專利名稱：一種具有抗氧化活性的卡拉寡糖硫酸酯的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種有機聚合物，特別是涉及一種具有抗氧化活性的卡拉寡糖硫酸酯的制備方法。
背景技術(shù)：
目前已有關(guān)于卡拉寡糖硫酸酯的活性報道，包括抑制腸道菌群、提高免疫功能、抗氧化以及對放射損傷的保護作用等方面，但這些報道均采用化學(xué)方法降解卡拉膠制備卡拉寡糖硫酸酯，化學(xué)方法由于反應(yīng)條件不易控制，產(chǎn)物得率低，制備過程中產(chǎn)物結(jié)構(gòu)易受到破壞等缺點，從而嚴(yán)重制約了卡拉寡糖硫酸酯的活性開發(fā)和應(yīng)用。在酶解制備活性卡拉寡糖硫酸酯的報道方面僅見一種具有抗腫瘤活性的硫酸半乳低聚糖的制備方法(ZL03138975.9)，但尚未有關(guān)于利用酶解方法制備具有抗氧化活性的卡拉寡糖硫酸酯的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有抗氧化活性的卡拉寡糖硫酸酯的制備方法，它能彌補現(xiàn)有技術(shù)的上述不足。
一種具有抗氧化活性的卡拉寡糖硫酸酯的制備方法，包括配制κ-卡拉膠底物，加入κ-卡拉膠酶酶粉，進行酶解反應(yīng)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，用有機溶劑沉淀收集酶解產(chǎn)生的卡拉寡糖，其特征是對卡拉寡糖進行硫酸化修飾，再經(jīng)丙酮反復(fù)洗滌和真空抽濾并干燥；所述的κ-卡拉膠酶由海洋噬纖維菌產(chǎn)生，所述的酶解反應(yīng)條件將8-12單位κ-卡拉膠酶酶粉加入到含2-5gκ-卡拉膠的100ml無菌蒸餾水中，于26-34℃反應(yīng)16-24h；所述的有機溶劑為乙醇或丙酮，加入有機溶劑的體積為濃縮液體積的4-10倍；所述的硫酸化修飾條件將2g烘干的卡拉寡糖加入到干燥的三頸瓶中，加入50-90ml N，N-二甲基甲酰胺，攪拌使寡糖充分分散在溶劑中，再加入硫酸化試劑10-15ml，水浴條件下逐漸升溫至64-70℃，反應(yīng)1-4h。
本發(fā)明的優(yōu)點是采用酶法降解和化學(xué)修飾相結(jié)合的步驟，使得制備過程簡單、產(chǎn)物得率高、質(zhì)量穩(wěn)定、在制備過程中活性基團不受破壞，并且該產(chǎn)品具有抗氧化活性，具備開發(fā)抗氧化功能食品的潛力。
具體實施例方式
實施例一將2gκ-卡拉膠溶于100ml無菌蒸餾水中，加入12單位由海洋噬纖維菌制成的κ-卡拉膠酶粉，1個酶活力單位定義為在32℃條件下，每min產(chǎn)生1μmol還原糖(以半乳糖計)所需要的酶量。于32℃150r/min振蕩反應(yīng)18h，反應(yīng)液于60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進行濃縮至20ml，然后加入4倍體積的丙酮使寡糖組分得到沉淀，離心收集沉淀物，經(jīng)70℃烘干后得到卡拉寡糖。于冰鹽浴條件下，加50ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)至干燥的三頸瓶中并不停攪拌，用恒壓分液漏斗緩緩滴加15ml氯磺酸進行反應(yīng)，形成DMF-氯磺酸硫酸化試劑。將2g烘干的卡拉寡糖加入至干燥的三頸瓶中，加入80ml DMF攪拌使寡糖充分分散在溶劑中，再加入DMF-氯磺酸硫酸化試劑10ml，水浴條件下逐漸升溫至68℃，反應(yīng)3h。待反應(yīng)液冷卻后，加入10ml去離子水，倒入燒杯中，加丙酮攪拌得到沉淀，真空抽濾后，用丙酮反復(fù)洗滌，50℃烘干獲得黃色的卡拉寡糖硫酸酯。
上述卡拉寡糖硫酸酯對H2O2具有良好的清除作用，具體驗證方法如下用Alsever′s液采集新鮮雞血，2000r/min離心收集沉淀紅細胞，用冷的生理鹽水洗滌3次，制成2％的細胞懸浮液。取紅細胞懸液1ml，加入0.1ml不同濃度的卡拉寡糖硫酸酯樣品及0.3ml H2O2(濃度為24 mmol/L)，37℃溫箱中反應(yīng)1h后，用生理鹽水稀釋3倍，2000r/min離心10min，收集上清液于415nm處測定吸光值。以不加H2O2的紅細胞正常組為空白調(diào)零，以H2O2加紅細胞混合為對照組，試驗組同對照組比較，計算出紅細胞溶血抑制率[(對照管A415值-樣品管A415值)/對照管A415值]×100％，卡拉寡糖硫酸酯濃度為6.4mg/ml時，對H2O2引起的溶血現(xiàn)象的抑制率為86.2％。
