專利名稱：海南狗牙花吲哚類生物堿及其在制備戒毒藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及天然藥物化學(xué)及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及從海南狗牙花(Ervatamiahainanensis Tsiang)中提取分離新的海南狗牙花吲哚類生物堿，以及包括該新生物堿在內(nèi)的海南狗牙花吲哚類生物堿在在制備防治阿片類物質(zhì)依賴性藥物或鎮(zhèn)痛藥或食品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
海南狗牙花(Ervatamia hainanensis Tsiang)為夾竹桃科狗牙花屬植物，又稱單根木、獨根木、山辣椒樹、艾角青、雞爪花等，分布于海南、廣東、廣西、云南等地。有清熱解毒、降壓、消腫止痛之功效，用于高血壓病、咽喉腫痛、風(fēng)濕痹痛等疾病的治療。海南狗牙花的化學(xué)成分研究較少，馮孝章等[Xiao-Zhang Feng，Christiane Kan，et al.Monomeric indole alkaloids fromErvatamia hainanensis.Planta Med.1982，44212-214.Xiao-Zhang Feng，Gui Liu，Christiane，et al.New dimeric indole alkaloids from Ervatamiahainanensis.Journal of Natural Products 1989，52(5)928-933]上世紀(jì)八十年代從中分得13個吲哚類生物堿冠狗牙花定堿(coronaridine)，冠狗牙花定堿羥基偽吲哚(coronaridine hydroxyindolenine)，3-氧代-冠狗牙花定堿(3-oxo-coronaridine)，3-(β羥基乙基)-冠狗牙花定堿(3-(β-hydroxyethyl)coronaridine)，海南狗牙花胺A、B(ervahaimine A，B)，海南狗牙花米定堿(ervahainamidine)，海南狗牙花堿A、B、C(ervahanine A，B，C)，海尼山辣椒堿(heyneanine)，10-羥基海尼山辣椒堿(10-hydroxyheyneanine)，派立文堿(perivine)。至今未見對上述化合物進(jìn)行防治阿片類物質(zhì)精神依賴性和身體依賴性及鎮(zhèn)痛作用研究的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于從天然產(chǎn)物中尋找安全有效的用于制備防治阿片類物質(zhì)依賴性藥物或食品的天然產(chǎn)物，經(jīng)過不斷努力，終于從海南狗牙花中提取分離到了二種新的海南狗牙花吲哚類生物堿，EHA053-(2-羰丙基)-依波加明(3-(2-oxopropyl)ibogamine)和EHA063-(2-羰丙基)-依波加明羥基偽吲哚(3-(2-oxopropyl)ibogamine hydroxyindolenine)；同時，本發(fā)明人提取分離到了足夠量的其它已知的海南狗牙花吲哚類生物堿，發(fā)現(xiàn)海南狗牙花吲哚類生物堿和其鹽類可用于制備防治阿片類物質(zhì)依賴性藥物或食品或制備鎮(zhèn)痛藥物，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案完成的，從海南狗牙花的根和莖中提取了吲哚類生物堿組分，并從組分中分離到9個生物堿單體EHA01老刺木堿(vobasine)[C.J.Pace，S.D.Glick，I.M.Maisonneuve，et al.Novel ibogaalkaloid congeners block nicotinic receptors and reduce drugself-administration.European Journal of Pharmacology2004，492，159-167]；EHA02冠狗牙花堿(coronaridine)[喻陽，劉吉開。