專(zhuān)利名稱(chēng)：胸腺五肽活性異構(gòu)體及其在藥物制備中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬有機(jī)化學(xué)及化學(xué)藥品領(lǐng)域，特別涉及胸腺五肽的活性異構(gòu)體及其在制備免疫調(diào)節(jié)藥物、抗腫瘤藥物和抗氧化藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
胸腺是一級(jí)淋巴上皮組織，為人體首要的中樞免疫器官，也是T細(xì)胞發(fā)育的中心器官。它除了提供一個(gè)T細(xì)胞發(fā)育所需要的微循環(huán)外，還可以產(chǎn)生多種胸腺肽類(lèi)激素。胸腺激素能促進(jìn)T細(xì)胞亞群的分化和成熟，進(jìn)而調(diào)節(jié)整個(gè)免疫系統(tǒng)的功能。哺乳動(dòng)物成年后隨著年齡的增長(zhǎng)胸腺逐漸萎縮退化，胸腺激素的分泌量也逐漸降低。大量研究結(jié)果表明，老年傳染病、腫瘤及自身免疫類(lèi)疾病與胸腺萎縮、胸腺激素降低有關(guān)。當(dāng)胸腺本身功能不足，或依賴(lài)胸腺的免疫系統(tǒng)出現(xiàn)明顯的原發(fā)性或繼發(fā)性缺陷、而自身的調(diào)節(jié)又不足以修復(fù)時(shí)，給予外源性胸腺激素就可以產(chǎn)生明顯的療效。
現(xiàn)已從胸腺激素中分離、純化了幾種胸腺肽，包括含有49個(gè)氨基酸殘基的胸腺生成素II、由28個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的胸腺素α1和胸腺九肽等。胸腺五肽(TP-5)是胸腺生成素II的殘基片段，文獻(xiàn)報(bào)道它們?nèi)跃哂行叵偕伤氐幕钚浴?br> 胸腺五肽(TP-5)的氨基酸序列為Arg-Lys-Asp-Val-Tyr。結(jié)構(gòu)如下 其中的Arg表示精氨酸，Lys表示賴(lài)氨酸，Asp表示天冬氨酸，Val表示纈氨酸，Tyr表示酪氨酸。
實(shí)驗(yàn)室和臨床研究結(jié)果均證明，在各種紊亂情況下，TP-5可以雙向調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能，它是一個(gè)很好的免疫調(diào)節(jié)劑，且沒(méi)有任何毒副作用。注射TP-5可以使老年人的胸腺功能缺乏癥得以正?；４送?，TP-5可以安全地清除自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化物，所以TP-5是一個(gè)非常優(yōu)秀的臨床治療藥物。TP-5是一個(gè)非常小的分子，分子量?jī)H僅為679，所以它很容易被合成，早在1985年，TP-5在意大利就成為了商品，我國(guó)海南中和制藥首先制取了該藥。
TP-5對(duì)用傳統(tǒng)方法很難控制的帶狀皰疹和單純皰疹也是非常有效的。對(duì)其它種類(lèi)的皮膚病也有同樣的作用，如慢性皮膚真菌病、屈側(cè)濕疹、特應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性濕疹、全身硬皮病、銀屑病及其它一些傳染病。作為免疫調(diào)節(jié)劑，TP-5對(duì)慢性肝炎也可產(chǎn)生有效的作用，尤其是長(zhǎng)期轉(zhuǎn)氨酶水平低下，免疫功能缺陷，及其它治療方法無(wú)效的疾病。它對(duì)慢性肝炎的作用，包括癥狀的消失和肝功能的恢復(fù)是非常有效的。TP-5對(duì)于治療腫瘤病人的幾種細(xì)胞免疫缺陷，尤其作為化療時(shí)的免疫調(diào)節(jié)劑是令人鼓舞的。臨床研究表明，腫瘤患者注射TP-5三十次以后生活質(zhì)量明顯提高，各種免疫指數(shù)，如NK細(xì)胞活性、白血球總數(shù)、淋巴轉(zhuǎn)化率等明顯增加，同時(shí)，CD4與CD8的比率趨于正常。很多結(jié)果表明，通常情況下，TP-5可以有效地增強(qiáng)患者的免疫功能，這對(duì)臨床上增強(qiáng)患者的免疫功能是非常有意義的。
通過(guò)聯(lián)合使用TP-5與吲哚美辛進(jìn)行治療的免疫調(diào)節(jié)，可以成功地恢復(fù)病人的IL-2的合成能力，以及完成手術(shù)后T細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的相互作用。這些結(jié)果表明，保持術(shù)后病人的免疫功能是可能的。在腫瘤手術(shù)中，TP-5可以防止老年病人的術(shù)后感染及由損傷、燒傷、營(yíng)養(yǎng)不良及血液中毒等引起的免疫失調(diào)。
總之，TP-5在幾種免疫及相關(guān)疾病的臨床研究中表現(xiàn)出雙向調(diào)節(jié)功能。在一定程度上，它可以防止各種免疫缺乏，它是一個(gè)非常有效的免疫調(diào)節(jié)劑。
