專利名稱：通過干擾cd99l2阻斷白細(xì)胞遷出和炎癥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗炎癥方法，特別是調(diào)節(jié)白細(xì)胞的經(jīng)內(nèi)皮遷移，和阻 斷白細(xì)胞經(jīng)內(nèi)皮遷移的組合物。
背景技術(shù)：
本說明書中用數(shù)字引用的參考文獻(xiàn)列于實施例后面的"參考文 獻(xiàn)"一節(jié)中。
先前的研究(1-12)已經(jīng)證實了血小板/內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1 (PECAM)在嗜中性粒細(xì)胞(PMN)、單核細(xì)胞(Mo)和自然殺傷 細(xì)胞(NK)的經(jīng)內(nèi)皮遷移(TEM)中的關(guān)鍵作用。但是，甚至在最 理想的環(huán)境下，抗-PECAM試劑僅僅阻斷白細(xì)胞流入的80-90%。雖 然這與通過靶向單個分子所獲得的炎癥阻斷一樣好或更好，但是剩余 的10-20%的未阻斷的白細(xì)胞可能代表了在慢性病癥下的臨床上重要 的群體。而且，至少有一些PECAM不起作用的炎性模型。 炎癥中白細(xì)胞的遷移
白細(xì)胞向炎癥部位的遷移涉及由幾個粘附分子家族介導(dǎo)的幾個 步驟。我們的研究集中在經(jīng)內(nèi)皮遷移(TEM)的步驟上，因為它是白 細(xì)胞不可逆轉(zhuǎn)地進(jìn)入發(fā)炎組織的步驟。我們先前已經(jīng)描述了在所有 Mo和PMN表面上表達(dá)并且在內(nèi)皮細(xì)胞邊界上濃縮的PECAM在TEM 中的關(guān)鍵作用。在最佳控制的條件下，抗-PECAM試劑在體外和許多 體內(nèi)模型中阻斷80-90%的TEM。但是，總是有至少10-20%的白細(xì)胞
5逃避了這種阻斷(l, 2, 4, 6, 8)。而且，至少描述了一種體內(nèi)模型， 其中抗-PECAM抗體沒有效果(9)。靶向清除PECAM產(chǎn)生在急性炎 性應(yīng)答中沒有顯著缺陷的小鼠(26)。因此，存在獨(dú)立于PECAM的 TEM的機(jī)制。了解這些機(jī)制將導(dǎo)致更好地理解炎癥。以這些途徑為 靶標(biāo)可能是針對PECAM的抗炎癥治療的有用的輔助手段。 白細(xì)胞遷出(emigration)中分子上可分割的歩驟 炎性反應(yīng)是一把雙刃劍。白細(xì)胞移動到炎癥病灶對于感染的快速 消退和由多#損傷引起的組織損傷的恢復(fù)是關(guān)鍵的。'另 一方面，大多 數(shù)人類病理學(xué)是由于誤導(dǎo)或拖延的炎癥引起的，造成宿主組織被損 傷。常見的例子包括炎性關(guān)節(jié)病、肺纖維化和動脈粥樣硬化癥，其通 常被看作一種動脈壁的慢性炎性疾病(13)。因此，已經(jīng)將大量的注 意力集中于在分子水平上了解炎癥，以希望可以更好地調(diào)節(jié)炎癥。
白細(xì)胞遷出的過程在下列工作模型中分為 一 系列連續(xù)的粘附事 件。我們可將白細(xì)胞遷出分為這些步驟，因為我們具有可阻斷每個步 驟的試劑。
虞動。在第一個步驟中， 一些進(jìn)入毛細(xì)管后小靜脈的炎癥區(qū)域的 白細(xì)胞在一個被適當(dāng)?shù)胤Q為"滾動"的過程中離開循環(huán)流并松散、暫時 且可逆地與內(nèi)皮細(xì)胞表面粘附。粘附分子的選擇家族和它們的唾液酸 化的-lexisX-修飾的配體表現(xiàn)為主要負(fù)責(zé)這種初始相互作用(在(M， 15)中綜述)。滾動的白細(xì)胞直接與內(nèi)皮接觸，將它們暴露于多種能 夠促進(jìn)接下來的步驟一活化白細(xì)胞特異性整合蛋白 一的信號。白細(xì)胞 與E-選擇素的結(jié)合本身可能就是一種充分的信號(16)?？蛇x地或另 外，被選擇素限制的白細(xì)胞現(xiàn)在能夠被血小板活化因子(17)或其他 脂質(zhì)調(diào)節(jié)物(18)、與內(nèi)皮表面糖胺聚糖結(jié)合的趨化因子(19)、可溶 性化學(xué)引誘物(20)或交聯(lián)白細(xì)胞CD31的配體(3， 21， 22)活化。
^/^。在它們的整合素被活化為高親和力結(jié)合狀態(tài)后，白細(xì)胞停 止?jié)L動并緊密地與內(nèi)皮表面粘附。對于表達(dá)(31和P2家族的整合素的 單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，每種整合素的參與可能足以促進(jìn)粘附，以利于 接下來的變移(transmigration) (23)。鑒定的(31和(32整合素介導(dǎo)的粘附的反受體包括ICAM-1、 ICAM-2和VCAM-l,它們是免疫球蛋 白基因超家族的成員。與內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)腔表面緊密結(jié)合的白細(xì)胞快速蠕 動到細(xì)胞間連接處，該過程需要粘附和解粘附的連續(xù)循環(huán)，因為白細(xì) 胞在它們的前端粘附并且在后端釋放。
^r移。在到達(dá)連接處后，白細(xì)胞在緊密相對的內(nèi)皮細(xì)胞間插入偽 足并以阿米巴樣的方式蠕動通過，同時保持與內(nèi)皮細(xì)胞緊密接觸。這 一步驟被稱為血細(xì)胞滲出、經(jīng)內(nèi)皮遷移(TEM)或變移。該步驟涉及 血小板/內(nèi)皮細(xì)胞粘I^分子-l(PECAM,也稱為CD31),它差免疫球 蛋白超家族的一種CAM (24)，在白細(xì)胞和血小板表面表達(dá)并且在內(nèi) 皮細(xì)胞間的邊界中濃縮。白細(xì)胞PECAM和內(nèi)皮PECAM之間的接觸 對于大多數(shù)嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞在體外(1)和在體內(nèi)(2， 8)的變 移是關(guān)鍵的。這包括結(jié)合PECAM結(jié)構(gòu)域1和/或2并且阻斷該關(guān)4建位 點的mAb,或至少包含結(jié)構(gòu)域1的可溶性重組PECAM-IgG嵌合體， 它們竟?fàn)幮缘匾种七@種相互作用(4, 6， 25)。因此，依賴于PECAM 的變移是抗炎治療的有希望的靶標(biāo)。
盡管對分子和白細(xì)胞滾動和與內(nèi)皮頂面粘附的機(jī)理的了解具有 一定的進(jìn)展(15， 46, 47),但是現(xiàn)在對經(jīng)內(nèi)皮遷移的了解仍然明顯 缺乏。在迄今研究的大多數(shù)炎性病癥中，PEC AM顯然在大多數(shù)PMN 和單核細(xì)胞的TEM中起重要作用。PECAM介導(dǎo)變移而不影響頂部粘 附的功能將TEM定義為白細(xì)胞遷出中的獨(dú)立步驟。然而，雖然 PECAM是已經(jīng)被鑒定為在TEM中起獨(dú)特作用的唯一分子，但是它顯 然不是TEM中涉及的唯一分子。
CD99
CD99是一種32kD的高度0-糖基化的分子，表達(dá)于大多數(shù)白
等人，2002， Nat Immunol 3 : 143-150)。直到最近，CD99仍屬于未知的 基因家族(Aubrit, F.等人.1989, Eur J Immunol 19: 1431 - 1436; Gelin; C.等人，1989， EMBO J. 8:3253-3259)。但是，隨著人和鼠基因組的克 隆，預(yù)測了一種相關(guān)蛋白質(zhì)，CD99L2 (Suh, Y.H.等人，2003， Gene307.'63-76)。已經(jīng)描述了 CD99為T細(xì)胞和胸腺細(xì)胞上的共刺激分子， 但它在經(jīng)內(nèi)皮遷移中的作用僅僅在最近才被認(rèn)識到(Schenkel等人)。 類似于PECAM-1(CD31), CD99在變移中以嗜同性方式起作用。白細(xì) 胞或內(nèi)皮細(xì)胞上CD99的阻斷作用阻斷了單核細(xì)胞的血細(xì)胞滲出，兩 種細(xì)胞類型上的CD99的同時阻斷也是如此。對于嗜中性粒細(xì)胞的血 細(xì)胞滲出也是這樣的。抗-CD99單克隆抗體的Fab片段在一 種經(jīng)內(nèi) 皮遷移的體外模型中阻斷了超過90%的血細(xì)胞滲出(Schenkel等人)。 CD99在血細(xì)胞滲出中控制的^驟與PECAM-1控制的步驟不同。同 時阻斷CD99和PECAM-1產(chǎn)生了加成效果，基本上完全消除了血細(xì) 胞滲出(Schenkel等人)。依賴于CD99的步驟遠(yuǎn)離被PECAM-1控制 的步驟。在依賴于CD99的步驟中被阻斷的白細(xì)胞在穿過內(nèi)皮連接點 的中途^d亭止。白細(xì)胞的最前端在內(nèi)皮細(xì)胞之下，但是細(xì)胞的大部分 仍然在連接點中，并且尾端保持在單層的頂面上。這證實了血細(xì)胞滲 出被在兩個獨(dú)立步驟中作用的至少兩組獨(dú)立的嗜同性相互作用控制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了 一種調(diào)節(jié)白細(xì)胞經(jīng)內(nèi)皮遷移(TEM)的方法，所述方 法包括抑制CD99L2-介導(dǎo)的白細(xì)胞穿過內(nèi)皮的變移。在該方法的一個 實施方式中，CD99L2位于內(nèi)皮細(xì)胞上。在另一個實施方式中，CD99L2 位于白細(xì)胞上。在一個進(jìn)一步的實施方式中，TEM在活化的內(nèi)皮細(xì) 胞之間發(fā)生。在一個另外的實施方式中，活化的內(nèi)皮細(xì)胞由于與選自 腫瘤壞死因子(TNF)和白介素-1 (IL-1 )的促炎細(xì)胞因子接觸而被 活化。在另一實施方式中，內(nèi)皮細(xì)胞在保持在組織培養(yǎng)物中的切下的 內(nèi)皮組織上發(fā)現(xiàn)。
在本方法的一個特定實施方式中，內(nèi)皮細(xì)胞在體外在透性膜上培 養(yǎng)。在本實施方式的一個方面，內(nèi)皮細(xì)胞是人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (HUVEC )。在另一實施方式中，發(fā)生穿過組織中的內(nèi)皮細(xì)胞的TEM, 所述組織選自動脈內(nèi)皮、靜脈內(nèi)皮、小靜脈內(nèi)皮和毛細(xì)血管后小靜脈 內(nèi)皮。在另一實施方式中，發(fā)生進(jìn)入炎癥部位的TEM。本發(fā)明進(jìn)一 步提供一種抑制CD99L2 -介導(dǎo)的白細(xì)胞變移的方 法，其包括將白細(xì)胞、內(nèi)皮、或此兩者與CD99L2結(jié)合抑制劑接觸。 在本方法的一個實施方式中，CD99L2結(jié)合抑制劑是一種抗-CD99L2 抗體分子。在另一實施方式中，抗-CD99L2抗體分子具有抗CD99L2 單克隆抗體的結(jié)合特異性。在一個進(jìn)一步的實施方式中，CD99L2結(jié) 合抑制劑是一種可溶性CD99L2分子或其片段。
本發(fā)明也提供一種在體內(nèi)治療炎性病癥的方法，所述方法包括抑 制CD99L2-介導(dǎo)的白細(xì)胞的經(jīng)內(nèi)皮ii移(TEM)。在本方法的一個 實施方式中，發(fā)生穿過組織中的內(nèi)皮細(xì)胞的TEM,所述組織選自動 脈內(nèi)皮、靜脈內(nèi)皮、毛細(xì)血管內(nèi)皮、小靜脈內(nèi)皮和毛細(xì)血管后小靜脈 內(nèi)皮。在另一實施方式中，炎性病癥是一種急性炎性病癥。在另一實 施方式中，炎性病癥由注射引起。在一個進(jìn)一步的實施方式中，炎性 病癥是一種慢性炎性病癥。
本發(fā)明的一個實施方式提供一種抑制CD99L2-介導(dǎo)的TEM的方 法，包括將白細(xì)胞、內(nèi)皮、或此兩者與一種CD99L2結(jié)合抑制劑接觸。 在本實施方式的一個方面，CD99L2結(jié)合抑制劑是一種抗-CD99L2 抗體分子。在另一方面，抗-CD99L2抗體分子具有抗CD99L2單克 隆抗體的結(jié)合特異性。在一個進(jìn)一步的方面，CD99L2結(jié)合抑制劑是 一種可溶性CD99L2分子或其片段。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種抗-CD99L2單克隆抗體分子，其中該抗 -CD99L2單克隆抗體抑制CD99L2-介導(dǎo)的白細(xì)胞的經(jīng)內(nèi)皮遷移 (TEM)。在本發(fā)明的一個實施方式中，該單克隆抗體分子結(jié)合單核細(xì) 胞、血小板和粒細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞上的CD99L2。在另一實施方式中， 該單克隆抗體分子具有抗CD99L2單克隆抗體的結(jié)合特性。在一個優(yōu) 選實施方式中，該單克隆抗體分子是一種人源化單克隆抗體。
本發(fā)明還提供一種篩選可抑制CD99L2-介導(dǎo)的白細(xì)胞TEM的 化合物的方法，所述方法包括鑒定結(jié)合CD99L2的化合物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種篩選抑制CD99L2-介導(dǎo)的白細(xì)胞TEM的 化合物的方法，所述方法包括鑒定一種抑制白細(xì)胞與CD99L2的結(jié)合的化合物。在本方法的一個實施方式中，所述化合物抑制白細(xì)胞與內(nèi) 皮細(xì)胞的結(jié)合。在另一實施方式中，所述化合物抑制白細(xì)胞的變移。 在一個進(jìn)一步的實施方式中，白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞在促進(jìn)白細(xì)胞變移的 條件下在所述化合物存在下體外共培養(yǎng)，進(jìn)一步包括檢測白細(xì)胞穿過
內(nèi)皮細(xì)胞的變移程度。在另一實施方式中，所述化合物結(jié)合CD99L2。
附圖說曰月


圖1. muCD99L2的cDNA序列(SEQ ID NO:l )。 圖2.利用MAXHOM同源性算法與人CD99 ( SEQ ID NO:3 )比 對的muCD99L2的預(yù)測的氨基酸序列(SEQIDNO:2),顯示了這兩 種分子之間實質(zhì)上具有同源性和同一性。關(guān)鍵字h二疏水性的，1=脂
肪族的，t二轉(zhuǎn)角樣的，&=芳香族的，s二小的，u—艮小的，p二極性的， +=正電荷，-=負(fù)電荷，o-醇，c二帶電的。(軟件來源Expasy.org網(wǎng) 站)
圖3A和圖3B,鼠CD99L2一皮兔抗血清特異性識別。(A)免疫前 血清顯示了非特異性染色的背景水平。(B)用純化的muCD99L2免 疫的兔的血清將用muCD99L2轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞染色，該細(xì)胞類似于 用人CD99轉(zhuǎn)染的細(xì)胞優(yōu)先在其邊界處表達(dá)所述分子。兩種血清都以 1: 100稀釋，并用Alexa488-標(biāo)記的山羊抗兔IgG檢測。
圖4A-4D.鼠CD99L2在內(nèi)皮上原位表達(dá)。小鼠腎(A， C)或心 臟(B, D)的冷凍切片與大鼠抗鼠CD99L2血清(A, B)或正常大 鼠血清(C, D)的1:1000稀釋液孵育30分鐘，清洗，與HRP標(biāo)記 的兔抗大鼠IgG孵育，之后用二氨基聯(lián)苯胺和過氧化氫顯色。在腎和 心臟兩者中，動脈(a)和靜脈(v)的內(nèi)皮都被清楚地染色(箭頭)。 另外，在腎中，腎小球(g)和腎小管周圍毛細(xì)血管被染色(圖A), 心臟中肌纖維之間的毛細(xì)血管也是如此(B )。用非免疫血清未見明顯 的染色。線段=200 iLim。
圖5A和5B. muCD99L2在血細(xì)胞上的表達(dá)。最終稀釋度為1: 1000的大鼠抗-muCD99L2用于染色抗凝的小鼠血液以進(jìn)行流式細(xì)胞分析。白細(xì)胞和紅細(xì)胞(RBC)通過前向和側(cè)向散射特征圈選，并 且分開顯示結(jié)果。(A)白細(xì)胞(灰色柱狀圖)顯示強(qiáng)烈的焚光，而 RBC的染色是可檢測的，但大約低1000倍(黑色柱狀圖)。(B)利 用生物素化兔抗-大鼠IgG和PE-標(biāo)記的鏈霉親和素檢測染色。黑色柱 狀圖=沒有添加第一抗體。
圖6.鼠CD99L2在小鼠組織和細(xì)胞中的表達(dá)。利用大鼠抗 -muCD99L2抗血清的Western印跡分析4企測腎裂解液(K )、全血(B )、 純化的白細(xì)胞('W)和腹膜灌洗細(xì)胞(P)中的一種大約'45kD的蛋白 質(zhì)，該蛋白質(zhì)與用muCD99L2 cDNA轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì) 一起遷移。在未轉(zhuǎn)染的COS中沒有檢測到所述條帶(未顯示)。注意 到在純化的白細(xì)胞和腹膜灌洗樣品中白細(xì)胞的數(shù)量大約是全血中的 1/10。在COS細(xì)胞裂解液中的成對物可能代表不同的糖基化形式。來 自不同印跡的條帶在該圖中進(jìn)行了比較。
圖7A和7B.抗-muCD99L2在體內(nèi)阻斷急性炎癥。在腹膜內(nèi)注射 巰基乙酸培養(yǎng)液或磷酸鹽緩沖液(PBS)之前1小時靜脈內(nèi)注射100 pi 大鼠抗-muCD99L2 (抗-CD99L2 )或正常大鼠血清(大鼠血清)作為 對照。18小時后通過通過腹膜灌洗收獲白細(xì)胞，(A)抗-muCD99L2 導(dǎo)致PMN水平降低。(B)抗-muCD99L2導(dǎo)致單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞水 平降低。
圖8. muCD99L2-Fc的表達(dá)。來自用編碼muCD99L2-Fc嵌合體的 cDNA構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞的培養(yǎng)上清液進(jìn)行SDS-PAGE和 Western印跡法以分析分子的表達(dá)。通過我們的兔和大鼠抗muCD99L2 抗血清和一種人IgG的Fc部分特異性的山羊抗體可檢測到預(yù)期分子 量為100KD (對于二聚體形式)的單一條帶。右道中的150KD的條 帶代表了抗-人IgG與存在于培養(yǎng)基中的牛IgG的交叉反應(yīng)性。
圖9A-9B.mAb9G5與muCD99L2轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞結(jié)合。用 muCD99L2-FLAG轉(zhuǎn)染的兩種COS細(xì)胞系被無酶重懸浮，并且與mAb 雜交瘤上清液在冰上孵育30分鐘，然后清洗并在AlexaFluo化8-標(biāo)記 的山羊抗-大鼠IgG中在冰上孵育30分鐘，清洗并通過流式細(xì)胞術(shù)分析。(A) 4FS是一種典型的陰性雜交瘤。用正常大鼠血清可見相同的
染色。(B) 9G5特異性地染色muCD99L2-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，因為它不與 未轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞反應(yīng)(未顯示)。
圖10A-10B. mAb9G5選擇性地與muCD99L2-轉(zhuǎn)染的L細(xì)胞反應(yīng)。 稀釋的mAb9G5培養(yǎng)上清液(1: 100稀釋)與(A)對照細(xì)胞(D6 系)或(B) muCD99L2-轉(zhuǎn)染的L細(xì)胞(XFL1系)反應(yīng)，如圖9所 示，用熒光第二抗-大鼠IgG檢測(用更濃縮的上清液在轉(zhuǎn)染細(xì)胞上 可見更強(qiáng)的染色，但在4照細(xì)胞上沒有見到)。 '
圖11A-11C. mAb9G5識別小鼠白細(xì)胞的主要亞群。肝素化小鼠 血液與(A )正常大鼠血清、(B )MEC13.3(單克隆大鼠抗-小鼠PECAM ) 或(C) 9G5 (單克隆大鼠抗-小鼠CD99L2)孵育30分鐘，然后裂解 RBC，清洗細(xì)胞，并與AlexFluor488-標(biāo)記的山羊抗-大鼠IgG孵育， 進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。
圖12A和12B. muCD99L2的表達(dá)使L細(xì)胞成纖維細(xì)胞具有相互 粘附的能力。用muCD99L2轉(zhuǎn)染的兩種獨(dú)立的L細(xì)胞系進(jìn)行兩種獨(dú) 立的試驗。在(A)中研究了細(xì)胞系XFL8。在(B)中研究了細(xì)胞系 XFL1。在這兩種情況中聚集是依賴于時間的，如先前所發(fā)現(xiàn)的一樣 (Muller等人，1992， J. Exp. Med. 175: 1401 -1404; Schenkel等人，2002， Nature Immunol. 3: 143-150)。在(A)中，L細(xì)胞系D6用作陰性對照。 這些細(xì)胞代表了用與其他細(xì)胞相同、但以相反方向表達(dá)人PECAM的 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的親本L細(xì)胞系。陽性對照是表達(dá)人PECAM的#6細(xì)胞和表 達(dá)人CD99的弁1細(xì)胞。在(B)中，陽性對照也是表達(dá)在二價陽離子 存在下(+ )聚集的人CD99的W細(xì)胞。陰性對照是在沒有(-)二價 陽離子的條件下孵育的相同細(xì)胞系(Schenkel等人，2002， Nature Immunol. 3 : 143-150)。