二杈狗牙花的化學(xué)成分。云南植物研究，1999，21(2)260-264]；EHA033-羥基冠狗牙花堿(3-hydroxyl coronaridine)[C.Thal，M.Dufour，P.Potier.Rearrangementof vobasine to ervatamine-type alkaloids catalyzed by microsomes.J.Am.Chem.Soc，1981，103，4956-4957]；EHA043-(2-羰丙基)-冠狗牙花堿(3-(2-oxopropyl)coronaridine)[C.Thal，M.Dufour，P.Potier.Rearrangement of vobasine to ervatamine-type alkaloids catalyzed bymicrosomes.J.Am.Chem.Soc，1981，103，4956-4957]；EHA0710-甲氧基冠狗牙花堿(voacangine)[黃麗瑛，周韻麗，李朝明等，二杈狗牙花中生物堿的研究。中草藥，1997，28(8)451-454]；EHA0819-海尼山辣椒堿(19-heyneanine)[Toh-Seok Kam，G.Subramaniam，Wei Chen.Kopsiadasyrachis.Phytochemistry，1999(51)，159-169]；EHA0919-表-海尼山辣椒堿(19-epi-heyneanine)[Toh-Seok Kam，G.Subramaniam，Wei Chen.Kopsia dasyrachis.Phytochemistry，1999(51)，159-169]。
我們還獲得了兩個新生物堿EHA053-(2-羰丙基)-依波加明(3-(2-oxopropyl)ibogamine)，波譜鑒定數(shù)據(jù)[電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)給出分子量336(M+1 337)，分子式C22H28N2O。核磁共振氫譜(1HNMR)(CD3OD，δ)3.77(2H，br，3-H)，3.11(1H，m，5-H)，3.56(1H，m，5-H)，2.79(1H，m，6-H)，3.48(1H，m，6-H)，7.53(1H，d，J＝7.7Hz，9-H)，7.1 2(1H，t，J＝7.5Hz，10-H)，7.18(1H，t，J＝7.2Hz，11-H)，7.39(1H，d，J＝8.0Hz，12-H)，1.80(1H，m，14-H)，1.49(1H，m，15-H)，1.78(1H，m，15-H)，1.63(1H，m，16-H)，1.81(1H，m，1 7-H)，2.32(1H，m，17-H)，1.09(3H，t，J＝7.5Hz，18-H)，1.65(1H，m，19-H)，1.77(1H，m，19-H)，3.16(1H，m，20-H)，2.98(1H，br s，21-H)，2.74(1H，dd，J＝16.0，8.0 Hz，24-Ha)，2.94(1H，dd，J＝16.0，4.5Hz，24-Hb)，2.33(3H，s，26-H)；核磁共振碳譜(13CNMR)(CDCl3，δ)143.48(C-2)，55.20(C-3)，53.87(C-5)，22.08(C-6)，108.97(C-7)，131.26(C-8)，118.77(C-9)，119.58(C-10)，121.67(C-11)，111.42(C-12)，136.95(C-13)，31.71(C-14)，28.19(C-15)，42.34(C-16)，37.62(C-17)，12.60(C-18)，28.81(C-19)，43.12(C-20)，60.69(C-21)，48.60(C-24)，212.52(C-25)，31.77(C-26)，]。
