專利名稱：用于神經(jīng)橋接的導(dǎo)管填充材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是屬于一種用于神經(jīng)缺損后修復(fù)與再生的新型組織工程填充材料，特別涉及用于神經(jīng)橋接術(shù)導(dǎo)管內(nèi)作為促神經(jīng)生長(zhǎng)的細(xì)胞、各種因子載體的填充材料及其制備方法。
背景技術(shù)：
目前，臨床工作中對(duì)于神經(jīng)缺損的修復(fù)大多仍采取自體神經(jīng)移植的方法，取相對(duì)次要的神經(jīng)作為供體來(lái)修補(bǔ)缺損神經(jīng)。該方法除存在犧牲供區(qū)神經(jīng)功能的弊病外，還存在著無(wú)法對(duì)較長(zhǎng)段神經(jīng)缺損進(jìn)行有效治療的嚴(yán)重不足。隨著組織工程學(xué)的迅猛發(fā)展，導(dǎo)管橋接術(shù)的問(wèn)世一定程度上解決了這一長(zhǎng)期困擾臨床工作者的難題。然而，臨床上神經(jīng)缺損的橋接雖應(yīng)用了靜脈、硅膠管及殼聚糖等多種生物材料，但仍存在著諸多不足，例如橋接物僅起到缺損斷端連接作用，對(duì)神經(jīng)再生沒(méi)有促進(jìn)作用，由于注入的各種促神經(jīng)生長(zhǎng)成分處于液體狀態(tài)，在導(dǎo)管內(nèi)局部不宜存留；導(dǎo)管因自身結(jié)構(gòu)特點(diǎn)容易塌陷，影響其功能、作用的發(fā)揮；以及瘢痕組織的形成。這些問(wèn)題都影響著缺損神經(jīng)的修復(fù)與再生，所以制約了臨床的應(yīng)用與推廣。
理想的人工神經(jīng)是以具有良好生物相容性的可降解高分子聚合物為載體，與有活性的細(xì)胞及因子結(jié)合而形成的具有特定三維結(jié)構(gòu)和生物活性的復(fù)合體，允許再生神經(jīng)纖維生長(zhǎng)到遠(yuǎn)側(cè)神經(jīng)殘端，抑制神經(jīng)瘤的形成和纖維瘢痕組織長(zhǎng)入，能夠?yàn)樯窠?jīng)的修復(fù)與再生營(yíng)造有利微環(huán)境等特點(diǎn)。
透明質(zhì)酸是由(1→4)-D-葡萄糖醛酸-β(1→3)-N-乙酰氨基葡萄糖的雙糖構(gòu)成的線性多糖類大分子物質(zhì)，廣泛存在于人及各種動(dòng)物結(jié)締組織中。由于其分子間作用形成復(fù)雜的三級(jí)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而獲得了諸多特性，如維持組織形態(tài)，潤(rùn)滑，擴(kuò)散屏障和緩沖應(yīng)力等機(jī)械功能和重要的生理功能，同時(shí)又具有顯著的粘彈性。透明質(zhì)酸也是構(gòu)成細(xì)胞間質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，細(xì)胞外基質(zhì)在維持組織器官的正常生理功能、支持細(xì)胞的生長(zhǎng)分化以及損傷組織的修復(fù)過(guò)程中均扮演了關(guān)鍵的角色。在創(chuàng)傷愈合過(guò)程中，細(xì)胞外基質(zhì)影響了細(xì)胞的行為表現(xiàn)，而細(xì)胞也反之通過(guò)多種途徑對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而形成了一個(gè)貫穿整個(gè)愈合過(guò)程而又不斷變化的支持細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的微環(huán)境。組織的修復(fù)與再生過(guò)程是一個(gè)牽涉到多種細(xì)胞和生物大分子進(jìn)行細(xì)胞增殖、分化和基質(zhì)重建的過(guò)程。在創(chuàng)傷發(fā)生的早期，局部的成纖維細(xì)胞、舉噬細(xì)胞等在生長(zhǎng)因子的作用下，合成透明質(zhì)酸的數(shù)量明顯增高。在對(duì)比胚胎和出生后的研究中表明，在胚胎皮膚創(chuàng)傷的修復(fù)過(guò)程中，透明質(zhì)酸保持了很高的濃度，從而抑制了膠原纖維組織的攣縮，直至組織得到再生性修復(fù)而不留下瘢痕。