圖13.整合一個muCD99L2的缺陷拷貝到小鼠ES細(xì)胞中的靶向 載體的圖示。這種載體可用于產(chǎn)生傳統(tǒng)的"敲除，，小鼠(通過同源重組 置換muCD99L2)和可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因小鼠。所述載體設(shè)計為在外顯子 4-6附近整合。在自然狀態(tài)下，neo盒破壞閱讀框并消除該基因。在
12ES細(xì)胞期通過暴露于Cre重組酶去除Neo盒，靶向載體重組入小鼠 基因組DNA內(nèi)，重建了一種功能性基因。在成年小鼠接下來暴露于 Cre重組酶后，外顯子4-6和介于之間的內(nèi)含子被刪除，產(chǎn)生了條件"敲
除"。 一個Sacl位點已經(jīng)被構(gòu)建到3， loxP位點，以使該載體向基因組 DNA內(nèi)的插入可用設(shè)計為與插入點直接3'側(cè)的基因組雜交的探針進(jìn) 行檢測。用Sacl消化基因組DNA從這一區(qū)域產(chǎn)生15.2kb的條帶。在 質(zhì)粒整合后，該限制性片段的長度變?yōu)?3.8kb。
發(fā)明詳述
先前對于PECAM-1和CD99的研究提示，在白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞 上都表達(dá)的并且能夠進(jìn)行嗜同性相互作用的其他分子的存在可能與 經(jīng)內(nèi)皮遷移有關(guān)。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CD99L2正是這樣的一種分子。雖 然鼠和人CD99L2的預(yù)測的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被公開(Suh等人)，但是沒有推 測出這種分子的功能?；谑驝D99L2(muCD99L2)的獨(dú)立的cDNA克 隆和對其作用的體內(nèi)和體外研究，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)muCD99L2在血細(xì)
胞滲出中起作用，并且muCD99L2的阻斷抑制炎癥。基于發(fā)明人的研
究和與人CD99L2的相近的同源性，很明顯人CD99L2在炎癥中具有
重要功能，阻斷CD99L2的功能將是一種有用的抗炎癥策略。
本申請部分地基于鑒定在匯合的內(nèi)皮細(xì)胞的邊界處和在白細(xì)胞
表面上表達(dá)的45kD膜蛋白。該蛋白質(zhì)被鑒定為鼠CD99L2。在一種 體內(nèi)測試中， 一種抗該分子的多克隆抗體選擇性阻斷了單核細(xì)胞和嗜 中性粒細(xì)胞向炎癥部位的遷移。很可能muCD99L2 (參考同源的人 CD99L2)的最重要的生理學(xué)功能與白細(xì)胞變移有關(guān)，其中抗緊密相 關(guān)的家族成員CD99的mAb阻斷變移超過90% (Schenkel等人)。
發(fā)明人已經(jīng)克隆了 muCD99L2， 一種具有與人CD99高度同源、 與人CD99L2更高度同源的區(qū)域的鼠CD99旁系同源物(paralogue )。 人CD99位于X染色體的q臂上(Suh等人)。cDNA序列顯示于圖1 中，預(yù)測的氨基酸序列和與人CD99的同源性顯示于圖2中。
在此提供的實施例證明了 ，產(chǎn)生的抗muCD99L2的多克隆和單克隆抗體識別存在于動脈、靜脈和許多器官的毛細(xì)血管的血管內(nèi)皮細(xì)胞
(圖4, 6)以及白細(xì)胞(圖5)上的CD99L2。功能數(shù)據(jù)證實成纖維 細(xì)胞中的CD99L2表達(dá)使它們具有相互粘附的能力(圖12)。這暗示 了白細(xì)胞上的CD99L2介導(dǎo)了與內(nèi)皮細(xì)胞上的CD99L2的粘附相互作 用，其作用方式類似于相關(guān)但不同的分子CD99的作用方式(Schenkel 等人)。更重要的是，兩種不同的多克隆抗-CD99L2抗體(一種在兔 子,中制備，一種在大鼠中制備)在一種腹膜炎體內(nèi)模型中阻斷炎癥(圖 7): '
人CD99和CD99L2之間的相似性突出了 muCD99L2研究在發(fā)展 靶向于人CD99L2用于治療人類患者群體中的炎癥和炎性疾病的治療 方法中的重要性。類似于CD99， muCD99L2和人CD99L2序列編碼 具有幾個潛在O-連接糖基化位點而沒有N-連接糖基化位點的I型膜 蛋白。鼠CD99L2在小鼠的內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞 和紅細(xì)胞一已知在人類中表達(dá)CD99的所有細(xì)胞一上表達(dá)。類似于人 CD99，以及人CD99L2, muCD99L2與炎癥有關(guān)。關(guān)于muCD99L2 在炎癥中的作用的研究將提供有關(guān)人CD99L2功能的重要理解。
鼠CD99L2
發(fā)明人已經(jīng)克隆了 muCD99L2 (也被稱為CD99L2或 muCD99L2), —種具有與CD99高度同源的區(qū)域的鼠CD99旁系同源 物。muCD99L2也與人類的第二 CD99-相關(guān)基因CD99L2類似。人 CD99L2位于X染色體的q臂上。
盡管對與白細(xì)胞遷出相關(guān)的白細(xì)胞和EC分子的了解具有一定的 進(jìn)展，但是調(diào)節(jié)血細(xì)胞滲出的機(jī)理還是未知的。PECAM和CD99被 組成型表達(dá)(Schenkel,等人，2002, Nature Immunol. 3: 143-150)。因此， 理解分子如何控制血細(xì)胞滲出功能可以促進(jìn)開發(fā)更好和更多的選擇
性抗炎癥治療。包含PECAM的表面連接區(qū)(SCC)是內(nèi)皮中的一種 新的細(xì)胞器官。它是重要的，因為它在血細(xì)胞滲出中的作用證明EC 活躍地參與促進(jìn)血細(xì)胞滲出，這不僅僅是通過適于白細(xì)胞識別的粘附分子的表達(dá)，而且參與白細(xì)胞穿過血管內(nèi)膜的物理運(yùn)動(Mamdouh，等 人，2003， Nature 421 :748-753)。 PECAM和CD99在血細(xì)胞滲出中具有 連續(xù)的、不相重疊的功能(Schenkd等人，2002, Nature Immunol. 3: 143-150)。然而，CD99沒有已知的信號基序，并且是不同于任何其 他白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的非常小的獨(dú)特分子家族的 一個成員。 因此，它的結(jié)構(gòu)中沒有任何關(guān)于它如何作用的暗示。
已經(jīng)鑒,定了 CD99L2的鼠形式，或者被稱為muCD99L2。關(guān)鍵的 是要知道鼠CD99L2在體內(nèi)是否如同在體外一樣在擊細(xì)胞遷出中起類 似的作用。這是特別重要的，因為鼠CD99L2顯示出相比人CD99更 類似于人CD99L2。很可能人CD99在炎癥中的作用出現(xiàn)在基因從產(chǎn) 生鼠CD99的共同祖先進(jìn)化之后。muCD99L2在所有測試的鼠細(xì)胞類 型中表達(dá)，所述細(xì)胞的人類對應(yīng)物表達(dá)CD99?？筸uCD99L2的抗體 阻斷PMN和單核細(xì)胞向體內(nèi)急性炎癥區(qū)域的補(bǔ)充。在此提供的研究 檢測了 muCD99L2在幾種急性炎癥模型中的作用。
人CD99和muCD99L2之間的相似性突出了 muCD99L2研究在 發(fā)展治療人類患者群體的炎癥或炎性疾病的CD99靶向治療方法中的 重要性。類似于CD99, muCD99L2序列編碼具有幾個潛在O-糖基化 位點而沒有潛在N-糖基化位點的I型膜蛋白。muCD99L2在小鼠的單 核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞和紅細(xì)胞一在人類中已知表達(dá)CD99的所 有細(xì)胞一上表達(dá)。類似于人CD99, muCD"L2與白細(xì)胞遷移和炎性 反應(yīng)有關(guān)。
兩種鼠急性炎癥模型(可以用于定量和定性地評價阻斷性mAb 的效果)可顯示通過干擾CD99型分子產(chǎn)生的阻斷是在TEM或粘附 的水平上。在野生型小鼠和其中PECAM被最大阻斷的小鼠中評價 muCD99L2的作用。muCD99L2活性也可在三種小鼠品系中的任何一 種中測試，所述小鼠品系中PECAM缺失或沒有功能，因此TEM不 依賴于PECAM發(fā)生。不依賴于PECAM的途徑或替代途徑在這些小 鼠中更易于鑒定。阻斷這些新分子的抗體的效果在以下小鼠中檢測 野生型小鼠，用于確定它們自身阻斷這些分子的效果；組成型表達(dá)循環(huán)PECAM-IgG并且具有最大PECAM功能阻斷的Tg8小鼠；PECAM 缺失(敲除)小鼠，其沒有PECAM;和Tg5和Tgl小鼠，其組成型 表達(dá)超過治療水平的可溶性PECAM-1并且其效應(yīng)不感受，盡管在其 內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞上具有正常水平的PECAM。這些研究可以更好地 理解涉及白細(xì)胞經(jīng)內(nèi)皮遷移的CD99L2-介導(dǎo)的機(jī)理并且鑒定了用于 抗炎治療的附加治療化合物。
如此處使用的術(shù)語"經(jīng)內(nèi)皮遷移"(TEM)指白細(xì)胞從內(nèi)皮細(xì)胞的 頂面到基底層并越過基底層的運(yùn)動。白細(xì)胞在各個內(nèi)皮細(xì)胞'之間的內(nèi) 皮中形成的連接點之間遷移。通常，TEM發(fā)生于當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞被激活 時，例如，被TNF、 IL-1或其他促炎介體激活時。TEM也可組成型 發(fā)生，特別是對于單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，由于白細(xì)胞粘附而以較低、 較弱的水平穿過內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生，甚至在不存在內(nèi)皮細(xì)胞直接活化的情 況下。因此，TEM在體內(nèi)在炎性病灶處發(fā)生；在體外，穿過培養(yǎng)的 內(nèi)皮細(xì)胞、優(yōu)選地在內(nèi)皮細(xì)胞活化和/或產(chǎn)生趨化梯度之后發(fā)生。發(fā)明 人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了該體外系統(tǒng)復(fù)制了體內(nèi)的炎性狀況，用于高預(yù)測性地研 究TEM。
術(shù)語"白細(xì)胞，，包括，但不限于，多形核白細(xì)胞(如，嗜中性粒細(xì) 胞)、單核細(xì)胞(其在變移到它們被吸引的部位之后分化為樹突細(xì)胞 或巨噬細(xì)胞)、粒細(xì)胞(包括嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞)、自然殺 傷細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，如，T淋巴細(xì)胞，以及循環(huán)樹突細(xì)胞前體。
術(shù)語"內(nèi)皮細(xì)胞，，(或EC)具有本領(lǐng)域中的通常含義。內(nèi)皮細(xì)胞 構(gòu)成內(nèi)皮，內(nèi)皮尤其在遍布全身的血管組織(靜脈、動脈和毛細(xì)血管) 的內(nèi)腔中發(fā)現(xiàn)。內(nèi)皮的"頂面，，是內(nèi)腔表面，即，與血液接觸。基底層 或基膜是將內(nèi)皮與血管壁隔開的細(xì)胞外基質(zhì)層。對于大多數(shù)炎癥來 說，白細(xì)胞穿過毛細(xì)血管后小靜脈遷出，毛細(xì)血管后小靜脈壁由將血 管與它供應(yīng)的組織隔開的不連續(xù)血管平滑肌細(xì)胞層組成。
內(nèi)皮細(xì)胞的活化可以由于與刺激性介體接觸而引起。對于本發(fā)明 的目的，內(nèi)皮細(xì)胞的活化由于與促炎細(xì)胞因子接觸而引起，所述促炎 細(xì)胞因子例如是，但不限于，腫瘤壞死因子(TNF)和白細(xì)胞介素-1(IL-1),特別是IL-1卩。
本發(fā)明包括在體外和體內(nèi)試驗中評價CD99L2-介導(dǎo)的TEM和作 為該過程的候選抑制劑的化合物。對于體外試驗，內(nèi)皮細(xì)胞優(yōu)選地在 透性膜或膠原凝膠上培養(yǎng)。在體內(nèi)，TEM在炎癥部位發(fā)生，其可被 誘導(dǎo)(例如，用巰基乙酸或巴豆油處理誘導(dǎo))或由自然炎性疾病(感 染、受傷、自身免疫)引起。
"CD99L2抑制劑"是阻斷或降低CD99L2與其自身或與其嗜異性 結(jié)合配偶體(即，CD99L2酉L體或CD99L2受體)結(jié)合的分子，即，' 防止CD99L2與嗜異性或嗜同性結(jié)合配偶體相互反應(yīng)(例如，結(jié)合) 和介導(dǎo)TEM的分子。在一個特定實施方式中，抗-CD99L2單克隆抗 體分子是這樣的抑制劑?？蛇x地，CD99L2的細(xì)胞外片段是一種抑制 劑，更特別地，是竟?fàn)幮砸种苿?CD99L2的細(xì)胞外片段"可以是整 個細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，即，從N-末端到大約跨膜區(qū)域的起點，或包含 CD99L2與其結(jié)合配偶體相互作用的結(jié)構(gòu)域的較d、部分(包括CD99L2 細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的嵌合構(gòu)建體，例如，具有免疫球蛋白分子的Fc結(jié)構(gòu) 域)；碳水化合物，特別是O-連接的碳水化合物；或凝集素配體。因 此，適當(dāng)?shù)囊种苿┛膳cCD99L2碳水化合物相互作用；所述抑制劑可 以是多種凝集素?？蛇x地，可溶性碳水化合物或碳水化合物模擬物可 用于阻斷與CD99L2的關(guān)鍵碳水化合物相互作用的凝集素。類似地， 肽或擬肽可以阻斷與CD99L2的多肽相互作用結(jié)構(gòu)域的相互作用。而 且，在某些情況下，上述的組合可證明在抑制CD99L2方面最有效。 在一個特定實施方式中，所述抑制劑是一種抗-CD99L^抗體分子，更 特別地，是一種抗-CD99L2單克隆抗體分子。
術(shù)語抗-CD99L2抗體分子包括識別小鼠、人類或其他物種的 CD99L2同源物的免疫球蛋白，也可以使用至少具有所述CD99L2同 源物的配體結(jié)合部分的所述抗體的衍生物，包括但不限于，單鏈、Fv、 Fab、 Fab'、 F ( ab') 2、嵌合抗體、人源化抗體等。
術(shù)語"炎性疾病"指急性或慢性炎性疾病，其可由感染或非感染原 因引起。多種感染疾病包括腦膜炎、腦炎、葡萄膜炎、結(jié)腸炎、皮炎、和成人呼吸窘迫綜合癥。非感染性原因包括外傷(燒傷、砍傷、擦傷、 撞傷)、自身免疫疾病、和器官排斥事件。因此，在特定實施方式中， 炎性疾病由選自下列的疾病引起動脈粥性硬化癥；自身免疫疾病，
例如多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、風(fēng)濕性多肌痛(PMR)、類風(fēng)濕
性關(guān)節(jié)炎和其他形式的炎性關(guān)節(jié)炎、舍格倫綜合癥、進(jìn)行性系統(tǒng)性硬 化癥(硬皮病)、強(qiáng)直性脊柱炎、多肌炎、皮肌炎、天皰癡、類天皰 瘡、I型糖尿病、重癥肌無力、橋本氏曱狀腺炎、格雷夫斯病、古德 帕斯徹氏病、混合結(jié)締組織病、硬化ko旦管炎、包括克羅恩病(局限
性腸炎)和潰瘍性結(jié)腸炎的炎性腸病、惡性貧血、炎性皮膚??；普通 間質(zhì)性肺炎(LFIP)、石棉沉著病、硅肺病、鈹中毒、滑石肺、所有 形式的塵肺病的不同形式、結(jié)節(jié)病(在肺和任何其他器官中)、脫屑 性間質(zhì)性肺炎、淋巴樣間質(zhì)性肺炎、巨細(xì)胞間質(zhì)性肺炎、細(xì)胞間質(zhì)性 肺炎、外源性變應(yīng)性肺泡炎、韋格納肉芽腫和相關(guān)形式的脈管炎(顳 動脈炎和結(jié)節(jié)性多動脈炎)；推定為不是自身免疫病的炎性皮膚??； 慢性活動性肝炎；遲發(fā)型超敏反應(yīng)(例如，毒漆藤皮炎)；肺炎或其 他由于任何原因引起的呼吸道炎癥；由于任何病因引起的成人呼吸窘 迫綜合癥(ARDS);腦炎，伴有炎性水腫；速發(fā)型超敏反應(yīng)，包括但 不限于，哮喘、花粉癥、皮膚變態(tài)反應(yīng)、急性過敏反應(yīng)；涉及免疫復(fù) 合物急性沉積的疾病，包括但不限于，風(fēng)濕熱，由于任何病因引起的 急性和/或慢性腎小球腎炎，特別包括感染后(例如，鏈球菌感染后) 腎小球腎炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡的急性惡化；腎盂腎炎；蜂窩織炎；膀 胱炎；急性膽嚢炎；和在胃腸道、膀胱、心臟或其他器官、特別是易 于破裂的器官的任何地方產(chǎn)生短暫性局部缺血的疾病；器官移植或組 織同種異體移植后遺癥，包括在同種異體器官或組織移植之后急性期
的同種異體移植物排斥和慢性宿主抗移植物排斥。
短語"藥學(xué)上可接受的"，不管是與本發(fā)明的藥物組合物還是與本 發(fā)明的疫苗組合物聯(lián)用，指生理上可耐受的并且一般不會產(chǎn)生不利反 應(yīng)例如胃不適、暈眩等的分子實體。優(yōu)選地，如此處所用術(shù)語"藥學(xué) 上可接受的，，表示被聯(lián)邦或州政府的管理機(jī)構(gòu)認(rèn)可或列在美國藥典或其他公認(rèn)的藥典中用于動物，更特別地用于人類。術(shù)語"載體，，指與化 合物一起施用的稀釋液、佐劑、賦形劑或介質(zhì)。所述藥物載體可以是 無菌液體，例如水和油，包括石油、動物、纟直物或合成來源的，例如 花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。優(yōu)選地用水或水溶液鹽水溶液 和葡萄糖和甘油水溶液作為載體，特別用于注射溶液。適合的藥物載
體描述于E. W. Martin的"Remington's Pharmaceutical Sciences"(第18
版)。，
術(shù)語"大約"或"近似"是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人'員根據(jù)本公開內(nèi)容已知 的。優(yōu)選地，該術(shù)語表示在給定的值或范圍的20%之內(nèi)，優(yōu)選10% 之內(nèi)，更優(yōu)選5%之內(nèi)。可選地，特別在生物系統(tǒng)中，術(shù)語"大約"優(yōu) 選地表示在給定數(shù)值的大約一個對數(shù)(即， 一個數(shù)量級)之內(nèi)，優(yōu)選 地在兩倍之內(nèi)，這依賴于如何定量測定。
"編碼序列"或"編碼"一種表達(dá)產(chǎn)物例如RNA、多肽、蛋白質(zhì)或 酶的序列是一種核苷酸序列，當(dāng)該序列表達(dá)時，導(dǎo)致RNA、多肽、 蛋白質(zhì)或酶的產(chǎn)生，即，核苷酸序列編碼所述多肽、蛋白質(zhì)或酶的氨 基酸序列。蛋白質(zhì)的編碼序列可以包括起始密碼子(通常ATG)和終 止密碼子。
術(shù)語"基因，，，也被稱為"結(jié)構(gòu)基因"，表示一種DNA序列，其編 碼或?qū)?yīng)于包含一種或多種蛋白質(zhì)妁全部或部分的特定氨基酸序列， 并且可包含或可不包含調(diào)節(jié)DNA序列，例如啟動子序列，該啟動子 序列例如決定了基因被表達(dá)的條件?；虻霓D(zhuǎn)錄區(qū)除翻譯(編碼)區(qū) 以外還可包括5'-和3'-非翻譯區(qū)(UTR)和內(nèi)含子。
"啟動子序列，，是能夠結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的RNA聚合酶并啟動下游(3， 方向)編碼序列的轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)節(jié)區(qū)。為了限定本發(fā)明的目的，啟 動子序列在其3，末端被轉(zhuǎn)錄起始位點限制'向上游(5'方向)延伸， 包括以高于背景的可檢測水平啟動轉(zhuǎn)錄所需的最小數(shù)量的堿基或元 件。在啟動子序列中將發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄起始位點(方便地，例如通過用核酸 酶Sl作圖進(jìn)行確定)，以及負(fù)責(zé)RNA聚合酶結(jié)合的蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu) 域(共有序列)。當(dāng)RNA聚合酶將編碼序列轉(zhuǎn)錄為mRNA時，編碼序列在細(xì)胞中 在轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列的"控制之下，，或與之"有效連接，，，然后反式-RNA剪接(如果包含內(nèi)含子)，并翻譯為該編碼序列編碼的蛋白質(zhì)。