另一個新生物堿EHA063-(2-羰丙基)-依波加明羥基偽吲哚(3-(2-oxopropyl)ibogamine hydroxyindolenine)，波譜鑒定數(shù)據(jù)[電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)給出分子量352(M+1 353)，分子式C22H28N2O2。核磁共振氫譜(1HNMR)(CD3OD，δ)3.26(2H，br，d，J＝11.5Hz，3-H)，2.47(1H，dd，J＝16.8，4.2Hz，5-H)，2.75(1H，ddd，J＝16.8，12.4，6.4 5-H)，2.06(1H，m，6-H)，7.49(1H，m，9-H)，7.54(1H，m，10-H)，7.51(1H，m，11-H)，7.40(1H，m，12-H)，1.59(1H，m，14-H)，1.49(1H，m，15-H)，1.78(1H，m，15-H)，3.81(1H，br d，J＝14.7Hz，16-H)，2.31(1H，m，17-H)，2.36(1H，m，17-H)，1.12(3H，t，J＝7.3Hz，18-H)，1.65(1H，m，19-H)，1.77(1H，m，19-H)，1.67(1H，m，20-H)，3.89(1H，br s，21-H)，2.88(1H，dd，J＝16.8，4.2Hz，24-Ha)，3.46(1H，m，24-Hb)，2.29(3H，s，26-H)；核磁共振碳譜(13CNMR)(CD3OD，δ)196.23(C-2)，54.04(C-3)，48.09(C-5)，33.71(C-6)，88.53(C-7)，144.07(C-8)，122.97(C-9)，120.57(C-10)，130.51(C-11)，127.74(C-12)，153.02(C-13)，32.75(C-14)，28.58(C-15)，44.70(C-16)，36.30(C-17)，12.44(C-18)，28.48(C-19)，41.59(C-20)，55.54(C-21)，48.05(C-24)，212.00(C-25)，31.06(C-26)]。
9個生物堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下
EHA02R1＝H；R2＝COOCH3EHA03R1＝OH；R2＝COOCH3EHA04R1＝CH2COCH3；R2＝COOCH3EHA05R1＝CH2COCH3；R2＝H EHA08R3＝OH， R4＝HEHA09R3＝H， R4＝OH我們進(jìn)行了相關(guān)的醫(yī)藥用途的研究，采用小鼠鹽酸嗎啡條件性位置偏愛精神依賴模型；鹽酸嗎啡及鹽酸納洛酮劑量遞增身體依賴模型試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)海南狗牙花(Ervatamia hainanensis Tsiang)中吲哚類生物堿(total Ervatamiahainanensis alkaloids簡稱tEHA)具有防治阿片類物質(zhì)精神依賴性和身體依賴性及鎮(zhèn)痛作用，因此，可將海南狗牙花中吲哚類生物堿(tEHA)用于制備防治阿片類物質(zhì)依賴性藥物或食品的用途。
具體實施例方式下面通過實施例以海南狗牙花吲哚生物堿(Ervatamia hainanensisalkaloids簡稱tEHA)的藥理活性試驗及結(jié)果來說明本發(fā)明。
實施例1 醇提取法制備海南狗牙花總生物堿海南狗牙花干燥根莖12kg，粉碎后用8倍量(W/W)95％乙醇加熱回流提取三次，減壓濃縮提取液至無乙醇，得醇提取物。提取物用以2％鹽酸2000ml溶解后，濾去酸水不溶物。酸水液用濃氨水調(diào)至pH 8～10，即產(chǎn)生沉淀，加入氯仿500ml萃取三次，合并萃取液后減壓除去氯仿，即得純化的海南狗牙花總堿(Ervatamia hainanensis alkaloids簡稱tEHA)。