實(shí)驗(yàn)證明，胸腺肽在小腸可部分吸收，并能提高免疫功能。但胸腺五肽在體內(nèi)易被各種酶類(lèi)水解，如胰蛋白酶、羧肽酶、氨肽酶等，因此體內(nèi)半衰期只有30秒。對(duì)于健康個(gè)體來(lái)講，肽類(lèi)激素在體內(nèi)起到調(diào)節(jié)作用后迅速被清除是很正常的，但對(duì)于患者而言，需要給藥治療時(shí)，半衰期短對(duì)治療不利，發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是，克服背景技術(shù)TP-5的缺點(diǎn)，增強(qiáng)肽類(lèi)激素的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)它的半衰期以提高療效。這對(duì)肽類(lèi)激素是一個(gè)普遍需要解決的問(wèn)題，尤其是TP-5，它的半衰期只有30秒，所以改造肽類(lèi)激素的結(jié)構(gòu)、增加它們?cè)隗w內(nèi)的穩(wěn)定性、提高生物利用度是非常重要的。
本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題的方案主要是對(duì)TP-5的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，設(shè)計(jì)活性肽異構(gòu)體，在TP-5原有結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，將其氨基酸序列中部分氨基酸用相應(yīng)的β-氨基酸、γ-氨基酸代替，所得改造結(jié)構(gòu)后的活性肽在保持原有活性的基礎(chǔ)上，提高其穩(wěn)定性，延長(zhǎng)體內(nèi)半衰期，提高其生物利用度，這對(duì)肽類(lèi)藥物的開(kāi)發(fā)將具有重要意義。本發(fā)明還通過(guò)測(cè)定改造結(jié)構(gòu)后的活性肽的活性及體內(nèi)外穩(wěn)定性，對(duì)它們的藥理、藥效進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這些異構(gòu)體在保持了原有活性的基礎(chǔ)上穩(wěn)定性大大提高。這一發(fā)明還為胸腺肽活性機(jī)理的研究及新藥開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)。
胸腺五肽活性異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)是TP-5中的Arg-Lys-Asp-Val-Tyr有1個(gè)或同時(shí)有2個(gè)氨基酸用其相對(duì)應(yīng)的β-氨基酸或γ-氨基酸代替的氨基酸序列。
優(yōu)選的胸腺五肽活性異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)是TP-5中的賴(lài)氨酸(Lys)或/和天冬氨酸(Asp)或/和纈氨酸(Val)有1個(gè)或同時(shí)有2個(gè)氨基酸用其相對(duì)應(yīng)的β-氨基酸或γ-氨基酸代替的氨基酸序列。
所說(shuō)的天冬氨酸(Asp)可以用β-谷氨酸(β-Glu)或γ-谷氨酸(γ-Glu)代替。
下面列舉本發(fā)明的部分胸腺五肽的活性異構(gòu)體，它們的代號(hào)和結(jié)構(gòu)為L(zhǎng)W501Arg-Lys-β-Asp-Val-Tyr LW502Arg-Lys-γ-Glu-Val-Tyr
LW503Arg-β-Lys-β-Asp-Val-Tyr LW504Arg-β-Lys-γ-Glu-Val-Tyr LW505 Arg-γ-Lys-γ-Glu-Val-Tyr 本發(fā)明的TP-5活性異構(gòu)體還可以是由β-Arg、γ-Arg，β-Val、γ-Val、β-Tyr代替TP-5氨基酸序列中的Arg、Val、Tyr而得到的各種結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的胸腺五肽活性異構(gòu)體以常規(guī)的Fmoc固相肽合成法制備。
原料及試劑接肽樹(shù)脂為王樹(shù)脂(Wang樹(shù)脂)。氨基酸衍生物分別為Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Asp-otBu、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Glu-otBu、Fmoc-β-Lys(Boc)-OH、Fmoc-γ-Lys(Boc)-OH或Fmoc-Tyr(tBu)-OH。
偶聯(lián)反應(yīng)縮合劑為苯駢三唑-1-氧-三(二甲氨基)磷六氟磷酸鹽(BOP)、1-羥基苯駢三氮唑(HOBT)、N-甲基嗎啉(NMM)。脫保護(hù)劑為20％哌啶/DMF溶液。切割試劑為三氟乙酸。