出生后，透明質(zhì)酸在早期保持了較高的濃度，但隨后在透明質(zhì)酸酶的作用下逐步被降解，同時(shí)膠原纖維的合成卻在不斷增加，最終形成了瘢痕性修復(fù)。另外，透明質(zhì)酸還具有促進(jìn)血管生長(zhǎng)、改善損傷局部微循環(huán)、促進(jìn)生長(zhǎng)因子表達(dá)的作用。透明質(zhì)酸分子中含有大量的羧基和羥基，在水溶液中形成分子內(nèi)和分子間氫鍵。這使其具有強(qiáng)大的保水作用，可結(jié)合多于本身1000倍的水。現(xiàn)有技術(shù)中已有以透明質(zhì)酸鈉為主要成分，同其他輔料和藥理活性物質(zhì)如殼聚糖、肝素、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、表皮生長(zhǎng)因子、殺菌劑等配成復(fù)方制劑應(yīng)用于臨床，主要用于治療燒燙傷的粉末劑(專利號(hào)CN1335135)；另外，透明質(zhì)酸鈉在應(yīng)用于外科手術(shù)中的防粘連醫(yī)用制劑里也發(fā)揮了重要作用(專利號(hào)CN1295838)。以透明質(zhì)酸鈉為主要成分作為神經(jīng)橋接的導(dǎo)管填充材料，目前檢索尚未見(jiàn)到。

發(fā)明內(nèi)容
為了補(bǔ)充和完善現(xiàn)有技術(shù)對(duì)神經(jīng)橋接物僅起到缺損斷端連接引導(dǎo)、屏壁作用，而對(duì)神經(jīng)再生缺乏促進(jìn)作用，以及在導(dǎo)管內(nèi)注入的各種促神經(jīng)生長(zhǎng)成分處于液體狀態(tài)，在導(dǎo)管內(nèi)局部不宜存留，以及導(dǎo)管因自身結(jié)構(gòu)特點(diǎn)容易塌陷，影響其功能、作用發(fā)揮的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種用于神經(jīng)橋接導(dǎo)管的填充材料及其制備方法。
本發(fā)明用于神經(jīng)橋接的導(dǎo)管填充材料所采用的技術(shù)方案是所說(shuō)的導(dǎo)管填充材料包括有透明質(zhì)酸鈉精制干粉(A)、生理平衡液(B)，促神經(jīng)生長(zhǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(C)或促神經(jīng)生長(zhǎng)的各種細(xì)胞(D)。
所指的促神經(jīng)生長(zhǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(C)可以是神經(jīng)生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子、酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、堿性成肌細(xì)胞生長(zhǎng)因子、睫狀神經(jīng)生長(zhǎng)因子、膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的一種或多種。
所說(shuō)的促神經(jīng)生長(zhǎng)細(xì)胞(D)可以是雪旺氏細(xì)胞、肌肉干細(xì)胞、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的一種或多種。
本發(fā)明所說(shuō)的用于神經(jīng)橋接的導(dǎo)管填充材料的制備方法包括如下步驟(1)將透明質(zhì)酸鈉干粉(青島盛洋生物公司)加入去離子水，配成0.01～0.2％的透明質(zhì)酸鈉溶液，通過(guò)0.22μm醋酸纖維素膜進(jìn)行除菌過(guò)濾，收集除菌濾液，加入1-5倍量的無(wú)菌丙酮或乙醇溶液，收集沉淀，真空干燥后得到無(wú)菌透明質(zhì)酸鈉精制干粉(A)；(2)取1～10％透明質(zhì)酸鈉精制干粉(A)，溶于90％～99％生理平衡液(B)，調(diào)節(jié)其PH值為7.0～7.4，充分?jǐn)嚢枧渲瞥?～10mg/ml濃度的透明質(zhì)酸鈉凝膠，靜止脫泡，1～10℃冷藏備用；(3)加入1％～10％促神經(jīng)生長(zhǎng)因子(C)或有促神經(jīng)生長(zhǎng)作用的細(xì)胞(D)。