實施例2 硅膠柱色譜法制備海南狗牙花生物堿單體海南狗牙花總堿15g，硅膠柱色譜分離(φ6*80cm，450g)，氯仿-甲醇(100∶1，50∶1，25∶1，10∶1，8∶1，5∶1)梯度洗脫，每1000ml收集，共分為1-24份。減壓回收溶劑后，自第4，6，9和12份中可得到化合物EHA-02，04，05和07的結(jié)晶.第7份(2.5g)再次硅膠柱色譜分離(φ4*40cm，75g)，石油醚-乙酸乙酯(20∶1，10∶1，5∶1)梯度洗脫后可得到化合物EHA-01，03和06。第14份(1.5g)再次硅膠柱色譜分離(φ2*40cm，35g)，石油醚-乙酸乙酯(5∶1，3∶1，1∶1)梯度洗脫后可得到化合物EHA-08和09。
實施例3 對鹽酸嗎啡精神依賴性的影響及其本身的精神依賴性實驗3.1材料與方法3.1.1動物雄性Sprague-Dawley大鼠160～200g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。雄性昆明株小鼠(清潔級)18～22g，復(fù)旦大學(xué)實驗動物科學(xué)部提供。動物飼養(yǎng)于自然光照的動物房，自由進(jìn)食和飲水。
3.1.2藥品與試劑鹽酸嗎啡(Morphine Hydrochloride，簡稱嗎啡，表中代號Mor)用pH 3.5～4的生理鹽水配成應(yīng)用液。
海南狗牙花生物堿(Ervatamia hainanensis alkaloids簡稱tEHA)用pH3.5～4.0的生理鹽水配成應(yīng)用液。
氫化可的松用生理鹽水配成應(yīng)用液。
3.2.給藥方法3.2.1鹽酸嗎啡的給藥方法上午皮下注射鹽酸嗎啡4.0mg·kg-1后放入白箱(伴藥箱)；下午皮下注射生理鹽水10ml·kg-1后放入黑箱(非伴藥箱)。每次在箱內(nèi)停留50分鐘，連續(xù)5天。
3.2.2給藥方法小鼠隨機分組，即生理鹽水組、單獨鹽酸嗎啡4.0mg·kg-1組、鹽酸嗎啡+tEHA10mg·kg-1組，于每次皮下注射鹽酸嗎啡后，立即腹腔內(nèi)注射tEHA，連續(xù)5天。
3.3.實驗方法3.3.1嗎啡精神依賴模型，用小鼠條件性位置偏愛試驗[萬興旺，黃矛，李萬亥.N-硝基-L-精氨酸對小鼠嗎啡和二氫埃托啡精神依賴性的抑制作用.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報1999；20(2)105-107]條件性位置偏愛箱 本實驗采用的條件位置偏愛穿梭箱采用“直線”型兩箱設(shè)計，材料為黑色有機玻璃，壁厚1cm。左右兩箱一黑一白，黑白兩個箱子的內(nèi)徑為15cm×15cm×35cm，穿梭門大小為5cm×5cm，，箱底上方5cm處分別安置有光滑、粗糙的鐵絲網(wǎng)各一塊；黑灰、白灰兩箱中間有穿梭門各一個，為可抽動的擋板。觀察箱具有隔光、隔音的效果，聲強衰減為20-25dB。在每個箱子的頂部，安裝有白光照明燈和紅外LED，并有通風(fēng)通道和小風(fēng)扇；黑、白箱均裝有1個微攝像頭，并有DC 12V電源線和A/V視頻線的接頭；箱底部墊有一塊墊板，可有效防止光線的反射，使成像清晰。
選擇實驗動物 選用雄性小鼠。打開兩室閘門，將小鼠放于中間閘門下，同時進(jìn)行視頻采集，采樣速度用15幀/秒。并允許探索黑白箱共2min，然后記錄小鼠15min內(nèi)在黑箱和白箱中的停留時間。連續(xù)試驗3d，選擇明顯偏愛黑箱的小鼠為實驗用小鼠。
訓(xùn)練動物 將實驗用小鼠按在黑箱(非伴藥箱)的停留時間以隨機數(shù)字表隨機分組。上午皮下注射鹽酸嗎啡4mg·kg-1后放入白箱(伴藥箱)，下午皮下注射生理鹽水后放入黑箱(非伴藥箱)。每次在箱內(nèi)停留50min，連續(xù)7d。小鼠經(jīng)鹽酸嗎啡訓(xùn)練將會改變其天然的偏愛，由偏愛黑箱轉(zhuǎn)為偏愛白箱。
觀察動物 完成訓(xùn)練的小鼠于第8天不給任何藥物，將其單只放于穿梭箱內(nèi)，打開兩室門，允許探索黑白箱2min，之后觀察小鼠15min內(nèi)在偏愛側(cè)(黑箱)的停留時間。
