一種癌性胸腹水來源的til細胞的高效擴增方法
【專利摘要】本發(fā)明目的是提供一種癌性胸腹水來源的TIL細胞的高效擴增方法，本發(fā)明所制備出的TIL細胞具有增殖速度快、細胞數(shù)量大、細胞活性高等特點。本發(fā)明的主要特點是：利用層粘連蛋白和纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶對TIL進行培養(yǎng)，這兩種蛋白的吸附作用可以使細胞成半貼壁狀態(tài)，從而利于細胞接受各種因子的刺激，并且這兩種蛋白本身就有對TIL細胞增殖的促進作用；而抗OX-40單克隆抗體的使用可以刺激TIL細胞中CD3+CD8+T細胞亞群的共刺激信號，促進細胞的活化，提高細胞穿孔素和顆粒酶的表達，增強其殺傷能力。到目前為止，仍未見有將層粘連蛋白、纖維連接蛋白和抗OX-40單克隆抗體聯(lián)合應用于TIL細胞制備的研究報道，本發(fā)明首次提供出一種在TIL細胞制備中通過添加以上三種因子提高細胞數(shù)量和殺傷活性的方法。
【專利說明】一種癌性胸腹水來源的TIL細胞的高效擴增方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于細胞培養(yǎng)領域，具體涉及一種腫瘤侵潤淋巴細胞(TumorInfiltrating lymphocyte, TIL)的培養(yǎng)，即利用各種細胞因子的組合來刺激胸腹水來源的淋巴細胞，使其可以高效擴增。
【背景技術】
[0002]腫瘤侵潤淋巴細胞(Tumor Infiltrating lymphocyte, TIL)是指侵潤到腫瘤組織周圍的淋巴細胞，細胞表型以⑶3+CD8+T和⑶3+⑶4+T細胞為主，另外還有少量的NKT細胞和NK細胞。由于TIL細胞多數(shù)與腫瘤細胞發(fā)生過接觸，所以理論上可以對腫瘤細胞產(chǎn)生特異性的殺傷作用。但是，由于腫瘤微環(huán)境中，存在很強的免疫抑制因子，所以實際上TIL細胞的功能是受到極大的抑制，無法發(fā)揮對腫瘤細胞的有效殺傷作用。
[0003]上個世紀八十年代，Rosenberg教授首次分離腫瘤組織中的TIL細胞，并通過白細胞介素2的刺激接來解除其免疫抑制狀態(tài)，體外擴增后，用于回輸治療黑色素瘤患者，并取得了一定的效果。
[0004]TIL細胞的來源主要有兩個:1、手術切除的腫瘤組織或淋巴結(jié)；2、癌性胸腹水。從手術樣品中分離TIL細胞需要經(jīng)過機械剪切，多種蛋白酶的酶解等多個步驟，方法比較繁瑣，而且最終能夠分離并成功培養(yǎng)的比例不高，這很大程度上限制了手術樣品來源TIL的臨床應用。癌性胸腹水來源的TIL細胞，分離的方法相對簡單，也容易在體外培養(yǎng)，所以在臨床得到了較為廣泛的應用。但是，由于使用傳統(tǒng)方法，TIL在體外的擴增有限，通常20天左右的時間，細胞數(shù)量僅擴增20-50倍左右，且TIL細胞中⑶3+⑶8+T細胞的殺傷能力不高，極大的影響了 TIL細胞臨床應用的效果。
[0005]科研工作者不斷探索培養(yǎng)TIL的新方法，比如在培養(yǎng)中期添加抗⑶3單克隆抗體、使用炎性因子等。因此，盡早建立一種高效擴增TIL細胞的方法，已成為國內(nèi)外學著研究工作的目標。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種癌性胸腹水來源的TIL細胞的高效擴增方法，即使用腫瘤患者的胸腹水，分離得到TIL細胞，在體外通過多種因子的刺激作用，使TIL細胞得到大量擴增，并提高其殺傷活性。
[0007] 申請人:在長期的研究中發(fā)現(xiàn)，層粘連蛋白和纖維連接蛋白可以極大的提高TIL細胞的增殖速度；而抗0X-40單克隆抗體的添加可以有效的刺激TIL細胞的活化，上調(diào)CD3+CD8+T細胞中行使殺傷功能的穿孔素和顆粒酶的表達，提高其對腫瘤細胞的殺傷活性。 申請人:將層粘連蛋白、纖維連接蛋白和抗0X-40單克隆抗體三種因子共用引入到TIL細胞的培養(yǎng)中，從而促成了本發(fā)明。
[0008]本發(fā)明的TIL細胞的培養(yǎng)方法，包括如下的步驟:
[0009]I)將層粘連蛋白和纖維連接蛋白溶解稀釋后，加入到細胞培養(yǎng)瓶中包被；[0010]2)將從胸腹水分離得到的TIL細胞用培養(yǎng)液重懸后，接種到包被后的培養(yǎng)瓶中；添加IL-2刺激；
[0011]3)培養(yǎng)4天后，將細胞轉(zhuǎn)移到透氣的細胞培養(yǎng)袋中繼續(xù)擴大培養(yǎng)，并添加抗0X-40單克隆抗體；
[0012]4)持續(xù)擴大培養(yǎng)至第20天時，完成高效TIL細胞的培養(yǎng)。
[0013]本發(fā)明步驟2)所述的培養(yǎng)液，其配方組成如下:氯化鈣40mg/ml、氯化鉀300mg/ml、硫酸鎂120mg/ml、氯化鈉5000mg/ml、磷酸二氫鉀300mg/ml、碳酸氫|丐1200mg/ml、氨基酸 1365mg/ml、維生素 21.4mg/ml、微量元素 0.93126mg/ml、白蛋白 450mg/ml、胰島素 8mg/ml、亞油酸0.4mg/ml、油酸5mg/ml、谷胱甘肽2.5mg/ml、雙甘氨肽mg/ml、次黃嘌呤0.8mg/ml、硫辛酸0.lmg/ml、丙酮酸150mg/ml、葡萄糖1500mg/ml、胸腺卩密唳0.12mg/ml。
[0014]其中氨基酸的配比如下:8份丙氨酸、40份天冬氨酸、10份胱氨酸、4份谷氨酸、12份甘氨酸、4份組氨酸、80份異亮氨酸、4份亮氨酸、4份賴氨酸、20份蛋氨酸、20份苯丙氨酸、25份脯氨酸、4份絲氨酸、8份蘇氨酸、3份色氨酸、10酪氨酸、17份纈氨酸。
[0015]維生素的配比如下:2份D-生物素、120份氯化膽堿、10份葉酸、35份硫胺素、2份維生素B2、25份維生素B1、20份D-泛酸酯。
[0016]微量元素的配比如下:85000份硫酸鐵、120份硫酸銅、1500份亞硒酸鈉、6份偏釩酸銨、5000份硫酸鋅。
[0017]為了獲得更好的培養(yǎng)效果，在培養(yǎng)液中還添加有25mg/L的小球藻生長因子(Chlorella Growth Factor, CGF)。
[0018]本發(fā)明所制備出的TIL細胞具有增殖速度快、細胞數(shù)量大、細胞活性高等特點。本發(fā)明的主要特點是:利用層粘連蛋白和纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶對TIL進行培養(yǎng)，這兩種蛋白的吸附作用可以使細胞成半貼壁狀態(tài)，從而利于細胞接受各種因子的刺激，并且這兩種蛋白本身就有對TIL細胞增殖的促進作用；而抗0X-40單克隆抗體的使用可以刺激TIL細胞中CD3+CD8+T細胞亞群的共刺激信號，促進細胞的活化，提高細胞穿孔素和顆粒酶的表達，增強其殺傷能力。到目前為止，仍未見有將層粘連蛋白、纖維連接蛋白和抗0X-40單克隆抗體聯(lián)合應用于TIL細胞制備的研究報道，本發(fā)明首次提供出一種在TIL細胞制備中通過添加以上三種因子提高細胞數(shù)量和殺傷活性的方法。
[0019]具體實施方法
[0020]本發(fā)明所用的材料描述如下:
[0021]抗0X-40單克隆抗體:鼠抗人0X-40單克隆抗體，購于安迪生物科技(上海)有限公司
[0022]HTB-135細胞:人胃癌細胞系，購于中科院細胞庫
[0023]NC1-H596細胞:人肺癌細胞系，購于中科院細胞庫
[0024]HepG2細胞:人肝癌細胞系，購于中科院細胞庫
[0025]本發(fā)明的癌性胸腹水來源的TIL細胞的高效擴增方法，包括如下的步驟:
[0026]I)培養(yǎng)瓶的包被:分別取層粘連蛋白和纖維連接蛋白100微克，于20毫升的磷酸鹽緩沖液中充分溶解，將液體用0.22微米的無菌濾膜過濾后，加入到底面積為175平方厘米的培養(yǎng)瓶中，室溫放置3-5小時。