樹(shù)脂用DMF溶脹30分鐘，然后脫保護(hù)20分鐘，用DMF洗滌，反應(yīng)器中加入氨基酸衍生物及縮合劑，室溫反應(yīng)3小時(shí)，洗滌，再脫保護(hù)，加入氨基酸衍生物及縮合劑，重復(fù)進(jìn)行至連接上所有的氨基酸。反應(yīng)器中再加入切割試劑，室溫反應(yīng)1小時(shí)，然后過(guò)濾，濾液在乙醚中沉淀，得粗品。
粗產(chǎn)品的純化采用高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行純化。
洗脫液為三氟乙酸水溶液，乙腈。流速為20ml/min，監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)為214nm。
本發(fā)明對(duì)胸腺五肽活性異構(gòu)體的體外活性和體外穩(wěn)定性作了測(cè)定。
體外活性的測(cè)定人外周血淋巴細(xì)胞和豬胸腺T淋巴細(xì)胞的表面具有綿羊紅細(xì)胞(SRBC)受體，簡(jiǎn)稱(chēng)為E受體，其使T細(xì)胞可與SRBC形成玫瑰花結(jié)，這是成熟T細(xì)胞的特征之一。細(xì)胞經(jīng)45℃加熱1h或用胰酶處理可脫去E受體。胸腺肽可以促進(jìn)脫E受體的T細(xì)胞重新合成E受體，因此可用脫E受體的E花環(huán)實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定胸腺肽的活性。
胸腺生成素能夠增加T細(xì)胞在各種抗原或致有絲分裂原如ConA等激活后產(chǎn)生干擾素(IFN)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)和白細(xì)胞介素-3(IL-3)等多種淋巴因子的分泌，增加T細(xì)胞表面淋巴因子受體的水平。淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)是評(píng)估受檢淋巴細(xì)胞功能的常用和主要指標(biāo)，也是考核藥物活性的有效手段。
體外血漿中穩(wěn)定性的測(cè)定將樣品在血漿中37℃進(jìn)行酶解，然后用HPLC分析水解產(chǎn)物，并與正常結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，結(jié)果它們比正常結(jié)構(gòu)半衰期均長(zhǎng)。
測(cè)定結(jié)果表明胸腺五肽活性異構(gòu)體體外免疫活性保持或者高于胸腺五肽(TP-5)的水平。胸腺五肽活性異構(gòu)體穩(wěn)定性增強(qiáng)，半衰期大大提高。
本發(fā)明對(duì)胸腺五肽活性異構(gòu)體作了一般藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明對(duì)動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)均無(wú)顯著影響。
本發(fā)明還對(duì)胸腺五肽活性異構(gòu)體作了藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示具有顯著的免疫增強(qiáng)作用、抗腫瘤作用和抗氧化作用。說(shuō)明本發(fā)明的胸腺五肽的活性異構(gòu)體能夠在制備免疫調(diào)節(jié)藥物或抗腫瘤藥物或抗氧化藥物中得到應(yīng)用。
本發(fā)明的胸腺五肽的活性異構(gòu)體在制備藥物中的藥物劑型可以是注射液或膠囊或片劑。


圖1是本發(fā)明的LW501的質(zhì)譜圖。
圖2是本發(fā)明的LW502的質(zhì)譜圖。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)施例，可以更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1 LW501的固相合成原料Fmoc-Tyr(tBu)-Wang樹(shù)脂、Fmoc-Asp-otBu、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH。偶聯(lián)反應(yīng)縮合劑為苯駢三唑-1-氧-三(二甲氨基)磷六氟磷酸鹽(BOP)、1-羥基苯駢三氮唑(HOBT)、N-甲基嗎啉(NMM)。脫保護(hù)劑為20％哌啶/DMF溶液。切割試劑為三氟乙酸。