3.3.2小鼠嗎啡復(fù)吸模型利用上述條件性位置偏愛箱和方法，每天皮下注射鹽酸嗎啡4mg·kg-1，訓(xùn)練小鼠7天。第8天停給鹽酸嗎啡，用上述方法觀察小鼠在偏愛側(cè)(黑箱)的停留時間，可見小鼠明顯偏愛白箱(拌藥箱)。之后每隔1天觀察一次，直到停給鹽酸嗎啡的第7天觀察到位置偏愛效應(yīng)退去。然后再隔4天，于停給嗎啡的第11天對小鼠進(jìn)行足底電擊(foot shock)或皮下注射氫化可的松20mg·kg-1后，馬上放入條件性位置偏愛箱內(nèi)進(jìn)行觀察。
電擊的方法用有蓋的尺寸為L 35cm×H 28cm×W 23cm的箱子，將小鼠置于箱底的不銹鋼柵(0.5cm間隔)，通過傳送直流電流電擊足部，受到電擊的小鼠發(fā)出吱吱叫聲或蹦跳。直流電流由CH-2型高壓恒流電刺激器輸出，恒定電壓為36V，起始直流電流為0.1mA，每10分鐘增加0.1mA，共電擊30分鐘。
3.3.3小鼠復(fù)吸模型及tEHA對嗎啡小鼠位置偏愛重現(xiàn)的阻斷作用3.4數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)處理給藥組與生理鹽水對照組間或不同給藥組間比較采用Student t-test。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。
3.5實驗結(jié)果3.5.1 tEHA和EHA單體對鹽酸嗎啡條件性位置偏愛的影響及tEHA本身的精神依賴性3.5.1.1給予tEHA對小鼠鹽酸嗎啡條件性位置偏愛的影響及tEHA本身的精神依賴性單純tEHA 10mg·kg-1組小鼠給藥前后在白箱中的停留時間無差異。tEHA5mg·kg-1、tEHA 10mg·kg-1以及TEHA 20mg·kg-1組小鼠給藥前后在白箱中的停留時間無差異。結(jié)果見表1。
表1.tEHA對小鼠鹽酸嗎啡條件性位置偏愛的影響及tEHA本身的精神依賴性。x±s.**P＜0.01，與給藥前比較；##P＜0.01，與生理鹽水組比較。

Mor為鹽酸嗎啡；括號內(nèi)代號為給藥途徑，sc為皮下注射，ip為腹腔內(nèi)注射。
3.5.1.2單次腹腔內(nèi)注射給予5個EHA單體對小鼠鹽酸嗎啡條件性位置偏愛的影響分別單次腹腔內(nèi)注射給予5個EHA單體EHA-03、EHA-04、EHA-05、EHA-06或EHA-07以20mg·kg-1組小鼠，給藥后顯著增加小鼠在白箱中的停留時間，即嗎啡誘導(dǎo)的條件性位置偏愛被海南狗牙花生物堿所反轉(zhuǎn)。結(jié)果見表2。
表2.單次給予5個EHA單體對小鼠鹽酸嗎啡條件性位置偏愛的影響。
每組小鼠數(shù)＝8，x±s。與給藥前比較，aP＞0.05，bP＜0.05，cP＜0.01。與鹽酸嗎啡組比較，dP＞0.05，eP＜0.05，fP＜0.01。

3.5.1.3連續(xù)腹腔內(nèi)注射給予5個單體EHA-03、EHA-04、EHA-05、EHA-06和EHA-07對嗎啡誘導(dǎo)的小鼠位置偏愛的形成的影響分別連續(xù)腹腔內(nèi)注射較小劑量的EHA-03、EHA-04、EHA-05、EHA-06和EHA-07各5mg·kg-1，可顯著抑制嗎啡誘導(dǎo)的小鼠位置偏愛的形成。結(jié)果見表3。
表3.連續(xù)腹腔內(nèi)注射給予單體EHA-03、EHA-04、EHA-05、EHA-0和EHA-07對嗎啡誘導(dǎo)的小鼠位置偏愛的形成的影響。每組小鼠數(shù)＝8，x±s。與給藥前比較，aP＞0.05，bP＜0.05，cP＜0.01。與鹽酸嗎啡組比較dP＞0.05，eP＜0.05，fP＜0.01。

3.5.2 tEHA對嗎啡“復(fù)吸”的阻斷作用3.5.2.1嗎啡依賴小鼠條件性位置偏愛效應(yīng)的消退在7天嗎啡訓(xùn)練期結(jié)束后的1～3天，小鼠保持同樣強度的條件性位置偏愛效應(yīng)；第5天條件性位置偏愛效應(yīng)開始減弱，第7天基本消退，結(jié)果見表4。因而選擇訓(xùn)練結(jié)束后第11天的小鼠誘發(fā)條件性位置偏愛效應(yīng)重現(xiàn)。
表4.同組小鼠嗎啡訓(xùn)練期結(jié)束后在不同時間的位置偏愛反應(yīng)。
