專利名稱：聚乙二醇修飾后具有體內(nèi)生理活性的重組促紅細(xì)胞生成素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以聚乙二醇對無體內(nèi)生理活性的重組促紅細(xì)胞生成素蛋白(EPOP)進(jìn)行修飾，而獲得的具有促紅細(xì)胞生成作用的體內(nèi)生理活性的結(jié)合物(PEG-EPOP)。
背景技術(shù)：
人紅細(xì)胞生成素(human Erythropoietin，hEPO)是一種主要由腎臟合成并分泌的糖蛋白激素，在胚胎期EPO產(chǎn)生于肝臟，出生后4個月轉(zhuǎn)由腎臟產(chǎn)生。其生理作用是刺激骨髓紅細(xì)胞前體細(xì)胞的分化與增殖，在紅細(xì)胞發(fā)育成熟過程中起著重要的作用，是紅細(xì)胞生長的內(nèi)源性調(diào)節(jié)劑。
早年從再生障礙性貧血病人的尿中、胎腎細(xì)胞的培養(yǎng)液中可獲得較多的hEPO，但并不能滿足臨床需求。1985年，應(yīng)用基因重組技術(shù)獲得重組人EPO(rhEPO)，開始了工業(yè)化生產(chǎn)EPO的歷史，使EPO在臨床上廣泛應(yīng)用成為可能。1989年6月美國Amgen公司生產(chǎn)的rhEPO正式獲得美國FDA注冊許可，商品名為“EPOGENEPOETIN ALFA”，用于治療慢性腎衰竭(CRF)合并貧血癥，取得了巨大的成功。目前世界上已有多家公司開發(fā)生產(chǎn)rhEPO，近十多年的臨床應(yīng)用的結(jié)果表明rhEPO的療效顯著，副作用小，是治療各類貧血的特效藥物，也是當(dāng)前最為成功的基因工程治療藥物。隨著人們對EPO的研究日益深入，其臨床適應(yīng)癥將進(jìn)一步擴(kuò)大，目前適用于(1)慢性腎衰合并貧血的治療此類貧血的一個主要原因是EPO生成缺乏，EPO可謂替代治療方法，其療效達(dá)95％以上，使血紅蛋白含量(Hb)及紅細(xì)胞壓積(Hct)增高，貧血改善，出血時間縮短，生活質(zhì)量提高，輸血次數(shù)減少，也有利于施行腎移植的病人；(2)艾滋病(AIDS)病人伴貧血，尤其應(yīng)用AZT治療的病人常易伴發(fā)貧血，EPO治療有效；(3)腫瘤病人化療所致貧血，尤其使用順鉑常出現(xiàn)明顯貧血，EPO治療有效；(4)慢性病貧血，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤病人，當(dāng)伴發(fā)貧血而需輸血維持治療者，EPO可使部分病人減少輸血的次數(shù)；(5)造血干細(xì)胞疾病的貧血，如骨髓增生異常綜合征(MDS)、再生障礙性貧血等的病人，若需反復(fù)輸血亦難以維持者，可試用EPO，約25％～30％病人可使貧血改善，減少輸血次數(shù)；(6)自體供血輸注美國血庫協(xié)會規(guī)定，擇期手術(shù)的病人，如矯形手術(shù)者宜取自血貯存，以備手術(shù)時輸注，術(shù)前3周開始用EPO，Hb上升明顯時取血400ml貯存，采集3次備用，可以滿足病人的需要。使用EPO可以提高貯血質(zhì)量，減少貯血數(shù)量；(7)早產(chǎn)兒貧血的防治50～100IU/kg，每周3次，于出生后開始，連用4周?？梢灶A(yù)計(jì)EPO在一個相當(dāng)長的時期內(nèi)都將是貧血治療的一線藥物。
在采用蛋白質(zhì)藥物治療過程中，常因其較短的血漿半衰期而使其生物利用度降低，這在EPO這樣的激素類蛋白質(zhì)上表現(xiàn)得尤為明顯。機(jī)體通過腎臟細(xì)胞上的氧分壓感受器調(diào)節(jié)EPO的分泌量，通過肝細(xì)胞快速滅活釋放到血漿中的EPO，由此建立維持紅細(xì)胞壓積相對恒定的靈敏調(diào)節(jié)機(jī)制既可在貧血時大量促進(jìn)紅細(xì)胞的釋放，又可防止過量釋放紅細(xì)胞造成血粘稠度過高等不利后果。在使用rhEPO對貧血疾病的治療中，此機(jī)制大大減低了rhEPO的生物利用度，造成用藥劑量的增加，而由于rhEPO昂貴的價(jià)格也造成治療費(fèi)用的增加；同時由于EPO受體數(shù)量的限制，此機(jī)制也限制了加大用藥劑量獲得更高治療效果的能力，在實(shí)際的治療中，大多數(shù)情況下需采用每周3劑的治療方案，只在貧血癥狀糾正后的維持治療中可視情形降低用藥劑量及用藥頻次至每周2劑或每周1劑。
EPO分子是一種含唾液酸的酸性糖蛋白，對熱(在80℃條件下不變性)和酸堿(穩(wěn)定范圍在PH 3.5～10.0之間)較為穩(wěn)定。蛋白質(zhì)肽鏈中Cys161與Cys7、Cys29和Cys33之間分別形成兩對二硫鍵，其中Cys7和Cys161之間的二硫鍵對于EPO的生物活性至關(guān)重要，如果二硫鍵被還原，EPO將喪失其生物活性。EPO分子的四個糖基化位點(diǎn)分別在Asn38、Asn24、Asn83和Ser126上，前三者為N-糖鏈，后者為O-糖鏈。糖鏈的分枝程度不同，有雙末梢、三末梢或四末梢，其中四末梢最為常見。研究結(jié)果表明，糖鏈的分枝程度對EPO在體內(nèi)的生物活性有影響，N-端糖鏈的高度分枝對其維持生物體內(nèi)生物活性是必要的。