[0027]2)細胞接種:收集400-1000毫升的癌性胸腹水，1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘。用30ml無血清培養(yǎng)基重懸細胞沉淀。將細胞懸液緩慢加入到已經(jīng)添加有15ml淋巴細胞分離液的離心管。2000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15分鐘。取中間白色的PBMC細胞層，生理鹽水洗滌2次，用60毫升的無血清培養(yǎng)基重懸，取樣計數(shù)后，接種到去包被液的培養(yǎng)瓶中。添加60000單位的IL-2。
[0028]3)轉(zhuǎn)移培養(yǎng):接種后的細胞在培養(yǎng)到第5天時，轉(zhuǎn)入透氣的細胞培養(yǎng)袋中繼續(xù)培養(yǎng)，添加無血清培養(yǎng)基至400毫升，添加200000單位的IL-2和4微克的抗0X-40單克隆抗體。
[0029]4)擴大培養(yǎng):每隔兩天根據(jù)細胞的數(shù)量和狀態(tài)，添加適量的無血清培養(yǎng)基，并按500單位/毫升的濃度添加IL-2，持續(xù)擴大培養(yǎng)。
[0030]收獲細胞:在培養(yǎng)的第20天，取I毫升的細胞懸液進行細胞計數(shù)，計算TIL細胞的增殖倍數(shù)。離心收集全部培養(yǎng)所得細胞，取適量細胞進行殺傷實驗。
[0031]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的方法進行詳細的描述。
[0032]實驗例I
[0033]1)培養(yǎng)瓶的包被:分別取層粘連蛋白和纖維連接蛋白100微克，于20毫升的磷酸鹽緩沖液中充分溶解，將液體用0.22微米的無菌濾膜過濾后，加入到底面積為175平方厘米的培養(yǎng)瓶中，室溫放置4小時。
[0034]2)細胞接種:收集600毫升的癌性腹水，1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘。用30ml無血清培養(yǎng)基重懸細胞沉淀。將細胞懸液緩慢加入到已經(jīng)添加有15ml淋巴細胞分離液的離心管。2000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15分鐘。取中間白色的PBMC細胞層，生理鹽水洗滌2次，用60毫升的無血清培養(yǎng)基重懸，取樣計數(shù)，計算細胞數(shù)為2.6 X IO7個。將細胞懸液接種到去包被液的培養(yǎng)瓶中，添加60000單位的IL-2。其中無血清培養(yǎng)基的組份如下:氯化鈣40mg/ml、氯化鉀300mg/ml、硫酸鎂120mg/ml、氯化鈉5000mg/ml、磷酸二氫鉀300mg/ml、碳酸氫鈣1200mg/ml、氨基酸 1365mg/ml、維生素 21.4mg/ml、微量兀素 0.93126mg/ml、白蛋白 450mg/ml、胰島素8mg/ml、亞油酸0.4mg/ml、油酸5mg/ml、谷胱甘肽2.5mg/ml、雙甘氨肽mg/ml、次黃嘌呤0.8mg/ml、硫辛酸0.lmg/ml、丙酮酸150mg/ml、葡萄糖1500mg/ml、胸腺卩密唳0.12mg/ml、25mg/L的小球藻生長因子。
[0035]其中氨基酸的配比如下:8份丙氨酸、40份天冬氨酸、10份胱氨酸、4份谷氨酸、12份甘氨酸、4份組氨酸、80份異亮氨酸、4份亮氨酸、4份賴氨酸、20份蛋氨酸、20份苯丙氨酸、25份脯氨酸、4份絲氨酸、8份蘇氨酸、3份色氨酸、10酪氨酸、17份纈氨酸。
[0036]維生素的配比如下:2份D-生物素、120份氯化膽堿、10份葉酸、35份硫胺素、2份維生素B2、25份維生素B1、20份D-泛酸酯。
[0037]微量元素的配比如下:85000份硫酸鐵、120份硫酸銅、1500份亞硒酸鈉、6份偏釩酸銨、5000份硫酸鋅。
[0038]上述的培養(yǎng)基是長期優(yōu)化獲得的，在同樣的培養(yǎng)時間內(nèi)，本發(fā)明的培養(yǎng)液對細胞的增殖效果要明顯好于現(xiàn)有的細胞培養(yǎng)液，細胞增殖速度可以提高約12%。
[0039]3)轉(zhuǎn)移培養(yǎng):接種后的細胞在培養(yǎng)到第5天時，轉(zhuǎn)入透氣的細胞培養(yǎng)袋中繼續(xù)培養(yǎng)，添加無血清培養(yǎng)基至400毫升，添加200000單位的IL-2和4微克的抗0X-40單克隆抗體。