每組小鼠數(shù)＝9只，x±s.與給嗎啡前比較，aP＞0.05，bP＜0.05，cP＜0.01；與生理鹽水組比較，dP＞0.05，eP＜0.05，fP＜0.01。

3.5.2.2 tEHA對足底電擊誘發(fā)小鼠消退的位置偏愛重現(xiàn)的阻斷作用在嗎啡訓(xùn)練結(jié)束的第11天，對位置偏愛已經(jīng)消退的小鼠，足底電擊可使已經(jīng)消退的4mg·kg-1鹽酸嗎啡引起的位置偏愛效應(yīng)再現(xiàn)，而生理鹽水對其位置選擇沒有改變。表明單次給予tEHA 40mg·kg-1可阻斷這種位置偏愛重現(xiàn)，即可阻斷鹽酸嗎啡引起的精神依賴性。結(jié)果見表5。
表5.單次tEHA對小鼠足底電擊誘發(fā)消退的位置偏愛重現(xiàn)的阻斷作用。每組小鼠數(shù)＝9只，x±s。與足底電擊前比較，aP＞0.05，bP＜0.05，cP＜0.01；與足底電擊后比較，dP＞0.05，eP＜0.05，fP＜0.01；與生理鹽水組比較gP＞0.05，hP＜0.05，iP＜0.01。

*tEHA 40為單次腹腔內(nèi)注射海南狗牙花總生物堿鹽酸鹽40mg·kg-1。
3.5.2.3單次給予tEHA對氫化可的松誘發(fā)小鼠消退的位置偏愛重現(xiàn)的阻斷作用在嗎啡訓(xùn)練結(jié)束的第11天，對位置偏愛已經(jīng)消退的小鼠，皮下注射氫化可的松20mg·kg-1，可使已經(jīng)消退的4mg·kg-1鹽酸嗎啡引起的位置偏愛效應(yīng)再現(xiàn)，而生理鹽水對其位置選擇沒有改變。單次給予tEHA 40mg·kg-1可阻斷這種位置偏愛重現(xiàn)，再次證明tEHA可阻斷鹽酸嗎啡引起的精神依賴性。結(jié)果見表6。
表6.單次給予tEHA對氫化可的松(皮下注射，20mg·kg-1)誘發(fā)小鼠消退的位置偏愛重現(xiàn)的阻斷作用。每組小鼠數(shù)＝8只，x±s。與氫化可的松激發(fā)前比較，aP＞0.05，bP＜0.05，cP＜0.01；與氫化可的松激發(fā)后比較，dP＞0.05，eP＜0.05，fP＜0.01；與生理鹽水組比較，gP＞0.05，hP＜0.05，iP＜0.01。

*tEHA40為單次腹腔內(nèi)注射海南狗牙花總生物堿鹽酸鹽40mg·kg-1。
實施例4 tEHA的鎮(zhèn)痛作用及對鹽酸嗎啡鎮(zhèn)痛作用的影響4.1材料與方法4.1.1實驗動物雌性昆明株小鼠(清潔級)18～22g，上海復(fù)旦大學(xué)實驗動物科學(xué)部提供，飼養(yǎng)于自然光照動物房；房間溫度20～25℃，日溫差小于3℃；任意進(jìn)食和飲水。
4.1.2試劑及其配制鹽酸嗎啡(Morphine Hydrochloride簡稱嗎啡，表中代號Mor)青海制藥廠產(chǎn)品，用pH 3.5～4的生理鹽水配成應(yīng)用液。
鹽酸納洛酮(Naloxone Hydrochloride，簡稱納洛酮，表中代號NLX)北京四環(huán)制藥廠，用pH 3.5～4的生理鹽水配成應(yīng)用液。
海南狗牙花總生物堿(total Ervatamia hainanensis alkaloids，簡稱tEHA)的鹽酸鹽，用pH 3.5～4的生理鹽水配成應(yīng)用液。
氫化可的松上海信誼藥廠，用生理鹽水配成應(yīng)用液。
4.2給藥方法4.2.1嗎啡4.2.2單次給予tEHA的給藥方法小鼠隨機分組，即生理鹽水組、單獨鹽酸嗎啡組、鹽酸嗎啡+tEHA 20mg·kg-1組(記作Mor+tEHA20)、鹽酸嗎啡+tEHA 40mg·kg-1組(記作Mor+tEHA40)和鹽酸嗎啡+tEHA 80mg·kg-1組(記作鹽酸嗎啡+tEHA80)。