去唾液酸或去糖基化不影響在體外的生物活性，但卻大大縮短了在體內(nèi)的半衰期(主要經(jīng)肝細(xì)胞吸附代謝)，結(jié)果完全喪失了在體內(nèi)的生物學(xué)活性。只有EPO分子被充分糖基化后，才能在體內(nèi)表現(xiàn)出生物活性。因此糖鏈結(jié)構(gòu)的存在對EPO在體內(nèi)的生物活性至關(guān)重要。也就是說只有真核細(xì)胞表達(dá)的EPO在體內(nèi)才具有生物活性。由于EPO糖基結(jié)構(gòu)部分占整個分子量的30～40％且有高度的不均一性，其糖鏈分枝程度的不同使EPO的分子量在30～40KD之間(Wasley LC，Linderberg G，F(xiàn)ishman L，et al.The importance of N-and O-linked oligosaccharides for thebiosynthesis and in vitro and vivo biological activities of erythropoietin.Blood 1991，77(3)419-434.)。眾多關(guān)于EPO的研究均證實(shí)了以上結(jié)論，因此普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為重組EPO必須以真核細(xì)胞表達(dá)，如文獻(xiàn)馬培奇。促紅細(xì)胞生成素及其臨床用途與市場前景?！吨袊t(yī)藥情報(bào)》1999年第5卷第1期，P11)。
基于以上對自然hEPO的認(rèn)識，目前用于藥物生產(chǎn)的rhEPO均采用真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，而對EPO特性及藥效改進(jìn)的研究也集中于采用真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)所獲得的rhEPO上。為增加rhEPO的藥效，目前有兩種較成功的方法，一是對現(xiàn)有的rhEPO進(jìn)行化學(xué)修飾，如在00898956專利申請中，公開一種EPO與PEG的偶聯(lián)物，其通過將EPO糖蛋白共價(jià)連接1～3個低級烷氧基聚乙二醇(PEG)基團(tuán)進(jìn)行修飾，而提高了EPO的循環(huán)半衰期和血漿滯留時間，并降低了EPO的清除率和提高其體內(nèi)活性。另一是通過基因工程的方法改變EPO肽鏈中的部份氨基酸以增加糖基化位點(diǎn)進(jìn)而增加糖基化程度，參見美國專利US5856298以及Amgen Inc.One Amgen Center Drive Thousand Oaks，California產(chǎn)品AranespTM說明書。
盡管以上改進(jìn)取得了明顯增加rhEPO血漿半衰期的效果，但其依然是采用現(xiàn)行rhEPO藥品生產(chǎn)工藝所用的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，生產(chǎn)成本應(yīng)與現(xiàn)行產(chǎn)品相當(dāng)。
在申請人的另一個較早的專利申請中(申請?zhí)?00410021859.7)，通過對已知的hEPO基因的堿基序列進(jìn)行重新設(shè)計(jì)，消除大腸桿菌稀有密碼子，而代之以大腸桿菌偏愛密碼子，并適量調(diào)整GC含量，成功地構(gòu)建了可在原核系統(tǒng)(例如大腸桿菌中)高效表達(dá)的重組基因和載體系統(tǒng)。雖然表達(dá)的重組人促紅細(xì)胞生成素蛋白(EPOP)由于缺乏糖基化修飾而在體內(nèi)不具有生理活性，但原核系統(tǒng)生產(chǎn)成本大大低于真核系統(tǒng)，這樣制備的無體內(nèi)活性的EPOP可用于例如制備EPO肽鏈蛋白試劑、也可用于免疫動物的EPO抗原；或制備成EPO陽性對照標(biāo)準(zhǔn)品，用于EPO免疫檢測的試劑盒，如反相血凝、放射免疫、酶聯(lián)免疫等方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種PEG-EPOP結(jié)合物，采用無糖基化因而無體內(nèi)活性的促紅細(xì)胞生存素(EPO)蛋白(EPOP)，如本發(fā)明提供的由原核表達(dá)系統(tǒng)獲得無體內(nèi)生物活性的EPO蛋白，再利用PEG對EPOP進(jìn)行化學(xué)修飾，獲得具有體內(nèi)促紅細(xì)胞生成作用生理活性的產(chǎn)物(PEG-EPOP)。
本發(fā)明還提供PEG-EPOP結(jié)合物在制備治療貧血性疾病藥物及升高紅細(xì)胞藥物中的用途。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供式(I)結(jié)構(gòu)的PEG-EPOP結(jié)合物mPEG-X-EPOP(I)式(I)中，mPEG的分子結(jié)構(gòu)式為 其中k為100～1000的整數(shù)，分子量為5000～40000道爾頓；X為NH或O，表明PEG對EPOP化學(xué)修飾的共價(jià)連接方式；EPOP為重組EPO蛋白，為無體內(nèi)生物活性的EPO蛋白，與天然EPO或真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)獲得的重組EPO相比缺少糖鏈部份，在動物實(shí)驗(yàn)中觀察不到促紅細(xì)胞生成的體內(nèi)生理活性，但是具有EPO特有的體外細(xì)胞學(xué)活性。
