專利名稱：用于修復(fù)周圍神經(jīng)缺損的緩釋組織工程支架復(fù)合體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是屬于一種用于神經(jīng)缺損后修復(fù)與再生的緩釋組織工程支架復(fù)合體，特別涉及用于神經(jīng)橋接術(shù)支架內(nèi)作為促神經(jīng)生長的各種因子載體的填充材料及其制備方法。
背景技術(shù)：
周圍神經(jīng)缺損的修復(fù)一直是困擾臨床的一個(gè)難題。傳統(tǒng)的修復(fù)方法如外膜縫合其療效優(yōu)良率僅為50％，應(yīng)用精細(xì)的顯微外科技術(shù)行束膜縫合，也難以避免地發(fā)生神經(jīng)束的錯(cuò)接，神經(jīng)功能恢復(fù)受到影響。通常為保證在無張力下縫合，一般在神經(jīng)缺損3cm以上就要進(jìn)行神經(jīng)移植。自體神經(jīng)移植至今仍是公認(rèn)的修復(fù)神經(jīng)缺損的黃金標(biāo)準(zhǔn)。但這種“拆東墻補(bǔ)西墻”的治療手段，不僅會(huì)造成新的創(chuàng)傷如供區(qū)感覺、運(yùn)動(dòng)障礙，而且尚有許多難以逾越的困難存在。異體神經(jīng)移植因免疫排斥反應(yīng)問題仍未解決，所以不能用于臨床。
為進(jìn)一步提高修復(fù)效果，人們從神經(jīng)細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)水平對(duì)周圍神經(jīng)再生進(jìn)行了深入的研究。特別是組織工程學(xué)的開展為從根本上解決組織器官的修復(fù)與重建帶來了希望。隨之提出的人工神經(jīng)作為一種嶄新的神經(jīng)缺損修復(fù)材料，要求具有良好生物相容性的載體與有活性的因子結(jié)合，形成具有特定三維結(jié)構(gòu)的生物活性復(fù)合體。即人工神經(jīng)應(yīng)具備1.可接納再生軸突長入并起引導(dǎo)作用的支架——神經(jīng)導(dǎo)管；2.活性細(xì)胞在神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)有序分布并具有生物活性能分泌營養(yǎng)因子。作為早期工作，近十余年來國內(nèi)外學(xué)者對(duì)應(yīng)用生物材料制成的神經(jīng)導(dǎo)管替代自體神經(jīng)修復(fù)N缺損高度重視，證實(shí)了其可行性。在論證了神經(jīng)生長因子(Nerve growth factor，NGF)在體內(nèi)外對(duì)神經(jīng)的營養(yǎng)和促生長作用基礎(chǔ)上，也通過實(shí)驗(yàn)表明神經(jīng)損傷后的再生依賴于局部由雪旺氏細(xì)胞等提供的營養(yǎng)因子，神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)加入NGF和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(Basicfibroblast growth factor，bFGF)后對(duì)神經(jīng)的修復(fù)作用明顯優(yōu)于對(duì)照組。然而，NGF雖可注入到神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)，但其操作、作用時(shí)間效能難以控制，以致應(yīng)用受限。