實施例二將2gκ-卡拉膠溶于100ml無菌蒸餾水中，加入9單位由海洋噬纖維菌制成的κ-卡拉膠酶粉，于34℃150r/min振蕩反應(yīng)24h，反應(yīng)液于70℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進行濃縮至20ml左右，然后加入10倍體積的乙醇使寡糖組分得到沉淀，離心收集沉淀物，經(jīng)76℃烘干后得到卡拉寡糖。將2g烘干的卡拉寡糖加入至干燥的三頸瓶中，加入50ml DMF攪拌使寡糖充分分散在溶劑中，再加入DMF-氯磺酸硫酸化試劑12ml，水浴條件下逐漸升溫至70℃，反應(yīng)1h。待反應(yīng)液冷卻后，加入10ml去離子水，倒入燒杯中，加乙醇攪拌得到沉淀，真空抽濾后，用乙醇反復(fù)洗滌，50℃烘干獲得黃色的卡拉寡糖硫酸酯。
上述卡拉寡糖硫酸酯對·OH具有良好的清除作用，具體驗證方法如下3ml反應(yīng)液中含有1.0ml 0.6mol/L FeSO4，0.75ml 8mmol/L水楊酸鈉及0.5ml不同濃度的卡拉寡糖硫酸酯樣品，最后添加0.75ml24 mmol/L H2O2，啟動反應(yīng)，于37℃反應(yīng)1h，測510nm處的吸光值。·OH的清除率(％)表示為[(對照管A510值-樣品管A510值)/對照管A510值]×100％，卡拉寡糖硫酸酯濃度為6.4 mg/ml時，對羥自由基的清除率達到81.1％。
本發(fā)明中所述的酶解反應(yīng)條件將8-12單位κ-卡拉膠酶酶粉加入到含2-5gκ-卡拉膠的100ml無菌蒸餾水中，于26-34℃反應(yīng)16-24h；所述的有機溶劑為乙醇或丙酮，加入有機溶劑的體積為濃縮液體積的4-10倍；所述的硫酸化修飾條件將2g烘干的卡拉寡糖加入到干燥的三頸瓶中，加入50-90ml N，N-二甲基甲酰胺，攪拌使寡糖充分分散在溶劑中，再加入硫酸化試劑10-15ml，水浴條件下逐漸升溫至64-70℃，反應(yīng)1-4h。
權(quán)利要求
1.一種具有抗氧化活性的卡拉寡糖硫酸酯的制備方法，包括配制κ-卡拉膠底物，加入κ-卡拉膠酶酶粉，進行酶解反應(yīng)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，用有機溶劑沉淀收集酶解產(chǎn)生的卡拉寡糖，其特征是對卡拉寡糖進行硫酸化修飾，再經(jīng)丙酮反復(fù)洗滌和真空抽濾并干燥；所述的κ-卡拉膠酶由海洋噬纖維菌產(chǎn)生，所述的酶解反應(yīng)條件將8-12單位κ-卡拉膠酶酶粉加入到含2-5gκ-卡拉膠的100ml無菌蒸餾水中，于26-34℃反應(yīng)16-24h；所述的有機溶劑為乙醇或丙酮，加入有機溶劑的體積為濃縮液體積的4-10倍；所述的硫酸化修飾條件將2g烘干的卡拉寡糖加入到干燥的三頸瓶中，加入50-90mlN，N-二甲基甲酰胺，攪拌使寡糖充分分散在溶劑中，再加入硫酸化試劑10-15ml，水浴條件下逐漸升溫至64-70℃，反應(yīng)1-4h。
全文摘要
一種具有抗氧化活性的卡拉寡糖硫酸酯的制備方法，包括配制κ－卡拉膠底物，加入κ－卡拉膠酶酶粉，進行酶解反應(yīng)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，用有機溶劑沉淀收集酶解產(chǎn)生的卡拉寡糖，其特征是對卡拉寡糖進行硫酸化修飾，再經(jīng)丙酮反復(fù)洗滌和真空抽濾并干燥；本發(fā)明的優(yōu)點是采用酶法降解和化學(xué)修飾相結(jié)合的步驟，使得制備過程簡單、產(chǎn)物得率高、質(zhì)量穩(wěn)定、在制備過程中活性基團不受破壞，并且該產(chǎn)品具有抗氧化活性，具備開發(fā)抗氧化功能食品的潛力。
文檔編號A61P39/06GK1986824SQ20061007079
公開日2007年6月27日 申請日期2006年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月13日
發(fā)明者牟海津, 江曉路, 劉志鴻 申請人:中國海洋大學(xué)