本發(fā)明中所指無體內(nèi)生理活性或無體內(nèi)生物活性，是指按一般治療使用劑量，在實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)用目前已知的檢測方法，檢測不出明顯的促紅細(xì)胞生長的生理作用，即EPOP不具備作為貧血糾正藥物使用的價(jià)值；當(dāng)然，不排除采用更大劑量或更高靈敏度的檢測方法可檢測到較微弱體內(nèi)活性的可能。
在本發(fā)明中，無體內(nèi)生理活性的EPOP可以有多種來源，凡肽鏈結(jié)構(gòu)與天然EPO相近的同源肽鏈，無論是人工合成的，還是通過原核系統(tǒng)或真核系統(tǒng)表達(dá)的，甚至經(jīng)過改造的，例如在本發(fā)明實(shí)施例1、2中通過原核系統(tǒng)表達(dá)的具有166個氨基酸或167個氨基酸的肽鏈，因?yàn)槿狈μ擎湺痪邆潴w內(nèi)生理活性，都可以作為本發(fā)明PEG修飾的原料，從而獲得具有體內(nèi)生理活性的產(chǎn)物。
為了低成本地獲得大量無體內(nèi)活性的EPO蛋白，在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，首先構(gòu)建可利用大腸桿菌系統(tǒng)高效表達(dá)的重組EPO基因和工程菌，其表達(dá)的重組EPOP無體內(nèi)活性，然后以此EPOP為基礎(chǔ)，用PEG2NHS-20K對其進(jìn)行化學(xué)修飾，經(jīng)修飾后的PEG-EPOP結(jié)合物在動物體內(nèi)表現(xiàn)出明顯的促紅細(xì)胞生成的體內(nèi)生理活性。
本發(fā)明采用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得無體內(nèi)生物活性的EPOP，再采用PEG對EPOP進(jìn)行化學(xué)修飾，獲得PEG-EPOP結(jié)合物，并在動物實(shí)驗(yàn)中觀察到具有體內(nèi)活性。如以此PEG-EPOP結(jié)合物制成治療貧血性疾病的藥物，因原核表達(dá)系統(tǒng)在生產(chǎn)成本和規(guī)模成本上顯著降低，比真核表達(dá)系統(tǒng)具有的巨大優(yōu)勢，可明顯地降低病人的治療用藥費(fèi)用。
圖1為重組EPOP原核表達(dá)系統(tǒng)質(zhì)粒構(gòu)建圖。
圖2PEG-EPO體內(nèi)生理活性檢測實(shí)驗(yàn)，用R-500分析儀測定網(wǎng)織紅細(xì)胞百分?jǐn)?shù)圖中縱坐標(biāo)為網(wǎng)織紅細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，橫坐標(biāo)為采血時間(1、2、3、4分別代表于注射樣品后第四、五、六、七日采血)0#陰性對照1#rhEPO陽性對照2#重組EPOP，未修飾對照3#PEG-EPOP結(jié)合物，修飾后產(chǎn)物圖3為兩種氨基酸序列(167AA和166AA)的EPO蛋白表達(dá)對照圖；圖中1密碼修改后，表達(dá)的167AA(含167位Arg)樣品2密碼修改后，表達(dá)的166AA(不含167位Arg)樣品31之誘導(dǎo)表達(dá)前對照樣品42之誘導(dǎo)表達(dá)前對照樣品具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖，通過對本發(fā)明較佳實(shí)施方式的詳細(xì)描述，說明但不限制本發(fā)明。
實(shí)施例1由原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組EPOP的制備1.菌株及質(zhì)粒質(zhì)粒PBV220全長3.66Kb，串聯(lián)噬菌體PLPR啟動子，下游為核糖體基因終止信號，氨芐青霉素抗性，制備方法見含PLPR啟動子的原核高效表達(dá)載體的組建及其應(yīng)用，病毒學(xué)報(bào)，1990，6(2)11，該質(zhì)粒由作者贈送。大腸桿菌菌株DH5α購自于GIBCO公司DH5α標(biāo)準(zhǔn)株。
2.工具酶及試劑限制性內(nèi)切酶BamH I、EcoRI、T4連接酶以及Taq DNA聚合酶購于Roche公司，質(zhì)粒純化試劑盒(Wizard Plus Minipreps DNA Purification System)購于Promega公司，蛋白分子量標(biāo)記購于華美公司，其它試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。