術(shù)語"表達(dá)"的意思是允許或使基因或DNA序列中的信息表現(xiàn)出 來，例如通過活化與相應(yīng)基因或DNA序列的轉(zhuǎn)錄和翻"i爭有關(guān)的細(xì)胞 功能而產(chǎn)生蛋白質(zhì)。DNA序列在細(xì)胞中表達(dá)或被細(xì)胞表達(dá)，形成"表 達(dá)產(chǎn)物"，例如,mRNA或蛋白質(zhì)。表達(dá)產(chǎn)物自身，例如，產(chǎn)生的mRNA 或蛋白質(zhì)，也可被稱為被細(xì)胞"表達(dá)"。表達(dá)產(chǎn)物可以表々正為細(xì)胞內(nèi)的、 細(xì)胞外的或分泌的。術(shù)語"細(xì)胞內(nèi)的"表示在細(xì)胞內(nèi)的某些物質(zhì)。術(shù)語 "細(xì)胞外的"表示在細(xì)胞外的某些物質(zhì)。如果一種物質(zhì)從細(xì)胞上或細(xì)胞 內(nèi)某處以顯著的量出現(xiàn)在細(xì)胞外，則該物質(zhì)是被細(xì)胞"分泌"的。"允 許表達(dá)的條件"，在體外是溫度(通常大約37GC)、濕度(潮濕的空氣)、 維持pH的二氧化碳濃度(通常大約5% C02到大約15% C02)、 pH(通 常大約7.0到8.0,優(yōu)選7.5)和培養(yǎng)液成分等培養(yǎng)條件，其依賴于宿主 細(xì)胞類型。在體內(nèi)，允許表達(dá)的條件主要是非人轉(zhuǎn)基因動物的健康， 其依賴于充分的營養(yǎng)、水、生活環(huán)境和環(huán)境條件(明-暗循環(huán)、溫度、 濕度、噪音水平)。在任一系統(tǒng)中，如本領(lǐng)域公知的，表達(dá)可依賴于 阻抑物或誘導(dǎo)物控制系統(tǒng)。
術(shù)語"轉(zhuǎn)染，，表示"外源，，(即，外來的或細(xì)胞外的)基因、DNA或 RNA序列導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中，以致宿主細(xì)胞表達(dá)導(dǎo)入的基因或序列 以產(chǎn)生期望的物質(zhì)， 一般是被導(dǎo)入基因或序列編碼的蛋白質(zhì)或酶。導(dǎo) 入的基因或序列也可被稱為"克隆的"或"外源的"基因或序列，可包括 調(diào)節(jié)或控制序列，例如起始、終止、啟動子、信號、分泌或細(xì)胞遺傳 機(jī)制中使用的其他序列?；蚧蛐蛄锌砂ǚ枪δ苄蛄谢驔]有已知功 能的序列。接受并表達(dá)被導(dǎo)入的DNA或RNA的宿主細(xì)胞已經(jīng)被"轉(zhuǎn) 染"并且是"轉(zhuǎn)染子"或"克隆"。導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中的DNA或RNA可 來源于任何來源，包括與宿主細(xì)胞相同屬或種的細(xì)胞，或不同屬或種 的細(xì)月包。
術(shù)語"載體"、"克隆載體"和"表達(dá)載體"表示可將DNA或RNA序列(例如，外源基因)導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)載工具，以轉(zhuǎn)化該宿主并 促進(jìn)導(dǎo)入序列的表達(dá)(例如，轉(zhuǎn)錄和翻譯)。載體包括質(zhì)粒、噬菌體、 病毒，等等；它們在下面更詳細(xì)地討論。
載體一般包括可傳遞物質(zhì)的DNA,外源DNA插入其中。將一種 DNA片斷插入另 一種DNA片斷的常用方法涉及使用被稱為限制性酶 的酶，所述酶在被稱為限制性位點的特定位點(特定核苷酸組)切割 DNA。"盒"(cassette )是指可在特定的限制性位點插入到載體或另一 種DNA片斷中的DNk片斷。優(yōu)選地，盒是一種"表達(dá)盒"，真中的 DNA是編碼表達(dá)產(chǎn)物的DNA的編碼序列或片斷，其可在特定的限制 性位點插入到載體中。盒限制性位點通常設(shè)計為確保盒在正確的閱讀 框內(nèi)插入。通常，外源DNA在載體DNA的一個或多個限制性位點處 插入，然后與可傳遞載體DNA—起被載體帶入宿主細(xì)胞中。具有插 入的或添加的DNA的DNA片斷或序列，例如表達(dá)載體，也可一皮稱為 "DNA構(gòu)建體"。載體的常見類型是"質(zhì)粒"，它通常是雙鏈DNA的自 包含分子，通常是細(xì)菌來源的，其可容易地接受附加的(外源)DNA, 并可容易地導(dǎo)入適合的宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒載體通常包含編碼DNA和 啟動子DNA,并具有適于插入外源DNA的一個或多個限制性位點。 已經(jīng)描述了大量載體(包括質(zhì)粒和真菌載體)在多種真核和原核宿主 中的復(fù)制和/或表達(dá)。非限制性的實例包括pKK質(zhì)粒(Amersham Pharmacia Biotech)、 pUC質(zhì)粒、pET質(zhì)粒(Novagen. Inc.， Madison， WT)、 pRSET或pREP質(zhì)粒(Invitrogen, San Diego, CA)、或pMAL質(zhì)粒(New England Biolabs, Beverly, MA)，和許多適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，利用本文已
組克隆載體通常包括一種或多種用于克隆或表達(dá)的復(fù)制系統(tǒng)、 一種或 多種用于在宿主中選^^的標(biāo)記物如抗生素抗性、和一種或多種表達(dá)盒。
術(shù)語"宿主細(xì)胞，，表示以任何方式選擇、修飾、轉(zhuǎn)化、生長、或使 用或處理的任何生物體的任何細(xì)月包，其用于由細(xì)胞產(chǎn)生物質(zhì)，例如由 細(xì)胞表達(dá)基因、DNA或RNA序列、蛋白質(zhì)或酶。宿主細(xì)胞進(jìn)一步可用于篩選或其他測試，如下文所述。宿主細(xì)胞可在體外發(fā)現(xiàn)，即，在 組織培養(yǎng)物中，或在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，即，在微生物、植物或動物中。
術(shù)語"表達(dá)系統(tǒng)"表示在適當(dāng)條件下的宿主細(xì)胞和相容的載體，例
如，用于表達(dá)被載體攜帶并導(dǎo)入宿主細(xì)胞的外源DNA所編碼的蛋白
質(zhì)。常見的表達(dá)系統(tǒng)包括大腸桿菌宿主細(xì)胞和質(zhì)粒載體、昆蟲宿主細(xì) 胞和桿狀病毒載體、和哺乳動物宿主細(xì)胞和載體。在一個特定實施方
式中，蛋白質(zhì)在COS-l或CHO細(xì)胞中表達(dá)。其他適合的細(xì)胞包括 NSO細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、293T'(人腎細(xì)胞)、小鼠原代成肌細(xì)胞、和 NIH3T3細(xì)胞。
術(shù)語"異源"指非天然存在的元件的組合。例如，異源DNA指非 天然位于細(xì)胞或細(xì)胞染色體位點上的DNA。異源表達(dá)調(diào)節(jié)元件是與 一種基因有效連接的元件，該基因不同于其天然有效連接的基因。在 本發(fā)明的上下文中，蛋白質(zhì)編碼序列對于為了克隆或表達(dá)而插入的載 體DNA來說是異源的，并且對于包含所述載體并表達(dá)所述載體的宿 主細(xì)胞例如CHO細(xì)胞來說是異源的。
根據(jù)本發(fā)明，可以應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的常規(guī)分子生物學(xué)、微生物 學(xué)和重組DNA技術(shù)。所述技術(shù)在文獻(xiàn)中充分闡述。見例如，Sambrook， Fritsch和Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (本文稱為"Sambrook等人，1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization, B. D. Haines 和S丄Higgins eds, (1985); Transcription And Translation, B.D. Hames 和S丄Higgins, eds. (1984); Animal Cell Culture, R丄Freshney, ed. (1986); Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press, (1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubd等人.(eds.)， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)。產(chǎn)生抗體分子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的抗體分子可通過任何本領(lǐng)域已知的合成免疫球蛋白的 方法產(chǎn)生，特別地，通過化學(xué)合成或通過重組表達(dá)產(chǎn)生。包含編碼抗 體分子的核苷酸序列的分離核酸可利用任何本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生。
抗體片段，例如Fab和F (ab，) 2，可通過對完整的抗體進(jìn)行蛋白水 解處理而產(chǎn)生。
, 本領(lǐng)域已知的多種方法可用于產(chǎn)生CD99L2的多克隆抗體或其衍 生物或類似物。對于抗體的產(chǎn)生，可通ii用CD99L2多肽或其衍生物
(例如，片段或融合蛋白)注射而免疫多種宿主動物，包括但不限于 兔、小鼠、大鼠、綿羊、山羊，等等。在一個實施方式中，CD99L2 多肽或其片段可與免疫原性載體例如牛血清白蛋白(BSA)或匙孔戚 血藍(lán)蛋白(KLH)偶聯(lián)。多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答，依賴于宿主 種類，包括但不限于弗氏(完全和不完全)佐劑、礦物凝膠例如氫氧 化鋁、表面活性劑例如溶血卵磷脂、多聚醇、聚陰離子、肽、油乳劑、 匙孔戚血藍(lán)蛋白、二硝基酚、和潛在有用的人用佐劑例如BCG(卡介 苗)禾口少豆小才奉習(xí)犬才干菌(Cor_ywe/)ac/^r/iw2 p"rvww )。
對于CD99L2多肽或其片段、類似物或衍生物的單克隆抗體的制 備，可以使用任何通過連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)抗體分子的技術(shù)。這些技 術(shù)包括4旦不限于最初由Kohler和Milstein (Nature 1975， 256:495-497) 發(fā)展的雜交瘤技術(shù)、三體瘤(trioma)技術(shù)、人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù) (Kozbor等人，Immunology Today 1983， 4:72; Cote等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1983, 80:2026-2030)、生產(chǎn)人單克隆抗體的EBV-雜交 瘤^支術(shù)(Cole等人,in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss, Inc., pp. 77-96， 1985)。在本發(fā)明的另外一個實施方式中，單克 隆抗體可在無菌動物中產(chǎn)生(PCT公開WO 89/12690)。實際上，根 據(jù)本發(fā)明，也可以使用為生產(chǎn)"嵌合抗體，，而發(fā)展的技術(shù)(Morrison等人， J. Bacteriol.， 1984, 159:870; Neuberger等人，Nature 1984, 312:604-608; Takeda等人，Nature 1985， 314:452-454),該技術(shù)包括剪接來源于 CD99L2多肽特異性小鼠抗體分子的基因和來源于具有適當(dāng)生物活性
23的人抗體分子的基因；這些抗體在本發(fā)明的范圍內(nèi)。所述人或人源化 嵌合抗體優(yōu)選用于治療人類疾病或失調(diào)(下文描述)，因為人或人源 化抗體誘導(dǎo)免疫應(yīng)答、特別是變應(yīng)性應(yīng)答的可能性比異種抗體更小。 根據(jù)本發(fā)明，描述的生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(美國專利Nos.
5，476,786、 5，132，405和4,946,778)可適用于生產(chǎn)CD99L2多肽-特異 性單鏈抗體。實際上，可遞送這些基因，以在體內(nèi)表達(dá)。本發(fā)明的另 夕|、一種實,施方式利用了描述的構(gòu)建Fab表達(dá)庫的技術(shù)(Huse等人. Science 1989, 246: 1275-1281)，以允許快速并容^地鑒定對CD99L2 多肽或其衍生物或類似物具有預(yù)期特異性的單克隆Fab片段。
CD99L2多肽表達(dá)
一旦包含至少編碼CD99L2的配體結(jié)合部分的核苷酸序列的核酸 被克隆，將該編碼序列插入一種重組表達(dá)載體中。所述編碼序列的工 程化可通過本領(lǐng)域已知的常規(guī)重組DNA技術(shù)完成。
編碼多肽的核酸任選地包含編碼引導(dǎo)蛋白質(zhì)分子分泌的前導(dǎo)序 列的核苷酸序列。在作為跨膜糖蛋白的CD99L2的具體情況中，可構(gòu) 建一種分泌形式，其僅僅編碼細(xì)胞外部分，或細(xì)胞外部分的有限區(qū)域， 以確4呆分)必。
然后可通過常規(guī)技術(shù)在體外或體內(nèi)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)移入宿主細(xì)胞 中，并且通過常規(guī)技術(shù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，以產(chǎn)生CD99L2。例如，通 過將編碼CD99L2的表達(dá)載體瞬時轉(zhuǎn)染入COS細(xì)胞中，將細(xì)胞培養(yǎng) 允許表達(dá)的一段適當(dāng)?shù)臅r期，然后吸取COS細(xì)胞的上清液，所述上 清液包含分泌的表達(dá)的CD99L2。
用于表達(dá)CD99L2的宿主細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞例如大腸桿菌或真 核細(xì)胞。特別地，與載體一起使用的哺乳動物細(xì)胞例如中國倉鼠卵巢 細(xì)胞(CHO)或COS細(xì)胞是有效的表達(dá)系統(tǒng)，所述載體中CD99L2 的表達(dá)在來源于人巨細(xì)胞病毒的主要中間早期基因啟動子元件的控 制之下。
多種宿主-表達(dá)載體系統(tǒng)可用于表達(dá)CD99L2。所述宿主-表達(dá)系統(tǒng)代表可以產(chǎn)生并隨后純化感興趣的編碼序列的載體，但是也產(chǎn)生當(dāng)
用適當(dāng)?shù)暮塑账峋幋a序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染時可在原位展現(xiàn)CD99L2的細(xì) 胞。這些系統(tǒng)包括但不限于用包含抗體編碼序列的重組噬菌體DNA、 質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物例如細(xì)菌(如，大腸桿 菌、枯草芽孢桿菌)；用包含CD99L2編碼序列的重組酵母表達(dá)載體 轉(zhuǎn)化的酵母(例如，畢赤酵母)；用包含CD99L2編碼序列的重組病 毒表達(dá)載體(例如>,桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；用重組病毒表 達(dá)載體(例如，花椰菜花葉病毒，CaMV;煙草花葉病毒,'TMV)感 染的或用包含CD99L2編碼序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(例如，Ti質(zhì)粒) 轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；含有包含源于哺乳動物細(xì)胞基因組的啟動子 (例如，金屬硫蛋白啟動子)或源于哺乳動物病毒的啟動子(例如， 腺病毒晚期啟動子、牛痘病毒7.5K啟動子)的重組表達(dá)構(gòu)建體的哺 乳動物細(xì)胞系統(tǒng)(例如，COS、 CHO、 BHK、 293和3T3細(xì)胞)。
蛋白質(zhì)或多肽的表達(dá)可被任何本領(lǐng)域已知的啟動子/增強(qiáng)子元件 控制，但這些調(diào)節(jié)元件必須在為表達(dá)選擇的宿主中是有功能的?？捎?于控制基因表達(dá)的啟動子包括但不限于巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子(美 國專利Nos. 5.385,839和5,168,062)、 SV40早期啟動子區(qū)(Benoist和 Chambon, Nature 1981， 290:304-310)，包含于勞斯肉瘤病毒的3'長末 端重復(fù)中的啟動子(Yamamoto,等人，Cell l兆0， 22:787-797)、皰疹胸苷 激酶啟動子(Wagner等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981， 78: 1441-1445)、金屬硫蛋白基因的調(diào)節(jié)序列(Brinster等人.，Nature 1982, 296:39-42);原核表達(dá)載體，例如(3-內(nèi)酰胺酶啟動子(Villa-Komaroff, 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, 75:3727-3731),或tac啟動子 (DeBoer等人，Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 1983, 80:21-25);參見在 Scientific American 1980, 242:74-94 中的"Useful proteins from recombinant bacteria";源于酵母或其他真菌的啟動子元件，例如Gal4 啟動子、ADC(乙醇脫氬酶)啟動子、PGK(磷酸甘油激酶)啟動子、 堿性磷酸酶啟動子；和特別是展現(xiàn)造血組織特異性的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)；在 骨髓細(xì)胞中具有活性的p-珠蛋白基因控制區(qū)(Mogram等人，Nature1985, 315:338-340; Kollias等人，Cell 1986, 46:89-94)、造血干細(xì)胞分化 因子啟動子、促紅細(xì)胞生成素受體啟動子(Maouche等人，Blood 1991， 15:2557)等等。
在細(xì)菌系統(tǒng)中，根據(jù)表達(dá)的CD99L2的預(yù)期用途，可有利地選^奪 許多表達(dá)載體。例如，當(dāng)為了產(chǎn)生CD99L2的藥物組合物而生產(chǎn)大量 的所述蛋白質(zhì)時，引導(dǎo)表達(dá)易于純化的高水平融合蛋白產(chǎn)物的載體是 預(yù)期的。所述載體包括但不限于大腸桿菌表達(dá)載體pUR278 (Ruther 等人，EMBO J. 1983,2: 1791)，在其中CD99L2編碼序列可與lacZ'編 碼區(qū)符合讀框地單獨(dú)連接入載體中，以產(chǎn)生融合蛋白；pIN載體 (Inouye和Inouye， Nucleic Acids Res. 1985, 13:3101-3109; Van Hleeke 和Schuster, J. Biol. Chem. 1989， 264:5503-5509);等等。pGEX載體也 可用于表達(dá)作為與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白的外源多肽。 通常，所述融合蛋白是可溶的，并且可通過吸附和結(jié)合到谷胱甘肽-瓊脂糖珠基質(zhì)上、然后在游離谷胱甘肽的存在下洗脫而從裂解的細(xì)胞 中容易地純化。pGEX載體"i殳計為包括凝血酶或Xa因子蛋白酶切割 位點，以使克隆的目標(biāo)基因產(chǎn)物可從GST部分上釋放。
