoid制劑的主要功效掩蓋了曱氨蝶呤最終的有益作用。用KLH處理的動(dòng)物組不能與用PBS緩沖液處理的動(dòng)物組區(qū)分。另外的結(jié)果，其涉及根據(jù)本發(fā)明的穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品的生物學(xué)特性，公布于以下實(shí)施例8至12。實(shí)施例8至12A.實(shí)施例8至12的材料和方法A丄試劑KLH購(gòu)自Intracel(圣地亞哥，加拿大)，hTNFa購(gòu)自BoehringerIngelhdm(曼海姆，德國(guó))，鼠TNFa購(gòu)自Cytolab(Rehovot，以色列)，hTNFa受體RI和RII、hTNFa、鼠IL2和鼠IFNy酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒購(gòu)自R&D系統(tǒng)(里爾，法國(guó))，ISA51佐劑購(gòu)自S印pic(巴黎，法國(guó))。A.2.動(dòng)物4-5周齡的雌性和雄性的雜合hTNF轉(zhuǎn)基因小鼠(1006-T)購(gòu)自Taconic，6-8周齡的雌性C57BI/6和Balb/c小鼠購(gòu)自CharlesRiver(L'Arbresles，法國(guó))。小鼠在無病菌的條件下銅養(yǎng)。兔子在CharlesRiverbreeding伺養(yǎng)(L'Arbresles，法國(guó))以及恒河猴在MDSPharma公司飼養(yǎng)(St-Germain-sur-L(，Arbresles，法國(guó))。A3.免疫原的制備通過公布于實(shí)施例1中的方法制備hTNFa-KLH免疫原。A,4.SDS/聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染和免疫印跡根據(jù)Laemmli的方法(Laemmli,U.K.(1970),A^wre227:680國(guó)85),在非還原條件下進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。在12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中，蛋白質(zhì)通過銀染和放射自顯影顯示(LeRoyF.，BisbalC.，SilholM.，MartinandC.，LebleuB.&SalehzadaT.(2001)。/ow簡(jiǎn)/5"tog/cfl/C^e附/s^v,276:48473-482.)或者用適當(dāng)?shù)目贵w進(jìn)行免疫印跡分析。A,5.凝膠過濾色"i普法將該雜絡(luò)物上樣至Superose610/300GL凝膠過濾柱(Amershambioscience,Orsay，法國(guó))，該柱用DPBS預(yù)平衡，并用與平衡時(shí)所用的相同緩沖液以0.2ml/min進(jìn)行洗脫。A,6.細(xì)胞培養(yǎng)小鼠L929細(xì)胞系(ATCC，CCLl)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI-1640中。純化的鼠脾細(xì)胞重懸于含有5%胎牛血清和50jiM2-卩-巰基乙醇的RPMI培養(yǎng)基中，并在培養(yǎng)基中單獨(dú)或與KLH(30照/ml)、hTNFa(3jig/ml)以及鼠TNFa(1ng/ml)抗原一起孵育。A.7.T細(xì)力包增殖測(cè)定法將抗原活化的脾細(xì)胞培養(yǎng)4天，然后用3H-胸腺嘧咬脫氧核苷放射脈沖18小時(shí)。18小時(shí)后將細(xì)胞收集于過濾器中，用p-射線計(jì)數(shù)器對(duì)摻入DNA的胸腺嘧咬脫氧核苷定量。刺激指數(shù)表示為[(來自被刺激細(xì)胞的cpm的平均值)-(來自未刺激細(xì)胞的cpm的平均值)/(來自未刺激細(xì)胞的cpm的平均值)。SI值大于2被認(rèn)為是陽(yáng)性。A.8.TNFa和受體測(cè)定法A&7._￡凝W愛琳錄合烤定.'用50ng/孔的hTNFaRI或RII預(yù)包被板測(cè)定與其靶受體結(jié)合的該雜絡(luò)物和hTNFa。系列稀釋的樣品與其受體孵育并且用生物素化的山羊多克隆抗-hTNFa抗體(R&DSystems)檢測(cè)。