專利名稱：用于化妝品和醫(yī)療皮膚病學的結合了透明質酸鈉片段和類維生素a的局部組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及透明質酸鹽基局部組合物，及它們在美容學和皮膚病學中的用途。
背景技術：
透明質酸鹽(HA)是細胞外基質的主要組分。與在所謂“硬”組織如軟骨中存在的糖胺聚糖如軟骨素硫酸相對，它特別地在所謂的“軟”結締組織中存在。因此，發(fā)現(xiàn)這種物質在皮膚中以顯著量存在。
HA是由D-葡糖醛酸和N-乙?；?D-葡糖胺的重復單元組成的非硫酸化線性糖胺聚糖(Tammi R.，Agren UM.，Tuhkanen AL.，Tammi M.Progress in Histochemistry & Hyaluronan metabolism in skin.29(2)1-81，1994)。
在正常皮膚中，HA基本由真皮成纖維細胞和表皮角質化細胞合成(Tammi R.，已經引用的文獻)。通過這些帶有負電荷的殘基，HA起水泵的作用，這種作用可以保持皮膚的彈性。HA的主要作用是控制結締組織的食品廢料、激素、維生素和無機鹽的擴散，并清潔可誘導炎性反應的代謝廢物。隨年齡的增長，HA的數(shù)量和它的聚合度降低，導致結締組織中保留的水量的降低。皮膚然后就經歷老化過程，這個過程導致纖維化的增加，并導致彈性纖維含量的下降。
在正常人皮膚中，HA以高分子量(600,000-1,000,000Da)的聚合物形式存在。皮膚中HA的生理降解通過(i)由角質化細胞通過CD44的內化和(ii)由透明質酸酶進行的細胞內斷裂而變成適當尺寸片段(60,000-300,000Da)。斷裂的HA由角質化細胞釋放，通過基膜，并直接在淋巴管中釋放(Tammi R.等人，已經引用的文獻)。
在發(fā)炎狀況下，在動物中表現(xiàn)為具有低分子量的HA形式的累積。在發(fā)炎期間，血小板趨化因子如纖維蛋白刺激成纖維細胞的流入和活化，成纖維細胞通過透明質酸酶的分泌降解HA，導致小HA片段的高組織濃度。這些小HA片段的產生也通過不同的機理如通過粒細胞釋放的氧反應性物質的解聚，或在由紫外線照射的皮膚中，或低分子量片段的重新合成。幾個研究已經說明高和低分子量HA可對細胞和組織具有不同的生物效應(McKee CM.，Penno MB.，Cowman M.，BurdickMD.，Strieter RM.，Bao C.，Noble PW.Hyaluronan(HA)fragments inducechemokine gene expression in alveolar macrophages.The role of NA sizeand CD44.Journal of Clinical investigation.98(10)2403-13，1996Termeer CC.，Hennies J.，Voith U.，Ahrens T.，Weiss JM.，Prehm P.，SimonJC.Oligosaccharides of hyaluronan are potent activators of dendritic cells.Journal of Immunology.165(4)1863-70，2000；Fitzegerald KA.，BowieAG.，Skeffington BS.，O’Neil LA.，Ras，Protein kinase C zeta，and I kappaB kinases 1 and 2 are downstream effectors of CD44 during the activationof NF-kappa B by hyaluronic acid fragments in T-24 carcinoma cells.Journal of Immunology.164(4)2053-63，2000)。
已經證明施用在鼠類和人皮膚上的中間分子量(50,000-250,000Da)的HA會通過表層和真皮層。在皮膚上施加HA之后2小時，降解產物在血清中出現(xiàn)。在血清中回收的HA的分子量略微小于在皮膚上施加的HA的分子量，這說明HA的經皮膚通過不僅僅限于較小尺寸的片段(100-10,000Da)(Brown TJ.，Alcorn D，F(xiàn)raser JR.Absorption ofhyaluronan applied to theb surface of intact skin.Journal of investigativeDermatology.113(5)740-6，1999)。
維生素A(視黃醇)及其天然和合成衍生物，統(tǒng)稱為類維生素A，形成很多種不同的物質，這些物質顯著地在胚胎發(fā)生、復制、視覺機理、生長調節(jié)和細胞分化現(xiàn)象中具有突出的效應(Blomhoff R.等人1991，Physiol.Rev.71951-990；Sporn M.B.等人(1994)在Retinoids，第2版，Raven Press，NY中)。
天然類維生素A由如下通式(I)定義，如在(生物化學命名中的IUPAC-IUB聯(lián)合委員會，在Eur.J.Biochem.(1982)，129，1-5中)中定義的那樣
其中R＝CH2OH對應于視黃醇(ROL)R＝CHO對應于視黃醛(RAL)R＝COOH對應于視黃酸(RA)類維生素A的生物效應由它們與RAR(視黃酸受體)和RXR(視黃酸X受體)類型的核受體的相互作用調節(jié)。
在包括上皮細胞的許多細胞類型中，ROL代謝成視黃基酯。
類維生素A在皮膚病學中的重要性可追溯到在維生素A缺乏誘導的皮膚異常的動物中首次觀察到的現(xiàn)象(Wolbach等人，J.exp.Med.43753)。
現(xiàn)在，已經合成了許多類維生素A。主要使用領域為皮膚病學適應癥如光化角化病、痤瘡和通常角質化病癥如牛皮癬和達里埃病(Darier‘s)的局部或口服治療。
此外，許多與類維生素A的組合和結合是已知的-對細胞分子和免疫調節(jié)起作用的分子組合，例如類維生素A和化學療法在皮膚淋巴瘤中的組合(Thestrup-Petersen等人，Br.J.Dermatol.118811-818)，-類維生素A和光線療法組合例如與補骨脂素結合(Saurat等人，Dermatologica177218-224)，-與影響類維生素A代謝的分子的組合。這是例如抑制類維生素A的代謝和使活性激素的細胞內速率增加的維生素D衍生物與唑類之間的相互作用情形(Kato等人，Biochem.J.(1992)286755-760，Jugert等人，Skin Pharmacol.1998)。
另外，已知在局部施加期間類維生素A的一種主要次級效應是誘導的刺激。此效應對觀察治療來說可能是無效的。
視黃醛(RAL)，類維生素A族的一員，是維生素A的天然代謝物，目前用于人類中的局部施加。已經證明RAL通過誘導表皮增生而在皮膚中產生生物活性，以及C57BL/6和無毛SKH1鼠(無毛SKH1)的濾泡和濾泡間表皮中CD44和HA表達的明顯增加。也可通過視黃酸(RA)和視黃醇(ROL)的局部施加觀察到這些效應。然而，與采用RA或ROL治療相比，CD44和HA的表達在采用RAL治療的鼠中更強烈地增加了。
CD44是多形性經膜糖蛋白，它具有由選擇性拼接和翻譯后改性產生的幾個構型(isoform)。在近來的研究中，我們證明CD44在鼠類皮膚中的兩個主要功能是(i)響應于細胞外刺激來調節(jié)角質化細胞增殖和(ii)保持HA的局部內環(huán)境穩(wěn)定(Kaya G，Rodriguez I.，Jorcano JL.，VassalliP.，Stamenkovic I.Selective suppression of CD44 transgene driven by atissue-specific promoter disrupts hyaluronate metabolism in the skin andimpairs keratinocyte proliferation.Genes & Development.11(8)996-1007，1997)。我們也觀察到在患有硬化-萎縮苔蘚的患者中表皮CD44表達的降低，這極有可能引起HA的真皮沉積和此疾病中的表皮萎縮(Kaya G，Augsburger E.，Stamenkovic K.，Saurat JH.Decrease in epidermal CD44expression as a potential mechanism for dermis in lichen sclerosus andatrophicus.Journal ofInvestigate Dermatology.115(6)1054-8，2000)。
CD44涉及細胞-細胞相互作用和細胞-基質相互作用。近來的研究顯示由CD44和HA片段形成的配對(CD44-HAF)是有絲分裂和HA新合成的誘導物(Larent TC，Laurent UB，F(xiàn)raser JR.The structure andfunction of hyaluronan綜述.Immunol.Cell Biol.74(2)1-7，1996)。因此，HA和RAL的表皮和真皮效應看來應由CD44介導的。
目前，存在包含高分子量HA無機鹽的藥物和化妝品制劑，優(yōu)選為喜朗(Healon)，海爾根(Hyalgan)，Provisc，Vitrax和在馬西德爾完全藥物參考中引用的那些，第32版，1999，The Pharmaceutical PressEditor。
然而，如果HA的分子量高，則其很難穿過皮膚。
這就是為什么在國際申請WO02/076470A1中，作者提出將N-乙?；?葡糖胺與類維生素A結合的組合物。采用此組合，體外透明質酸的合成可以通過表皮細胞協(xié)同地增加。但是沒有提及在體內施加該制劑之后所獲得的結果。
日本申請11279042描述了基于硫酸化透明質酸片段的組合物，該片段優(yōu)選地具有的分子量為1,000-50,000Da，且硫酸根基團占據(jù)分子式中R1，R2，R3和R4取代基總體的10-90％。這些低分子量片段對于保持皮膚彈性和避免角質化是非常活性的。相反，非硫酸化透明質酸片段在測試中經證明是非活性的。