在昆蟲系統(tǒng)中，苜蓿l艮纟丈夜蛾(JWograp/z" ca/z/orm'c")核型多 角體病毒(AcNPV)用作表達(dá)外源基因的載體。病毒在草地貪夜蛾 (印t^o/^ra/n/g^m^ )細(xì)胞中生長。CD9禮2編碼序列可被單獨(dú)克 隆入病毒的非核心區(qū)域(例如，多角體蛋白基因)，并且置于AcNPV 啟動子(例如，多角體蛋白啟動子)的控制之下。
在哺乳動物宿主細(xì)胞中，可以使用許多基于病毒的和非基于病毒 的表達(dá)系統(tǒng)。在腺病毒用作表達(dá)載體的情況中，目標(biāo)CD""編碼序 列可與腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯控制復(fù)合物例如晚期啟動子和三聯(lián)前導(dǎo)序列 連接。然后可通過體外或體內(nèi)重組將該嵌合基因插入到腺病毒基因組 中。向病毒基因組的非必需區(qū)(例如，E1或E3區(qū))的插入將產(chǎn)生一 種存活的并能夠在感染的宿主內(nèi)表達(dá)抗體的重組病毒(見例如，Logan 和Shenk, Pro" Natl. Acad. Sci. USA， 1984, 81:3655-3659)。特定的起始 信號對于插入的抗體編碼序列的有效翻譯也是需要的。這些信號包括ATG起始密碼子和相鄰序列。而且，起始密碼子必須與期望的編碼序 列的閱讀框相符，以確保全部插入部分的翻譯。這些外源翻譯控制信 號和起始密碼子可以是來自多種來源的，是天然的和合成的。表達(dá)效
率可通過包括適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄增強(qiáng)元件、轉(zhuǎn)錄終止子等來提高(見Bittner 等人，Methods in Enzymol. 1987， 153:516-544)。
另外，可選擇調(diào)節(jié)插入序列的表達(dá)或以期望的特定方式修飾和處 理基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞抹。不同的宿主細(xì)胞具有蛋白質(zhì)和基因產(chǎn)物的 翻譯后處理和修飾的特性和特定的才幾理。可選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞系或宿主 系統(tǒng)以確保正確地修飾和處理表達(dá)的外源蛋白。為此，可以使用具有 正確處理基因產(chǎn)物的初級轉(zhuǎn)錄物、糖基化和磷酸化的細(xì)胞機(jī)制的真核 宿主細(xì)胞。所述哺乳動物宿主細(xì)胞包括但不限于CHO、 VERO、 BHK、 HeLa、 COS、 MDCK、 293、 3T3、 WI38。
為了長期、高產(chǎn)量地產(chǎn)生重組蛋白，穩(wěn)定的表達(dá)是優(yōu)選的。例如， 可以構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)CD99L2的細(xì)胞系。代替使用包含病毒復(fù)制起點的 表達(dá)載體，可用由適當(dāng)表達(dá)控制元件(例如，啟動子、增強(qiáng)子序列、 轉(zhuǎn)錄終止子、多聚腺香酸化位點，等等)和選擇性標(biāo)記控制的DNA 轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。在導(dǎo)入外源DNA之后，可使工程化細(xì)胞在富集培養(yǎng) 基中生長1到2天，然后轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基中。重組質(zhì)粒中的選擇性標(biāo) 記提供選擇抗性，并允許細(xì)胞將質(zhì)粒穩(wěn)定地整合入其染色體中并生長 形成轉(zhuǎn)化灶，轉(zhuǎn)化灶又可以被克隆并擴(kuò)增為細(xì)胞系。本方法可有利地 用于工程化表達(dá)抗體的細(xì)胞系。所述工程化細(xì)胞系在篩選和評價直接 或間接與抗體相互作用的化合物中是特別有用的。
可以使用許多選擇系統(tǒng)，包括但不限于單純皰疹病毒胸苷激酶 (Wigler等人，Cell 1977， 11 :223)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶 (Szybalska和Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1962， 48:2026)和腺 。票呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Lowy等人，Cell 1980, 22:817)基因可分別用 于tk-、 hgprt-或aprt-細(xì)胞。另外，抗代謝物抗性可用作選擇下列基因 的基礎(chǔ)dhfr，其提供氨曱喋呤抗性(Wigler等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, 77:3567; O，Hare等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1981， 78:1527); gpt,其提供霉酚酸抗性(Mulligan和Berg,Proc. Natl. Acad. Sci. USA1981, 78:2072); neo，其提供氨基糖苷G-418抗性(Colberre-Garapin等人，J. Mol. Biol. 1981, 150: 1);和hygro,其提供潮霉素抗 性(Santerre等人，Gene 1984, 30: 147)。
CD99L2的表達(dá)水平可通過載體擴(kuò)增而提高(綜述見Bebbington 和Hentschel， The Use of Vectors Based on Gene， Ampliflication for the Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells in DNA, Cloning, Vol. 3., Academic Press, New York， 1987)。當(dāng)表達(dá)'CD99L2的載體系統(tǒng)內(nèi)的 標(biāo)記物可擴(kuò)增時，宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中存在的抑制劑水平的提高將提 高標(biāo)記物基因的拷貝數(shù)。因為擴(kuò)增的區(qū)域與CD99L2基因相連，蛋白 質(zhì)的產(chǎn)量也將提高(Crouse等人，Mol. Cell. Biol. 1983， 3:257)。
病毒和非病毒載體
在體外和體內(nèi)有用的載體是病毒載體，例如慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、
皰瘆病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、痘苗病毒、甲病毒、桿狀病毒、和 其他具有期望的細(xì)胞向性的重組病毒。因此，編碼功能性或突變蛋白
或其多肽結(jié)構(gòu)域片段的基因可利用病毒載體或通過直接DNA導(dǎo)入而 在體內(nèi)、離體或在體外導(dǎo)入。在目標(biāo)組織中的表達(dá)可通過將轉(zhuǎn)基因載 體輩巴向到特定細(xì)胞而實現(xiàn)，例如使用病毒載體或受體配體，或通過利 用組織特異性啟動子，或使用這兩種手段。靶向基因遞送在PCT公 開WO 95/28494中描述。
常用于體內(nèi)或離體靶向和治療程序的病毒載體是基于DNA的載 體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。構(gòu)建和利用病毒載體的方法是本領(lǐng)域已知的 (見例如，Miller和Rosman， BioTechniques 1992， 7:980-990)。優(yōu)選地， 病毒載體是復(fù)制缺陷型的，即，它們不能在目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制。優(yōu) 選地，復(fù)制缺陷型病毒是一種最小的病毒，即，它僅僅保留對于用殼 體包裹基因組以產(chǎn)生病毒顆粒而言必需的基因組序列。
DNA病毒載體包括減毒的或缺陷的DNA病毒,例如但不限于， 單純皰滲病毒(HSV)、乳頭瘤病毒、EB病毒(EBV)、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)等。優(yōu)選缺陷病毒，其全部或幾乎全部缺失病毒基 因。缺陷病毒在進(jìn)入細(xì)胞后是非感染性的。使用缺陷病毒載體允許在 特定的、局部的區(qū)域施用細(xì)胞，而不用擔(dān)心該載體會感染其他細(xì)胞。 因此，可以特異性地靶向特定的組織。特別的載體的例子包括但不限
于缺陷皰滲病毒1 (HSV1 )載體(Kaplitt等人，Molec. Cell. Neu薩i. 1991,2:320-330)、缺少糖蛋白L基因的缺陷皰滲病毒載體、或其他缺 陷皰瘆病毒,體(PCT公開WO 94/21807和WO 92/05263);減毒腺 病毒載體，例如Stratford-Perricaudet等人描述的載4(J. Clin. Invest. 1992，90:626-630;參見La Salle等人，Science 1993， 259:988-990);缺 陷腺伴隨病毒載體(Samulski等人，J. Virol. 1987, 61:3096-3101; Samulski等人,J. Virol. 1989， 63:3822-3828; Lebkowski等人，Mol. Cell. Biol.， 1988, 8:3988-3996);和辛德畢斯病毒( 一種甲病毒)(PCT公開 WO 98/06237;美國專利No. 5,091,309)。
許多公司都商業(yè)化生產(chǎn)病毒載體，包括但不限于，Avigen, Inc. (Alameda, CA; AAV載體)、Cell Genesys (Foster City, CA;逆轉(zhuǎn)錄病 毒、腺病毒、AAV載體和慢病毒載體)、Clontech(逆轉(zhuǎn)錄病毒和桿狀 病毒載體)、Genovo, Inc. (Sharon Hill, PA;腺病毒和AAV載體)、 Genvec (腺病毒載體)、IntroGene (Leiden, Netherlands;l^病毒載體)、 Molecular Medicine (逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、AAV和皰滲病毒載體)、 Norgen (腺病毒載體)、Oxford BioMedica (Oxford, United Kingdom;慢 病毒載體)、和Transgene (Strasbourg, France;腺病毒、痘苗病毒、逆 轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體)。
在另一實施方式中，載體可通過脂轉(zhuǎn)染、作為棵DNA或利用其 他轉(zhuǎn)染促進(jìn)試劑(肽、聚合物，等等)在體內(nèi)導(dǎo)入。合成的陽離子脂 質(zhì)可用于制備在體內(nèi)轉(zhuǎn)染編碼標(biāo)記物的基因的脂質(zhì)體(Feigner，等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987， 84:7413-7417; Feigner和Ringold, Science l卿，337:387-388;參見Mackey,等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988， 85:8027-8031; Ulmer等人.Science 1993, 259: 1745-1748)。 對于轉(zhuǎn)移核苷酸有用的脂質(zhì)化合物和組合物描述于PCT專利公開
29WO 95/18863和WO 96/17823和美國專利No. 5，459，127中。脂質(zhì)可 與其他以靶向為目的的分子化學(xué)偶聯(lián)(見Mackey等人，上述)。被耙 向的肽，例如激素或神經(jīng)傳遞質(zhì)，和蛋白質(zhì)例如抗體，或非肽分子， 可與脂質(zhì)體化學(xué)偶聯(lián)。
其他分子對于促進(jìn)體內(nèi)核酸轉(zhuǎn)染也是有用的，例如陽離子寡肽 (例如，PCT專利公開WO 95/21931)、衍生自DNA結(jié)合蛋白的肽(例 如，PCT專利公開WO 96/25508)或陽離子聚合物(例如，PCT專利 公開WO 95/21931)。 '
也可能在體內(nèi)作為棵DNA質(zhì)粒導(dǎo)入載體。用于基因治療的棵 DNA載體可通過本領(lǐng)域已知的方法導(dǎo)入期望的宿主細(xì)胞中，這些方 法例如是，電穿孔、顯^f敬注射、細(xì)胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沉 淀、利用基因槍、或利用DNA載體轉(zhuǎn)運(yùn)體(參見例如，Wu等人，J. Biol. Chem. 1992, 267:963-967; Wu和Wu， J. Biol. Chem. 1988, 263: 14621-14624;加拿大專利申請No. 2，012，311; Williams等人，Pro" Natl. Acad. Sci. USA 1991 , 88:2726-2730)。也可使用受體介導(dǎo)的DNA 遞送方法(Cmiel等人，Hum. Gene Ther. 1992, 3: 147-154; Wu和Wu, J. Biol. Chem. 1987， 262:4429-4432)。美國專利Nos. 5,580,859和 5,589,466公開了在哺乳動物中遞送外源DNA序列，沒有使用轉(zhuǎn)染促 進(jìn)劑。最近，描述了一種相對低電壓、高效率的體內(nèi)DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)， 稱為電轉(zhuǎn)移(Mir等人，CP. Acad. Sci. 1988, 321:893; PCT公開WO 99/01157; WO 99/01158; WO 99/01175)。
CD99L2抑制劑的治療應(yīng)用
本發(fā)明也提供了通過施用本發(fā)明的治療劑治療或預(yù)防與CD99L2 依賴性經(jīng)內(nèi)皮遷移有關(guān)的疾病和病癥(例如，任意一種或多種上述炎 性疾病)的方法。所述治療劑包括前述抗體分子、小分子、寡肽、蛋 白質(zhì)，包括可溶性非膜結(jié)合的CD99L2,和其組合。
通常，優(yōu)選施用與受試者相同種的物種來源或物種反應(yīng)性的產(chǎn) 品。因此，對于人類施用，本發(fā)明的治療方法利用一種抗體分子，該抗體分子優(yōu)選地來源于人抗體，但可以是來自異源物種例如小鼠的抗 體，其可被人源化或可不被人源化。
為了提高本發(fā)明中包含的治療方法的有效性，這些治療可與阻斷 其他白細(xì)胞經(jīng)內(nèi)皮遷移相關(guān)分子的功能的其他治療方法聯(lián)合應(yīng)用。
CD99L2之外的白細(xì)胞經(jīng)內(nèi)皮遷移相關(guān)分子可包括PECAM。
本發(fā)明適用的受試者可以是任何哺乳動物或脊稚動物種，包括但 不限于，牛、馬、綿羊、豬、家禽(如雞)、山羊、貓、狗、倉鼠、 小鼠、大鼠、猴、兔、黑猩猩和人。在一個優(yōu)選實施方式中，受試者 是人。
基因治療
在一個特定實施方式中，施用包含編碼蛋白質(zhì)(包括但不限于如 上所述的抗體分子，或CD99L2)的序列的載體，以治療或預(yù)防與 CD99L2在白細(xì)胞經(jīng)內(nèi)皮遷移中的功能相關(guān)的疾病或病癥。在本發(fā)明 的一個特定實施方式中，CD99L2或上述抗體分子在患者的血流中以 可溶性的、非膜結(jié)合的形式表達(dá)?？扇苄訡D99L2或抗體分子與位于 白細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞膜上的CD99L2結(jié)合，由此阻止這兩種細(xì)胞類型的 細(xì)胞間結(jié)合，并抑制CD99L2-介導(dǎo)的白細(xì)胞經(jīng)內(nèi)皮遷移。
在本發(fā)明的該實施方式中，治療載體編碼一種序列，該序列在細(xì) 胞外(具有前導(dǎo)序列)產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明可以使用本領(lǐng)域可用的任何基因治療方法。示例性的 方法如下所述。
基因治療方法的綜述參見，Goldspiel等人，Clinical Pharmacy 1993, 12:488-505; Wu和Wu， Biotherapy 1991 , 3:87-95; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1993, 32:573-596; Mulligan, Science 1993, 260:926-932; Morgan和Anderson, Ann. Rev. Biochem. 1993， 62: 191-217; May， TIBTECH 1993, 11:155-215)?？衫玫闹亟MDNA技術(shù) 領(lǐng)域公知的方法描述于Ausubel等人，(eds.)， 1993， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler， 1990, GeneTransfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY;和 第12、 13章,Dracopoli等人，(eds.), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY。適于基因治療的載體如上所述。
在一個方面，治療載體包含在適當(dāng)?shù)乃拗髦斜磉_(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)的 核酸。特別地，所述載體具有與編碼蛋白質(zhì)的序列有效連接的啟動子。 啟動子可以是誘導(dǎo)型的或組成型的，和任選地組織特異性的。在另一 實施方式中，使用一種核酸分子，其中蛋白質(zhì)編碼序列和任何其他期 望的序列的側(cè)翼為促進(jìn)在基因組的期望'位點處同源重組的區(qū)域，從而 提供蛋白質(zhì)的染色體內(nèi)表達(dá)(Koller和Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 86:8932-8935; Zijlstra等人，Nature 1989， 342:435-438)。
載體向患者中的遞送可以是直接的，在此情況中患者直接暴露于 載體或遞送復(fù)合物，或是間接的，在此情況中細(xì)胞首先用載體體外轉(zhuǎn) 化，然后移植入患者中。這兩種方法分別作為體內(nèi)和離體基因治療是 已知的。
在一個特定實施方式中，載體在體內(nèi)直接施用，它進(jìn)入生物體細(xì) 胞中并介導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)。這可通過本領(lǐng)域已知的任何方法而完成， 例如，通過構(gòu)建為適當(dāng)表達(dá)載體的一部分并施用，以4吏其成為細(xì)胞內(nèi) 的，例如，通過利用缺陷或減毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他病毒載體感染 (見，美國專利No, 4,980,286)，或通過直接注射棵DNA,或通過利 用微粒轟擊(例如，基因槍；Biolistic, Dupont);或用脂質(zhì)或細(xì)胞表面 受體或轉(zhuǎn)染試劑包裹，在生物聚合物內(nèi)包封(例如，聚-S-l-64-N-乙 酰葡糖胺多糖；見，美國專利No. 5,635,493),在脂質(zhì)體、微顆粒、 或微膠嚢內(nèi)包封；通過與已知進(jìn)入細(xì)胞核的肽或其他配體連接施用； 或通過與經(jīng)歷受體介導(dǎo)的胞吞作用的配體連接施用(參見例如，Wu 和Wu， J. Biol. Chem. 1987, 62:4429-4432 ),等等。在另一實施方式中， 可形成一種核酸配體復(fù)合物，其中配體包含破壞內(nèi)體的促融合病毒 肽，使核酸避免溶酶體降解。在另一實施方式中，為了細(xì)胞特異性攝 取和表達(dá)，可通過靶向特定受體而在體內(nèi)靶向核酸(見例如，PCT公 開WO 92/06180、 WO 92/22635、 WO 92/20316和WO 93/14188)?？蛇x地，核酸可在細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入并通過同源重組結(jié)合入宿主細(xì)胞DNA中
用于表達(dá)(Koller和Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989， 86:8932-8935; Zijlstra,等人，Nature, 1989, 342:435-438)。這些方法是以 上在"病毒和非病毒載體，，中所述的方法的補(bǔ)充。