反應(yīng)取Fmoc-Tyr(tBu)-Wang樹(shù)脂在DMF中室溫溶脹30分鐘，用DMF洗滌三次。加入20％哌啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)1小時(shí)脫保護(hù)。再用DMF洗滌三次，加入Fmoc-Val-OH，室溫反應(yīng)3小時(shí)，后用DMF洗滌三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)1小時(shí)脫保護(hù)。加入Fmoc-Asp-otBu，室溫反應(yīng)3小時(shí)，后用DMF洗滌三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)1小時(shí)脫保護(hù)。再用DMF洗滌三次，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH，室溫反應(yīng)3小時(shí)，后用DMF洗滌三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)1小時(shí)脫保護(hù)。再用DMF洗滌三次，再加入Fmoc-Arg(pbf)-OH，室溫反應(yīng)3小時(shí)，后用DMF洗滌三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)1小時(shí)脫保護(hù)，再用DMF洗滌三次。
切割上述反應(yīng)的樹(shù)脂干燥后加入切割試劑三氟乙酸，室溫反應(yīng)2小時(shí)，過(guò)濾，濾液在乙醚中沉淀，干燥，得到粗產(chǎn)品。
純化將粗品溶于水中，用C18反相柱進(jìn)行純化，洗脫液為A相為0.1％TFA水溶液，B相為乙腈，流速為20ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm，收集主峰，凍干，得到純品。
鑒定用質(zhì)譜(MS)測(cè)定其分子量，為679.77，與LW501相符(見(jiàn)圖1)。
實(shí)施例2 LW502的固相合成原料Fmoc-Tyr(tBu)-Wang樹(shù)脂、Fmoc-Glu-otBu、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH。偶聯(lián)反應(yīng)縮合劑為苯駢三唑-1-氧-三(二甲氨基)磷六氟磷酸鹽(BOP)、1-羥基苯駢三氮唑(HOBT)、N-甲基嗎啉(NMM)。脫保護(hù)劑為20％哌啶/DMF溶液。切割試劑為三氟乙酸。
反應(yīng)取Fmoc-Tyr(tBu)-Wang樹(shù)脂在DMF中室溫溶脹30分鐘，用DMF洗滌三次。加入20％哌啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)1小時(shí)脫保護(hù)。再用DMF洗滌三次，加入Fmoc-Val-OH，室溫反應(yīng)3小時(shí)，后用DMF洗滌三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)1小時(shí)脫保護(hù)。加入Fmoc-Glu-otBu，室溫反應(yīng)3小時(shí)，后用DMF洗滌三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)1小時(shí)脫保護(hù)。再用DMF洗滌三次，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH，室溫反應(yīng)3小時(shí)，后用DMF洗滌三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)1小時(shí)脫保護(hù)。再用DMF洗滌三次，再加入Fmoc-Arg(pbf)-OH，室溫反應(yīng)3小時(shí)，后用DMF洗滌三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)1小時(shí)脫保護(hù)，再用DMF洗滌三次。
切割上述反應(yīng)的樹(shù)脂干燥后加入切割試劑為三氟乙酸，室溫反應(yīng)2小時(shí)，過(guò)濾，濾液在乙醚中沉淀，干燥，得到粗產(chǎn)品。
純化將粗品溶于水中，用C18反相柱進(jìn)行純化，洗脫液為A相為0.1％TFA水溶液，B相為乙腈，流速為20ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm，收集主峰，凍干，得到純品。
鑒定用質(zhì)譜(MS)測(cè)定其分子量，為679.77，與LW502相符(見(jiàn)圖2)。
實(shí)施例3 LW503、LW504、LW505的固相合成將實(shí)施例1中的原料改換用Fmoc-Tyr(tBu)-Wang樹(shù)脂、Fmoc-Val-OHFmoc-Asp-otBu、Fmoc-β-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH，用與實(shí)施例1相同的方法可以合成出LW503。