雖然起支架作用的神經(jīng)導(dǎo)管目前可被制備，雪旺氏細(xì)胞也可體外培養(yǎng)，但其分泌神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)具有時(shí)效局限性，而且將其植入神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)的存活及克服其抗原性一時(shí)難以解決，細(xì)胞型組織工程離臨床應(yīng)用距離尚遠(yuǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有技術(shù)中各種促神經(jīng)生長因子在支架中難以發(fā)揮其應(yīng)有作用，以及注入的相關(guān)因子多處于液體狀態(tài)，在導(dǎo)管內(nèi)局部不宜存留，以及導(dǎo)管因自身結(jié)構(gòu)特點(diǎn)容易塌陷，影響其功能、作用發(fā)揮的問題，本發(fā)明提供了一種新型緩釋組織工程支架復(fù)合體及其制備方法，用于修復(fù)周圍神經(jīng)的缺損。
本發(fā)明的緩釋組織工程支架復(fù)合體所采用的技術(shù)方案是本發(fā)明所指的緩釋組織工程支架復(fù)合體包括殼聚糖導(dǎo)管(A)、瓊脂糖凝膠(B)、神經(jīng)生長因子NGF(C)。其具體制備方法是(1)取15萬單位的殼聚糖(浙江玉環(huán)海洋生物化工有限公司)5～10克加入150～200毫升2％乙酸溶液中，攪拌完全溶解后，加入1～5毫升甘油(增加膜片柔韌性)充分?jǐn)嚢瑁稳諏⒒旌弦旱谷?面有隔擋(高約3.0毫米)的已經(jīng)過處理的平板玻璃上，干燥后制成厚約0.1～0.5毫米的殼聚糖膜片，用直徑1.6毫米的玻璃棒卷成直徑約1.0～2.0毫米，厚0.1～0.5毫米的殼聚糖導(dǎo)管(A)，干燥保存。
(2)取0.1～1.0克瓊脂糖(浙江洞頭縣水產(chǎn)公司海生物化工廠)加入50～150毫升蒸餾水中，加熱3分鐘溶解后置于38℃水浴箱中。(B)(3)取瓊脂糖凝膠(B)3～10ml加入NGF(C)(廈門北大之路生物有限公司)1支(2000AU)，充分溶解后，室溫放置2分鐘形成均勻包裹NGF的瓊脂糖凝膠以備用。
經(jīng)上述制備方法所制作出的緩釋組織工程支架復(fù)合體直接把NGF包裹于瓊脂糖凝膠中，注入殼聚糖導(dǎo)管，使NGF隨著瓊脂糖凝膠的降解不斷的釋放，形成新型的具有緩釋功能的復(fù)合型組織工程神經(jīng)支架，具有良好的生物相容性、生物降解性，較好的強(qiáng)度支撐及NGF的緩釋功能。
本發(fā)明的有益效果是在神經(jīng)橋接術(shù)中對(duì)神經(jīng)導(dǎo)管壁起到有效的支撐作用，能防止管壁塌陷，同時(shí)為周圍神經(jīng)的修復(fù)與再生過程中發(fā)揮促進(jìn)組織引導(dǎo)作用，并營造了有利于神經(jīng)缺損修復(fù)與再生的微環(huán)境。在作為加入導(dǎo)管中的促神經(jīng)修復(fù)與再生物質(zhì)(NGF)的載體時(shí)還能發(fā)揮生物控釋或細(xì)胞外基質(zhì)載體的作用。本發(fā)明采用的材料在人體內(nèi)可吸收降解，無毒無害，無須二次手術(shù)，應(yīng)用操作簡單，可以大大提高導(dǎo)管修復(fù)神經(jīng)缺損的療效。
目前，在大鼠體內(nèi)已經(jīng)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，并取得了顯著效果。選取雄性SD大鼠30只，體重250～克300克之間。由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只，分別設(shè)為對(duì)照組I(單純殼聚糖導(dǎo)管組)，對(duì)照組II(自體神經(jīng)組)和實(shí)驗(yàn)組(復(fù)合支架組)。