可選地，也可以施用抗體分子，例如，通過利用例如描述于 Marasco等人Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1993,90:7889-7893中的技術(shù)， 通過在，標(biāo)細(xì)胞群中表達(dá)編碼單鏈抗體的核苷酸序列進(jìn)行施用。
預(yù)期使用的治療'性核酸的形式和量取決于'疾病的類型和所需效 果的程度、患者狀態(tài)，等等，并且可由本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員確定。
制劑和給藥
根據(jù)本發(fā)明使用的治療組合物可以4吏用 一 種或多種生理上可接 受的載體或賦形劑以任何常規(guī)方法配制。
因此，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或編碼它們的核酸和它們的生理上可接受 的鹽和溶劑可配制用于通過吸入(肺)或吹入(通過口或鼻)給藥、 經(jīng)皮給藥、或經(jīng)粘膜給藥，包括但不限于口服、含服、經(jīng)鼻、經(jīng)眼、 陰道或直腸給藥。
對于口服給藥，治療劑可采用例如片劑或膠嚢劑的形式，它是通 過常規(guī)方法用藥學(xué)上可接受的賦形劑制備的，該賦形劑例如是粘合
劑(例如，預(yù)凝膠化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基曱基纖維素)； 填充劑(例如，乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如，硬 脂酸鎂、滑石或硅石)；崩解劑(例如，土豆淀粉或羥基乙酸淀粉鈉)； 或濕潤劑(例如，月桂基硫酸鈉。片劑可通過本領(lǐng)域公知的方法包衣。 口服給藥的液體制劑可采用例如溶液、糖漿、乳劑或懸浮液的形式， 或它們可作為在使用前用水或其他適當(dāng)載體構(gòu)建的干產(chǎn)物形式存在。 所述液體制劑可通過常規(guī)方法利用藥學(xué)上可接受的添加劑制備，該添 加劑例如是懸浮劑(例如，山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氬化可食 用脂肪)；乳化劑(例如，卵磷脂或阿拉伯樹膠)；非水載體(例如， 杏仁油、油脂、乙醇或分餾植物油)；和防腐劑(例如，曱基或丙基-對-羥基苯甲酸酯或山梨酸)。該制劑也可包含適當(dāng)?shù)木彌_鹽、調(diào)味劑、
著色劑和甜味劑。
口服給藥的制劑可適當(dāng)?shù)嘏渲茷榭刂漆尫呕钚曰衔铩?br> 對于含服給藥，治療劑可采用以常規(guī)方法配制的片劑或錠劑的形式。
對于吸入給藥，根據(jù)本發(fā)明的治療劑以來自加壓包或噴霧器的氣 霧噴霧劑的形式,,利用適當(dāng)?shù)膾伾鋭├缍榷淄椤⑷确淄椤?二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合適的氣體方便地給藥。'在加壓噴霧 劑的情況中，可以通過設(shè)置遞送計量量的閥門來確定劑量單位。例如， 用于吸入劑或吹入劑的明膠膠嚢和藥筒，可配制為包含化合物和適合 的粉末基質(zhì)例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
治療劑可配制為通過注射例如通過彈丸注射或持續(xù)輸注腸胃外 給藥(例如，靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi))。注射制劑可以單位劑 量形式存在，例如，存在于添加有防腐劑的小瓶或安瓿或多劑量容器 中。組合物可采用諸如在油或水載體中的賦形劑、懸浮液、溶液或乳 液的形式，并且可包含配制劑例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?？蛇x 地，活性成分可以為凍干的(即，冷凍干燥的)粉末形式，以在使用 前用適當(dāng)?shù)妮d體例如無菌無熱原水或鹽水構(gòu)建。
治療劑也可配制為直腸組合物，例如栓劑或保留灌腸劑，例如包 含常規(guī)栓劑基質(zhì)，如可可脂或其他甘油酯。
除了前述制劑之外，治療劑還可配制為儲庫型制劑。這種長效制 劑可通過植入(例如，皮下或肌肉內(nèi))或通過肌肉內(nèi)注射而施用。因 此，例如，化合物可用適當(dāng)?shù)木酆匣蚴杷圆牧?例如，作為在可接 受的油中的乳劑)或離子交換樹脂配制，或配制為微溶性的衍生物， 例如微溶性的鹽。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以在聚乙醇酸/乳酸(PGLA)微球中遞送(見 美國專利Nos. 5，100，669和4,849,222; PCT公開WO 95/11010和WO 93/07861)。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)可作為具有通過常規(guī)化學(xué)方法或分子生物學(xué)方法連接的一種以上抗體的分離組合物或單個組合物給藥。另外，本發(fā) 明抗體的診斷和治療價值可通過它們與放射性核素或毒素例如蓖麻 毒素或化療劑例如氨甲喋呤聯(lián)合使用而得以增大。
如果需要，所述組合物也可包含少量的濕潤劑或乳化劑或pH緩 沖劑。該組合物可以是液體溶液、懸浮液、乳液、片劑、丸劑、膠嚢、 持續(xù)釋放制劑、或粉末?？诜苿┛砂?biāo)準(zhǔn)載體，例如制藥等級的 甘露醇、乳糖、淀粉、，脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂，等等。
通常，所述成分分開或混合在一起以單位劑量形式提供，例i口， 作為在密封容器例如標(biāo)示活性劑含量的安瓿或藥嚢中的凍干粉末或 無水濃縮物。在組合物通過注射給藥的情況中，可提供無菌稀釋液的 安瓿，以^吏得成分可在給藥前混合。
本發(fā)明也提供了 一種包含填滿了 一種或多種本發(fā)明制劑成分的 一種或多種容器的藥物包裝或試劑盒。附著在所述容器上的可以是管 理藥品或生物產(chǎn)品制造、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)所規(guī)定的形式的通 知，該通知反映了該機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)對于人類給藥的制造、使用或銷售。
如果需要，組合物可以存在于包含一種或多種包含活性成分的單 位劑量形式的包裝或分配裝置中。所述包裝例如可以包含金屬或塑料 箔，例如泡罩包裝。所述包裝或分配裝置可附有給藥指導(dǎo)。也可制備 包含在相容藥物載體中配制的本發(fā)明化合物的組合物，置于適當(dāng)?shù)娜?器中，并且貼上治療說明的疾病的標(biāo)簽。
可利用許多方法導(dǎo)入本發(fā)明的制劑；這些方法包括但不限于口 服、腦內(nèi)、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)途徑，和通 過劃痕(通過皮膚頂層的刮擦，例如，使用分叉針)或任何其他標(biāo)準(zhǔn) 給藥途徑。
有效劑量
本文描述的化合物和載體可以治療有效劑量施用于患者以治療 某種疾病或病癥。治療有效劑量指足以在被治療的受試者中導(dǎo)致健康 益處的治療量。
35本發(fā)明具體實施的在制劑中使用的治療劑的精確劑量將取決于 給藥途徑和患者疾病的狀態(tài)，并且應(yīng)該根據(jù)醫(yī)師的判斷和每個患者的 情況依照標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)決定。術(shù)語"抑制"表示降低了可測量的量。本 發(fā)明的治療組合物或疫苗產(chǎn)生這種效果的能力可在體外^^僉測，例如利 用如前所述的經(jīng)內(nèi)皮遷移試驗來檢測。抑制的進(jìn)一 步實驗證據(jù)包括觀 察動物模型體內(nèi)炎癥的抑制。因此可從動物模型測試系統(tǒng)獲得的劑量 反應(yīng)曲線推斷有效劑量。
化合物的毒性和治療效果可it過標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)程序在細(xì)胞培養(yǎng)物或
實驗動物中確定，例如，確定LD5q (導(dǎo)致50%群體死亡的劑量)和
ED5。(在50%群體中有治療效果的劑量)。毒性和治療效果的劑量比 是治療指數(shù)，它可表示為LD5()/ED5()。優(yōu)選顯示出大的治療指數(shù)的治 療劑。雖然可以使用顯示出毒性副作用的治療劑，但是應(yīng)該注意設(shè)計 一種將所述化合物靶向于患病組織部位的給藥系統(tǒng)，以使對于未感染 細(xì)胞的潛在損害最小化，并因此減少副作用。
從細(xì)胞培養(yǎng)試驗和動物研究中獲得的數(shù)據(jù)可用于配制用于人類 的 一 定范圍的劑量。所述化合物的劑量優(yōu)選地位于循環(huán)濃度的范圍 內(nèi)，所述濃度包括具有很小或沒有毒性的ED,所述劑量可在此范圍 內(nèi)改變，依賴于使用的劑量形式和采用的給藥途徑。對于任何在本發(fā) 明方法中使用的化合物，最初可從細(xì)胞培養(yǎng)試-驗中估計治療有效劑 量?？稍趧游锬Ｐ椭性O(shè)計一種劑量，以獲得包括在細(xì)胞培養(yǎng)中確定的 ICso(即，達(dá)到癥狀最大抑制的一半的受試化合物濃度)的循環(huán)血漿 濃度范圍。所述信息可用以更精確地確定用于人的有效劑量。例如， 可以通過高效液相色謙法測定血漿中的水平。
體外變移試驗
在 一種典型的在組織培養(yǎng)插入物中的"變移試驗，，中，將白細(xì)胞放 置于內(nèi)皮單層上的懸浮液中，所述內(nèi)皮單層在內(nèi)源(內(nèi)皮產(chǎn)生的)或 外源化學(xué)引誘物的下孔之上的多孔濾膜上生長。計數(shù)在試驗結(jié)束時終 止于底室中的白細(xì)胞作為變移的白細(xì)胞，減少其數(shù)目的試劑被認(rèn)為阻斷變移。然而，為了獲得這些，白細(xì)胞必須與內(nèi)皮結(jié)合，蠕動到連接 點附近，穿過內(nèi)皮滲出，通過內(nèi)皮下基底層遷移，蠕動穿過濾器支持 物(通常比內(nèi)皮自身厚許多倍)，并且從濾器下側(cè)分離。阻斷本過程 中的任何步驟的任何試劑將被認(rèn)為阻斷變移。
對于經(jīng)內(nèi)皮遷移的體外試驗，內(nèi)皮細(xì)胞(E.C.)在用纖連蛋白覆 蓋的水合I型膠原凝膠上培養(yǎng)。培養(yǎng)基組份滲入多孔凝膠中。生長于 多，濾器上表面的E.C.懸浮于更大的培養(yǎng)容器中。培養(yǎng)基分別置于內(nèi)
室k外室中以達(dá)到單層的頂表面和底表面'。在優(yōu)選的膠原凝膠方法
中，保持在頂表面上的附著的白細(xì)胞可從視覺上與已經(jīng)變移的區(qū)分 開。在過濾室方法中，通過直接計數(shù)計算添加到上部室中的白細(xì)胞在 下室中出現(xiàn)的百分比。但是，為了計數(shù)為"變移的"，白細(xì)胞必須l) 附著于內(nèi)皮的頂表面，2)遷移到細(xì)胞間的連接處，3)在內(nèi)皮細(xì)胞之
間滲出，4)從內(nèi)皮細(xì)胞上脫離并滲入它們的基底層中，5)蠕動穿過 濾器自身，并6)從濾器上脫離并落入下面的室中。阻斷任何這些步 驟的試劑將因此阻斷該系統(tǒng)內(nèi)的變移的讀數(shù)。
根據(jù)本發(fā)明利用的優(yōu)選的變移試驗(即，上面的那個)特別可區(qū) 別頂部粘附與變移(l, 5),并且可在內(nèi)皮下基底層水平上檢測變移 細(xì)^^的阻斷(4)。
經(jīng)內(nèi)皮遷移試驗
所有的HUVEC、 PMN、 Mo和NK都以單峰分布方式表達(dá)PECAM (5， 6, 11, 45)。我們還不能通過表面標(biāo)記物或形態(tài)學(xué)辨別被抗 -PECAM試劑阻斷的和未被阻斷的白細(xì)胞之間的任何差異。因此，利 用功能性試驗揭示體內(nèi)替代分子的功能。HUVEC如(48)所述在培 養(yǎng)基199+20%正常人血清中的水合膠原凝膠上培養(yǎng)，并且優(yōu)選地如以 前發(fā)表的那樣(l， 45 )進(jìn)行經(jīng)內(nèi)皮遷移試驗。單核細(xì)胞的遷移可在 存在或不存在內(nèi)皮的細(xì)胞因子刺激的條件下進(jìn)行。對于研究嗜中性粒 細(xì)胞的TEM的實驗，通過在試驗前四小時添加3 I.U./ml的IL-I(3到 培養(yǎng)基中而活化HUVEC單層。筒言之，以Ficoll/Hypaque梯度從健康供體靜脈血中新鮮分離單 核細(xì)胞或嗜中性粒細(xì)胞，使其在37°C和存在或不存在測試試劑的條件 下置于匯合的HUVEC單層上。優(yōu)選地，試驗在培養(yǎng)基199+0.1%人 血清白蛋白上進(jìn)行，但當(dāng)在完全培養(yǎng)基中進(jìn)行時沒有區(qū)別(45)。在 對照組進(jìn)行充分時間的TEM后(通常1小時)，用lmM EGTA充分 清洗單層，以除去任何通過依賴二價陽離子的相互作用仍然附著的白 細(xì)胞(選跨素或整合素)，然后用具有二價陽離子的磷酸鹽緩沖液漂 洗，并在2.5%戊二醛中固定過夜。這加強(qiáng)了膠原歲i膠，以致當(dāng)從96 孔板中除去時更容易地操作。這些單層用賴特-吉姆薩染色并置于載 玻片上，在Nomarski光學(xué)裝置下直接觀察。
與內(nèi)皮單層頂表面的緊密粘附是白細(xì)胞遷出中的限速步驟(4 5 ), 并且在緊密粘附后，遷出過程不依賴于剪切應(yīng)力(56)。因此培養(yǎng)系 統(tǒng)中沒有液體剪切應(yīng)力具有很少的生理學(xué)相關(guān)性，并且基于這種體外 模型進(jìn)行的預(yù)測在幾個體內(nèi)模型中得到支持(2, 6, 8, 9， 12)。該 試驗的關(guān)鍵是觀察與匯合的內(nèi)皮細(xì)胞單層相關(guān)的原位白細(xì)胞。利用
與已經(jīng)變移的白細(xì)月包。然后，可通過目測或通過熒光標(biāo)記的白細(xì)月包的 定量對與單層相關(guān)的白細(xì)胞的總數(shù)進(jìn)行定量(1, 45),以評價試劑對
與內(nèi)皮粘附的效果。變移被定量為已經(jīng)遷移到單層之下、保持與單層 結(jié)合的白細(xì)胞的百分比。因此，TEM測量不依賴于與單層粘附的程 度，并且可獨(dú)立地評價抗體或其他試劑對粘附和TEM的效果。
顯然，如果白細(xì)胞不粘附于內(nèi)皮表面，它不能變移。有人可能認(rèn) 為，例如，在抗-CD18存在下正常變移的白細(xì)胞群可以是分離的亞群 或可能利用與"CD18依賴性"白細(xì)胞(在mAb的存在下不結(jié)合)不同 的粘附途徑。為解決這一問題，可如下重復(fù)對步驟進(jìn)行了修改的這些 試驗優(yōu)化細(xì)胞因子活化條件，使得有多種粘附受體在內(nèi)皮表面上表 達(dá)(E-和P-選擇素、ICAM-1、 VCAM-1),以致由于粘附分子過多， 阻斷任何特定的一種不會顯著影響白細(xì)胞群的頂部粘附。TEM試驗 將在這些條件下進(jìn)行。如果測試mAb的存在對粘附的影響最小但是TEM降低，則可以得出如下結(jié)論所研究的分子在TEM中起作用， 與它在頂部粘附中的作用無關(guān)。標(biāo)準(zhǔn)TEM試驗的其他改變將參考特 定條件在下面討論。
CD99L2在經(jīng)內(nèi)皮遷移中的作用
與白細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞選擇性地預(yù)結(jié)合的CD99L2的純化的Fab和 F(ab，)2可用于確定萍原對于哪些細(xì)胞是關(guān)鍵的。這避免了使用與白細(xì) 胞通過其高親和力Fc受體結(jié)合的帶有完整Fc的抗體或?qū)?nèi)k細(xì)胞單 層轉(zhuǎn)化為免疫復(fù)合物以及刺激白細(xì)胞通過低親和力Fc受體與結(jié)合于 內(nèi)皮上的mAb粘附中潛在的問題。劑量應(yīng)答試驗將確定最佳阻斷濃 度。用PMN重復(fù)這些試驗。
為了顯示白細(xì)胞CD99L2對于TEM是關(guān)4建的，單核細(xì)胞或PMN 在具有飽和濃度的CD99L2的Fab片段(通過流體細(xì)胞術(shù)確定)的懸 浮液中在4。C下孵育30分鐘，然后清洗除去未結(jié)合的mAb。將白細(xì) 胞加入到未處理的HUVEC單層中，并且常規(guī)進(jìn)行TEM試驗。作為 陽性對照，可在持續(xù)存在最適濃度的CD99L2的條件下(已知該條件 可阻斷TEM )進(jìn)行TEM試驗。如果僅與白細(xì)胞結(jié)合的CD99L2的Fab 片段對TEM的阻斷與同時加入到兩種細(xì)胞類型中的Fab —樣有效， 則可以將其解釋為CD99L2對于白細(xì)胞是關(guān)鍵的。然而，這并不排除 內(nèi)皮CD99L2的作用。如果僅僅添加到白細(xì)胞中的CD99L2非常差地 阻斷TEM，這與帶有關(guān)鍵CD99L2的內(nèi)皮細(xì)胞是一致的，可能與白 細(xì)胞上的不同分子結(jié)合。如果添加到白細(xì)胞中的CD99L2部分阻斷， 則提示白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上的CD99L2都是關(guān)鍵的，但是它們與相對 的細(xì)胞上的不同分子結(jié)合。
為了顯示內(nèi)皮CD99L2對于TEM是關(guān)鍵的，匯合的HUVEC單 層與CD99L2的Fab或F(ab，)2片段在通過免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)確定 可在連接處產(chǎn)生最大和飽和CD99L2染色的條件下孵育。(對于抗 PECAM和VE-鈣粘著蛋白的mAb，在4。C孵育l小時就足夠了，但 這也可以通過經(jīng)-瞼確定。)清洗掉未結(jié)合的mAb,加入未處理的Mo或PMN,將共培養(yǎng)物加熱到37。C進(jìn)行TEM試驗。陽性對照也優(yōu)選地 在持續(xù)存在最佳濃度的CD99L2的條件下進(jìn)行。如果當(dāng)僅僅向內(nèi)皮細(xì) 胞中加入CD99L2時產(chǎn)生的TEM阻斷與兩種細(xì)胞類型都暴露于mAb 的陽性對照一樣強(qiáng)，則提示內(nèi)皮細(xì)胞上的CD99L2是關(guān)鍵的。在這些 條件下較差的阻斷提示內(nèi)皮上的CD99L2在這些條件下是不重要的。 此外，中等水平的阻斷提示白細(xì)胞和內(nèi)皮CD99L2是相關(guān)的，也許與 彼此上的不同分子結(jié)合。 ，
CD99L2在白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上的存在提示白細(xì)胞上的CD99li 可能以嗜同性方式與內(nèi)皮上的CD99L2相互作用。如果通過mAb與 白細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合可獲得TEM的最佳阻斷，并且當(dāng)將mAb添加 到兩者中時沒有加成的阻斷，則提示白細(xì)胞上的CD99L2與內(nèi)皮細(xì)胞 上的CD99L2以一種類似于PECAM-1的嗜同性方式直4妾相互作用。 這可用克隆的蛋白質(zhì)直接驗證。
對于這些試驗中的不完全阻斷，存在另外的解釋。最通常的一種 是在試驗過程中細(xì)胞結(jié)合的mAb的胞吞作用或破壞，以致它下降到 不足以阻斷TEM的水平。如果當(dāng)mAb在上述試驗中與細(xì)胞預(yù)結(jié)合時 存在不完全阻斷，這種可能性可通過如下述改變TEM試-瞼而l全i正 在CD99L2與期望的細(xì)胞類型預(yù)結(jié)合之后，清洗掉未結(jié)合的mAb并 且將細(xì)胞保持在4。C。將白細(xì)胞添加到在冰上的HUVEC單層中，并 且保持在低溫下。在這些條件下，抗體不象保持在單層表面上的白細(xì) 胞那樣被代謝。在低溫下它們粘附得不緊密。當(dāng)大多數(shù)細(xì)胞已經(jīng)固定 時，培養(yǎng)容器迅速在孵箱中升溫到37°C,并且白細(xì)胞緊密粘附并在 5-10分鐘之內(nèi)變移。免疫熒光顯微鏡方法證實了大多數(shù)mAb在這一 時期最后仍然存在于細(xì)胞上。這種方法的修改允許研究添加的mAb 在被代謝之前的效果。
當(dāng)僅僅添加到一種細(xì)胞類型時CD99L2不能阻斷TEM的另一種 解釋是被mAb CD99L2識別的CD99L2表位不是該細(xì)胞類型使用的表 位。例如，如果內(nèi)皮CD99L2的氨基末端與靠近膜的白細(xì)胞CD99L2 的表位相互作用，并且所述CD99L2表位在CD99L2的氨基末端上，則可以預(yù)期向HUVEC上添加CD99L2將阻斷TEM,但僅僅向白細(xì)胞 中添加CD99L2將不阻斷TEM。
也可評價CD99L2在粘附事件的順序中相對于PECAM的位置。 當(dāng)阻斷PECAM功能時，甚至在EDTA存在下，白細(xì)胞保持與內(nèi)皮在 細(xì)胞邊界緊密粘附。這提示它們通過不同于二價陽離子依賴性整合素 /ICAM相互作用的分子結(jié)合。如果白細(xì)胞通過CD99L2結(jié)合，當(dāng)添加 阻斷性mAb時，它們將被釋放。這與CD99L2部分阻斷Mo和PMN 粘附的數(shù)據(jù)是相符的。如果CD99L2^離PECAM較遠(yuǎn)的步驟中起作 用，則在這一階段添加mAb將沒有效果。