將實(shí)施例1中的原料改換用Fmoc-Tyr(tBu)-Wang樹(shù)脂、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu-otBu、Fmoc-β-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH，用與實(shí)施例1相同的方法可以合成出LW504。
將實(shí)施例1中的原料改換用Fmoc-Tyr(tBu)-Wang樹(shù)脂、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu-otBu、Fmoc-γ-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH，用與實(shí)施例1相同的方法可以合成LW505。
經(jīng)質(zhì)譜鑒定其分子量與LW503、LW504、LW505完全相符。
實(shí)施例4 TP5活性異構(gòu)體Arg-Lys-Asp-β-Val-Tyr及Arg-γ-Lys-Asp-β-Val-Tyr的合成將實(shí)施例1中的原料改換用Fmoc-Tyr(tBu)-Wang樹(shù)脂、Fmoc-β-Val-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH，用與實(shí)施例1相同的方法可以合成TP5活性異構(gòu)體Arg-Lys-Asp-β-Val-Tyr。
將實(shí)施例1中的原料改換用Fmoc-Tyr(tBu)-Wang樹(shù)脂、Fmoc-β-Val-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-γ-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH，用與實(shí)施例1相同的方法可以合成TP5活性異構(gòu)體Arg-γ-Lys-Asp-β-Val-Tyr。
經(jīng)質(zhì)譜鑒定其分子量完全相符。
實(shí)施例5玫瑰花結(jié)實(shí)驗(yàn)1、T細(xì)胞的制備取新鮮豬胸腺剪碎，100目篩過(guò)濾，用D-Hank’液洗滌，濾液中加入淋巴細(xì)胞分離液，2000轉(zhuǎn)離心20分鐘，吸取T細(xì)胞，用D-Hank’液稀釋至細(xì)胞濃度為2.5×106個(gè)/ml。
2、綿羊紅細(xì)胞的制備取綿羊血1ml，用D-Hank’液洗滌三次，1500轉(zhuǎn)/分離心3分鐘，得到紅細(xì)胞，再將其稀釋至細(xì)胞濃度為2.5×107個(gè)/ml。
3、玫瑰花結(jié)的生成取T細(xì)胞200μl加入樣品(50μg/ml)100μl，30℃保溫1小時(shí)，再加入綿羊紅細(xì)胞200μl，4℃過(guò)夜。
用反應(yīng)液涂片，顯微鏡下計(jì)數(shù)。


結(jié)論TP-5活性異構(gòu)體的活性相當(dāng)于或略高于TP-5。
實(shí)施例6細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)1、細(xì)胞懸液的制備昆明鼠取脾放入D-Hank’液中研磨釋放T細(xì)胞，再用D-Hank’液洗滌三次，最后用IMEM培養(yǎng)基稀釋至細(xì)胞濃度為2.5×107個(gè)/ml。
2、反應(yīng)體系取細(xì)胞100μl，樣品(50μg/ml)50μl加入96孔板中，二氧化碳培養(yǎng)箱中作用4小時(shí)，加入ConA 50μl作用44小時(shí)后，體系中加入MTT 20μl作用4小時(shí)，2000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。加入DMSO振搖20分鐘，酶標(biāo)儀570nm比色，計(jì)算刺激率。

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)論TP-5活性異構(gòu)體的對(duì)細(xì)胞增殖的影響與TP-5相當(dāng)。
實(shí)施例7體外血漿中穩(wěn)定性的測(cè)定為測(cè)定各異構(gòu)體的體外穩(wěn)定性，我們將樣品在血漿中37℃進(jìn)行酶解，然后用HPLC分析水解產(chǎn)物，并與正常結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，結(jié)果它們比正常結(jié)構(gòu)半衰期均長(zhǎng)。
方法新鮮人血漿37℃水浴活化30分鐘，再加入樣品，使樣品的終濃度為50μg/ml，37℃水浴水解，每間隔1分鐘取樣品種400μl，加入醋酸400μl終止反應(yīng)。樣品用HPLC檢測(cè)水解產(chǎn)物的濃度，求算出半衰期。
測(cè)定結(jié)果

結(jié)論TP-5活性異構(gòu)體的體外穩(wěn)定性明顯好于TP-5。