10％水合氯醛400mg/kg腹腔注射，麻醉后股后部正中切口，暴露左后肢中段坐骨神經(jīng)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組I離斷6mm，9/0顯微外科縫合線分別與神經(jīng)遠(yuǎn)近斷端外膜處縫合一針，打結(jié)，尾線交叉自導(dǎo)管對(duì)側(cè)端穿出將神經(jīng)套入導(dǎo)管內(nèi)各1mm，管外再把2尾線打結(jié)固定，管內(nèi)形成10mm神經(jīng)缺損，其中實(shí)驗(yàn)組在神經(jīng)套入管內(nèi)之前，把包裹NGF的瓊脂糖凝膠注入導(dǎo)管內(nèi)神經(jīng)斷端之間。對(duì)照組II離段神經(jīng)10mm，離段的神經(jīng)倒置后再吻合于神經(jīng)缺損處。使用慶大霉素噴灑于手術(shù)切口處，預(yù)防感染。術(shù)后20℃～22℃，相對(duì)濕度40％～70％，室內(nèi)通風(fēng)良好，以標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)，并觀察其術(shù)后恢復(fù)情況。
1動(dòng)物一般觀察術(shù)后1周內(nèi)各組大鼠精神萎靡、厭動(dòng)，術(shù)側(cè)腿部行動(dòng)困難，各組動(dòng)物手術(shù)切口愈合較好，未見有感染發(fā)生；術(shù)后2周各組大鼠術(shù)側(cè)足底均發(fā)生明顯紅腫，對(duì)照組I有6只、實(shí)驗(yàn)組有3只、對(duì)照組II有4只大鼠出現(xiàn)足底踝關(guān)節(jié)后部皮膚潰瘍；術(shù)后1個(gè)月時(shí)各組大鼠精神已經(jīng)恢復(fù)正常，術(shù)側(cè)腿部已能活動(dòng)，但是小腿不能伸直，各足趾亦不能伸，呈自然彎曲狀態(tài)，足底部紅腫和潰瘍均存在且有加重趨勢，同時(shí)術(shù)側(cè)腿部肌肉均有不同程度的萎縮。術(shù)后2個(gè)月時(shí)，各組大鼠的小腿仍不能伸直，各足趾不能伸，呈自然彎曲狀態(tài)，而且對(duì)照組I有4只、實(shí)驗(yàn)組2只、對(duì)照組II有3只術(shù)側(cè)足趾與健側(cè)相比出現(xiàn)了不同程度的萎縮。術(shù)后3個(gè)月時(shí)，出現(xiàn)萎縮的大鼠的情況無明顯改善，對(duì)照組I出現(xiàn)有3只萎縮進(jìn)一步加重，各組大鼠的足底的紅腫和潰瘍已經(jīng)有所恢復(fù)。術(shù)后4個(gè)月時(shí)，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組II大鼠的腿部紅腫和潰瘍已基本消失，除對(duì)照組I有3只、實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組II各1只萎縮外，其余大鼠小腿部肌肉基本恢復(fù)正常。
2術(shù)后4個(gè)月解剖學(xué)觀察術(shù)后4個(gè)月見實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組I再生神經(jīng)全部長入遠(yuǎn)端導(dǎo)管，與周圍組織有輕度粘連，導(dǎo)管表面覆蓋有薄層結(jié)締組織，管壁無塌陷，炎性反應(yīng)不明顯，管壁仍可支撐，但變軟變薄，部分吸收。剖開導(dǎo)管見再生神經(jīng)實(shí)驗(yàn)組要粗于對(duì)照組I。
3術(shù)后4個(gè)月標(biāo)本HE染色光鏡觀察術(shù)后4個(gè)月再生的坐骨神經(jīng)縱切HE染色組織切片顯示三組再生神經(jīng)全部長入遠(yuǎn)端，對(duì)照組II神經(jīng)排列最整齊，優(yōu)于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組I，在神經(jīng)密集程度、血管化程度上，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組II要好于對(duì)照組I。
