專利名稱：一種重組人紅細胞生成素溶液制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種紅細胞生成素(EPO)，特別是涉及一種重組人紅細胞生成素(rhEPO)的溶液制劑。
背景技術(shù)：
紅細胞生成素是一種調(diào)節(jié)紅細胞生成的多肽類激素，90％由腎臟產(chǎn)生。重組人紅細胞生成素與天然的紅細胞生成素的結(jié)構(gòu)及生理作用均相同，在臨床上已經(jīng)廣泛應(yīng)用于腎性貧血、外科圍手術(shù)期的紅細胞動員以及腫瘤化療引起的貧血等。
人血白蛋白是一種血液制品，由健康人的血漿經(jīng)低溫蛋白分離等方法提取，并經(jīng)滅活病毒后制成的制劑。人血白蛋白因為自身的特點，如剛架結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性好、生物兼容性好、強的結(jié)合能力、能夠?qū)ζ渌幬锲鸬骄忈屪饔?，常被用作藥物，尤其是重組蛋白藥物的輔料，可以防止蛋白藥物的聚集、修飾和降解，并可顯著減少其它穩(wěn)定劑的用量。目前市場上的重組人紅細胞生成素制劑產(chǎn)品普遍采用的是以人血白蛋白為輔料的制劑配方。例如，美國安進公司(Amgen)的重組人紅細胞生成素注射液(商品名Epogen)、華北制藥金坦生物技術(shù)股份有限公司的重組人紅細胞生成素注射液(商品名濟脈欣)均采用血源白蛋白作為穩(wěn)定劑。
由于血源白蛋白原料來源于人血，雖然世界衛(wèi)生組織(WHO)、美國食品和藥物管理局(FDA)、人用藥物注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會議(ICH)以及中國國家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)等對血液制品及其生產(chǎn)原料、過程均有嚴格規(guī)定，但是作為血液制品，不可避免地存在著潛在的病毒污染問題(如肝炎病毒、愛滋病毒等)。另外，血源白蛋白還存在周期性貨源短缺的問題。因此，研究人員一直在尋找能代替人血白蛋白的穩(wěn)定劑。

發(fā)明內(nèi)容
與血源白蛋白(pHSA)相比，重組人血白蛋白(rHSA)的化學均一程度更高。從血漿純化制備的白蛋白在糖基化、脂肪含量以及結(jié)合的小分子配基方面批間差異很大(Day，et al.，″Nonenzymatically Glucosylated Albumin″，The Journalof Biological Chemistry，vol.254，No.3,pp.595-597，F(xiàn)eb.10，1979.)，而rHSA則不存在這些問題。同時，rHSA中二聚體及寡聚體含量遠低于pHSA中的聚體含量。所以，重組人血白蛋白是化學成分更為均一、成分更為明確的蛋白質(zhì)，在保持蛋白藥物的生理活性方面，具有血源白蛋白不可比擬的優(yōu)勢。
本發(fā)明利用重組人血白蛋白作為重組人紅細胞生成素的穩(wěn)定劑，解決了血源白蛋白可能帶來的病原體污染以及周期性貨源短缺的問題。本發(fā)明以血源白蛋白及重組人血白蛋白為輔料制備重組人紅細胞生成素溶液制劑。在不同的環(huán)境溫度下(37℃、25℃、2-8℃)放置3-24個月，與pHSA相比，以rHSA為穩(wěn)定劑制備的rhEPO在體內(nèi)外均表現(xiàn)出了更高的活性，而且rHSA在rhEPO溶液制劑中保持了比pHSA更高的純度和穩(wěn)定性。