實(shí)施例8 TP-5活性異構(gòu)體在藥物中的應(yīng)用——免疫增強(qiáng)作用1、對(duì)免疫抑制小鼠單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬功能的影響將60只小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，雌雄各半。分為對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥組、給藥組。給藥組20μg/kg靜脈注射胸腺活性肽，對(duì)照組和模型組按10ml/kg靜脈注射等體積生理鹽水，陽(yáng)性藥組按20μg/kg靜脈注射TP-5，每日一次，連續(xù)6日。于實(shí)驗(yàn)第6天，各組小鼠尾靜脈注射印度墨汁0.1ml/10g，于注射后2及20min分別從眼眶靜脈叢取血20μl，加到2ml 0.1％Na2CO3溶液中搖勻，在680nm處測(cè)定光密度，計(jì)算吞噬指數(shù)K和吞噬活性α。胸腺活性肽20μg/kg靜脈注射可明顯增強(qiáng)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬功能，作用明顯強(qiáng)于對(duì)照藥TP-520μg/kg。
胸腺活性肽對(duì)免疫抑制小鼠單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬功能的影響(x±s)

與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.0012、對(duì)免疫抑制小鼠血清溶血素抗體生成的影響動(dòng)物分組給藥同實(shí)驗(yàn)1，在給藥第1天，每只小鼠用5％雞紅細(xì)胞0.2ml腹腔注射進(jìn)行免疫，于實(shí)驗(yàn)第6天，各組小鼠眼眶靜脈叢取血20μl，加入1ml生理鹽水中搖勻，再加入5％雞紅細(xì)胞0.5ml，在冰浴中加入0.5ml補(bǔ)體(1∶10新鮮豚鼠血清)，在37℃恒溫水浴中溫育30min，在冰浴中終止反應(yīng)3min，2000rpm離心10min，取上清1ml，加入3ml都氏液，室溫靜置10min后，在540nm處測(cè)光密度值。胸腺活性肽20μg/kg靜脈注射可明顯增加環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠血清溶血素抗體的生成，作用明顯強(qiáng)于對(duì)照TP-5 20μg/kg。
胸腺活性肽對(duì)免疫抑制小鼠血清溶血素抗體生成的影響(x±s)

與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.0013、體內(nèi)對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響將50只小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半。分為對(duì)照組、陽(yáng)性藥組、給藥組。給藥組20μg/kg靜脈注射胸腺活性肽，對(duì)照組按10ml/kg靜脈注射等體積生理鹽水，陽(yáng)性藥組按20μg/kg靜脈注射TP-5，每日一次，連續(xù)6日。于實(shí)驗(yàn)第6天，末次給藥1h后，所有小鼠脫頸椎處死。取脾按上述方法制備脾細(xì)胞，同上法培養(yǎng)后測(cè)定。胸腺活性肽20μg/kg靜脈注射對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖具有顯著促進(jìn)作用，作用明顯強(qiáng)于對(duì)照藥TP-5 20μg/kg。
體內(nèi)胸腺免疫活性肽對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響(x±s)

與對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001實(shí)施例9 TP-5活性異構(gòu)體在藥物中的應(yīng)用——抗腫瘤作用1、對(duì)荷S180腫瘤小鼠的影響將50只小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半。分為對(duì)照組、陽(yáng)性藥組、給藥組。各組小鼠在無(wú)菌條件下，將S180瘤株(培養(yǎng)7日，1∶4稀釋)接種在小鼠右側(cè)腋下0.2ml/只。給藥組按20μg/kg靜脈注射胸腺活性肽，對(duì)照組按10ml/kg靜脈注射等體積生理鹽水，陽(yáng)性藥組腹腔注射20mg/kg環(huán)磷酰胺，每日一次，連續(xù)6日，末次給藥1h后，稱(chēng)各組小鼠體重，脫頸處死小鼠。取瘤稱(chēng)重。胸腺活性肽20μg/kg靜脈注射對(duì)S180移植性小鼠腫瘤生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，抑制率為33～48％。