3.人促紅細(xì)胞生成素基因的合成人體內(nèi)表達(dá)的EPO分子是由166個氨基酸構(gòu)成的糖基化蛋白質(zhì)，在后加工修飾過程中其C-末端Arg166位被切除，成為由165個氨基酸組成的成熟hEPO。hEPO的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，其蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2。其中大腸桿菌稀有密碼子的比例占到12％。為了讓基因最佳化表達(dá)，我們通過對基因的重新設(shè)計(jì)和合成，消除稀有密碼子而利用最佳化密碼子。將hEPO中的絕大部分稀有密碼子替換成大腸桿菌偏愛密碼子，并適量調(diào)整GC含量，同時在目的基因片段的兩端增加3個酶切位點(diǎn)EcoR IGAATTC；Nde ICATATG；BamH IGGATCC。密碼替換前后對照如表1中所示，替換后合成的序列中編碼序列如SEQ ID NO.3所示。由于大腸桿菌基因表達(dá)以甲硫氨酸起始，實(shí)際得到的肽鏈在SEQ ID NO.2序列N端多一個甲硫氨酸，共167個氨基酸的肽鏈，蛋白一級結(jié)構(gòu)沒有其它改變。
表1 hEPO基因密碼替換前后對照表
4.序列合成方法方法參考Jelenkovic G，Billings S，Chen Q，et al.Transformation of eggplant withsynthetic ccryIIIA gene produces a high level of resistance to the Colorado potatobeetle.J Amer Soc Hort Sci，1998.123(1)19～25，采用全基因合成的方法，首先使用設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)長度約為80nt的oligo，這些oligo之間互相形成約18nt的overlap，然后進(jìn)行多輪PCR擴(kuò)增后得到全長基因，電泳回收后進(jìn)行克隆，再測序得到序列正確的克隆。
為了合成表達(dá)成熟hEPO的165個氨基酸(由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列缺少第166位精氨酸)的基因序列，設(shè)計(jì)如下兩條引物，用PCR法從含有經(jīng)密碼替換后的EPO基因的質(zhì)粒中重新擴(kuò)增出缺少第166位精氨酸密碼(CGT)的EPO基因(如SEQ ID NO.4所示的表達(dá)165個氨基酸的基因序列)，按上述方法同樣獲高效表達(dá)，見圖3。同樣，在大腸桿菌中表達(dá)的肽鏈為N端增加一個甲硫氨酸共166個氨基酸的肽鏈。
引物5’GAG GAA TTC ATA TGG CTC CGC CGC GTC TG 3’5’CAG CTG GGA TCC TCA ATC ACC GGT ACG GCA 3’5.重組質(zhì)粒構(gòu)建和篩選鑒定將經(jīng)測序正確的目的基因用限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I雙酶切得到編碼序列(SEQ ID NO.4)，電泳后回收后與用限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I同樣雙酶切的PBV220質(zhì)粒連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布含氨芐青霉素的LB平板得轉(zhuǎn)化子。挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I雙酶切分析，篩選含有hEPO基因片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子。
重組質(zhì)粒的構(gòu)建路線見圖1。
6.EPO基因在大腸桿菌中的表達(dá)將重組子接種于5ml LB培養(yǎng)基中，在30℃，180rpm搖床培養(yǎng)14h左右。然后以1∶30的比例轉(zhuǎn)入LB培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)4h左右(A600≈0.8時)。再以42℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4h。取培養(yǎng)物1ml，離心后進(jìn)行SDS-PAGE及Western blot鑒定所表達(dá)的蛋白質(zhì)。
7.高密度發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件7.1.LB種子培養(yǎng)基每立升含蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl5g，PH7.0，高壓滅菌，使用時加入氨芐青霉素至100ug/ml。
7.2.發(fā)酵用培養(yǎng)基每10L含K2HPO412g，KH2PO4·3H2O 20g，NaCl 20g，MgSO4·7H2O 10g，葡萄糖500g，酵母粉480g，蛋白胨430g，高壓滅菌后使用。
7.3.發(fā)酵培養(yǎng)將保存的菌種劃平皿，挑取單個菌落，接種于LB種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)14～16h后，再以1∶30的比例擴(kuò)大培養(yǎng)12h。然后接種于NBSMPP-40發(fā)酵罐中培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中每間隔1個小時補(bǔ)料一次，并根據(jù)菌體生長情況調(diào)整PH和氧溶解度(DO)。