為了顯示這一點，進(jìn)行了幾個系列的試驗，其中在TEM中首先 用抗-PECAM的mAb阻止白細(xì)胞。在第一系列中，隨后在持續(xù)存在 抗-PECAM的條件下加入CD99L2或同種型對照mAb。如果結(jié)合的白 細(xì)胞被釋放，則CD99L2很可能是在PECAM阻斷中結(jié)合白細(xì)胞的分 子。不能釋放白細(xì)胞可能是由于多種因素。因此，進(jìn)行第二組試驗， 其中在用抗-PECAM mAb阻止TEM之后，清洗掉抗-PECAM試劑并 且添加CD99L2或?qū)φ誱Ab。在抗-PECAM mAb被清洗掉之后，TEM 恢復(fù)正常并且在不存在附加抑制劑的情況下在30-90分鐘內(nèi)完成(1 )。 如果CD99L2在最接近PECAM的步驟中起作用，我們不能預(yù)期看見 任何阻斷，并且TEM將正常完成。但是，如果CD99L2涉及到遠(yuǎn)離 PECAM的步驟，我們預(yù)期TEM的阻止將會繼續(xù)。
第三系列的試驗可以類似于第二系列進(jìn)行，其中將應(yīng)用mAb的 順序顛倒。首先應(yīng)用mAb CD99L2阻止TEM,然后在清洗掉CD99L2 之后添加抗-PECAM。在這些試驗中，如果抗-PECAM mAb接近于 CD99L2發(fā)揮作用，則當(dāng)CD99L2 一皮清洗掉之后它不應(yīng)阻止隨后的 TEM,但是如果PECAM在很遠(yuǎn)處發(fā)揮作用則應(yīng)該阻止。由于一皮抗 -PECAM試劑阻止的白細(xì)胞保持與內(nèi)皮細(xì)胞緊密粘附，重復(fù)顛倒試劑 順序的第 一 系列試驗將是無益的，但可以作為內(nèi)部對照進(jìn)行。
CD99L2的表征所述分子的完全功能和重要性的暗示來自幾種直接的試驗(45 ，
48, 57-59 )。這些生化和免疫研究補(bǔ)充了對該分子進(jìn)行克隆和測序所 獲得的數(shù)據(jù)。
該蛋白質(zhì)的生物合成和更新率
在脈沖追蹤試驗中，在沒有甲硫氨酸和半胱氨酸的培養(yǎng)基中預(yù)處 理HU，VEC單層1小時，用"S-曱硫氨酸和半胱氨酸代謝標(biāo)記1小時， 然后在非放射性培養(yǎng)基中進(jìn)行"追蹤"。在不同'的時間點，裂解細(xì)胞并 用CD99L2和對照mAb進(jìn)行免疫沉淀以回收CD99L2和對照抗原。 通過SDS-PAGE分析并進(jìn)行放射自顯影(48 )。通過對放射自顯影圖 的密度測定或直接通過從凝膠上切下放射性帶，相對于內(nèi)皮膜的其他 標(biāo)記物例如PECAM-1、 VE-《丐粘著蛋白(連接分子)和ICAM-1或 MHCI類(在質(zhì)膜上廣泛表達(dá))確定合成和翻譯后修飾的比率(58， 59)。更新率可直接在獨(dú)立試驗中確定，其中將HUVEC代謝性標(biāo)記 為穩(wěn)定狀態(tài)，然后除去放射性培養(yǎng)基。細(xì)胞裂解液的免疫沉淀在超過 兩天的時間點進(jìn)行，并如上所述分析放射性CD99L2和對照細(xì)胞標(biāo)記 物的存在。
CD99L2的替fC形式
裂解內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、PMN、血小板和淋巴細(xì)胞，并用抗 -CD99L2抗體通過Western印跡法才僉測。這種方法已經(jīng)通過HUVEC 的Western印跡法和免疫沉淀法鑒定了 一種45kD的分子。但是，在 不同條件下(例如，細(xì)胞因子刺激)生長的HUVEC可能表達(dá)以與靜 止條件下細(xì)胞不同方式糖基化的選擇性剪接形式的CD99L2。這一發(fā) 現(xiàn)提示CD99L2在這些條件下具有不同的(或提高的)功能，所述功 能可通過在細(xì)胞因子條件下進(jìn)行TEM試驗而直接4企-瞼。白細(xì)胞可能 表達(dá)具有相同CD99L2表位的結(jié)構(gòu)不同的分子。如果這樣，該分子在 這些細(xì)胞類型以及多于一種的cDNA克隆上可能具有不同的相互作 用或信號途徑。與其他分子的結(jié)合
在用磷酸緩沖液中的0.1。/。NonidetP-40提取，接著用0.5% NP-40 + 0.1% SDS清洗免疫沉淀物的條件下，沒有其他分子與CD99L2從 HUVEC裂解液中共純化。在不同去污劑條件下從白細(xì)胞或EC裂解 液中的免疫沉淀可能揭示了與其他可傳導(dǎo)信號或可將其與細(xì)胞骨架 連接的分子的結(jié)合。基于與商業(yè)上可獲得的已知信號和結(jié)構(gòu)分子的抗 體的反應(yīng)性，定這些分子，并且將產(chǎn)生關(guān)于信號傳導(dǎo)途徑或與 CD99L2相互作用的細(xì)胞骨架元件的第 一假說。 '
在對炎性細(xì)胞因子的應(yīng)答中CD99L2表達(dá)的變化
CD99L2與炎癥的關(guān)系提示CD99L2可能對炎性細(xì)胞因子應(yīng)答。 當(dāng)HUVEC被IL-ip、 TNF-a刺激時ICAM-1表達(dá)提高(45， 60)。對 于細(xì)胞因子處理，PECAM水平不提高，但是IFN-y處理導(dǎo)致PECAM 從連接點向細(xì)胞頂表面重新分布(61)。在一個特定試驗中，匯合的 HUVEC單層用與炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子處理(例如，IL-1(3, 3-10 IU/ml， 6到24小時；IFNy, 100 I.U./ml, 1到3天)，并且利用免疫熒光法 評價表達(dá)或分布的變化。已知的細(xì)胞因子反應(yīng)性粘附分子(例如，分 別為ICAM-1和MHC II類或PECAM)可用作陽性對照。表達(dá)水平的 變化例如可通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行定量。
過氧化物酶組織化學(xué)法可用于確i在來自人體多種器官的發(fā)炎^織 中脈管系統(tǒng)上的細(xì)胞表達(dá)和分布，并與來自相應(yīng)普通組織的脈管系統(tǒng) 上的表達(dá)對比。多種"廢組織，，對于檢驗是可利用的，例如，來自外科 病理學(xué)和尸檢標(biāo)本，或牛皮癬患者的皮膚。可以比較在同一時間來自 同 一人的損害和未損害皮膚，和在時間過程內(nèi)采集的活檢組織。
CD99L2的作用機(jī)理
該分子的預(yù)測氨基酸序列給出了它潛在功能的線索，如從CD99 中所見(圖2)。"序列觀察"提供了試驗的起始位置。克隆的分子在多種哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)，以確定表達(dá)分子使這些細(xì)胞具有哪些功能，
例如，類似于連接粘附分子PECAM (7, 49， 53， 65)和VE-釣粘著 蛋白(29)的試驗。特別重要的是CD99L2的可溶形式，即，其配體 結(jié)合部分的胞外域，其可以用作CD99L2功能的抑制劑。在一個特定 方案中，制備類似于以上所述的PECAM-Ig嵌合構(gòu)建體的CD99L2-Ig
嵌合體。
CD99L2在白細(xì)胞，內(nèi)皮上的表達(dá)提示了它介導(dǎo)這些細(xì)胞之間的 嗜同性相互作用。這種介導(dǎo)在以前所述的短期(L-細(xì)胞聚集試會)和 長期(培養(yǎng))試驗中得到證實(7， 29, 49， 53, 65 )。
L細(xì)胞是顯示很小的彼此自然結(jié)合傾向性的鼠成纖維細(xì)胞系。通 過轉(zhuǎn)染表達(dá)外源粘附分子使它們具有這些分子的粘附性質(zhì)。用 CD99L2 cDNA轉(zhuǎn)染的L細(xì)胞通過在10 mM EDTA中短時孵育非酶重 懸浮，清洗，并以106細(xì)胞/011在緩沖液中重懸浮。將lml這種懸浮 液置于24孔培養(yǎng)板的每個孔中，并置于90rpm的gyrotory振蕩器上。 在零時刻和直到1小時的不同時間點，通過添加戊二醛至終濃度為2% 的終止聚集。如果在表面表達(dá)CD99L2的L細(xì)胞彼此結(jié)合，它們將形 成聚集體，在血細(xì)胞計上定量。粘附的溫度依賴性和二價陽離子依賴 性在所述試驗中容易地被驗證。粘附的潛在抑制劑在零時間點加入， 并且定量它們對粘附的效果。特別地，阻斷白細(xì)胞變移的mAb CD99L2應(yīng)當(dāng)阻斷粘附。
因為EC和白細(xì)胞都有CD99L2,合理地假設(shè)CD99L2-介導(dǎo)的粘 附是嗜同性。也就是說， 一種細(xì)胞上的CD99L2分子與相對細(xì)胞上的 CD99L2分子結(jié)合。為了驗證該假設(shè)，將兩種L細(xì)胞群體混合。CD99L2 轉(zhuǎn)染體在聚集試驗中與等量的熒光標(biāo)記的親本細(xì)胞混合。在試驗最
后，在焚光顯微鏡下檢測聚集體。如果結(jié)合是嗜同性的，應(yīng)該僅有 CD99L2轉(zhuǎn)染體在聚集體中，其是非熒光的。如果結(jié)合是嗜異性的 (CD99L2與L細(xì)胞表面上內(nèi)源表達(dá)的另一種分子結(jié)合)，則可見標(biāo) 記的和未標(biāo)記的細(xì)胞的混合聚集體。然后變換為標(biāo)記的群體用其重復(fù) 該試-驗。這些試驗證實了 CD99L2轉(zhuǎn)染的L細(xì)胞以嗜同性方式聚集。 這些試驗可通過混合CD99L2轉(zhuǎn)染體與白細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞而重 復(fù)，這些細(xì)胞推定地包含CD99L2配體。在此例子中，CD99L2轉(zhuǎn)染 體與白細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，添加CD99L2到轉(zhuǎn)染體中可阻斷這種結(jié) 合，但添加CD99L2到白細(xì)胞或EC中不阻斷這種結(jié)合。
在長期試驗中，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與非轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞在培養(yǎng)物中混 合，其還可通過外源標(biāo)記而識別。細(xì)胞共培養(yǎng)數(shù)天，然后用CD99L2 染色以確定分布。如果結(jié)合在連'接點是嗜同性的，則CD99L2將僅僅 在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相互形成的邊界處濃縮，而不在與非轉(zhuǎn)染的細(xì)胞形成的 邊界處濃縮。
如果在內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞上的CD99L2之間的相互作用是嗜異性 的，這產(chǎn)生了在白細(xì)胞上具有內(nèi)皮CD99L2獨(dú)特性配體和在內(nèi)皮細(xì)胞 上具有白細(xì)胞CD99L2獨(dú)特性配體的可能性。白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上的 CD99L2配體可通過將CD99L2轉(zhuǎn)染體分別與大量放射標(biāo)記的白細(xì)胞 和內(nèi)皮細(xì)胞混合而鑒定。這些細(xì)胞在溫和去污劑條件下裂解，并且裂 解液通過CD99L2-Sepharose柱。這將結(jié)合CD99L2和它附著的配體。 洗脫下結(jié)合的物質(zhì)并且進(jìn)行SDS-PAGE。放射條帶代表候選的 CD99L2配體。這些條帶從凝膠上切下，并進(jìn)行蛋白質(zhì)測序。
CD99L2在TEM中的功能
CD99L2具有至少兩種與炎癥相關(guān)的功能。它是可潛在地將白細(xì) 胞與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的粘附分子(圖12)?？故驝D99L2抗體在體內(nèi)阻 斷炎癥。特別地，預(yù)先注射抗-CD99L2抗體阻止嗜中性粒細(xì)胞和單核 細(xì)胞(分別是急性和慢性炎癥的主要細(xì)胞介質(zhì))遷移進(jìn)入發(fā)炎的腹膜 腔(圖7 )。
已知內(nèi)皮細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的增多對于TEM是必需的 (66 )。阻斷這種增多將抑制變移，但不粘附PMN到內(nèi)皮細(xì)胞上(66 )。 Fluo3 ( Molecular Probes, Eugene, OR)或其他〔&++敏感試劑可用于 確定是否在白細(xì)胞/EC接觸后很短時間內(nèi)發(fā)生細(xì)胞內(nèi)鈣流出(flux)。
45在一個特定實施方式中，洗去匯合的HUVEC單層中的血清，與
Fluo3-AM ( 3.3mM，溶解在Pluronic F-127和DMSO中)在熱滅活的 小牛血清中室溫孵育40分鐘。這擴(kuò)散進(jìn)細(xì)胞中，在其中細(xì)胞質(zhì)酯酶 切割乙酸基曱酯，使染料不可透過膜。加入苯磺唑酮(0.25mM)或 丙磺舒(2.5mM)阻斷將染料泵出細(xì)胞并泵入內(nèi)體中的有機(jī)陰離子轉(zhuǎn) 運(yùn)體(67)。細(xì)胞內(nèi)鈣離子的增多導(dǎo)致Fluo3熒光明顯升高，其可在 qytofluo^儀器上定量，通過焚光顯微鏡顯現(xiàn)，或在FITC通道上通過 流 式細(xì)胞術(shù)#:測。
當(dāng)白細(xì)胞遷移穿過這些載有Fluo3的HUVEC單層時，由于胞質(zhì) 游離鈣離子[(Ca++ ) i]的增多導(dǎo)致熒光升高。鈣流出可被CD99L2 mAb 阻斷；如果這樣，CD99L2是產(chǎn)生這種信號的原因。CD99L2在鈣信 號中的直接參與可通過設(shè)計CD99L2轉(zhuǎn)染體復(fù)制相同現(xiàn)象的條件進(jìn)行 檢測。如果在白細(xì)胞和內(nèi)皮之間的嗜同性CD99L2相互作用刺激 [(Ca++) i]升高，則HUVEC上的CD99L2被mAb的交聯(lián)也可刺激 [(Ca++) i]升高。
PECAM缺陷小鼠中的變移試驗
我們最近產(chǎn)生了組成型表達(dá)作為二聚PECAM-IgG嵌合蛋白的可 溶性鼠PECAM的轉(zhuǎn)基因小鼠。具有20(ig/ml循環(huán)濃度(對應(yīng)于最大 阻斷炎癥的外源施用的PECAM-IgG劑量到達(dá)的水平)的Tg82o系小 鼠在動物設(shè)備的清潔環(huán)境下是健康的，但具有嚴(yán)重鈍化的急性炎性應(yīng) 答。與野生型同窩出生仔相比，它們僅僅動員了 10-20。/。的PMN和單 核細(xì)胞。這提示正常的宿主不耐受治療水平的這種抗-PECAM試劑。 這些小鼠對于研究PECAM在慢性炎癥中的作用和長期干擾PECAM 功能對炎性應(yīng)答的效果是有價值的。這些小鼠也證實了治療水平的炎 癥抑制物(即PECAM-IgG)的表達(dá)不抑制基礎(chǔ)炎性應(yīng)答例如亞臨床 創(chuàng)傷修復(fù)，并且不會使小鼠成為免疫缺陷的。因此，可能長期施用治 療水平的抗-CD99L2試劑，而對涉及基線免疫功能的細(xì)胞沒有不利效應(yīng)。多個實驗室已經(jīng)確定了 PECAM在嗜中性粒細(xì)胞(PMN)、單核 細(xì)胞(Mo)和自然殺傷細(xì)胞(NK)的TEM中起關(guān)鍵作用。PECAM 功能抑制物在幾個不同模型中(2, 8-11)在體外(1, 4， 6, 7)和 體內(nèi)都阻斷大多數(shù)TEM。但是，甚至在最佳條件下，我們利用單克 隆或多克隆抗體、可溶性PECAM-IgG嵌合體或其組合(4, 6)從來 不能阻斷80-90%的TEM。甚至組成型暴露于最大治療濃度(20mg/ml) 的Tg82o,轉(zhuǎn)基因PECAM-IgG小鼠響應(yīng)于急性炎癥刺激仍然動員 10-20%的白細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)提示不依賴于PECAIvi的途徑正常存在， 并且當(dāng)最大PECAM阻斷前負(fù)責(zé)殘留白細(xì)胞的遷出。在一些炎性病癥 特別是慢性病癥中，殘留TEM當(dāng)最大有效抗-PECAM治療前可足夠 產(chǎn)生臨床癥狀。因此，鑒定這些替代TEM途徑、確定它們?nèi)绾巫饔谩?并且如何最好地抑制它們是重要的。
在一種急性炎癥模型中，其中通過直接對大鼠腸系膜應(yīng)用趨化性 肽甲酰基-曱硫氨?；?亮氨酰-苯基丙氨酸(fMLP)刺激嗜中性粒細(xì) 胞遷出，抗-PECAM抗體不阻斷PMN滲出，但是當(dāng)用IL-1(3活化腸 系膜小靜脈的內(nèi)皮時同樣的抗體阻斷PMN滲出(9)。因此，在野生 型動物中至少有一種引起不依賴于PECAM的白細(xì)胞遷出的刺激物。 當(dāng)在C57B1/6系中進(jìn)行缺失時，靶向PECAM-1缺失的純合小鼠在多 種急性炎癥模型中不顯示任何顯著缺陷(26)。這些定義的小鼠利用 了替代的TEM機(jī)理。但是，當(dāng)在FVB/n系中進(jìn)行相同PECAM缺失 時，小鼠不能對急性炎性刺激應(yīng)答，即使在基線時它們是健康的 (Schenkel等人.，2004, J. Immunol. 173:6403-6408)。
抗-PECAM治療已經(jīng)證明可阻斷腸系膜(2, 6， 8, 9)、肺(S)、 皮膚(8, 11 )、心肌(10， 12)和(或許)角膜(27)中的TEM。 但是，這造成了在其他脈管床中PECAM作用的重要性更低的可能性。 大多數(shù)白細(xì)胞在急性炎癥部位的遷出穿過毛細(xì)血管后小靜脈。但是， 在肺中，發(fā)生穿過毛細(xì)血管的遷出。在動脈粥樣硬化癥和許多形式的 動脈炎中，白細(xì)胞遷出穿過動脈內(nèi)皮發(fā)生。
在體內(nèi)表征CD99L2的巨大的障礙是在野生型小鼠中抗-PECAM試劑阻斷變移。考慮到在動物試驗中固有的標(biāo)準(zhǔn)誤差，當(dāng)抗-PECAM
阻斷85±10%的白細(xì)胞遷出時，鑒定殘余的 15%的阻斷可能是非常困 難的。因此發(fā)展了兩種不同類型的小鼠來研究不依賴于PECAM的變 移途徑。在這些小鼠中，所有的TEM通過不依賴于PECAM的途徑 發(fā)生。具有PECAM-1基因靶向缺失的C57B1/6系小鼠具有正常的白 細(xì)胞計數(shù)，在炎性應(yīng)答中僅有非常小的缺陷。已經(jīng)發(fā)展了PECAM缺 失的這些小鼠，因>此它們必須利用替代粘附分子進(jìn)行TEM。另外， 已經(jīng)發(fā)展了組成型表達(dá)超治療水平的可溶性PECAM-IgG無合體的兩 種獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因小鼠系[Tg5KHK)和Tgll1()()()],其血液中的循環(huán)濃度是 500到2000 jug/ml。雖然當(dāng)轉(zhuǎn)移給野生型小鼠時他們表達(dá)的轉(zhuǎn)基因蛋 白具有完全活性，但矛盾的是，這些小鼠對于抗炎效應(yīng)是抗性的。由 于這些小鼠在它們的淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上具有正常水平的內(nèi)源 PECAM,它們一定是利用不依賴于PECAM的途徑進(jìn)行TEM。
PECAM"敲除"的正常炎性表型提示不依賴于PECAM的途徑可 從數(shù)量上擴(kuò)大到支持正常水平的TEM。使用轉(zhuǎn)基因小鼠Tg51G(K)和 Tgll咖。的結(jié)果提示非常高水平的循環(huán)抗-PECAM試劑可使宿主隨著 時間對抗炎效應(yīng)脫敏。這些轉(zhuǎn)基因小鼠用于更充分地表征TEM的 CD99L2途徑。
篩選和化學(xué)
根據(jù)本發(fā)明，源于編碼CD99L2的基因的核苷酸序列，和源于 CD99L2的肽序列，對于鑒定對治療炎性病癥有效的藥物是有用的靶 標(biāo)。藥物靶標(biāo)包括但不限于(I)源于編碼CD99L2的基因的分離的 核酸；(ii)源于CD99L2多肽的分離的肽和多肽；源于CDE99結(jié)合 配偶體的分離的肽和多肽；在CD99L2上發(fā)現(xiàn)的碳水化合物基團(tuán)；及
其小分子模擬物或類似物。
特別地，鑒定作為TEM的重要介質(zhì)的CD99L2可開發(fā)篩選試驗， 特別是用于高通量篩選上調(diào)或下調(diào)CD99L2活性的分子。相應(yīng)地，本 發(fā)明涉及利用本領(lǐng)域已知的不同篩選試驗鑒定特定的CD99L2配體的方法。
任何本領(lǐng)域已知的篩選技術(shù)可用于篩選CD99L2激動劑或拮抗 劑。本發(fā)明涉及小分子配體或配體類似物和模擬物的篩選方法，和篩 選在體內(nèi)結(jié)合并激動或拮抗CD99L2的天然配體的方法。所述激動劑 或拮抗劑可以，例如，干擾CD99L2的TEM性質(zhì)或粘附性質(zhì)，對 CD99L2功能產(chǎn)生影響。例如，可利用本發(fā)明的試驗篩查天然產(chǎn)物庫， 以篩選激動或拮抗CD99L2,活性的分子。