胸腺活性肽對(duì)荷S180腫瘤小鼠的影響(x±s)

與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.0012、對(duì)荷H22腫瘤小鼠的影響實(shí)驗(yàn)過(guò)程同上，接種瘤株為H22瘤株。胸腺活性肽20μg/kg靜脈注射對(duì)H22移植性小鼠腫瘤生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，抑制率為34～49％。
胸腺活性肽對(duì)荷H22腫瘤小鼠的影響(x±s)

與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
3、對(duì)荷瘤小鼠血清白細(xì)胞介素-2(IL-2)的影響動(dòng)物分組給藥同1，按文獻(xiàn)方法[2]測(cè)定血清IL-2含量。胸腺活性肽20μg/kg靜脈注射可明顯增加荷S180腫瘤小鼠血清白細(xì)胞介素-2(IL-2)水平，作用明顯強(qiáng)于對(duì)照藥TP-520μg/kg。表明胸腺活性肽具有提高荷瘤小鼠T細(xì)胞生長(zhǎng)因子作用。
胸腺活性肽對(duì)荷S180腫瘤小鼠血清IL-2的影響(x±s)

與模型組比較*P＜0.05**P＜0.01，***P＜0.001實(shí)施例10 TP-5活性異構(gòu)體在藥物中的應(yīng)用——胸腺活性肽抗氧化作用1、對(duì)小鼠脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物-丙二醛(MDA)的影響將60只小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，雌雄各半。分為對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥組、給藥組。給藥組20μg/kg靜脈注射胸腺活性肽，對(duì)照組和模型組按10ml/kg靜脈注射等體積生理鹽水，陽(yáng)性藥組按20μg/kg靜脈注射TP-5，每日一次，連續(xù)6日。末次給藥1h后，模型組和給藥組按10ml/kg腹腔注射0.1％CCl4豆油溶液，正常組腹腔注射同體積豆油，禁食16h后，取腦、肝和胸腺組織，按Lowry法[3]測(cè)定蛋白質(zhì)含量，按TBA法[4]測(cè)定脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物-丙二醛含量。胸腺免疫活性肽20μg/kg靜脈注射對(duì)CCl4引起小鼠腦、肝和胸腺脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物-丙二醛升高均有明顯的降低作用，作用明顯強(qiáng)于對(duì)照藥TP-5 20μg/kg。
胸腺活性肽對(duì)小鼠脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物-丙二醛(MDA)的影響(x±s)

與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.0012、胸腺活性肽對(duì)小鼠超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響取實(shí)驗(yàn)10.1小鼠肝組織和血清，按試劑盒方法測(cè)定SOD活性。胸腺活性肽20μg/kg靜脈注射對(duì)CCl4引起小鼠脂質(zhì)過(guò)氧化肝組織和血清SOD活性的降低均具有明顯的增強(qiáng)作用，作用明顯強(qiáng)于對(duì)照藥TP-5 20μg/kg。
胸腺活性肽對(duì)小鼠SOD活性的影響(x±s)

與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.0013、對(duì)超氧陰離子自由基(O2·-)產(chǎn)生的抑制作用反應(yīng)體系含pH7.7緩沖液(0.1mol/L Tris-HCl，0.2mmol/L XAN，0.1mmol/LEDTA)0.97ml，細(xì)胞色素C(20mg/ml)0.01ml，不同濃度的藥物0.01ml，XOD(0.9U/ml)0.01ml。按細(xì)胞色素C還原法測(cè)定還原型細(xì)胞色素C生成量[5]，以此間接計(jì)算超氧陰離子自由基(O2·-)的產(chǎn)生量。胸腺活性肽1μg/ml可明顯抑制還原型細(xì)胞色素C生成量，表明胸腺活性肽對(duì)超氧陰離子自由基(O2·-)產(chǎn)生具有明顯的抑制作用。
胸腺活性肽對(duì)超氧陰離子自由基(O2·-)產(chǎn)生的的影響(x±s)

與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001實(shí)施例11 TP-5活性異構(gòu)體在藥物中的應(yīng)用——注射液(氯化鈉溶液)分別稱(chēng)取實(shí)施例1、2的方法得到胸腺活性異構(gòu)體LW501、LW502、LW503、LW504、LW505各100mg，溶于1000ml 0.9％氯化鈉溶液，混合均勻后，分裝成0.1mg/ml/支濃度的注射液于藥瓶中密封，滅菌制成產(chǎn)品。