術(shù)后4個(gè)月再生的坐骨神經(jīng)橫切HE染色組織切片于軸突圖象分析儀上檢測實(shí)驗(yàn)組再生神經(jīng)的直徑與數(shù)目要優(yōu)于對(duì)照組I，與對(duì)照組II相當(dāng)，但后者排列更規(guī)則些。
坐骨神經(jīng)橫切面HE染色組織切片于軸突圖象分析儀上檢測結(jié)果，見表2表2坐骨神經(jīng)橫切面有髓神經(jīng)纖維數(shù)目和有髓纖維直徑(像素值)

有髓神經(jīng)纖維數(shù)目和有髓纖維直徑實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組I相比料**P＜0.01，與對(duì)照組II相比P＞0.05。
4.術(shù)后4個(gè)月透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察實(shí)驗(yàn)組再生神經(jīng)纖維直徑、軸突粗細(xì)和數(shù)目、髓鞘厚度及形態(tài)方面更接近對(duì)照組II，明顯優(yōu)于對(duì)照組I。
5.術(shù)后第4月HE染色S-100免疫組織化學(xué)染色觀察作為周圍神經(jīng)標(biāo)志蛋白S-100蛋白質(zhì)分布于少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和Sc上，經(jīng)依次滴加一抗兔抗大鼠S-100蛋白、二抗兔IgG、SABC，HRP、DAB顯色液顯色，陽性結(jié)果為出現(xiàn)棕紅色。實(shí)驗(yàn)組S-100免疫組織化學(xué)染色可見大量的長條狀棕紅色反應(yīng)物，提示Sc細(xì)胞增生，在數(shù)量和排列上達(dá)到對(duì)照組II水平。而對(duì)照組I棕紅色反應(yīng)物相比要少而稀疏，提示再生Sc比實(shí)驗(yàn)組要少。
6.神經(jīng)電生理檢測術(shù)后4個(gè)月檢測坐骨神經(jīng)動(dòng)作電位和傳導(dǎo)速度，結(jié)果見表2。
表2坐骨神經(jīng)動(dòng)作電位和傳導(dǎo)速度

傳導(dǎo)速度實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組I相比*P＜0.05，與對(duì)照組II相比#P＜0.05。
動(dòng)作電位實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組I相比**P＜0.01，與對(duì)照組II相比P＞0.05。
7坐骨神經(jīng)指數(shù)計(jì)算見表3。
表3各組術(shù)后坐骨神經(jīng)指數(shù)比較

結(jié)果術(shù)后4個(gè)月結(jié)果顯示緩釋組織工程支架復(fù)合體組在形態(tài)學(xué)和電生理指標(biāo)上與對(duì)照組I(空白導(dǎo)管組)比較，再生神經(jīng)纖維數(shù)量多，排列規(guī)律，髓鞘化成熟程度好，電生理學(xué)檢查亦有顯著性差異，而與對(duì)照組II(自體神經(jīng)組)比較無顯著性差異。
結(jié)論此種緩釋組織工程支架復(fù)合體可以修復(fù)神經(jīng)缺損，在動(dòng)物體內(nèi)可以明顯促進(jìn)神經(jīng)再生，基本達(dá)到了目前的黃金標(biāo)準(zhǔn)——自體神經(jīng)移植水平。
具體實(shí)施例方式
(1)取15萬單位的殼聚糖(A)(浙江玉環(huán)海洋生物化工有限公司)9克加入180毫升2％乙酸溶液中，攪拌完全溶解后，加入1.5毫升甘油(增加膜片柔韌性)充分?jǐn)嚢瑁稳諏⒒旌弦旱谷?面有隔擋(高約3.0毫米)的已經(jīng)過處理的平板玻璃上，干燥后制成厚約0.15毫米的殼聚糖膜片，用直徑1.6毫米的玻璃棒卷成直徑約1.65毫米，厚0.3毫米，長1.2毫米的殼聚糖導(dǎo)管，干燥保存。