發(fā)明內容
現(xiàn)在，本發(fā)明人令人驚奇地發(fā)現(xiàn)水解成分子量為50,000-750,000Da片段的非硫酸化HA對皮膚具有生物活性，當這些片段與類維生素A結合時這種生物活性增強。
因此，本發(fā)明涉及可用于局部施加的組合物，其特征在于它們包括作為活性成分的一種或多種50,000-750,000Da低分子量的透明質酸鹽片段。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，透明質酸鹽片段的分子量為50,000-250,000Da或250,000-750,000Da。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，所述組合物進一步包含至少一種類維生素A。
分子量為50,000-750,000Da的透明質酸鹽片段與類維生素A的組合對由角質化細胞進行的透明質酸合成有協(xié)同效應。
在本發(fā)明的意義上，類維生素A表示視黃醇或它的異構體、視黃醛、視黃酸或它的異構體，或視黃酸酯。
透明質酸鹽表示任何鹽，優(yōu)選為透明質酸鈉。
本發(fā)明的局部組合物也可包含染料、硅油、類維生素A或彩色顏料、防腐劑、植物油、抗氧劑、礦物鹽、增稠劑、pH改進劑、吸收紫外射線的試劑、維生素或任何其它藥用和皮膚病學可接受的賦形劑。
本發(fā)明的組合物可用于美容學和皮膚病，以預防或改進起皺紋皮膚，干燥皮膚，并且可以用它們保持皮膚的緊實度和濕度。
本發(fā)明的組合物可用于局部制劑中，用于皮膚病學或美容學的領域，目的在于預防或治療與皮膚組織萎縮相關的皮膚病，并且它必須能改善皮膚的潤濕狀態(tài)，以降低在例如腎上腺皮質類脂醇治療次級效應中的皮膚萎縮，減少皺紋，對抗無論是否是由光誘導的皮膚老化，重新引發(fā)表皮和真皮細胞活性，激活皮膚，增加它的彈性。
通過以下的實施例和