實(shí)施例12 TP-5活性異構(gòu)體在藥物中的應(yīng)用——注射液(水溶液)分別稱(chēng)取實(shí)施例1、2的方法得到胸腺活性異構(gòu)體LW501、LW502、LW503、LW504、LW505各100mg，溶于1000ml水中制成水溶液，混合均勻后，分裝成0.1mg/ml/支濃度的注射液于藥瓶中密封，滅菌，制成成品。
實(shí)施例13 TP-5活性異構(gòu)體在藥物中的應(yīng)用——膠囊分別稱(chēng)取實(shí)施例1、2的方法得到胸腺活性異構(gòu)體LW501、LW502、LW503、LW504、LW505各100g，藥用淀粉0.5kg，按公知的膠囊制備技術(shù)和裝備制成膠囊，每粒10mg。其它項(xiàng)目應(yīng)符合中華人民共和國(guó)藥典2000年版膠囊項(xiàng)下要求。
實(shí)施例14 TP-5活性異構(gòu)體在藥物中的應(yīng)用——片劑分別稱(chēng)取實(shí)施例1、2的方法得到胸腺活性異構(gòu)體LW501、LW502、LW503、LW504、LW505各100g，微晶纖維素560g，無(wú)水乳糖380g，硬脂酸鎂200g，氧化硅30g，按公知的制片技術(shù)和裝備制成片劑，每片10mg。其它項(xiàng)目應(yīng)符合中華人民共和國(guó)藥典2000年版片劑項(xiàng)下要求。附胸腺五肽活性異構(gòu)體氨基酸序列表

*該表僅列出了胸腺五肽活性異構(gòu)體的部分結(jié)構(gòu)式
權(quán)利要求
1.一種胸腺五肽活性異構(gòu)體，其特征是，其結(jié)構(gòu)是胸腺五肽中的Arg-Lys-Asp-Val-Tyr有1個(gè)或同時(shí)有2個(gè)氨基酸用其相對(duì)應(yīng)的β-氨基酸或γ-氨基酸代替的氨基酸序列。
2.按照權(quán)利要求1所述的胸腺五肽活性異構(gòu)體，其特征是，其結(jié)構(gòu)是胸腺五肽中的Lys-Asp-Val有1個(gè)或同時(shí)有2個(gè)氨基酸用其相對(duì)應(yīng)的β-氨基酸或γ-氨基酸代替的氨基酸序列。
3.按照權(quán)利要求1或2的所述的胸腺五肽活性異構(gòu)體，其特征是，所說(shuō)的天冬氨酸用β-谷氨酸或γ-谷氨酸代替。
4.按照權(quán)利要求1或2所述的的胸腺五肽活性異構(gòu)體，其特征是，其結(jié)構(gòu)的氨基酸序列是Arg-Lys-β-Asp-Val-Tyr或Arg-Lys-γ-Glu-Val-Tyr 或Arg-β-Lys-β-Asp-Val-Tyr或Arg-β-Lys-γ-Asp-Val-Tyr或Arg-γ-Lys-γ-Glu-Val-Tyr。
5.一種權(quán)利要求1的胸腺五肽活性異構(gòu)體在制備藥物中的應(yīng)用，其特征是，在制備免疫調(diào)節(jié)藥物或抗腫瘤制藥物或抗氧化藥物中的應(yīng)用。
6.按照權(quán)利要求5所述的胸腺五肽活性異構(gòu)體在制備藥物中的應(yīng)用，其特征是，藥物劑型是注射液或膠囊或片劑。
全文摘要
本發(fā)明的胸腺五肽活性異構(gòu)體及其在藥物制備中的應(yīng)用屬有機(jī)化學(xué)及化學(xué)藥品領(lǐng)域。其結(jié)構(gòu)是TP－5中的Arg－Lys－Asp－Val－Tyr有1個(gè)或同時(shí)有2個(gè)氨基酸用其相對(duì)應(yīng)的β－氨基酸或γ－氨基酸代替的氨基酸序列。其制備方法是以常規(guī)的Fmoc固相肽合成法合成。藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胸腺五肽活性異構(gòu)體具有顯著的免疫增強(qiáng)作用、抗腫瘤作用和抗氧化作用。體外活性和穩(wěn)定性測(cè)定表明，其活性保持或者高于TP－5的水平，穩(wěn)定性增強(qiáng)，半衰期提高，因此將大大增強(qiáng)肽類(lèi)激素的療效。本發(fā)明為胸腺肽活性機(jī)理的研究及新藥開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)。
文檔編號(hào)A61K9/20GK1927879SQ200610017209
公開(kāi)日2007年3月14日 申請(qǐng)日期2006年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月25日
發(fā)明者李惟, 王麗鳳, 王麗萍, 陳曉光, 單慧潔, 顧景凱 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)