該導(dǎo)管的填充材料經(jīng)上述制備方法，制成一種凝膠狀，不僅可以支撐導(dǎo)管，解決導(dǎo)管塌陷的問(wèn)題，還可以因其自身生物學(xué)特性在導(dǎo)管內(nèi)營(yíng)造有利于神經(jīng)生長(zhǎng)的微環(huán)境，促進(jìn)、引導(dǎo)神經(jīng)再生。另外還可以作為加入導(dǎo)管中的各種外源性物質(zhì)(如藥物因子、細(xì)胞、基因等)的載體，發(fā)揮對(duì)細(xì)胞及營(yíng)養(yǎng)因子控釋或細(xì)胞外基質(zhì)載體的作用。
本發(fā)明的有益效果是在神經(jīng)橋接術(shù)中對(duì)神經(jīng)導(dǎo)管壁起到有效的支撐作用，能防止管壁塌陷，同時(shí)為神經(jīng)缺損的修復(fù)與再生過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)組織引導(dǎo)作用并營(yíng)造了有利于神經(jīng)缺損修復(fù)與再生的微環(huán)境。在作為加入導(dǎo)管中的各種促神經(jīng)修復(fù)與再生物質(zhì)的載體時(shí)還能發(fā)揮生物控釋或細(xì)胞外基質(zhì)載體的作用。本發(fā)明采用的填充材料在人體可吸收降解，無(wú)毒無(wú)害，無(wú)須二次手術(shù)，應(yīng)用操作簡(jiǎn)單，可以大大提高導(dǎo)管修復(fù)神經(jīng)缺損的療效。
目前，在大鼠體內(nèi)已經(jīng)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，并取得了顯著效果。選取健康成年清潔級(jí)SD雄性大鼠30只(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供)，體重200～250g，平均223g。1％戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉。消毒后，取股后斜切口，暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)，并在梨狀肌出口下方5mm處將坐骨神經(jīng)切除約8mm，任其回縮，造成10mm缺損，用無(wú)損傷顯微縫合線將神經(jīng)遠(yuǎn)、近斷端與橋接導(dǎo)管縫合固定2針，縫合方法采用兩定點(diǎn)套接法分別在神經(jīng)干周徑180°兩相對(duì)位置各縫合1針，使得再生神經(jīng)斷端套入橋接管內(nèi)1mm。動(dòng)物數(shù)量平均分為5組A組不加入任何導(dǎo)管填充物。
B組用一次性無(wú)菌注射器(套接特制大孔徑針頭)吸取適量透明質(zhì)酸鈉凝膠由導(dǎo)管一側(cè)注入，使導(dǎo)管充分充盈。
C組用一次性無(wú)菌注射器(套接特制大孔徑針頭)吸取適量已經(jīng)加入促神經(jīng)生長(zhǎng)因子(睫狀神經(jīng)生長(zhǎng)因子)的透明質(zhì)酸鈉凝膠由導(dǎo)管一側(cè)注入，使導(dǎo)管充分充盈。
D組用一次性無(wú)菌注射器(套接特制大孔徑針頭)吸取適量已經(jīng)加入促神經(jīng)生長(zhǎng)細(xì)胞(肌源性干細(xì)胞)的透明質(zhì)酸鈉凝膠由導(dǎo)管一側(cè)注入，使導(dǎo)管充分充盈。
E組。用一次性無(wú)菌注射器(套接特制大孔徑針頭)吸取適量已經(jīng)加入促神經(jīng)生長(zhǎng)因子(睫狀神經(jīng)生長(zhǎng)因子)和促神經(jīng)生長(zhǎng)細(xì)胞(肌源性干細(xì)胞)的透明質(zhì)酸鈉凝膠由導(dǎo)管一側(cè)注入，使導(dǎo)管充分充盈。
而后逐層縫合股后肌肉及皮膚切口，按常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一分籠飼養(yǎng)。待4、8和12周后分別取各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行檢測(cè)。