對CD99L2—級序列的了解，和該序列與具有已知功能的蛋白k 的相似性，可以提供作為該蛋白質(zhì)抑制劑或拮抗劑的最初暗示。確定 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)一步有利于拮抗劑的鑒定和篩選，例如，利用
X-射線晶體照相術(shù)、中子衍射、核磁共振光i普和其他結(jié)構(gòu)確定技術(shù)進(jìn) 行確定。這些技術(shù)提供了激動劑和拮抗劑的合理的設(shè)計或鑒定。
另一方法利用重組噬菌體產(chǎn)生大文庫。利用"噬菌體方法"(Scott 和Smith, Science 1990, 249:386-390; Cwirla,等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990, 87:6378-6382; Devlin等人，Science, 1990,49:404-406),可 構(gòu)建非常大的文庫(106-108化學(xué)實體)。第二種方法利用主要是化學(xué) 的方法,例長口 Geysen的方法(Geysen等人.，Molecular Immunology 1986, 23:709-715; Geysen等人.J. Immunol. Meth. 1987， 102:259-274); 例子有Fodor等人的方法(Science 1991. 251:767-773)。 Furka等人 (14th International Congress of Biochemistry 1988, Vol. 5, Abstract FR:013; Furka， Int. J. Peptide Protein Res. 1991, 37:487-493)、 Houghton (美國專利No. 4,631，211)和Rutter等人(美國專利No. 5,010,175)描述 了制備可檢測為激動劑或拮抗劑的肽混合物的方法。
在另一方面，可以利用合成文庫(Needels等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993， 90: 10700-4; Ohlmeyer等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993，卯10922-10926; PCT公開WO 92/00252和WO 9428028)等篩選 根據(jù)本發(fā)明的CD99L2配體。
法用于隨機(jī)和定向合成基于糖、肽和核酸的化合物。合成化合物文庫在商業(yè)上可獲自Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK)、 Comgenex (Princeton, NJ)、 Brandon Associates (Merrimack, NH)和 Microsource (New Milford, CT)。 一種罕見的化學(xué)文庫可/人Aldrich (Milwaukee, WI)獲得?？蛇x地，細(xì)菌、真菌、植物和動物提耳又物形式 的天然化合物文庫可從例如Pan Laboratories (Bothell， WA)或 MycoSearch (NC)獲得，或容易地產(chǎn)生。另外，天然和合成產(chǎn)生的 文庫和化合物通過常規(guī)化學(xué)、物理和生化方法可容易地修飾(Blondelle 等人，Tib Tech 1996， 14:60)。
體外篩選方法
將候選試劑添加到內(nèi)皮細(xì)胞的體外細(xì)胞培養(yǎng)物中，或添加到純化 的CD99L2 (優(yōu)選地為穩(wěn)定的可溶形式，例如，表達(dá)為CD99L2/Ig嵌 合構(gòu)建體)，并且評價它們結(jié)合CD99L2的能力(特別對于鑒定候選 化合物的初步篩選)或更優(yōu)選地，它們抑制白細(xì)胞與CD99L2結(jié)合的 能力。在內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，可以評價抑制TEM的能力。
上面描述了多種適當(dāng)?shù)捏w外系統(tǒng)。
體內(nèi)篩選方法
表達(dá)編碼CD99L2的基因的完整細(xì)胞或完整動物可用于鑒定并進(jìn) 一步表征候選藥物的篩選方法中。上述的任何動物模型或轉(zhuǎn)基因動物 才莫型適于篩選CD99L2拮抗劑。
在一系列的實施方式中，建立一種7Jc久細(xì)月包系?？蛇x地，例如通 過利用上述載體系統(tǒng)導(dǎo)入適當(dāng)?shù)腄NA或mRNA，將細(xì)胞(包括但不 限于哺乳動物、昆蟲、酵母或細(xì)菌細(xì)胞)短暫地編程為表達(dá)CD99L2 基因。候選化合物的鑒定可利用任何適當(dāng)?shù)脑囼炦M(jìn)行，包括但不限于 (i)測定測試化合物與CD99L2的選擇性結(jié)合的試驗，(ii)測定測 試化合物改變(即，抑制或增強(qiáng))CD99L2的可檢測活性或功能的能 力的試驗，和(iii)測定化合物改變(即，抑制或增強(qiáng))源于CD99L2 基因啟動子(即，調(diào)節(jié))區(qū)的序列的轉(zhuǎn)錄活性的能力的試驗。
50利用轉(zhuǎn)基因動物的體內(nèi)試驗
可制備轉(zhuǎn)基因哺乳動物以評價CD99L2的分子機(jī)理。優(yōu)選地，為 了評價用于人類治療的化合物，動物就CD99L2而言被人源化。所述 哺乳動物提供了篩選或測試藥物候選物的很好的模型。術(shù)語"轉(zhuǎn)基因，， 通常指其種系和體細(xì)胞包含目標(biāo)轉(zhuǎn)基因即CD99L2的動物。但是，短 期轉(zhuǎn)基因動物可通過離體或體內(nèi)導(dǎo)入本發(fā)明的表達(dá)載體而產(chǎn)生。兩種 類型，的"轉(zhuǎn)基因"動物預(yù)期用于本發(fā)明中，例如，評價測試化合物對 CD99L2活性的效果。 '
因此，可制備表達(dá)人CD99或人CD99L2或此兩者的"敲入"哺乳 動物，用于比應(yīng)用人類受試者更詳細(xì)地評^H亥系統(tǒng)的分子生物學(xué)。也 可以在人或鼠CD99"敲除"動物中評價化合物或疾病，例如，用于鑒 定可補(bǔ)償人或鼠CD99活性缺陷的化合物。這兩種技術(shù)允許操作在細(xì) 胞基因組的自然位置中的單個單元的遺傳信息，以在最終分化的生物 體的背景中檢驗該操作的結(jié)果。
盡管大鼠和小鼠以及兔最常被用作轉(zhuǎn)基因動物，特別是用于體內(nèi) 蛋白質(zhì)功能和基因調(diào)節(jié)的實驗室研究，但是在本發(fā)明的實踐中可以使 用任何動物。
"敲入"哺乳動物是其中 一種內(nèi)源基因用 一種異源基因取代的哺 乳動物(Roemer等人，NewBiol. 1991 , 3:331)。優(yōu)選地，異源基因被"敲 入，，到感興趣的基因座，這是評價同源基因的表達(dá)或功能的對象(在 此情況中基因可以是報告基因，見Elefanty等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95: 11897),因此將異源基因表達(dá)與源于適當(dāng)啟動子的轉(zhuǎn)錄 耳關(guān)系起來。這可通過同源重組、壽爭座子(Westphal和Leder. Curr. Biol. 1997, 7:530, 1997)、利用突變重組位點(Araki等人，Nucleic Acids Res. 1997, 25:868)或PCR(Zhang和Henderson, Biotechniques 1998， 25:784) 來實現(xiàn)。參見Coffman, Semin. Nephrol. 1997， 17:404; Esther等人，Lab. Invest. 1996， 74:953; Murakami等人.Blood Press. Suppl. 1996， 2:36。
"敲除哺乳動物，，是在其基因組中包含通過基因打靶方法(見，例 如，美國專利No. 5,777，195和No. 5,616,491 )滅活了特定基因的哺乳動物(例如小鼠)。敲除哺乳動物可以是雜合敲除(即， 一個突變等 位基因和一個野生型等位基因)或純合突變體(即，兩個突變等位基 因)。敲除哺乳動物的制備需要首先向被稱為胚胎干細(xì)胞的未分化細(xì) 胞型中導(dǎo)入用于抑制特定基因表達(dá)的核酸構(gòu)建體。然后將這種細(xì)胞注 射入哺乳動物胚胎中。然后將具有整合的細(xì)胞的哺乳動物胚胎植入代
孕母體中度過妊娠期。Zhou等人(Genes and Development 1995， 9:2623-34)描述了 PPCA敲除小鼠。
術(shù)語"敲除"指細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源DNA序列編碼的蛋白i的至少一部分 的表達(dá)被部分或全部抑制。術(shù)語"敲除構(gòu)建體"指設(shè)計為降低或抑制由 細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源DNA序列編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)的核酸序列。用作敲除構(gòu)建 體的核酸序列典型地包含(1 )源于待抑制的基因某部分的DNA (外 顯子序列，內(nèi)含子序列，和/或啟動子序列)和(2)用于檢測細(xì)胞內(nèi) 敲除構(gòu)建體的存在的標(biāo)記序列。將敲除構(gòu)建體插入細(xì)胞中，在阻止或 中斷天然DNA序列的轉(zhuǎn)錄的位點處與細(xì)胞基因組DNA整合。所述插 入通常通過同源重組實現(xiàn)(即，當(dāng)敲除構(gòu)建體插入細(xì)胞并重組時，與 內(nèi)源DNA序列同源的敲除構(gòu)建體的區(qū)域相互雜交，導(dǎo)致敲除構(gòu)建體 并入內(nèi)源DNA的相應(yīng)位點)。敲除構(gòu)建體的核酸序列可包含1 )待抑 制的基因的一種或多種外顯子和/或內(nèi)含子的全部或部分序列，2)待 抑制的基因的全部或部分啟動子序列，或3)它們的組合。典型地， 將敲除構(gòu)建體插入胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)中并整合入ES細(xì)胞基因組 DNA中，通常通過同源重組過程進(jìn)行。然后將該ES細(xì)胞注射到發(fā)育 的胚胎中并與之整合。然而，本發(fā)明并不需要任何特別的方法制備轉(zhuǎn) 基因動物。
通常，對于同源重組，DNA的長度至少為大約1千堿基(kb), 優(yōu)選3-4kb,因而當(dāng)導(dǎo)入構(gòu)建體時為重組提供充分互補(bǔ)的序列。轉(zhuǎn)基 因構(gòu)建體可以導(dǎo)入ES細(xì)胞的基因組DNA中，通過顯微注射或通過 任何本領(lǐng)域已知的方法導(dǎo)入已受精卵母細(xì)胞的雄性原核中，例如，如 美國專利Nos. 4,736,866和4,870,009， Hogan等人，Transgenic Animals: A Laboratory Manual, 1986, Cold Spring Harbor所述?？梢允褂棉D(zhuǎn)基因建立者(founder)動物繁殖其他的轉(zhuǎn)基因動物；可選地，可以克隆轉(zhuǎn) 基因建立者以產(chǎn)生其他的轉(zhuǎn)基因動物。
在本發(fā)明范圍內(nèi)包括其中兩種或更多種基因被敲除或敲入或既 有敲除也有敲入的哺乳動物。所述哺乳動物可通過重復(fù)本文所述的產(chǎn) 生每種敲除構(gòu)建體的程序而產(chǎn)生，或通過單個基因被敲除的哺乳動物 互相繁殖并且篩選具有雙敲除基因型的動物而產(chǎn)生。
調(diào)節(jié)的敲除動物，利用多種系統(tǒng)制備，例如tet-抑制子系統(tǒng)(見 美國專利No. 5,654,168 )或cre-lox系統(tǒng)(見美國專利No. 4》59,317 和No. 5，801 ,030)。
高通量篩選
本發(fā)明的試劑可通過在高通量試驗中篩選來鑒定，該試驗包括但 不限于基于細(xì)胞或無細(xì)胞的試驗。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會預(yù)期不同類型 的試驗可用于檢測不同類型的試劑。最近幾年發(fā)展了幾種自動化測定 方法，其允許在短時間內(nèi)篩選上萬種化合物。特別優(yōu)選這種高通量篩 選方法。如本發(fā)明所提供的，大量純化多肽的可獲得性大大促進(jìn)了高 通量篩選試驗測試試劑的應(yīng)用。
實施例
通過參考下述實施例將更好地理解本發(fā)明，這些實施例用于對本 發(fā)明進(jìn)行說明而不是限制。
實施例1:鼠CD99L2
用人CD99 cDNA克隆探測幾種鼠cDNA文庫以發(fā)現(xiàn)鼠CD99。 當(dāng)鼠基因組序列開始在公共數(shù)據(jù)庫中積累時，產(chǎn)生了 一個突破。 根據(jù)三種EST和一種基因組序列粘粒(分別為Genbank登錄號 AI466980、 AW227546、 AW320831和AF125314),預(yù)測編碼一種^皮 稱為XAP89 (X染色體相關(guān)蛋白89)的假定蛋白質(zhì)的推定的開放閱 讀框具有與人CD99高度同源的幾個區(qū)域(Butcher, E. C. 1991 Cell 67:1033-1036)。然而，由于替代密碼子的使用，其核苷酸序列與人CD99 顯著不同。這種序列用于設(shè)計引物，以通過利用鼠胸腺cDNA文庫的 5，-RACE完成cDNA序列。 一種843bp的cDNA克隆(圖1 )編碼一 種237個氨基酸的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)沿著幾個高度保守的片段，特別 是在跨膜結(jié)構(gòu)域，與人CD99具有顯著的同源性(圖2)。預(yù)測該蛋白 質(zhì)是I型膜蛋白，其類似于人CD99具有幾個潛在的O-糖基化位點， 但沒有N-連接的糖基化位點。，兩種分子的親水性曲線是類似的。非 糖基化蛋白質(zhì)的大小預(yù)測為25.46kD,稍微大于非糖基化人CD99 (18kD)。這種蛋白質(zhì)與genebank中的蛋白質(zhì)的比較顯示該分子與人 CD99L2比與人CD99更同源。最接近的匹配是隨后作為鼠 CD99L2(GenBank登錄號AY078163)提出的序列。這種分子的鼠形式 在本申請中稱為鼠CD99L2或muCD99L2。
如基于人CD99的組織表達(dá)所預(yù)期的那樣，在骨髓和胸腺中檢測 到muCD99L2的轉(zhuǎn)錄物。用Flag-標(biāo)記形式的muCD99L2克隆轉(zhuǎn)染的 COS細(xì)胞在細(xì)胞表面上表達(dá)在細(xì)胞邊界處濃縮的該物質(zhì)，如基于人 CD99局部化所預(yù)期的那樣(2)。利用從轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中純化的鼠 CD99L2接種兔，以產(chǎn)生抗-muCD99L2抗體。來自被免疫兔的免疫J求 蛋白以一種連接方式染色相同的被轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞，證實了特異性 染色(圖3)。相同的抗血清染色來自鼠外周血的單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、 粒細(xì)胞和紅細(xì)胞一已知在人類中具有CD99的所有細(xì)胞(未顯示)。 而且，在血管內(nèi)皮細(xì)胞上可見特異性的染色，在血管平滑肌細(xì)胞上可 見較弱的染色，這類似于用人CD99所發(fā)現(xiàn)的(圖4)。
被免疫的大鼠用于生產(chǎn)單克隆抗體。來自被免疫大鼠的免疫球蛋 白染色白細(xì)胞和紅細(xì)胞(圖5)。對于我們的體內(nèi)研究幸運(yùn)的是， muCD99L2在RBC上的表達(dá)非常低，允許使用大鼠抗血清進(jìn)行初步 研究。來自鼠組織的免疫印跡顯示了具有大約45kD的表觀分子量的 單個條帶，其大小類似于在轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞中克隆的基因產(chǎn)物的電 泳遷移率(圖6)。因此，本發(fā)明人已經(jīng)鑒定、克隆并發(fā)展了鑒定 muCD99L2的試劑。實施例2: muCD99L2在體內(nèi)變移中的作用
初步數(shù)據(jù)顯示了大鼠抗-muCD99L2血清可阻斷巰基乙酸鹽腹膜 炎模型中的炎癥。在巰基乙酸鹽給藥18小時后檢測，抗-muCD99L2 血清，而不是正常大鼠血清，阻斷60%的PMN積累并使單核細(xì)胞流 入降低到接近背景水平(圖7)。使用多克隆兔IgG獲得類似的數(shù)據(jù)。
我們也發(fā)展了一種muCD99L2-Fc嵌合體，其中CD99的細(xì)胞外 結(jié)構(gòu)域與人IgGl的Fc部分融合。我們已經(jīng)成功地利用一種類似的 PECAM-Fc嵌合體在體外(34 )和體內(nèi)('35， 36 )阻斷了依賴于PECAM 的步驟的變移。muCD99L2-Fc嵌合體從;帔轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清液中純化， 在SDS-PAGE上表現(xiàn)出預(yù)期的100kD的Mr (對于二聚體)(圖8 )。 由于muCD99L2在白細(xì)胞上的高水平表達(dá)和muCD99L2在RBC上的 低水平表達(dá)(見圖5)，這種試劑具有結(jié)合白細(xì)胞而不結(jié)合RBC的預(yù) 期的性質(zhì)(未顯示)。
實施例3:抗-muCD99L2單克隆抗體的產(chǎn)生
雌性Fisher大鼠用100 )ag在COS細(xì)胞中產(chǎn)生的muCD99L2-Flag
蛋白質(zhì)腹膜內(nèi)免疫，并用同樣的材料加強(qiáng)免疫兩次。最后一次加強(qiáng)免 疫4天之后，從大鼠個體中收獲脾臟，利用聚乙二醇將脾細(xì)胞與Y3 大鼠骨髓瘤細(xì)胞無菌融合。存活的雜交細(xì)胞以每孔"105細(xì)胞的密度 接種于11塊Costar 96孔板(每塊板僅僅使用中間60個孔)的HAT
培養(yǎng)基中。
具有豐富細(xì)胞生長的孔中的雜交瘤上清液如前所述通過免疫過 氧化物酶細(xì)胞化學(xué)法篩選(Muller等人，l989, J. Exp. Med. nO, 399-414)。簡言之，培養(yǎng)的表達(dá)muCD99L2的COS細(xì)胞或親本細(xì)胞 的單層在多聚甲醛中固定，并風(fēng)干。將2pl小滴的雜交瘤培養(yǎng)上清液 置于細(xì)胞頂部，其位置通過在培養(yǎng)板背部所畫的格子來確定。在室溫 下孵育30分鐘之后，清洗培養(yǎng)板并相繼在兔抗-大鼠IgG、豬抗-兔IgG 和兔抗-過氧化物酶與辣根過氧化物酶的可溶性復(fù)合物中孵育(30分 鐘，每次孵育在抗體間進(jìn)行充分清洗)。各自雜交瘤上清液的反應(yīng)性通過用二氨基聯(lián)苯胺-11202顯色HRP反應(yīng)來檢測。
液的雜交瘤^t認(rèn)為是陽性的。重復(fù)該試驗，并且將6個在兩種篩選中 均測試為陽性的雜交瘤在胸腺細(xì)胞滋養(yǎng)層中擴(kuò)增以進(jìn)行克隆。同時，
通過利用非透化活細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù);險測這些擴(kuò)增的培養(yǎng)物抗 muCD99L2的反應(yīng)性。六個雜交瘤中的兩個持續(xù)地染色muCD99L2-轉(zhuǎn)染的fOS細(xì)胞、muCD99L2-轉(zhuǎn)染的L細(xì)胞和鼠白細(xì)胞。
從一個雜交瘤(9G5)中產(chǎn)生識別muCD99亡2的穩(wěn)定的克隆。該 雜交瘤產(chǎn)生抗-CD99L2 mAb (圖9 )。 9G5特異性染色muCD99L2-轉(zhuǎn) 染的細(xì)胞，因為它不與未轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞反應(yīng)(未顯示)。mAb9G5 也與muCD99L2-轉(zhuǎn)染的L細(xì)胞選擇性反應(yīng)。將稀釋的mAb 9G5培養(yǎng) 上清液(1: 100稀釋)與對照L細(xì)胞(圖10A)或muCD99L2-轉(zhuǎn)染 的L細(xì)胞(圖10B)反應(yīng)，用熒光第二抗-大鼠IgG纟企測。用更濃縮 的上清液對轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可見更強(qiáng)烈的染色，但對于對照細(xì)胞則不是這 樣。肝素化小鼠血液與正常大鼠血清(圖IIA)、 MEC13.3 (大鼠抗-小鼠PECAM;圖11B)或9G5 (大鼠抗-小鼠CD99L2;圖11C) 一 起孵育30分鐘，然后RBC被裂解，清洗細(xì)胞，并與AlexaFluor488-標(biāo)記的山羊抗-大鼠IgG—起孵育以進(jìn)行流式細(xì)胞分析。圖ll顯示了 mAb 9G5識別小鼠白細(xì)胞的主要亞群。