4.3實驗方法鎮(zhèn)痛試驗——小鼠熱板(hot-plate)法，按照徐叔云，卞如濂，陳修主編.藥理實驗方法學(xué).第二版.北京人民衛(wèi)生出版社，1991695熱板儀由熱板(紫銅皮材料)置于電熱恒溫水浴鍋中組成。水浴溫度精確到0.1℃，熱板溫度維持在55℃±0.5℃。秒表(金雀牌石英秒表，上海秒表廠)記錄自小鼠足底接觸熱板至出現(xiàn)舔后足的時間(單位s)，即熱板反應(yīng)潛伏期(或稱為痛反應(yīng)時間)作為痛閾指標(biāo)。實驗選用熱板反應(yīng)潛伏期(基礎(chǔ)痛閾)＞15s但＜30s的小鼠。每只小鼠基礎(chǔ)痛閾為該小鼠3次痛反應(yīng)時間的平均值，每次測定痛反應(yīng)時間的間隔大于15min；給藥后小鼠潛伏期＞60s者撤離熱板并以60s計。實驗時室溫維持在23℃～25℃。
4.4數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)處理給藥組與生理鹽水對照組間或不同給藥組間比較采用Student t-test。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。
4.5.實驗結(jié)果4.5.1 tEHA的鎮(zhèn)痛作用tEHA具有鎮(zhèn)痛作用，并隨劑量的增大而增強，與鹽酸嗎啡相比具有緩慢、持久的特點。與鹽酸嗎啡8mg·kg-1相比，可見灌胃tEHA 20mg·kg-1、tEHA 40mg·kg-1和tEHA 80mg·kg-1，以及腹腔內(nèi)注射tEHA 40mg·kg-1，均具有明顯的鎮(zhèn)痛作用，灌胃后的作用產(chǎn)生比腹腔內(nèi)注射后的慢，但作用強度與腹腔內(nèi)注射后的相當(dāng)，表明灌胃給藥后吸收是比較完全的。結(jié)果見表7。
表7.tEHA在小鼠熱板法上的鎮(zhèn)痛作用。每組小鼠數(shù)＝9只，x±s.與生理鹽水組比較，aP＞0.05，bP＜0.05，cP＜0.01；與鹽酸嗎啡組比較，dP＞0.05，eP＜0.05，fP＜0.01。

*Mor為鹽酸嗎啡，tEHA20、tEHA40、tEHA80分別為海南狗牙花總生物堿鹽酸鹽20mg·kg-1、40mg·kg-1或80mg·kg-1；括號內(nèi)代號為給藥途徑，sc為皮下注射，ip為腹腔內(nèi)注射，ig為灌胃。
4.5.2 tEHA對鹽酸嗎啡鎮(zhèn)痛作用的影響與鹽酸嗎啡4mg·kg-1相比，tEHA 40mg·kg-1比鹽酸嗎啡的鎮(zhèn)痛作用明顯。同時給予阿片受體拮抗劑鹽酸納洛酮1mg·kg-1，鹽酸嗎啡的鎮(zhèn)痛作用可被取消。tEHA 40mg·kg-1的鎮(zhèn)痛作用可被腹腔內(nèi)注射4mg·kg-1的鹽酸納洛酮部分地阻斷；當(dāng)同時給予鹽酸嗎啡4mg·kg-1和tEHA 10mg·kg-1、鹽酸嗎啡4mg·kg-1和TEHA 20mg·kg-1時鎮(zhèn)痛作用出現(xiàn)協(xié)同。結(jié)果提示tEHA的鎮(zhèn)痛作用可能部分通過阿片受體來實現(xiàn)。結(jié)果見表8。
表8.小鼠熱板法上tEHA對嗎啡鎮(zhèn)痛作用的影響。每組小鼠數(shù)＝9只，x±s.與生理鹽水組比較，aP＞0.05，bP＜0.05，cP＜0.01；與鹽酸嗎啡組比較，dP＞0.05，eP＜0.05，fP＜0.01。

*Mor為嗎啡，NLX為鹽酸納洛酮，tEHA10、tEHA20、tEHA40分別為海南狗牙花總生物堿鹽酸鹽10mg·kg-1、20mg·kg-1或40mg·kg-1；括號內(nèi)代號為給藥途徑，sc為皮下注射，ip為腹腔內(nèi)注射。
由于阿片類的成癮及其治療，在許多方面與其鎮(zhèn)痛的機制都有密切聯(lián)系。周身肌肉關(guān)節(jié)疼痛是海洛因成癮脫毒后的主要稽延性癥狀之一，也是促使吸毒者復(fù)吸的重要原因之一。因此，非成癮性鎮(zhèn)痛藥在減少復(fù)吸的治療中具有相當(dāng)重要的意義。狗牙花在我國民間就用于風(fēng)濕骨痛、跌打損傷或蛇咬傷。