一、肢體觀察術(shù)后即發(fā)現(xiàn)大鼠右后肢、足趾彎曲，無(wú)法伸展，拖曳行走，針刺不能引發(fā)收縮；術(shù)后1周時(shí)發(fā)現(xiàn)各組大鼠右側(cè)足跟負(fù)重區(qū)皮膚均有不同程度紅腫，2周時(shí)A、組中出現(xiàn)足底輕度潰瘍，隨后趨于愈合。術(shù)后3周全部出現(xiàn)局部肌肉萎縮；術(shù)后4周肌肉萎縮有不同程度恢復(fù)，肌肉僵直有所減輕，行走時(shí)拖曳程度降低，A、B組中各有1和3只(各組總數(shù)均6只)有針刺反應(yīng)，但不明顯；C、D、E各組中分別有5、5和6只(各組總數(shù)均6只)有針刺反應(yīng)；8周時(shí)共有25只大鼠，其中A、B組各有2和3只，C、D、E組各有5、4、5只(各組總數(shù)均5只)右后肢肌肉僵直度明顯降低，外力可使之伸展，足趾有較大握力，存在明顯針刺反應(yīng)，足趾觀察拖曳程度明顯降低。
二、解剖學(xué)觀察術(shù)后12周各組取1只大鼠，1％戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉后再次切開(kāi)并暴露坐骨神經(jīng)，可見(jiàn)植入的導(dǎo)管及兩端的神經(jīng)均包繞著由纖維結(jié)締組織形成的包殼，與周圍組織無(wú)明顯粘連。剪開(kāi)并取出導(dǎo)管后，除A外，各組均可見(jiàn)再生神經(jīng)，遠(yuǎn)、近端與正常神經(jīng)連接處光滑無(wú)斷裂，無(wú)瘢痕組織、神經(jīng)瘤形成，表面可見(jiàn)微小血管網(wǎng)形成，外形似正常神經(jīng)，直徑較正常的神經(jīng)干細(xì)，C、D、E組略粗于B組。A組導(dǎo)管內(nèi)充滿淡黃色的液體，無(wú)再生神經(jīng)通過(guò)。
三、坐骨神經(jīng)指數(shù)(SFI)Bain公式計(jì)算SFI＝-38.3[(EPL-NPL)/NPL]+109.5[(ETS-NTS)/NTS]]+13.3[(EIT-NIT)/NIT]-8.8SFI值0％～±11％表示神經(jīng)功能完全正常，-100％表示神經(jīng)功能完全喪失，-11％～-100％之間表示部分神經(jīng)功能恢復(fù)。
見(jiàn)表1，A組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)均不及其他各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。術(shù)后4周B、C、D組SFI相比較，無(wú)顯著性差別(p＞0.05)；術(shù)后8周、12周，C、D、E組SFI恢復(fù)情況明顯優(yōu)于B組，同時(shí)，E組SFI優(yōu)于C、D組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。
表1 術(shù)后4、8、12周時(shí)各組坐骨神經(jīng)指數(shù)(SFI)比較(n＝6，x±s)

四、電生理檢查術(shù)后12周，清醒狀態(tài)下，用肌電圖儀檢測(cè)患肢小腿三頭肌的肌電圖。麻醉狀態(tài)下，暴露術(shù)側(cè)坐骨神經(jīng)，檢測(cè)坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度、復(fù)合肌肉動(dòng)作電位的波幅。
見(jiàn)表2，A組為纖顫電位，可見(jiàn)正尖波，表現(xiàn)為完全失神經(jīng)電位；B、C、D、E組腓腸肌肌電圖為混合相電位，呈部分失神經(jīng)電位表現(xiàn)；E組的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度及波幅略高于C、D組，但明顯高于B組(P＜0.01)。
表2 術(shù)后12周神經(jīng)電生理檢測(cè)(n＝6，x±s)

五、完整的取下雙側(cè)的腓腸肌，ER-182A電子天平(1/2000g)測(cè)量其濕重，計(jì)算腓腸肌濕重恢復(fù)率。觀其表3結(jié)果可見(jiàn)C、D、E組腓腸肌濕重恢復(fù)率好于A組和B組。其中E組指標(biāo)最佳。