為了評(píng)估血清或IgG抑制hTNFa與其受體結(jié)合的能力，在將hTNFa轉(zhuǎn)移至固定hTNFaRI的平板之前，首先將其與系列稀釋的待測(cè)血清或IgG進(jìn)行預(yù)處理。封閉滴度用中和50%hTNFa結(jié)合的血清稀釋度的倒數(shù)表示。A&2恭/^77VFct拔沐,漆產(chǎn)jW定通過直接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(Elisa)測(cè)定免疫的和對(duì)照小鼠血清中的特異的抗-hTNFa抗體滴度。用50ng/孔hTNFa預(yù)包被的Elisa板與系列稀釋的免疫的和對(duì)照小鼠的血清孵育。用過氧化物酶兔抗-小鼠IgG(Zymed,加拿大)檢測(cè)特異的IgG。最終滴度以給出0.3的光密度值的最高樣品稀釋度的倒數(shù)表示。A&j.勿應(yīng)廚f;C量通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法對(duì)血清和培養(yǎng)液上清中的hTNFa、鼠IL-2和鼠IFNy進(jìn)行測(cè)定。A.9.hTNFa的生物測(cè)定用L929細(xì)胞毒性測(cè)定法(Bloquel2004)評(píng)估hTNFa的活性。系列稀釋的hTNFa和雜絡(luò)物與L929細(xì)胞在放線菌素D(lfig/ml)存在條件下孵育18小時(shí)，并通過MTT測(cè)定法確定存活細(xì)胞的數(shù)量。在血清和IgG與hTNFa孵育之后類似地測(cè)定高度免疫血清或IgG中和hTNFa活性的能力。中和滴度用中和50%的hTNFa活性的血清稀釋度的倒數(shù)表示。A.IO.免疫接種通過3或4次肌肉注射以ISA51為佐劑的kinoid(Seppic)或?qū)φ罩苿?5-30fig)免疫動(dòng)物。在第3次或第4次免疫之后8至12天以及處死時(shí)收集血清。A.ll.抗體純化免疫球蛋白(IgG)和特異的抗-hTNFa或抗-KLH抗體是從免疫小鼠或?qū)φ招∈蟮难逵玫鞍踪|(zhì)GIgG純化試劑盒(Pierce)或基于hTNF或KLH偶聯(lián)的瓊脂糖4B柱的親和層析法(Sigma化學(xué)試劑公司，圣路易斯，Mo)。用BIAcore3000技術(shù)確定親合力(Lofas，S.，JohnssonB.(1990)/CAe肌5VcC^e/w.Co附附w".21:1526;Karlsson，R.,FaitA.,(1997)//柳附Mff0A200:121)。入.12.致死休克在最后的免疫注射之后10天，用存在于溶于PBS的20mgD-半乳糖胺中的hTNFa腹膜注射刺激對(duì)照和hTNFa-kinoid免疫的小鼠(C57B1/6或TTg)的反應(yīng)。注射80-卯％的hTNFa致死劑量記錄注射后24小時(shí)存活的動(dòng)物(LehmannVJExpMed1997657)。在這些試驗(yàn)中，對(duì)注射TNFa后8小時(shí)處死的小鼠分組，進(jìn)行肝臟的肉目,查。A.13.關(guān)節(jié)炎追蹤人TNFa轉(zhuǎn)基因小鼠1006-T從第8周齡起罹患自發(fā)性關(guān)節(jié)炎，如Tgl97品系(Keffer，J.，Probert,L.，Cazlaris,H.,Georgopoulos，S.，Kaslaris，E.，Kioussis,D.&Kollias,G.(1991)五附6</10，4025-31)。用盲法監(jiān)測(cè)小鼠四個(gè)爪子的關(guān)節(jié)炎跡象。對(duì)每側(cè)肢體，將臨床嚴(yán)重程度評(píng)分為0(正常)至3(嚴(yán)重的炎癥伴隨變形)(Williams，R.O.，F(xiàn)eld-mann.M和Maini，R.N.(1992)iVoc7Va#爿cadScZC/5^"，W-《;Thwin,M.M.，Douni，E"Aidinis，V"Kollias，G"Kodama，K"Sato，K"Satish,R丄.,Mahendran，R.&Gopalakri-shnakone，P.(2004)y4w/rW^s及es2%w6,R282-94)。計(jì)算每個(gè)治療組中臨床觀察每天的平均關(guān)節(jié)炎分值。