[0040]4)擴大培養(yǎng):每隔兩天根據(jù)細胞的數(shù)量和狀態(tài)，添加適量的無血清培養(yǎng)基，并按500單位/毫升的濃度添加IL-2，持續(xù)擴大培養(yǎng)。
[0041]收獲細胞:在培養(yǎng)的第20天，取I毫升的細胞懸液計數(shù)，計算細胞數(shù)為5.4X109個，增殖倍數(shù)為208倍。離心收集全部培養(yǎng)所得細胞，取適量細胞進行殺傷實驗。高效TIL細胞在效靶比為10:1的條件下，對HTB-135、NC1-H596和!fepG2細胞系的殺傷分別達到22.8%、19.4%、13.4%。
[0042]按照上述步驟，重復試驗7次，高效TIL細胞增殖倍數(shù)的平均值為172倍。在效靶比為10:1的條件下，高效TIL細胞對對HTB-135、NC1-H596和!fepG2細胞系殺傷的平均值為 26.2%, 20.7% 和 15.8%.[0043]實驗例2
[0044]I)培養(yǎng)瓶的包被:分別取層粘連蛋白和纖維連接蛋白100微克，于20毫升的磷酸鹽緩沖液中充分溶解，將液體用0.22微米的無菌濾膜過濾后，加入到底面積為175平方厘米的培養(yǎng)瓶中，室溫放置5小時。
[0045]2)細胞接種:收集400毫升的癌性胸水，1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘。用30ml無血清培養(yǎng)基重懸細胞沉淀。將細胞懸液緩慢加入到已經(jīng)添加有15ml淋巴細胞分離液的離心管。2000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15分鐘。取中間白色的PBMC細胞層，生理鹽水洗滌2次，用80毫升的無血清培養(yǎng)基重懸，取樣計數(shù)，計算細胞數(shù)為3.2 X IO7個。將細胞懸液接種到去包被液的培養(yǎng)瓶中，添加80000單位的IL-2。
[0046]3)轉(zhuǎn)移培養(yǎng):接種后的細胞在培養(yǎng)到第5天時，轉(zhuǎn)入透氣的細胞培養(yǎng)袋中繼續(xù)培養(yǎng)，添加無血清培養(yǎng)基至400毫升，添加160000單位的IL-2和4微克的抗0X-40單克隆抗體。
[0047]擴大培養(yǎng):每隔兩天根據(jù)細胞的數(shù)量和狀態(tài)，添加適量的無血清培養(yǎng)基，并按400單位/毫升的濃度添加IL-2，持續(xù)擴大培養(yǎng)。
[0048]4)收獲細胞:在培養(yǎng)的第20天，取I毫升的細胞懸液計數(shù)，計算細胞數(shù)為5.7 X IO9個，增殖倍數(shù)為178倍。離心收集全部培養(yǎng)所得細胞，取適量細胞進行殺傷實驗。高效TIL細胞在效靶比為10:1的條件下，對HTB-135、NC1-H596和!fepG2細胞系的殺傷分別達到16.3%, 27.6%、15.5%。
[0049]實驗例3
[0050]1)培養(yǎng)瓶的包被:分別取層粘連蛋白和纖維連接蛋白100微克，于20毫升的磷酸鹽緩沖液中充分溶解，將液體用0.22微米的無菌濾膜過濾后，加入到底面積為175平方厘米的培養(yǎng)瓶中，室溫放置3小時。
[0051]2)細胞接種:收集900毫升的癌性腹水，1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘。用30ml無血清培養(yǎng)基重懸細胞沉淀。將細胞懸液緩慢加入到已經(jīng)添加有15ml淋巴細胞分離液的離心管。2000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15分鐘。取中間白色的PBMC細胞層，生理鹽水洗滌2次，用80毫升的無血清培養(yǎng)基重懸，取樣計數(shù)，計算細胞數(shù)為3.6X107個。將細胞懸液接種到去包被液的培養(yǎng)瓶中，添加80000單位的IL-2。