8.純化發(fā)酵產(chǎn)物按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法分離、純化蛋白，如文獻(xiàn)Asn to Lysmutations at three sites which are N-glycosylated in the mammalian protein decreasethe aggregation of Escherichia coli-derived erythropoietin，Protein Engineering，Vol.14 no.2 pp.135-140，2001，Linda O.Narhi etc.獲得來自原核表達(dá)系統(tǒng)的重組EPO(EPOP)。
9.EPOP體外細(xì)胞學(xué)活性測定9.1.方法參考MTT比色法與ELISA法測定rhEPO體外生物學(xué)活性的比較細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志(J Cell Mol Immunol)2000；16(5)]韓蕾，韓為躍，收獲菌體以超聲波破菌后離心。上清液直接進(jìn)行UT7細(xì)胞活性檢測，沉淀以6倍體積的7M尿素溶解后進(jìn)行UT7細(xì)胞活性檢測。標(biāo)準(zhǔn)品為利血寶(麒麟鯤鵬公司)3000IU/瓶(2ml)9.2.結(jié)果對照的載體菌上清及沉淀溶解液中均未測得UT7細(xì)胞活性。構(gòu)建的工程菌破菌上清液測得8IU/ml，沉淀溶解液400倍稀釋后測得700IU/ml。
因此獲得的重組EPOP有維持UT7細(xì)胞生長的活性，證明所獲的重組EPOP肽鏈具有EPO特有的體外細(xì)胞學(xué)活性。
實(shí)施例2PEG-EPOP結(jié)合物的制備本發(fā)明涉及以PEG2NHS-20K修飾EPOP，所進(jìn)行的化學(xué)修飾反應(yīng)式如下 其中X為NH或O，代表PEG對EPOP化學(xué)修飾的共價(jià)連接方式，一般為EPO肽鏈中賴氨酸的側(cè)鏈氨基(NH)或EPO的N未端氨基，也可以是EPO肽鏈中如絲氨酸的側(cè)鏈羥基(OH)。
其中i、j為整數(shù)，代表PEG碳鏈的長度；根據(jù)PEG對EPOP的修飾程度，n為1～5的整數(shù)，優(yōu)選為1；mPEG的分子結(jié)構(gòu)式為 其中k為100～1000的整數(shù)，為i與j之和，使結(jié)合物的mPEG部分分子量為5000～40000道爾頓，優(yōu)選10000～20000道爾頓。
可采用以下方法對獲得的重組EPO進(jìn)行化學(xué)修飾
1.交換緩沖體系(超濾法)用預(yù)先經(jīng)0.5mol/L NaOH除熱原處理過的超濾器濃縮重組人促紅細(xì)胞生成素半成品，并對PH8.5、50.0mmol/L磷酸鹽緩沖液透濾4次，并用相同緩沖液調(diào)整蛋白濃度為1mg/ml。
2.重組EPO的化學(xué)修飾反應(yīng)取重組EPO樣品(1mg/ml)20ml，加入PEG2NHS-20K 100毫克(PEG2NHS為NEKTAR公司產(chǎn)品，產(chǎn)品使用說明見Nektar Molecule Engingeering CATALOG2003)，25℃緩慢攪拌下反應(yīng)30min，加Gly400毫克終止反應(yīng)。
在化學(xué)修飾中，重組EPO樣品的蛋白濃度可以采用0.01～5mg/ml，優(yōu)選0.1～1mg/ml，在本發(fā)明中最優(yōu)選1mg/ml?；罨疨EG酯與被修飾蛋白的摩爾比為1∶1～1∶10或更高，如采用PEG2NHS-20K重量比約為2∶1～1∶5，在本發(fā)明中優(yōu)選重量比為1∶5。
3.分離及純化3.1.Superdex 200分子篩層析柱柱大小(26cm×100cm)3.2.清洗及平衡用無熱原水洗層析柱，流速8～10ml/min，用5倍柱床體積清洗，然后用5倍柱床體積的平衡緩沖液(0.2mol/L NaCl 20mmol/L檸檬酸緩沖液PH7.0)平衡柱。
3.3.上樣及洗脫將促紅細(xì)胞生成素修飾反應(yīng)混合物樣品進(jìn)樣，進(jìn)樣后用緩沖液(0.2mol.dm-3 NaCl 20mmol.dm-3檸檬酸緩沖液PH7.0)洗脫，OD280nm檢測。分別收集第一峰(PEG-EPOP結(jié)合物)和第二峰(未反應(yīng)EPOP)。
實(shí)施例3PEG-EPOP結(jié)合物動物體內(nèi)促紅細(xì)胞生成活性的測定之一1.實(shí)驗(yàn)方法參考《檢測EPO體內(nèi)生物學(xué)活性的網(wǎng)織紅細(xì)胞法的建立 王箐舟、程雅琴 中國生物制品學(xué)雜志1997年第10卷第1期》，與文中略有不同的是按作者推薦，現(xiàn)采用僅注射一劑第四日采血的方法。
1.1.重組EPOP樣品依實(shí)施例1方法表達(dá)制備的EPO蛋白提純樣品，含有N端的甲硫氨酸及C端的精氨酸，共長167個氨基酸的肽鏈，UT-7檢測細(xì)胞活性為44000IU/ml；1.2.PEG-EPOP結(jié)合物樣品參照實(shí)施例2方法制備的PEG修飾后的PEG-EPOP結(jié)合物樣品，在本次實(shí)驗(yàn)中的具體方法為5ML前述重組EPOP樣品中加入PEG2NHS-20K 50毫克，修飾反應(yīng)完全后未經(jīng)分離及純化，置4度保存供動物實(shí)驗(yàn)用。