表3 術(shù)后12周腓腸肌濕重恢復(fù)率(％)(n＝6，x±s)

六、組織學(xué)檢查1、光學(xué)顯微鏡觀察HE縱切片染色顯示，C、D組與E組橋接處神經(jīng)結(jié)構(gòu)連續(xù)性良好，再生神經(jīng)全部長(zhǎng)入遠(yuǎn)端，再生神經(jīng)纖維排列整齊，周圍可見(jiàn)大量新生血管，未見(jiàn)有變性壞死及瘢痕化等情況。B組橋接處神經(jīng)結(jié)構(gòu)連續(xù)性不良，僅有少量神經(jīng)纖維通過(guò)，長(zhǎng)入遠(yuǎn)端，再生神經(jīng)纖維排列紊亂，新生血管較少。
HE橫切片染色顯示，C、D組與E組均可見(jiàn)大量的再生神經(jīng)纖維，排列緊密。而B(niǎo)組再生神經(jīng)纖維數(shù)量較少，排列疏松。而且再生神經(jīng)纖維的直徑較細(xì)小。
S-100免疫組織化學(xué)染色顯示，C、D與E組可見(jiàn)S-100免疫反應(yīng)陽(yáng)性的雪旺氏細(xì)胞沿神經(jīng)纖維分布成條帶狀。而B(niǎo)組S-100免疫反應(yīng)陽(yáng)性的雪旺氏細(xì)胞數(shù)量較少，且未呈明顯的條帶狀分布。
2、透射電鏡觀察E組再生神經(jīng)纖維軸突形態(tài)接近正常，大量有髓和無(wú)髓神經(jīng)纖維，形狀比較規(guī)則，有髓纖維髓鞘厚度較正常薄。而B(niǎo)組的再生神經(jīng)纖維細(xì)小，形狀不規(guī)則，各條神經(jīng)纖維大小不一，排列疏松，髓鞘厚度較薄，軸突結(jié)構(gòu)不完整。
3、再生神經(jīng)纖維圖像分析圖像分析結(jié)果見(jiàn)表4，術(shù)后12周，B、C、D、E組再生有髓纖維密度均高于正常組(P＜0.01)；同時(shí)比較B、C、D、E組，有髓神經(jīng)纖維密度、神經(jīng)纖維有效面積、有髓神經(jīng)纖維數(shù)量、直徑及髓鞘厚度等指標(biāo)上C、D、E組均優(yōu)于B組(P＜0.05或P＜0.01)。其中以E組最為明顯。
表4 術(shù)后12周再生神經(jīng)形態(tài)圖像分析結(jié)果(n＝6，x±s)

具體實(shí)施方式
一、(1)將透明質(zhì)酸鈉干粉加入去離子水，配成0.1％的透明質(zhì)酸鈉溶液，通過(guò)0.22μm醋酸纖維素膜進(jìn)行除菌過(guò)濾，收集除菌濾液，加入4倍量的無(wú)菌丙酮液，收集沉淀，真空干燥后得到無(wú)菌透明質(zhì)酸鈉精制干粉(A)；(2)取6mg透明質(zhì)酸鈉精制干粉(A)，溶于1ml生理平衡液(B)[77％ DMEM(GIBCO公司)，20％FBS(SIGMA公司)]，2％Glutamine(SIGMA公司)和1％青鏈霉素(大連美羅)，氫氧化鈉液調(diào)節(jié)其PH值為7.0～7.4，加入適量(C)[神經(jīng)生長(zhǎng)因子(20ng/μl)]，使其濃度達(dá)到5％，充分?jǐn)嚢枧渲瞥赏该髻|(zhì)酸鈉凝膠。1～10℃冷藏備用。
手術(shù)前將冷藏備用的透明質(zhì)酸鈉凝膠取出室溫放置，術(shù)中將神經(jīng)缺損處兩側(cè)斷端修整后應(yīng)用導(dǎo)管行端-端外膜縫合，再用一次性無(wú)菌注射器(套接特制大孔徑針頭)吸取適量透明質(zhì)酸鈉凝膠由導(dǎo)管一側(cè)或穿刺導(dǎo)管注入，使其導(dǎo)管充分充盈，從而形成了一個(gè)以導(dǎo)管為外壁，透明質(zhì)酸鈉凝膠為內(nèi)容物，富含促神經(jīng)修復(fù)與再生的因子的有利微環(huán)境。同時(shí)，因?yàn)橥该髻|(zhì)酸鈉凝膠的物理性狀，對(duì)管壁也起到了有力的支持作用。
二、(1)將透明質(zhì)酸鈉干粉加入去離子水，配成0.1％的透明質(zhì)酸鈉溶液，通過(guò)0.22μm醋酸纖維素膜進(jìn)行除菌過(guò)濾，收集除菌濾液，加入4倍量的無(wú)菌丙酮液，收集沉淀，真空干燥后得到無(wú)菌透明質(zhì)酸鈉精制干粉(A)；(2)取6mg透明質(zhì)酸鈉精制干粉(A)，溶于1ml生理平衡液(B)[77％DMEM(GIBCO公司)，20％FBS(SIGMA公司)]，2％Glutamine(SIGMA公司)和1％青鏈霉素(大連美羅)，氫氧化鈉液調(diào)節(jié)其PH值為7.0～7.4，加入適量(C)[睫狀神經(jīng)生長(zhǎng)因子(60ng/μl)]，使其濃度達(dá)到5％，充分?jǐn)嚢枧渲瞥赏该髻|(zhì)酸鈉凝膠。1～10℃冷藏備用。