以上鎮(zhèn)痛實驗結(jié)果表明tEHA具有明顯的鎮(zhèn)痛作用，且呈劑量依賴關(guān)系，并與鹽酸嗎啡有協(xié)同作用；tEHA的這種作用可被阿片受體拮抗劑鹽酸納洛酮部分地阻斷，這表明tEHA的鎮(zhèn)痛作用可能部分通過阿片系統(tǒng)來實現(xiàn)。tEHA的鎮(zhèn)痛作用，對于減輕吸毒病人脫毒后的稽延性癥狀將會有積極的輔助治療作用。
以上實施例3，4的試驗結(jié)果表明在所試驗的劑量范圍內(nèi)，tEHA在不具有身體依賴和精神依賴的同時，能顯著地抑制嗎啡誘導(dǎo)的條件性位置偏愛。tEHA可以阻斷由應(yīng)激刺激(足底電擊)和給予外源性糖皮質(zhì)激素引起的小鼠對嗎啡的“復(fù)吸”行為。tEHA具有明顯的鎮(zhèn)痛作用。灌胃和腹腔內(nèi)注射給予tEHA的藥效試驗提示，tEHA在胃腸道內(nèi)吸收比較完全而迅速，適合口服給藥。從目前積累的研究資料看，tEHA已初步具備作為有效防治海洛因成癮脫毒治療后減少復(fù)吸的藥物的基本條件。因此，本發(fā)明海南狗牙花生物堿組分及其鹽類可用于制備防治阿片類物質(zhì)依賴性藥物或食品或制備鎮(zhèn)痛藥物。
權(quán)利要求
1.兩個新的海南狗牙花吲哚類生物堿，3-(2-羰丙基)-依波加明(3-(2-oxopropyl)ibogamine，EHA05)和3-(2-羰丙基)-依波加明羥基偽吲哚(3-(2-oxopropyl)ibogamine hydroxyindolenine，EHA06)其特征在于該兩個生物堿具有化學(xué)結(jié)構(gòu)式(EHA05)和(EHA06)所示的化學(xué)結(jié)構(gòu) EHA05其中R1＝CH2COCH3R2＝H；EHA06。
2.一種包括權(quán)利要求1中所述兩個新的海南狗牙花吲哚類生物堿，3-(2-羰丙基)-依波加明(3-(2-oxopropyl)ibogamine，EHA05)，3-(2-羰丙基)-依波加明羥基偽吲哚(3-(2-oxopropyl)ibogamine hydroxyindolenine，EHA06)以及還包括老刺木堿(vobasine，EHA01)、冠狗牙花堿(coronaridine，EHA02)、3-羥基冠狗牙花堿(3-hydroxyl coronaridine，EHA03)、3-(2-羰丙基)-冠狗牙花堿(3-(2-oxopropyl)coronaridine，EHA04)、10-甲氧基冠狗牙花堿(voacangine，EHA07)、19-海尼山辣椒堿(19-heyneanine，EHA08)和19-表-海尼山辣椒堿(19-epi-heyneanine，EHA09)在內(nèi)的海南狗牙花吲哚類生物堿及其鹽類在制備防治阿片類物質(zhì)依賴性藥物或鎮(zhèn)痛藥或食品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及天然藥物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，公開了兩種從海南狗牙花(Ervatamia hainanensis Tsiang)中提取分離的新的海南狗牙花吲哚類生物堿，即EHA053－(2－羰丙基)－依波加明(3－(2－oxopropyl)ibogamine)和EHA063－(2－羰丙基)－依波加明羥基偽吲哚(3－(2－oxopropyl)ibogaminehydroxyindolenine)的結(jié)構(gòu)及其提取分離方法；以及包括所述新生物堿EHA05和EHA06在內(nèi)的海南狗牙花制備的吲哚類生物堿和其鹽類在制備防治阿片類物質(zhì)依賴性藥物或食品或鎮(zhèn)痛藥物的用途。
文檔編號A61P25/00GK1915993SQ20061003103
公開日2007年2月21日 申請日期2006年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月12日
發(fā)明者黃矛, 陳海生, 張曉冬, 梁爽, 陳梅玉, 金麗, 鄭杰民, 劉建國, 譚興起 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)