腿被分離切片并如他處所述進(jìn)行加工以用于組織學(xué)分析。(Bessis，N.，Guery，L，Mantovani，A.，Vecchi，A.,Sims，J.E.，F(xiàn)radelizi，D.&Boissier，M.C.(2000)五"r//ww"wtf/30,867-75)。每只爪切出大量的切片并且至少檢查四個(gè)切片。用盲法評(píng)估在膝關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)和足部每個(gè)關(guān)節(jié)的損傷，如先前所述用4點(diǎn)劃分法(0-3，其中0是正常以及3是嚴(yán)重)或者對(duì)滑膜炎(滑液增多，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn))或者關(guān)節(jié)損傷(骨和軟骨厚度、不規(guī)則性以及出現(xiàn)侵蝕)進(jìn)行評(píng)估(Saidenberg-Kermanac'h，N.，Corrado,A.，Lemeiter,D.，deVernejoul,M.C.，Boissier,M.C&Cohen畫Solal，M.E.(2004)Bone35，1200-7，Miellot，A.，Zhu，R.，Diem,S.，Boissier,M.C.，Herbelin，A.&Bessis，N.(2005)EurJImmunol35，3704-13)。114.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用StatView版本5.0軟件完成所有的統(tǒng)計(jì)分析。方差分析被用于分析重復(fù)的測(cè)量，例如臨床評(píng)分、患肢數(shù)量、增加體重、患病率。為了定量資料的比較，采用非參數(shù)MannWhitney檢驗(yàn)。使用Yates修正的卡方檢驗(yàn)來比較定性數(shù)據(jù)。B.實(shí)施例8至12的結(jié)果實(shí)施例8:穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品giTNFakinoid)的生物學(xué)特性A龍瘦^化橫^人TNFakinoid是KLH-hTNFa雜絡(luò)物，其在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中遷移為3條帶，呈現(xiàn)的分子量(MW)為大約250、105和40kDa(圖8-a)。相當(dāng)大比例的kinoid不遷移并可見于積層膠水平。hTNFa和KLH都用特異抗體進(jìn)行鑒定(圖8-a)。用1251-標(biāo)記的kinoid在KLH或者h(yuǎn)TNFa上獲得類似的遷移圖，如圖8-b所示。在superose6凝膠過濾上分辨出4個(gè)峰。一個(gè)峰在排阻體積中而其它3個(gè)是分子量440、158和13.7kDa(圖8-c)。及7TVFct^#活#的缺關(guān)當(dāng)用標(biāo)準(zhǔn)的L929檢驗(yàn)評(píng)估，即使在最高濃度(圖8-d)下，Kinoid缺乏任何TNFa-誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。盡管其令人如愿的缺乏生物活性，人TNFoc-kinoid與hTNFa受體I(p55)和受體I1(p75)都結(jié)合(圖8-e)。實(shí)施例9:在人TNFoc轉(zhuǎn)基因小鼠(TTg小鼠)中抗-TNFa抗體的誘導(dǎo)在TTg小鼠中用TNFockinoid免疫誘導(dǎo)高滴度的抗-TNFoc抗體，然而用失活的TNFa或用對(duì)照KLH不能誘導(dǎo)任何可檢測(cè)的抗-TNFa抗體。與此形成對(duì)照的是，在Balb/c小鼠中用kinoid或者失活的TNFa都誘導(dǎo)產(chǎn)生抗-TNFa抗體(圖9-a)。在TTg和Balb/c小鼠中，KLH以及kinoid免疫導(dǎo)致產(chǎn)生抗-KLH抗體(未顯示)。如用標(biāo)準(zhǔn)的L929細(xì)胞毒性試驗(yàn)所評(píng)估的，源于kinoid免疫的TTg小鼠的高稀釋度的高度免疫血清，甚至在高稀釋度也能中和TNFa的生物活性，然而來自于KLH免疫小鼠的血清無此效應(yīng)(圖9-b)。