1.3.實(shí)驗(yàn)動物Balb/C純系小鼠，體重約20克。
1.4.樣品以20mM磷酸鹽緩沖液50倍稀釋，各樣品組以背部皮下注射0.2ml，每組3只，給藥后第四日眼眶靜脈采血，涂片染色，測網(wǎng)織紅百分?jǐn)?shù)。
2.結(jié)果2.1.重組EPOP2.6％、3.4％、3.7％，均值為3.2％2.2.PEG-EPOP9.7％、7.9％、7.5％，均值為8.4％2.3.陰性對照2.3％、3.9％、3.4％，均值為3.2％(歷史值)在動物實(shí)驗(yàn)中，原核表達(dá)的重組EPOP樣品未能檢測出促紅細(xì)胞生成作用，而同樣量的PEG修飾后PEG-EPOP結(jié)合物樣品有明顯的促紅細(xì)胞生成作用。說明重組EPOP樣品可以通過PEG修飾獲得原不具有的促紅細(xì)胞生成素的體內(nèi)活性。因此，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說明沒有體內(nèi)活性而有體外細(xì)胞活性的EPO蛋白可以通過PEG修飾獲得促紅細(xì)胞生成素的體內(nèi)活性。
實(shí)施例4PEG-EPOP結(jié)合物動物體內(nèi)促紅細(xì)胞生成活性的測定之二1. 實(shí)驗(yàn)方法參考實(shí)施例3，每只腹部皮下注射0.2ml，以R-500分析儀代替涂片染色測網(wǎng)織紅細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，并測定注射后第四、五、六、七日的結(jié)果。
1.1. 0#陰性對照共4只，注射生理鹽水；1.2. 1#rhEPO陽性對照，采用上海復(fù)星科技生物克隆公司rhEPO產(chǎn)品貽寶，批號20040101，2000IU/瓶，2ml生理鹽水溶解，取200ul，加生理鹽水4.8ml稀釋，濃度為40IU/ml，分4組每組4只。
1.3. 2#重組EPOP，未修飾對照樣品。依實(shí)施例1方法表達(dá)制備的EPO蛋白提純樣品，含有N端的甲硫氨酸不含C端的精氨酸，共長166個氨基酸的肽鏈，UT-7檢測細(xì)胞活性為30000IU/ml，100倍稀釋，濃度300IU/ml。分4組每組4只。
1.4. 3#PEG-EPOP結(jié)合物，前述2#樣品的修飾后產(chǎn)物，修飾方法同實(shí)施例3，同2#樣品稀釋分組。
2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2，本次實(shí)驗(yàn)中重組EPOP僅檢測出微弱的體內(nèi)活性，而在PEG-EPOP結(jié)合物中測出明顯的體內(nèi)活性。
上述實(shí)施例表明，無體內(nèi)活性的EPOP，經(jīng)過本發(fā)明方法修飾后的產(chǎn)物，具有良好的體內(nèi)促紅細(xì)胞生成的活性，由于成本低廉，應(yīng)用前景好。
本發(fā)明涉及的肽鏈包括具有天然EPO氨基酸順序的肽鏈以及為各種目的改進(jìn)的同源肽鏈，如按本發(fā)明中提出的具有166個氨基酸(如果從N端的第一位甲硫氨酸MET起算應(yīng)為167個氨基酸，本發(fā)明的實(shí)施例表明具有該甲硫氨酸的EPOP仍具有理論上應(yīng)有的體外細(xì)胞學(xué)活性及PEG修飾后的體內(nèi)生理活性)的天然表達(dá)序列以及表達(dá)的模擬后加工中切去Arg166的天然肽鏈，或?yàn)樗N目的改變部分氨基酸的肽鏈，如減少糖基化位點(diǎn)以增加肽鏈穩(wěn)定性等等，只要該EPO同源肽鏈在體內(nèi)不能表現(xiàn)或僅能表現(xiàn)微弱的EPO生理活性，經(jīng)PEG修飾后獲得較強(qiáng)的體內(nèi)生理活性，均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明涉及的修飾試劑為活化PEG酯，也可采用其它的方法將PEG鏈與EPOP的肽鏈共價(jià)偶聯(lián)，包括其它種類的活化基團(tuán)，或?qū)POP肽鏈的相應(yīng)位點(diǎn)也進(jìn)行活化，以及單鏈、雙鏈或多鏈的多種結(jié)構(gòu)的mPEG，同樣在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
很顯然，以上對本發(fā)明的詳細(xì)描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變或變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求所定義的范圍。
重組人促紅細(xì)胞生成素.ST25SEQUENCE LISTING<110>成都生物制品研究所<120>聚乙二醇修飾后具有體內(nèi)生理活性的重組促紅細(xì)胞生成素<130>2905<160>4<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>501<212>DNA<213>Artificial(人工序列)<220>