[0052]3)轉(zhuǎn)移培養(yǎng):接種后的細胞在培養(yǎng)到第5天時，轉(zhuǎn)入透氣的細胞培養(yǎng)袋中繼續(xù)培養(yǎng)，添加無血清培養(yǎng)基至450毫升，添加180000單位的IL-2和4微克的抗0X-40單克隆抗體。
[0053]擴大培養(yǎng):每隔兩天根據(jù)細胞的數(shù)量和狀態(tài)，添加適量的無血清培養(yǎng)基，并按400單位/毫升的濃度添加IL-2，持續(xù)擴大培養(yǎng)。
[0054]5)收獲細胞:在培養(yǎng)的第20天，取I毫升的細胞懸液計數(shù)，計算細胞數(shù)5.5 X IO9個，增殖倍數(shù)為153倍。離心收集全部培養(yǎng)所得細胞，取適量細胞進行殺傷實驗。高效TIL細胞在效靶比為10:1的條件下，對HTB-135、NC1-H596和!fepG2細胞系的殺傷分別達到14.6%、12.9%, 20.1%。
[0055]本發(fā)明所制備的高效TIL細胞在培養(yǎng)第20天時，增殖倍數(shù)超過150倍，是比常規(guī)TIL培養(yǎng)方法增殖倍數(shù)的300%以上，并且高效TIL細胞在較低的效靶比條件下，即可對常見的胃癌、肺癌和肝癌細胞系產(chǎn)生較高的殺傷。
【權(quán)利要求】
1.一種TIL細胞的培養(yǎng)方法，包括如下的步驟: 1)將層粘連蛋白和纖維連接蛋白溶解稀釋后，加入到細胞培養(yǎng)瓶中包被； 2)將從胸腹水分離得到的TIL細胞用培養(yǎng)液重懸后，接種到包被后的培養(yǎng)瓶中；添加IL-2刺激； 3)培養(yǎng)4天后，將細胞轉(zhuǎn)移到透氣的細胞培養(yǎng)袋中繼續(xù)擴大培養(yǎng)，并添加抗0X-40單克隆抗體； 4)持續(xù)擴大培養(yǎng)至第20天時，完成高效TIL細胞的培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的步驟2)中的培養(yǎng)液，其配方組成如下:氯化韓40mg/ml、氯化鉀300mg/ml、硫酸鎂120mg/ml、氯化鈉5000mg/ml、磷酸二氫鉀300mg/ml、碳酸氫|丐1200mg/ml、氨基酸1365mg/ml、維生素21.4mg/ml、微量兀素0.93126mg/ml、白蛋白450mg/ml、胰島素8mg/ml、亞油酸0.4mg/ml、油酸5mg/ml、谷胱甘肽2.5mg/ml、雙甘氨肽mg/ml、次黃嘌呤0.8mg/ml、硫辛酸0.lmg/ml、丙酮酸150mg/ml、葡萄糖1500mg/ml、胸腺喃P定 0.12mg/ml。
3.如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的氨基酸的配比如下:8份丙氨酸、40份天冬氨酸、10份胱氨酸、4份谷氨酸、12份甘氨酸、4份組氨酸、80份異亮氨酸、4份亮氨酸、4份賴氨酸、20份蛋氨 酸、20份苯丙氨酸、25份脯氨酸、4份絲氨酸、8份蘇氨酸、3份色氨酸、10酪氨酸、17份纈氨酸。
4.如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的維生素的配比如下:2份D-生物素、120份氯化膽堿、10份葉酸、35份硫胺素、2份維生素B2、25份維生素Bl、20份D-泛酸酯。
5.如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的微量元素的配比如下:85000份硫酸鐵、120份硫酸銅、1500份亞硒酸鈉、6份偏釩酸銨、5000份硫酸鋅。
6.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的步驟2)中的培養(yǎng)液添加有25mg/L的小球藻生長因子。
【文檔編號】C12N5/0783GK103468641SQ201310452172
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月28日
【發(fā)明者】徐矯健, 孫威 申請人:青島麥迪賽斯生物科技有限公司