加強(qiáng)免疫后2-4周其活性達(dá)峰值，在3個(gè)月內(nèi)顯著下降(>50%)(圖9-c)并且阻斷TNFaRl和R2受體的結(jié)合(圖9-d)?？?hTNFa抗體主要屬于IgGl(52%)和IgG2a(48%)。當(dāng)用同種型Elisa試劑盒檢測(cè)時(shí)，IgG3、IgM和IgE的量可忽略不計(jì)。當(dāng)用Biacore技術(shù)進(jìn)行評(píng)估時(shí)，最后從高度免疫血清純化的IgG顯示出對(duì)KD范圍從5x10-8]\1至1(T1(}M的huTNFa的高親和力，并且阻斷hTNFa與其受體I和II的結(jié)合(圖9-f)。這些結(jié)果解釋了為什么在免疫的小鼠中不能檢測(cè)到循環(huán)中的hTNFa，相反在未免疫小鼠中其以9pg/ml存在。實(shí)施例10:穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品(hTNFakinoid)的安全性在不同品系的小鼠(Balb/c;C57B1/6;Swiss)、兔子或恒河猴中注射高劑量的TNFakinoid(—直到100pg)不產(chǎn)生局部或系統(tǒng)的臨床副作用。而且，雖然在D-半乳糖胺處理的C57B1/6小鼠中施用天然hTNFoc導(dǎo)致在24小時(shí)內(nèi)(8只鼠中有8只)死亡，但hTNFockinoid無此效應(yīng)。此外，kinoid免疫不引發(fā)不良反應(yīng)，其包括不希望產(chǎn)生的抗-TNFot細(xì)胞自身免疫應(yīng)答以及對(duì)免疫的TTg小鼠的長(zhǎng)期生長(zhǎng)和存活的損害。正如通過對(duì)T-細(xì)胞增殖和在細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子(IL-2和IFNy)的產(chǎn)生進(jìn)行的檢測(cè)，來源于kinoid免疫的TTg小鼠的脾細(xì)胞體外培養(yǎng)不引發(fā)任何細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)自身hTNFa的免疫應(yīng)答(圖IO(A、B、C)-a)。相反，kinoid免疫的Balb/c小鼠與對(duì)照的非免疫動(dòng)物(未顯示)比較，顯示出顯著的對(duì)異源hTNFa的細(xì)胞介導(dǎo)免疫。與對(duì)照比較在免疫的小鼠中沒有檢測(cè)到對(duì)鼠TNFot的細(xì)胞應(yīng)答(圖.10(A,B，C)-b)。最后，在免疫的TTg小鼠中，對(duì)KLH抗原有可比較的陽(yáng)性T細(xì)胞應(yīng)答，其等同于接受KLH的對(duì)照動(dòng)物所觀察到的，該應(yīng)答不具有可檢測(cè)到的臨床效應(yīng)(圖IO(A、B、C)-c)。kinoid免疫小鼠(11=8)的生長(zhǎng)，當(dāng)通過測(cè)量體重，與非免疫動(dòng)物(11=7)對(duì)照一直到免疫后50天是相當(dāng)?shù)?，但在更晚的階段變得明顯更好(圖ll-a)。在免疫后120天處死的小鼠用于關(guān)節(jié)組織的組織學(xué)比較研究。更長(zhǎng)時(shí)間的追蹤其它組的TTg小鼠以便觀察其關(guān)節(jié)炎的臨床進(jìn)程。在這些動(dòng)物中，由于其關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度在第150天將對(duì)照鼠(11=3)處死。相反3只hTNFa-kinoid免疫的TTg小鼠一直保持未患嚴(yán)重關(guān)節(jié)炎(現(xiàn)在已經(jīng)超過210天)。實(shí)施例11:通過中和穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品(hTNFakinoid)誘導(dǎo)的抗體預(yù)防TNFa-半乳糖胺致死性休克。腹膜內(nèi)施用TNFa在半乳糖胺存在時(shí)可引發(fā)小鼠致死性休克。該效應(yīng)是劑量依賴的。如表1所示，在C57B1/6小鼠中該致死性休克在劑量為ll嗎時(shí)發(fā)生，并且在TTg小鼠中所記錄的死亡劑量低至l嗎。