手術(shù)前將冷藏備用的透明質(zhì)酸鈉凝膠取出室溫放置，術(shù)中將神經(jīng)缺損處兩側(cè)斷端修整后應(yīng)用導(dǎo)管行端-端外膜縫合，再用一次性無(wú)菌注射器(套接特制大孔徑針頭)吸取適量透明質(zhì)酸鈉凝膠由導(dǎo)管一側(cè)或穿刺導(dǎo)管注入，使其導(dǎo)管充分充盈。
三、(1)將透明質(zhì)酸鈉干粉加入去離子水，配成0.1％的透明質(zhì)酸鈉溶液，通過(guò)0.22μm醋酸纖維素膜進(jìn)行除菌過(guò)濾，收集除菌濾液，加入4倍量的無(wú)菌丙酮液，收集沉淀，真空干燥后得到無(wú)菌透明質(zhì)酸鈉精制干粉(A)；(2)取6mg透明質(zhì)酸鈉精制干粉(A)，溶于1ml生理平衡液(B)[77％ DMEM(GIBCO公司)，20％FBS(SIGMA公司)]，2％Glutamine(SIGMA公司)和1％青鏈霉素(大連美羅)，氫氧化鈉液調(diào)節(jié)其PH值為7.0～7.4，加入適量(C)[睫狀神經(jīng)生長(zhǎng)因子(60ng/μl)]，使其濃度達(dá)到5％，充分?jǐn)嚢枧渲瞥赏该髻|(zhì)酸鈉凝膠。1～10℃冷藏備用。
將所取肌肉標(biāo)本(1cm×1cm×1cm左右或更大)用高糖無(wú)血清無(wú)雙抗DMEM液(GIBCO公司)沖洗2次，洗去血液及脂肪等，剔除筋膜，剪成1mm3的碎片(肉泥)加入混合酶(SIGMA公司)(1g/1.5ml)后用吸管吹打5min后在37℃(孵箱中即可)條件下消化45min，每15min用吸管吹打1次。45分鐘后，肌肉組織應(yīng)呈糊狀，目視無(wú)明顯雜質(zhì)，此時(shí)即可加入培養(yǎng)液(82％DMEM(GIBCO公司)，15％FBS(SIGMA公司)，2％Glutamine(SIGMA公司)和1％青鏈霉素(大連美羅)終止消化，培養(yǎng)液量為加入混合酶的2～3倍。經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾后，用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，每分鐘1000轉(zhuǎn)離心5min，棄上清，加入培養(yǎng)液重懸細(xì)胞后，接種于25cm2培養(yǎng)瓶(CORNING公司)中并標(biāo)記為P1。放入37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)，2小時(shí)后將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基以及懸浮的細(xì)胞一起轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶中(P2)。24h后取出P2的上清液移置到離心管中，以每分鐘1000轉(zhuǎn)的速度離心10分鐘。離心結(jié)束后去除上清，此時(shí)便可得到純度較高的P3。
手術(shù)前將冷藏備用的透明質(zhì)酸鈉凝膠取出室溫放置，并用微量移液器將準(zhǔn)備好的(D)均勻攪拌在透明質(zhì)酸鈉凝膠中。術(shù)中將神經(jīng)缺損處兩側(cè)斷端修整后應(yīng)用導(dǎo)管行端-端外膜縫合，再用一次性無(wú)菌注射器(套接特制大孔徑針頭)吸取適量透明質(zhì)酸鈉凝膠由導(dǎo)管一側(cè)或穿刺導(dǎo)管注入，使其導(dǎo)管充分充盈。從而形成了一個(gè)以導(dǎo)管為外壁，透明質(zhì)酸鈉凝膠為內(nèi)容物，富含促神經(jīng)修復(fù)與再生的細(xì)胞與因子的有利微環(huán)境。對(duì)管壁起到有力支持作用的同時(shí)，將更好的發(fā)揮其療效。
權(quán)利要求