<221>CDS<222>(1)..(501)<223>編碼人重組人促紅細(xì)胞生成素基因<400>1gcc cca cca cgc ctc atc tgt gac agc cga gtc ctg gag agg tac ctc48Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15ttg gag gcc aag gag gcc gag aat atc acg acg ggc tgt gct gaa cac 96Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His20 25 30tgc agc ttg aat gag aat atc act gtc cca gac acc aaa gtt aat ttc144Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45tat gcc tgg aag agg atg gag gtc ggg cag cag gcc gta gaa gtc tgg192Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60cag ggc ctg gcc ctg ctg tcg gaa gct gtc ctg cgg ggc cag gcc ctg240Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80ttg gtc aac tct tcc cag ccg tgg gag ccc ctg cag ctg cat gtg gat288Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp85 90 95aaa gcc gtc agt ggc ctt cgc agc ctc acc act ctg ctt cgg gct ctg336Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110gga gcc cag aag gaa gcc atc tcc cct cca gat gcg gcc tca gct gct384Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala115 120 125cca ctc cga aca atc act gct gac act ttc cgc aaa ctc ttc cga gtc432Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val130 135 140tac tcc aat ttc ctc cgg gga aag ctg aag ctg tac aca ggg gag gcc480Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160tgc agg aca ggg gac aga tga501Cys Arg Thr Gly Asp Arg165<210>2<211>166<212>PRT<213>Artificial(人工序列)<400>2
重組人促紅細(xì)胞生成素.ST25Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His20 25 30Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp85 90 95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala115 120 125Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val130 135 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Thr Gly Asp Arg165<210>3<211>501<212>DNA<213>Artificial(人工序列)<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(501)<400>3gctccgccgc gtctgatctg tgatagccgt gttctggaac gttacctgct ggaagctaaa 60gaagctgaaa acatcacgac gggctgtgct gaacactgca gcctgaacga aaacatcact120gttccggata ccaaagttaa cttctatgct tggaaacgta tggaagttgg tcagcaggct180gtagaagttt ggcagggcct ggctctgctg tcggaagctg ttctgcgtgg ccaggctctg240ctggttaact ctagccagcc gtgggaaccc ctgcagctgc acgtggataa agctgttagt300ggcctgcgta gcctgaccac tctgctgcgt gctctgggag ctcagaaaga agctatcagc360cctccggatg cggcttcagc tgctccgctg cgtaccatca ctgctgatac tttccgtaaa420ctgttccgtg tttacagcaa cttcctgcgt ggaaaactga aactgtacac cggtgaagct480tgccgtaccg gtgatcgttg a 501