所有的非接種的對(duì)照死亡，但用11叫hTNFa處理的hTNFa-kinoid免疫的C57B1/6小鼠沒有死亡(表6)。值得注意的是該免疫動(dòng)物不但抵抗致死性休克，在臨床上它們還保持健康。而且，間隔一個(gè)月重復(fù)注射hTNFa-半乳糖胺對(duì)其沒有影響(未顯示)。重要的是，kinoid免疫的TTg小鼠，也抵抗hTNFa依賴的致死性休克，而對(duì)照TTg小鼠死亡(表6)。施用更高劑量的hTNFa(2jig)對(duì)hTNFakinoid免疫的TTg小鼠沒有影響(表6)。這些動(dòng)物在經(jīng)歷重復(fù)的hTNFa沖擊2周后存活下來并且至今保持完全健康。在免疫的小鼠中對(duì)休克的防護(hù)是由于中和抗-TNFa抗體。然而在施用TNFa(11照)-D-半乳糖胺1小時(shí)之后，接受非特異IgG(1mg)的對(duì)照C57B1/6小鼠在24小時(shí)內(nèi)死亡，給予特異的純化多克隆IgG(其來源于高度免疫血清)的小鼠存活下來(PO.OOl相對(duì)于對(duì)照組)。在這些試驗(yàn)中，另外的對(duì)照分組和免疫小鼠在施用hTNFa后8小時(shí)被處死，肉眼器官檢查顯示對(duì)照中肝萎縮，但免疫的小鼠中無此現(xiàn)象(p0.02相對(duì)于對(duì)照)(表7)。實(shí)施例12:用穩(wěn)定的免疫原產(chǎn)品(hTNFakinoid)免疫接種TTg小鼠保護(hù)其不發(fā)生關(guān)節(jié)炎用KLH/TNF-akinoid免疫接種7周齡的TTg小鼠并且在120天的期限內(nèi)進(jìn)4亍監(jiān)測(cè)。對(duì)照組由用KLH處理和用鹽水處理的小鼠組成，都未影響關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。所有對(duì)照小鼠患多關(guān)節(jié)炎，伴隨炎癥和關(guān)節(jié)變形(圖11),而kinoid免疫接種的小鼠僅患邊緣關(guān)節(jié)疾病(p0.0001)(圖4-c)，伴隨臨床征象開始的延遲(P〈0.05)、最高臨床指數(shù)的低分值(pO.01)(表8)和顯著減少的彌散性疾病以及少得多的患肢(PO.OOOl)(圖ll-b)。雖然所有動(dòng)物發(fā)生臨床的關(guān)節(jié)炎，該病僅在TNF-akinoid免疫的組中逆轉(zhuǎn)(圖ll-d);在120天中，與對(duì)照組相反，處理組中的所有動(dòng)物除一只以外均得到保護(hù)(表8)(P<0.001)。組織學(xué)評(píng)估顯示經(jīng)過處理的動(dòng)物中炎癥和關(guān)節(jié)損傷明顯減少，其顯示低組織學(xué)分值(pO.01)(表8);相反，對(duì)照小鼠顯示明顯的關(guān)節(jié)炎跡象，伴隨增殖性滑膜炎和單核及多形核細(xì)胞的細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)伴隨軟骨和骨侵蝕。在TNFa-kinoid處理的小鼠中組織學(xué)上的滑膜炎或破壞的發(fā)生顯著減少沐8)。表6.TNFa依賴的致死性休克給予對(duì)照和kinoid免疫的C57B1/6和TTg小鼠最后的免疫加強(qiáng)之后10天在D-半乳糖胺存在下通過腹腔注射給與溶于O.lmlPBS的hTNFa通過動(dòng)物存活評(píng)估的致死性休克的預(yù)防24小時(shí)后僅在免疫小鼠中觀察到。*P<0.01相對(duì)于對(duì)照(卡方檢驗(yàn))<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>試驗(yàn)l試驗(yàn)2111216/60/66/66/66/66/66/66/60/6未做未做0/66/6*未做6/66/6*表7.通過高度免疫IgG對(duì)TNFa依賴的休克的中和在靜脈注射蛋白質(zhì)G純化的小鼠IgG(來源于對(duì)照和kinoid免疫的C57BI/6小鼠)之前30分鐘，小鼠組通過腹腔注射接受溶于0.1mlPBS的D-半乳糖胺和hTNFa。