(2)取0.6克瓊脂糖(B)(浙江洞頭縣水產(chǎn)公司海生物化工廠)加入100毫升蒸餾水中，微波爐加熱3分鐘溶解后，取5毫升置于38℃水浴中。
(3)在溶解后的瓊脂糖中加入NGF(C)(廈門北大之路生物有限公司)1支(2000AU)，充分溶解后，室溫放置2分鐘形成均勻包裹NGF的瓊脂糖凝膠以備用。
(4)暴露周圍神經(jīng)缺損處后，9/0顯微外科縫合線分別與神經(jīng)遠(yuǎn)近斷端外膜處縫合一針，打結(jié)，尾線交叉自導(dǎo)管對(duì)側(cè)端穿出將神經(jīng)套入導(dǎo)管內(nèi)各1mm，管外再把2尾線打結(jié)固定，在神經(jīng)套入管內(nèi)之前，把包裹NGF的瓊脂糖凝膠注入導(dǎo)管內(nèi)神經(jīng)斷端之間，使其導(dǎo)管充分充盈。從而形成了一個(gè)有利于神經(jīng)修復(fù)于再生微環(huán)境的緩釋組織工程支架復(fù)合體。該復(fù)合體必將將更好的發(fā)揮其神經(jīng)橋接術(shù)的療效。
權(quán)利要求
1.一種用于周圍神經(jīng)缺損修復(fù)與重建的緩釋組織工程神經(jīng)支架復(fù)合體，其材料包括有殼聚糖導(dǎo)管(A)、瓊脂糖凝膠(B)和神經(jīng)生長因子NGF(C)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所說的緩釋組織工程神經(jīng)支架復(fù)合體，其制備方法為(1)取15萬單位的殼聚糖(浙江玉環(huán)海洋生物化工有限公司)5～10克加入150～200毫升2％乙酸溶液中，攪拌完全溶解后，加入1～5毫升甘油，充分?jǐn)嚢?，次日將混合液倒?面有隔擋的已經(jīng)過處理的平板玻璃上，干燥后制成厚約0.1～0.5毫米的殼聚糖膜片，用直徑1.6毫米的玻璃棒卷成直徑約1.0～2.0毫米，厚0.1～0.5毫米的殼聚糖導(dǎo)管(A)，干燥保存。(2)取0.1～1.0克瓊脂糖(浙江洞頭縣水產(chǎn)公司海生物化工廠)加入50～150毫升蒸餾水中，加熱3分鐘溶解后置于38℃水浴箱中。(B)(3)取瓊脂糖凝膠(B)3～10ml加入NGF(C)(廈門北大之路生物有限公司)1支(2000AU)，充分溶解后，室溫放置2分鐘形成均勻包裹NGF的瓊脂糖凝膠以備用。(4)暴露周圍神經(jīng)缺損處后，9/0顯微外科縫合線分別與神經(jīng)遠(yuǎn)近斷端外膜處縫合一針，打結(jié)，尾線交叉自導(dǎo)管對(duì)側(cè)端穿出將神經(jīng)套入導(dǎo)管內(nèi)各1mm，管外再把2尾線打結(jié)固定，在神經(jīng)套入管內(nèi)之前，把包裹NGF的瓊脂糖凝膠注入導(dǎo)管內(nèi)神經(jīng)斷端之間，使其導(dǎo)管充分充盈。從而形成一個(gè)緩釋組織工程神經(jīng)支架復(fù)合體。
全文摘要
本發(fā)明公開一種用于周圍神經(jīng)缺損修復(fù)與重建的緩釋組織工程神經(jīng)支架復(fù)合體及其制備方法。該復(fù)合體是由殼聚糖、瓊脂糖及神經(jīng)生長因子按其制備方法構(gòu)建而成，在人體內(nèi)可吸收降解，無毒無害，價(jià)格低廉。可以明顯促進(jìn)神經(jīng)再生，克服了原有單純導(dǎo)管的各種弊端，其治療效果基本達(dá)到了自體神經(jīng)移植水平。
文檔編號(hào)A61L29/14GK1935276SQ20061015079
公開日2007年3月28日 申請(qǐng)日期2006年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月27日
發(fā)明者王偉, 范明, 徐艷, 劉淑紅, 孫亮, 呂剛, 智曉東 申請(qǐng)人:遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院, 王偉