實施例4: muCD99L2的表達(dá)提供粘附能力
無酶重懸浮的L細(xì)胞成纖維細(xì)胞不相互粘附。當(dāng)這些相同細(xì)胞用 PECAM (Muller等人,1992, J. Exp. Med. 175:1401-1404)或人CD99 (Schenkel等人，2002, Nature Immunol. 3: 143-150)轉(zhuǎn)染時，這些分子的 表達(dá)使它們具有以依賴于特定粘附分子功能的方式相互粘附的能力。
檢測了用muCD99L2轉(zhuǎn)染的L細(xì)胞聚集的能力(XFL1細(xì)胞；圖 12A)。用人CD99轉(zhuǎn)染的L細(xì)胞作為陽性對照，用反義方向的人 PECAM轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為陰性對照。
轉(zhuǎn)染的L細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中清洗，并通過在包含10mM的Hanks'平衡緩沖鹽溶液(HBSS)中孵育而重懸浮，直到它們可以從培 養(yǎng)板表面輕輕地吸出，而具有最小的細(xì)胞存活力損失。重懸浮的細(xì)胞 在冷HBSS中清洗，在包含二價陽離子的溫HBSS中以濃度lxl0Vml 重懸浮。對于每個測試樣品，24孔培養(yǎng)板的每孔轉(zhuǎn)移lml的細(xì)胞懸 浮液。培養(yǎng)板在gyrotory振蕩器(90rpm )上在37°C下孵育指定的時 間。為終止反應(yīng)，向孔中添加戊二醛到終濃度為2%,然后在血細(xì)胞 計的室中檢測重,浮的樣品。對于每個樣品，定量血細(xì)胞計室中全部 九個方格的單個細(xì)胞和聚集體(^3個細(xì)胞粘附在一起)"數(shù)量(Muller 等人，1992， J. Exp. Med. 175: 1401 - 1404)。
在存在生理水平的Ca+2和Mg+2 (分別為1 mM和0.5 mM)時， CD99L2轉(zhuǎn)染的L細(xì)胞以時間依賴方式聚集到類似于陽性對照人 CD99-轉(zhuǎn)染的L細(xì)胞的程度(圖12A)。作為對比，僅僅用載體轉(zhuǎn)染的 對照L細(xì)胞基本不聚集?？蛇M(jìn)行另外的試驗以確定muCD99L2的粘 附相互作用是嗜異性的還是嗜同性的、粘附是否需要二價陽離子、是 否它可被純化的抗-CD99L2mAb 9G5阻斷。
實施例5: TEM中muCD99L2的轉(zhuǎn)基因小鼠研究
muCD99L2在TEM中的作用在兩個不同的急性炎癥模型中檢測， 在所述模型中白細(xì)胞與內(nèi)皮粘附的阻斷可與TEM的阻斷區(qū)別開來。 該試驗是巰基乙酸鹽培養(yǎng)液腹膜炎試驗，和巴豆油耳部腫脹試驗。在 每個試驗中，定量評價阻斷該分子的效果對于血細(xì)胞滲出的選擇性作 用。檢測了 muCD99L2在野生型小鼠中的作用，以觀察對其單獨(dú)阻斷 對炎癥有何效果。評價了 muCD99L2在PECAM功能被最大阻斷的小 鼠Tg820中的作用，以觀察它們是否補(bǔ)充PEC AM阻斷，或需要PEC AM 阻斷來起作用。評價了 muCD99L2在Tg5咖o和Tglh,小鼠中的作 用，以觀察它們在PECAM不起作用的條件下如何起作用，并且評價 了其在PECAM敲除小鼠中的作用，以觀察在PECAM不存在的情形 下它們?nèi)绾纹鹱饔?。這后兩種條件在這兩種動物模型中可能顯示出 muCD99L2的作用在野生型小鼠中可能不明顯，在野生型小鼠中
57PECAM在TEM中具有支配地位。
巰基乙酸鹽培養(yǎng)液誘導(dǎo)的腹膜炎模型
這種才莫型評價PECAM在TEM中的作用(2, 6)，和其他粘附分 子在急性炎癥中的作用(72-74)。系統(tǒng)性注射試劑(阻斷性的mAb 或CAM-IgG嵌合體)，并檢測它們阻斷白細(xì)胞進(jìn)入腹膜腔的能力。收 獲腸系膜并用顯微鏡檢查以確定阻斷是在粘附水平還是在TEM水 平。在幾個先前的研究中，已經(jīng)明顯地證實了當(dāng)tem被抗PEcXm 的mAb (2)或mPECAM-IgG (6)阻斷時白細(xì)胞在腸系膜小靜脈內(nèi) 皮上停止，但當(dāng)粘附被抗CDllbmAb阻斷時不是這樣。測試的mAb 或同種型對照IgG通過尾靜脈靜脈內(nèi)注射。 一個小時后通過26G 3/8" 針頭腹膜內(nèi)注射lml 4%的巰基乙酸鹽培養(yǎng)液。對巰基乙酸鹽的應(yīng)答 在18小時測試，以觀察試驗性干擾對PMN和單核細(xì)胞的效果。將時 間過程調(diào)節(jié)到較短的時間(4-12小時)，以使對PMN的效果更顯著， 并且使對MO的效果更顯著的時間更晚(可達(dá)4天)。在測試時，殺 死小鼠。通過用Hanks平衡鹽溶液灌洗而分離腹膜細(xì)胞。定量總腹膜 細(xì)胞數(shù)，并且在賴特-吉姆薩染色的細(xì)胞離心涂片上進(jìn)行差別計數(shù)。 為了總WBC計數(shù)和差別涂片收集外周血。重要的是確定進(jìn)入腹膜腔 中的白細(xì)胞的減少不是由于循環(huán)中數(shù)量的減少引起的。選擇的器官也 在此時收獲，包括腸系膜，在福爾馬林中將其固定以進(jìn)行組織學(xué)檢查。
巴豆油皮炎試驗
這是一種非特異性炎癥試驗，其中將10ml的巴豆油(2%,在丙 酮橄欖油的4: 1混合物中)應(yīng)用于小鼠的一只耳朵(72)。對側(cè)耳 接受10ml的載體并作為背景炎癥的內(nèi)部對照。巴豆油產(chǎn)生急性炎癥 反應(yīng)，其中受影響的耳朵變紅并腫脹。在組織學(xué)上，有肥大細(xì)胞的脫 粒和白細(xì)胞從局部小靜脈向耳真皮軟組織中的補(bǔ)充。據(jù)我們所知，最 大的白細(xì)胞遷出(主要是PMN)發(fā)生在應(yīng)用刺激物后的8小時。測 試阻斷TEM的能力的試劑在應(yīng)用巴豆油1小時前腹膜內(nèi)注射。
殺死小鼠，除下兩只耳朵，檢查幾個橫切片以定量白細(xì)胞流出。這可手工操作或利用圖像分析軟件來定量PMN/mm2?？蛇x地，可以 應(yīng)用具有熒光標(biāo)記的抗-PMN mAb,并且利用感光成像儀定量總熒光。 對耳朵的仔細(xì)組織學(xué)檢查也可告訴我們阻斷是在TEM水平還是在粘 附水平上。阻斷TEM導(dǎo)致PMN在小靜脈壁上聚集。這也是一種良好 的系統(tǒng)，其中檢驗PECAM敲除或PECAM抗性小鼠(高劑量轉(zhuǎn)基因) 通過不同的血管途徑(例如，毛細(xì)血管而不是小靜脈)遷出的可能性， 因為白細(xì)胞傾向于停留在與它們々人該模型中遷出的血管相對較近的 位置。
CD99L2在TEM中的作用
測試了抗鼠形式CD99L2的單克隆抗體(mAb)在這些模型中的 阻斷能力。抗muCD99L2的mAb預(yù)期在體內(nèi)抑制TEM,其方式與人 CD99在體外抑制人細(xì)胞的TEM的方式相同。測試了純化的、無菌的、 無內(nèi)毒素的抗鼠CD99L2的mAb的Fab和F(ab，)2片段。
野i藝V、處。由于人CD99在沒有PECAM阻斷的情況下阻斷 TEM,預(yù)期鼠形式將在體內(nèi)類似地起作用。白細(xì)胞遷出被最佳濃度的 抗鼠CD99L2 mAb顯著抑制。檢查小鼠耳朵和腸系膜的小靜脈。TEM 中的選擇性阻斷導(dǎo)致血管壁上的白細(xì)胞增多，其反映了這些細(xì)胞的遷 出減少。但是，如果CD99L2與比PECAM更早的TEM階段有關(guān)， 則體內(nèi)阻斷CD99L2可能不產(chǎn)生停止在血管壁上的白細(xì)胞的表型。如 果與CD99L2相互作用的中斷不使它們通過一些其他的機(jī)理與內(nèi)皮緊 密地粘附，則它們可能在血流中被帶走，并且在體外在靜止條件下產(chǎn) 生的表型將無法看見，盡管遷出的白細(xì)胞顯著減少。
rgS^小虞。對CD99L2和抗-PECAM抗體的聯(lián)合作用進(jìn)行體內(nèi) 測試。知道阻斷白細(xì)胞或內(nèi)皮上的任意兩種分子是否能產(chǎn)生體內(nèi)完全 阻斷在臨床上是重要的。預(yù)期阻斷鼠CD99L2和鼠PECAM產(chǎn)生近乎 完全的白細(xì)胞遷出的阻斷。這通過注射抗鼠CD99L2mAb到Tg820小 鼠和PECAM缺陷小鼠中進(jìn)行檢測，所述小鼠以FVB/n為背景小鼠， 其中PECAM被最大地阻斷?？赡茈y以確定(如果不是不可能的話) 體內(nèi)的阻斷部位，因為在FVB/n背景小鼠中的Tg82o和PECAM-缺陷小鼠已經(jīng)顯示了如此多的停止在血管壁上的白細(xì)胞。但是，在腹膜腔 或耳朵真皮中的白細(xì)胞數(shù)的減少應(yīng)該值得注意。
rg5,。。。和7^ ^, V、處。在這些小鼠中，不依賴于PEC AM的TEM
途徑占主導(dǎo)地位，因為這些小鼠似乎不利用它們自己的PECAM?？?鼠CD99L2的單克隆抗體可能比在野生型小鼠中具有更大的效果。在 此堅持關(guān)于在流動狀態(tài)下與變移相比更可能阻斷粘附的觀點，與野生 型^、鼠一樣。 ，
在C575〃6 ff,的i^C4Af-^潛V、處。PECAM敲除 小鼠必須利用不依賴于PECAM的TEM途徑。它們移動與野生型小 鼠相同數(shù)量和類型的白細(xì)胞到炎癥部位，因此它們擴(kuò)大了對這些途徑 的利用以支持正常水平的TEM。在這些條件下，可以簡單地觀察到 阻斷替代的粘附分子的效果。確定敲除小鼠用于TEM的分子與那些 具有PECAM但不能利用它的小鼠(例如，Tg5!。。。和Tglh。。Q)所使 用的分子是否相同是有益的。
實施例6: muCD99L2"敲除"小鼠的產(chǎn)生
構(gòu)建打靶載體以在C57B1/6背景中產(chǎn)生muCD99L2敲除小鼠是 復(fù)雜的，需要連接散布有LoxP位點的鼠基因組DNA的大片斷。這 種策略用于產(chǎn)生打靶載體，在全基因組切除muCD99L2導(dǎo)致胚胎致死 性的情況下，該載體可用于產(chǎn)生傳統(tǒng)的"敲除"小鼠(通過同源重組替 換muCD99L2)和可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因小鼠。
打靶載體將muCD99L2的外顯子4-6置于來自muCD99L2基因 的內(nèi)含子DNA的長臂和短臂之間(圖13)。存在一個新霉素抗性盒， 用于正選擇打靶載體已正確插入其中的胚胎干細(xì)胞中，而編碼白喉毒 素A片段的下游盒將引起非同源重組的整合事件。發(fā)生這些不希望的 事件的ES細(xì)胞將因此不在培養(yǎng)物中生長。
如果意圖通過同源重組刪除muCD99L2將導(dǎo)致胚胎致死性，則 "Cre-LVox"方法可用同樣的構(gòu)建體產(chǎn)生可誘導(dǎo)的敲除。在這一例子中， 通過將Cre重組酶瞬時轉(zhuǎn)染到ES細(xì)胞中并選擇已經(jīng)選擇性清除了Neo抗性盒的克隆，從LoxP位點中刪除新霉素抗性基因。將產(chǎn)生的
ES細(xì)胞注射入表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠的胚泡中。這種重組酶 將特異性切開DNA中的LoxP位點，導(dǎo)致兩者之間的基因組部分一 在此情況下為鼠CD99L2的外顯子4-6—的刪除。存在以組織-(甚至 細(xì)胞-)限制性的方式表達(dá)可誘導(dǎo)形式的Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠。因
由于打,耙構(gòu)建體的大尺寸，無法獲得允許從較十片段逐片構(gòu)建該 載體的限制性酶。MultiSite Gateway克隆系統(tǒng)(Invitrogen)利用了噬 菌體整合位點允許同時連接多個DNA片段。
測試該載體，以確保當(dāng)它并入基因組DNA時可被4笨針檢測到， 并且在ES細(xì)胞中的muCD99L2序列不包含將會改變對于檢測整合關(guān) 鍵性的限制性酶切位點的多態(tài)性。
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本發(fā)明不限于在此描述的特定實施方式的范圍。實際上，除了在 此描述的之外，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)前述描述應(yīng)當(dāng)明白本發(fā)明的多種 修改。所述修改落入所附的權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
進(jìn)一步應(yīng)當(dāng)理解的是所有數(shù)值是近似的，是為了說明而提供的。 在此引用的所有專利、申請、出版物、實驗方法、文獻(xiàn)和其他材 料均引入本文作為參考，包括這些文獻(xiàn)引用的文獻(xiàn)。
權(quán)利要求
1. 一種調(diào)節(jié)白細(xì)胞的經(jīng)內(nèi)皮遷移(TEM)的方法，所述方法包括抑制CD99L2介導(dǎo)的白細(xì)胞穿過內(nèi)皮的變移。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中CD99L2位于內(nèi)皮細(xì)胞上。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中CD99L2位于白細(xì)胞上。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中TEM在活化的內(nèi)皮細(xì)胞之間發(fā)生。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述活化的內(nèi)皮細(xì)胞由于與選自 腫瘤壞死因子(TNF)和白介素-1 (IL-1 )的促炎細(xì)胞因子接觸而被 活化。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中內(nèi)皮細(xì)胞存在于保持在組織培養(yǎng) 中的切下的內(nèi)皮組織上。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中內(nèi)皮細(xì)胞在透性膜上在體外培養(yǎng)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中內(nèi)皮細(xì)胞是人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (HUVEC )。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中穿過組織中的內(nèi)皮細(xì)胞而發(fā)生 TEM,所述組織選自動脈內(nèi)皮、靜脈內(nèi)皮、小靜脈內(nèi)皮和毛細(xì)血管后 小靜脈內(nèi)皮。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中發(fā)生進(jìn)入炎癥部位的TEM。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中抑制CD99L2介導(dǎo)的白細(xì)胞變移 包括將白細(xì)胞、內(nèi)皮或此兩者與CD99L2結(jié)合抑制劑接觸。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中CD99L2結(jié)合抑制劑是一種抗 -CD99L2抗體分子。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中抗-CD99L2抗體分子具有 CD99L2單克隆抗體的結(jié)合特異性。
14. 根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中CD99L2結(jié)合抑制劑是一種可 溶性CD99L2分子或其片段。
15. —種在體內(nèi)治療炎性病癥的方法，所述方法包括抑制CD99L2 介導(dǎo)的白細(xì)胞的經(jīng)內(nèi)皮遷移(TEM)。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中穿過組織中的內(nèi)皮細(xì)胞而發(fā)生 TEM,所述組織選自動脈內(nèi)皮、靜脈內(nèi)皮、毛細(xì)血管內(nèi)皮、小靜脈內(nèi) 皮、和毛細(xì)血管后小靜脈內(nèi)皮。
17. 根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中炎性病癥是一種急性炎性病癥。
18. 根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中炎性病癥由感染引起。
19. 根據(jù)權(quán)利要求15 ^方法，其中炎性病癥是一種慢性炎性病i。
20. 根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中抑制CD99L2-介導(dǎo)的TEM包 括將白細(xì)胞、內(nèi)皮或此兩者與CD99L2結(jié)合抑制劑接觸。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中CD99L2結(jié)合抑制劑是一種抗 -CD99L2抗體分子。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中抗-CD99L2抗體分子具有 CD99L2單克隆抗體的結(jié)合特異性。
23. 根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中CD99L2結(jié)合抑制劑是一種可 溶性CD99L2分子或其片段。
24. —種抗-CD99L2單克隆抗體分子，其中該抗-CD99L2單克 隆抗體抑制CD99L2介導(dǎo)的白細(xì)胞的經(jīng)內(nèi)皮遷移(TEM)。
25. 權(quán)利要求24的單克隆抗體分子，其結(jié)合單核細(xì)胞、血小板和 粒細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞上的CD99L2。
26. 權(quán)利要求25的單克隆抗體分子，其具有CD99L2單克隆抗體 的結(jié)合特性。
27. 權(quán)利要求26的單克隆抗體分子，它是一種人源化單克隆抗體。
28. —種篩選可抑制CD99L2介導(dǎo)的白細(xì)胞TEM的化合物的方 法，所述方法包括鑒定結(jié)合CD99L2的化合物。
29. —種篩選抑制CD99L2介導(dǎo)的白細(xì)胞TEM的化合物的方法， 所述方法包括鑒定抑制白細(xì)胞與CD99L2結(jié)合的化合物。
30. 根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述化合物抑制白細(xì)胞與內(nèi)皮 細(xì)胞的結(jié)合。
31. 根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述化合物抑制白細(xì)胞變移。
32. 根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中在所述化合物的存在下在促進(jìn) 白細(xì)胞變移的條件下體外共培養(yǎng)白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)一步包括檢測 白細(xì)胞穿過內(nèi)皮細(xì)胞的變移程度。
33. 根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述化合物與CD99L2結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)白細(xì)胞經(jīng)內(nèi)皮遷移(TEM)的方法和組合物。特別地，抑制TEM可提供一種治療炎性病癥的有效的治療方法。本發(fā)明特別涉及粘附分子CD99L2介導(dǎo)白細(xì)胞TEM的發(fā)現(xiàn)。CD99L2存在于內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞上，并且介導(dǎo)白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附。利用特異性抗體阻斷CD99L2阻斷了白細(xì)胞向炎癥部位的遷移。CD99L2顯示與結(jié)構(gòu)相關(guān)分子CD99具有功能相似性，它的抑制與PECAM的抑制協(xié)同導(dǎo)致幾乎全部的TEM阻斷。因此，阻斷內(nèi)皮細(xì)胞或單核細(xì)胞上的CD99L2可阻斷80-90％的遷移。與PECAM抑制劑協(xié)同，TEM阻斷作用可達(dá)到100％。涉及CD99L2抑制的治療方法在治療炎性病癥中顯示出重要的希望。
文檔編號A61K39/385GK101437539SQ200680024804
公開日2009年5月20日 申請日期2006年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月5日
發(fā)明者A·R·申凱爾, W·A·馬勒 申請人:康奈爾研究基金會(有限公司)