*P<0.001相對(duì)于對(duì)照(卡方檢驗(yàn))卞P<0.02(卡方檢驗(yàn))<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>表8.在TNF-akinoid(KLH-TNF)免疫接種的小鼠和在對(duì)照(KLH)小鼠中第120天時(shí)關(guān)節(jié)炎的臨床和組織學(xué)分值。通過組織學(xué)評(píng)估的炎癥/損壞的發(fā)病率是炎癥/損壞的分值^0.5的小鼠的數(shù)目。Amax:關(guān)節(jié)炎臨床最高分值。結(jié)果以平均數(shù)士SEM給出。*p<0.05相對(duì)于KLH，卞p〈0.01相對(duì)于KLH<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>權(quán)利要求1.用于制備抗-TNFα免疫原產(chǎn)品的方法，包括步驟a)提供含有TNFα的溶液；b)向步驟a)的含有TNFα的溶液中加入EDTA；c)向在步驟b)結(jié)束時(shí)獲得的溶液中加入載體蛋白質(zhì)；d)向在步驟c)結(jié)束時(shí)獲得的液體混合物中加入戊二醛；e)從在步驟d)結(jié)束時(shí)獲得的溶液中除去戊二醛以及TNFα和所述載體蛋白質(zhì)的游離分子；f)向在步驟e)結(jié)束時(shí)獲得的溶液中加入甲醛，并在96小時(shí)至192小時(shí)時(shí)間范圍內(nèi)維持甲醛的存在；g)向在步驟f)結(jié)束時(shí)獲得的溶液中加入阻斷與甲醛反應(yīng)的試劑；以及h)從在步驟h)結(jié)束時(shí)獲得的溶液中除去甲醛和阻斷試劑，從而獲得含有上述抗-TNFα免疫原產(chǎn)品的溶液。2.權(quán)利要求l的方法，其中步驟b)包括下列步驟bl)向含有步驟a)的TNFa的溶液中加入EDTA;以及b2)向在步驟bl)結(jié)束時(shí)獲得的溶液中加入DMSO。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的任意一項(xiàng)的方法，其中步驟d)包括下列步驟dl)向在步驟c)結(jié)束時(shí)獲得的液體混合物中加入戊二醛；以及d2)向在步驟dl)結(jié)束時(shí)獲得的TNFa和所述載體蛋白質(zhì)之間的雜絡(luò)物中加入EDTA。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3的任意一項(xiàng)的方法，其中在步驟a)TNFa的濃度范圍從0.1mg/ml至50mg/ml。5.根據(jù)權(quán)利要求1至3的任意一項(xiàng)的方法，其中在步驟a)TNFa的濃度范圍從0.5mg/ml至10mg/ml。6.根據(jù)權(quán)利要求1至5的任意一項(xiàng)的方法，其中在步驟b)EDTA的終濃度范圍從1mM至500mM。7.根據(jù)權(quán)利要求2至6的任意一項(xiàng)的方法，其中在步驟b2)DMSO的終濃度范圍從0.5%v/v至20%v/v。8.根據(jù)權(quán)利要求1至7的任意一項(xiàng)的方法，其中在步驟c)TNFa對(duì)所述載體蛋白質(zhì)的摩爾比率的范圍從5:1至100:1。9.根據(jù)權(quán)利要求1至8的任意一項(xiàng)的方法，其中在步驟d)戊二醛的終濃度范圍從0.05%w/w至0.5%w/w。10.根據(jù)權(quán)利要求3至9的任意一項(xiàng)的方法，其中在步驟d2)EDTA的終濃度范圍從1mM至10mM。11.根據(jù)權(quán)利要求1至10的任意一項(xiàng)的方法，其中在步驟e)通過進(jìn)行透析，通過應(yīng)用滲濾的超濾或者通過正切流動(dòng)過濾(TFF)除去戊二醛。12.根據(jù)權(quán)利要求l至ll的任意一項(xiàng)的方法，其中在步驟f)曱醛的終濃度范圍從1%w/w至10%w/w。13.根據(jù)權(quán)利要求1至12的任意一項(xiàng)的方法，其中在步驟f)曱醛的終濃度范圍從2%w/w至5%w/w。14.根據(jù)權(quán)利要求1至13的任意一項(xiàng)的方法，其中在步驟f)在從120小時(shí)至168小時(shí)的時(shí)間范圍內(nèi)維持甲醛的存在。15.