1.一種用于神經(jīng)橋接的導(dǎo)管填充材料，包括有透明質(zhì)酸鈉精制干粉(A)、生理平衡液(B)，其特征在于還含有促神經(jīng)生長(zhǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(C)或促神經(jīng)生長(zhǎng)的各種細(xì)胞(D)組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的用于神經(jīng)橋接的新型導(dǎo)管填充材料，其特征在于所說(shuō)的透明質(zhì)酸鈉精制干粉(A)、生理平衡液(B)、促神經(jīng)生長(zhǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(C)的構(gòu)成是(A)1～10％；(B)80％～99％；(C)1～10％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的用于神經(jīng)橋接的新型導(dǎo)管填充材料，其特征在于所說(shuō)的透明質(zhì)酸鈉精制干粉(A)、生理平衡液(B)、促神經(jīng)生長(zhǎng)的各種細(xì)胞(D)的構(gòu)成可以是(A)1～10％；(B)80％～99％；(D)微量。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的用于神經(jīng)橋接的導(dǎo)管填充材料，其特征在于所說(shuō)的透明質(zhì)酸鈉精制干粉(A)、生理平衡液(B)、促神經(jīng)生長(zhǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(C)、促神經(jīng)生長(zhǎng)的各種細(xì)胞(D)的構(gòu)成可以是(A)1～10％；(B)80％～99％；(C)1～10％；(D)微量。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所說(shuō)的用于神經(jīng)橋接的導(dǎo)管填充材料，其特征在于，所說(shuō)的促神經(jīng)生長(zhǎng)因子(C)可以是成纖維生長(zhǎng)因子、睫狀神經(jīng)生長(zhǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的一種或多種。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所說(shuō)的用于神經(jīng)橋接的導(dǎo)管填充材料，其特征在于，所說(shuō)的促神經(jīng)生長(zhǎng)的細(xì)胞(D)可以是雪旺氏細(xì)胞、肌肉干細(xì)胞、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的一種或多種。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所說(shuō)的用于神經(jīng)橋接的導(dǎo)管填充材料，其特征在于所說(shuō)的促神經(jīng)生長(zhǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(C)可以是神經(jīng)生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子、酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、堿性成肌細(xì)胞生長(zhǎng)因子、睫狀神經(jīng)生長(zhǎng)因子、膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子的一種或多種；所說(shuō)的促神經(jīng)生長(zhǎng)細(xì)胞(D)可以是雪旺氏細(xì)胞、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、肌肉干細(xì)胞的一種或多種。