圖1rhEPO在37℃環(huán)境下放置3個月的體外活性檢測結(jié)果；圖2rhEPO在37℃環(huán)境下放置3個月的體內(nèi)活性檢測結(jié)果；
圖3rhEPO在25℃環(huán)境下放置15個月的體外活性檢測結(jié)果；圖4rhEPO在25℃環(huán)境下放置15個月的體內(nèi)活性檢測結(jié)果；圖5rhEPO在2-8℃環(huán)境下放置24個月的體外活性檢測結(jié)果；圖6rhEP0在2-8℃環(huán)境下放置24個月的體內(nèi)活性檢測結(jié)果；圖1-圖6中， 2.5mg/ml rHSA 4.0mg/ml rHSA 2.5mg/ml pHSA。
具體實施例方式
實施例rhEPO原液由華北制藥金坦生物技術(shù)股份有限公司提供rHSA由華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司提供pHSA購自上海萊士血制品有限公司酶聯(lián)免疫測定儀microplate reader(Molecular Device，USA)(型號VERSAmax)高壓液相Waters HPLC高壓液相系統(tǒng)(996光電二極管陣列檢測器)實施例1含rHSA的3000IU/ml rhEPO的配制配方成分濃度 用量rhEP0 3000IU/ml 165mlrHSA2.5mg/ml 137.5ml檸檬酸鈉、氯化 檸檬酸鈉20mmol/L、氯化鈉10697．5ml鈉緩沖液100mmol/L(調(diào)pH至6.9)
10000支量取rhEPO原液(2.0×105IU/ml)165ml，加入rHSA(200mg/ml)137.5ml，加檸檬酸鈉、氯化鈉緩沖液10697.5ml。充分混勻后，無菌過濾到滅菌的容器中，即為rhEPO的半成品。
然后將半成品溶液灌裝至3ml西林瓶，每瓶加入1.1ml。最后加塞、軋蓋、貼簽，制成3000IU/支的rhEPO注射液。
實施例2含rHSA的1500IU/ml rhEPO的配制配方成分 含量 用量rhEPO 1500IU/ml 82.5mlrHSA 2.5mg/ml 137.5ml檸檬酸鈉、氯化 檸檬酸鈉20mmol/L、氯化鈉10780ml鈉緩沖液100mmol/L(調(diào)pH至6.9)
10000支量制備方法同實施例1實施例3含rHSA的6000IU/ml rhEPO的配制配方成分 含量用量rhEPO 6000IU/ml 330mlrHSA 4.0mg/ml220ml檸檬酸鈉、氯化 檸檬酸鈉20mmol/L、氯化鈉10450ml鈉緩沖液100mmol/L(調(diào)pH至6.9)
10000支量制備方法同實施例1實施例4 含pHSA的3000IU/ml rhEPO的配制配方成分含量 用量rhEPO 3000IU/ml165mlpHSA2.5mg/ml 137.5ml檸檬酸鈉、氯化 檸檬酸鈉20mmol/L、氯化鈉10697.5ml鈉緩沖液100mmol(調(diào)pH至6.9)
10000支量取rhEPO原液(2.0×105IU/ml)165ml，加入pHSA(200mg/ml)137.5ml，加檸檬酸鈉、氯化鈉緩沖液10697.5ml。充分混勻后，無菌過濾到滅菌的容器中，即為rhEPO的半成品。
然后將半成品溶液灌裝至3ml西林瓶，每瓶加入1.1ml。最后加塞、軋蓋、貼簽，制成3000IU/支的rhEPO注射液。
實驗例實驗例1rhEPO活性檢測為了確證在儲存期內(nèi)生物制品的質(zhì)量穩(wěn)定，應(yīng)將至少三批試制品存放于不同條件下進行穩(wěn)定性考察，一般存放條件包括2～8℃、室溫、37℃(《生物技術(shù)藥物研究開發(fā)和質(zhì)量控制》，王軍志主編，科學出版社，2002年，第173頁)。將樣品在37℃、25℃、2-8℃的環(huán)境條件下分別放置3個月、15個月和24個月。檢測各批次rhEPO的體內(nèi)、體外活性(《中國生物制品規(guī)程》2000年版，重組人紅細胞生成素制造及檢定規(guī)程，第399-408頁)，考察rHSA對rhEPO生物學活性的影響。
根據(jù)實施例1的溶液制劑，以及rHSA含量4.0mg/ml、pHSA含量2.5mg/ml的3000IU/ml規(guī)格的rhEPO(參照實施例1制備)，將三個批次的體內(nèi)外活性檢測結(jié)果取平均值做圖(見說明書附圖1-6)。結(jié)果顯示，rHSA與rhEPO配伍良好。在相同保存溫度和保存時間的條件下，與2.5mg/ml的pHSA相比，以2.5mg/ml和4.0mg/ml的rHSA作輔料，都可以更有效地保持rhEPO的體內(nèi)外活性，尤其是rHSA2.5mg/ml的作用明顯優(yōu)于pHSA2.5mg/ml。
實驗例2rHSA穩(wěn)定性檢測實施例1和實施例4制備的3000IU/ml規(guī)格的rhEPO，分別放置于37℃、25℃、2-8℃的環(huán)境中，定期用分子篩高壓液相層析(SEC-HPLC，Superdex200 HR10/30)檢測rhEPO溶液制劑中的rHSA和pHSA純度，考察制劑中rHSA和pHSA的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，rHSA在rhEPO溶液制劑中可保持比pHSA更高的純度，具有良好的穩(wěn)定性。檢測結(jié)果見表1。
穩(wěn)定性檢測方法儀器Waters HPLC系統(tǒng)(996光電二極管陣列檢測器)色譜柱Superdex200 HR10/30(Amersham Biosciences，Sweden)流動相100mmol/L PB，pH7.0流速0.5ml/min上樣量50μl檢測波長280nm
表1 rhEPO溶液制劑中的HSA純度(％)

發(fā)明人對實施例2和實施例3制備的1500IU/ml、6000IU/ml的rhEPO溶液制劑也按實驗例1和實驗例2進行了同樣的實驗。實驗結(jié)果一致，重組人血白蛋白在rhEPO溶液制劑中保持比血源白蛋白(參照實施例4同樣可以制備1500IU/ml、6000IU/ml的含血源白蛋白的rhEPO)更高的純度，穩(wěn)定性也更好。
權(quán)利要求
1.一種重組人紅細胞生成素溶液制劑，含有重組人紅細胞生成素和重組人血白蛋白。
2.權(quán)利要求1的溶液制劑，其中重組人血白蛋白含量為2.5-4.0mg/ml。
3.權(quán)利要求2的溶液制劑，其中重組人血白蛋白含量為2.5mg/ml。
4.權(quán)利要求2的溶液制劑，其中重組人血白蛋白含量為4.0mg/ml。
5.權(quán)利要求1的溶液制劑，還含有檸檬酸鈉、氯化鈉緩沖液。
6.權(quán)利要求1至5任一所述的溶液制劑，為注射劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組人紅細胞生成素的溶液制劑。該制劑由重組人紅細胞生成素、重組人血白蛋白以及檸檬酸鈉、氯化鈉緩沖液組成，可用于腎性貧血、外科圍手術(shù)期的紅細胞動員以及腫瘤化療引起的貧血等。
文檔編號A61K9/08GK101015684SQ20061001239
公開日2007年8月15日 申請日期2006年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月10日
發(fā)明者魏敬雙, 李梅彥, 賈茜, 姜揚, 賀建功, 任樂民, 程立均, 周興軍 申請人:華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司