根據(jù)權(quán)利要求1至14的任意一項(xiàng)的方法，其中在步驟g)阻斷試劑由甘氨酸組成。16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中在步驟g)甘氨酸的終濃度范圍從0.01M至10M。17.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中在步驟g)甘氨酸的終濃度范圍從0.05M至2M。18.根據(jù)權(quán)利要求1至14的任意一項(xiàng)的方法，其中在步驟g)阻斷試劑由賴氨酸組成。19.權(quán)利要求18的方法，其中在步驟g)賴氨酸的終濃度范圍從0.01M至10M。20.權(quán)利要求18的方法，其中在步驟g)賴氨酸的終濃度范圍從0.05M至0.5M。21.根據(jù)權(quán)利要求1至20的任意一項(xiàng)的方法，其中在步驟h)通過進(jìn)行透析，通過應(yīng)用滲濾的超濾或者通過正切流動(dòng)過濾(TFF)除去甲醛和阻斷試劑。22.根據(jù)權(quán)利要求1至21的任意一項(xiàng)的方法，其中所述載體蛋白質(zhì)選自由白喉類毒素(DT)及其突變體、破傷風(fēng)毒素(TT)、匙孔槭血藍(lán)素(KLH)、以及結(jié)核菌素的純化蛋白質(zhì)衍生物(PPD)、源于腦膜炎奈瑟氏球菌的OMPC、結(jié)核菌素的純化蛋白質(zhì)衍生物(PPD)、牛血清白蛋白(BSA)和流感嗜血桿菌來源的蛋白質(zhì)D組成的組。23.根據(jù)權(quán)利要求1至22的任意一項(xiàng)的方法，其中所述載體蛋白質(zhì)由匙孔槭血藍(lán)素(KLH)組成。24.用于制備疫苗組合物的方法，包括步驟a)通過實(shí)施權(quán)利要求1至23的任意一項(xiàng)的方法制備抗-TNFa免疫原產(chǎn)品；以及b)將在步驟a)制備的所述抗-TNFa免疫原產(chǎn)品與一種或多種免疫佐劑組合。25.抗-TNFoc免疫原產(chǎn)品，其具有一種或多種下列技術(shù)特征(i)其包括(a)通過少于40。/o的共價(jià)鍵和(b)通過超過60%的非共價(jià)鍵結(jié)合在一起的(l)TNF-a分子和(2)載體蛋白質(zhì)分子；(ii)其顯示TNF-oc對(duì)所述載體蛋白質(zhì)的摩爾比率范圍從40:1至60:1;(iii)其誘導(dǎo)產(chǎn)生TNFa中和能力(NC5Q)小于1/1000的抗-TNFa抗體；以及(iv)在L929細(xì)胞毒性試驗(yàn)中，其具有大于50ng/ml和甚至大于400ng/ml的EDs。值。26.免疫原組合物，包括(i)根據(jù)權(quán)利要求l至23的任意一項(xiàng)的方法制備的抗-TNFa免疫原產(chǎn)品，或(ii)根據(jù)權(quán)利要求25的抗-TNFa免疫原產(chǎn)品，與一種或多種可藥用賦形劑組合。27.疫苗組合物，包括(i)根據(jù)權(quán)利要求l至23的任意一項(xiàng)的方法制備的抗-TNFa免疫原產(chǎn)品，或(ii)根據(jù)權(quán)利要求25的抗-TNFa免疫原產(chǎn)品，與一種或多種免疫佐劑組合。全文摘要本發(fā)明涉及TNFα和載體蛋白質(zhì)的抗原雜絡(luò)物，其用于在哺乳動(dòng)物中獲得體液免疫應(yīng)答，產(chǎn)生中和TNFα的生物活性的抗體，還涉及其制備方法。該抗原蛋白質(zhì)TNFα和載體蛋白質(zhì)在EDTA存在下結(jié)合，使用戊二醛、甲醛和甘氨酸以及，在某些實(shí)施方案中使用DMSO，從而提高其免疫原性和穩(wěn)定性。可以使用下列蛋白質(zhì)作為載體匙孔槭血藍(lán)素(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、滅活的細(xì)菌毒素例如破傷風(fēng)毒素或白喉類毒素(TT和DT)、結(jié)核菌素的純化的蛋白質(zhì)衍生物(PPD)和來自流感嗜血桿菌的蛋白質(zhì)D。文檔編號(hào)A61K47/48GK101222941SQ200680025994公開日2008年7月16日申請(qǐng)日期2006年5月24日優(yōu)先權(quán)日2005年5月24日發(fā)明者D·扎古里,H·勒布阿內(nèi)克申請(qǐng)人:尼奧瓦克斯公司