8.一種如權(quán)利要求1或2所說(shuō)的用于神經(jīng)橋接的導(dǎo)管填充材料的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)將透明質(zhì)酸鈉干粉加入去離子水，配成0.01～0.2％的透明質(zhì)酸鈉溶液，通過(guò)0.22μm醋酸纖維素膜進(jìn)行除菌過(guò)濾，收集除菌濾液，加入1-5倍量的無(wú)菌丙酮或乙醇溶液，收集沉淀，真空干燥后得到無(wú)菌透明質(zhì)酸鈉精制干粉(A)；(2)取1～10％透明質(zhì)酸鈉精制干粉(A)，溶于90％～99％生理平衡液(B)，調(diào)節(jié)其PH值為7.0-7.4，充分?jǐn)嚢枧渲瞥?～10mg/ml濃度的透明質(zhì)酸鈉凝膠，靜止脫泡，1-10℃冷藏備用；(3)加入微量促神經(jīng)生長(zhǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(C)制備成用于神經(jīng)橋接的導(dǎo)管填充材料。
9.一種如權(quán)利要求1或3所說(shuō)的用于神經(jīng)橋接的導(dǎo)管填充材料的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)將透明質(zhì)酸鈉干粉加入去離子水，配成0.01～0.2％的透明質(zhì)酸鈉溶液，通過(guò)0.22μm醋酸纖維素膜進(jìn)行除菌過(guò)濾，收集除菌濾液，加入1-5倍量的無(wú)菌丙酮或乙醇溶液，收集沉淀，真空干燥后得到無(wú)菌透明質(zhì)酸鈉精制干粉(A)；(2)取1～10％透明質(zhì)酸鈉精制干粉(A)，溶于90％～99％生理平衡液(B)，調(diào)節(jié)其PH值為7.0-7.4，充分?jǐn)嚢枧渲瞥?～10mg/ml濃度的透明質(zhì)酸鈉凝膠，靜止脫泡，1-10℃冷藏備用；(3)加入微量促神經(jīng)生長(zhǎng)的細(xì)胞(D)制備成用于神經(jīng)橋接的導(dǎo)管填充材料。
10.一種如權(quán)利要求1或4所說(shuō)的用于神經(jīng)橋接的導(dǎo)管填充材料的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)將透明質(zhì)酸鈉干粉加入去離子水，配成0.01～0.2％的透明質(zhì)酸鈉溶液，通過(guò)0.22μm醋酸纖維素膜進(jìn)行除菌過(guò)濾，收集除菌濾液，加入1-5倍量的無(wú)菌丙酮或乙醇溶液，收集沉淀，真空干燥后得到無(wú)菌透明質(zhì)酸鈉精制干粉(A)；(2)取1～10％透明質(zhì)酸鈉精制干粉(A)，溶于90％～99％生理平衡液(B)，調(diào)節(jié)其PH值為7.0-7.4，充分?jǐn)嚢枧渲瞥?～10mg/ml濃度的透明質(zhì)酸鈉凝膠，靜止脫泡，1-10℃冷藏備用；(3)加入微量促神經(jīng)生長(zhǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(C)和促神經(jīng)生長(zhǎng)的細(xì)胞(D)制備成用于神經(jīng)橋接的導(dǎo)管填充材料。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種用于神經(jīng)橋接的導(dǎo)管填充材料及其制備方法。該材料是由過(guò)濾法提純的高純度透明質(zhì)酸鈉與生理平衡液按一定比例配制而成凝膠狀導(dǎo)管填充材料，生物相容性好，親/疏水平衡性可調(diào)，在人體可吸收降解，無(wú)毒無(wú)害，價(jià)格低廉，適用于作為神經(jīng)橋接的導(dǎo)管填充材料，在凝膠中加入促神經(jīng)修復(fù)與再生的細(xì)胞或因子即可營(yíng)造出有利的微環(huán)境，能有效避免神經(jīng)橋接后導(dǎo)管塌陷的副作用。在作為加入導(dǎo)管中的各種促神經(jīng)修復(fù)與再生物質(zhì)的載體時(shí)還能發(fā)揮生物控釋或細(xì)胞外基質(zhì)載體的作用。
文檔編號(hào)A61L31/00GK1872354SQ20061006643
公開(kāi)日2006年12月6日 申請(qǐng)日期2006年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月31日
發(fā)明者王偉, 范明, 徐艷, 孫亮, 劉淑紅 申請(qǐng)人:錦州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院, 王偉