重組人促紅細(xì)胞生成素.ST25<210>4<211>498<212>DNA<213>Artificial(人工序列)<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(498)<400>4gctccgccgc gtctgatctg tgatagccgt gttctggaac gttacctgct ggaagctaaa 60gaagctgaaa acatcacgac gggctgtgct gaacactgca gcctgaacga aaacatcact120gttccggata ccaaagttaa cttctatgct tggaaacgta tggaagttgg tcagcaggct180gtagaagttt ggcagggcct ggctctgctg tcggaagctg ttctgcgtgg ccaggctctg240ctggttaact ctagccagcc gtgggaaccc ctgcagctgc acgtggataa agctgttagt300ggcctgcgta gcctgaccac tctgctgcgt gctctgggag ctcagaaaga agctatcagc360cctccggatg cggcttcagc tgctccgctg cgtaccatca ctgctgatac tttccgtaaa420ctgttccgtg tttacagcaa cttcctgcgt ggaaaactga aactgtacac cggtgaagct480tgccgtaccg gtgattga 498
權(quán)利要求
1.一種促紅細(xì)胞生成素蛋白的聚乙二醇結(jié)合物，其特征在于將無體內(nèi)活性的重組人促紅細(xì)胞生成素蛋白經(jīng)聚乙二醇化學(xué)修飾，獲得具有體內(nèi)促紅細(xì)胞生成活性的產(chǎn)物。
2.權(quán)利要求1所述的促紅細(xì)胞生成素蛋白的聚乙二醇結(jié)合物，其特征在于其具有式(I)結(jié)構(gòu)mPEG-X-EPOP(I)式(I)中，mPEG的分子結(jié)構(gòu)式為 其中k為100～1000的整數(shù)，使結(jié)合物的mPEG部分分子量為5000～40000道爾頓；X為NH或O，代表PEG對EPOP化學(xué)修飾的共價(jià)連接方式；EPOP代表無體內(nèi)活性的重組人促紅細(xì)胞生成素蛋白。
3.權(quán)利要求2所述的促紅細(xì)胞生成素蛋白的聚乙二醇結(jié)合物，其特征在于其具有式(II)結(jié)構(gòu) 式(II)中，n為1～5的整數(shù)，代表PEG對EPOP的修飾程度；mPEG的分子結(jié)構(gòu)式為 其中k為100～1000的整數(shù)，為i與j之和，使結(jié)合物的mPEG部分分子量為5000～40000道爾頓；X為NH或O，代表PEG對EPOP化學(xué)修飾的共價(jià)連接方式；EPOP代表無體內(nèi)活性的重組人促紅細(xì)胞生成素蛋白。
4.權(quán)利要求2所述的促紅細(xì)胞生成素蛋白的聚乙二醇結(jié)合物，其特征在于所述EPOP是由原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的。
5.權(quán)利要求4所述的促紅細(xì)胞生成素蛋白的聚乙二醇結(jié)合物，其特征在于所述EPOP是由大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的。
6.權(quán)利要求1所述的促紅細(xì)胞生成素蛋白的聚乙二醇結(jié)合物在治療貧血性疾病藥物中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述的促紅細(xì)胞生成素蛋白的聚乙二醇結(jié)合物在制備升高紅細(xì)胞藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種促紅細(xì)胞生成素蛋白的聚乙二醇結(jié)合物(PEG－EPOP)，將無體內(nèi)活性因而不具備作為貧血糾正藥物使用價(jià)值的重組人促紅細(xì)胞生成素蛋白(rhEPOP)，經(jīng)聚乙二醇(PEG)化學(xué)修飾，獲得具有體內(nèi)促紅細(xì)胞生成活性的產(chǎn)物。本發(fā)明特別揭示了可以用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得低成本的EPOP，由此獲得低成本的PEG－EPOP，生產(chǎn)治療貧血性疾病藥物及升高紅細(xì)胞藥物。
文檔編號A61P7/06GK1680449SQ20051005202
公開日2005年10月12日 申請日期2005年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月2日
發(fā)明者葛永紅, 陳智勇, 曾獻(xiàn)武, 劉蘭軍 申請人:成都生物制品研究所