本發(fā)明。
圖1說明在非治療動物中和每日用制劑5，制劑3或制劑7治療兩次的動物表皮中測量的HA數(shù)量，這些制劑根據(jù)實施例1和2中描述的操作過程獲得。
圖2說明在非治療動物或經制劑5，3或7治療的動物真皮中的HA量，這些制劑如在實施例1和2中那樣制備。
實施例實施例1局部使用的透明質酸鹽片段的效應1.材料和方法1.1.制劑評價了3種類型的透明質酸片段(HAF)·非常高分子量HAF(1,000,000-2,000,000Da)·低分子量HAF(50,000-750,000Da)-HAF(250,000-750,000Da)-HAF(50,000-250,000Da)·非常低分子量HAF(1,000-20,000Da)這些片段包括在標準化妝品制劑中，它們的兩種例示組成在下表1中給出


表1HAF基制劑

1.2.HAFs活性的測量使用無毛SKH1鼠，每組3只動物。
局部施加不同的制劑。
采用有刻度的目鏡(Zeiss)測量表皮厚度；放大40倍，該厚度在每只鼠的五個場內取平均。
通過計算真皮細胞的數(shù)目評價真皮細胞含量(cellularity)，放大40倍，該細胞含量在每只鼠的五個場內平均。
表皮和真皮的增殖細胞數(shù)目由采用抗Ki-67抗體的免疫標記Ki67來揭示(抗小鼠的鼠，Dako)。
在根據(jù)ELISA技術每天施加兩次的速率下施加不同的制劑之后，測量真皮中透明質酸鹽的存在(Corgenix)和在由膠體鐵染色的組織切片上揭示透明質酸鹽。
2.結果
2.1.表皮厚度，真皮細胞構成和增殖細胞數(shù)目的效應結果見表2和3。
表2根據(jù)本發(fā)明的HAFS的效果(1)

表3根據(jù)本發(fā)明的HAFS的效果(2)

*ND未測定與分別包含高和非常低分子量HAF的制劑1和4相比，采用根據(jù)本發(fā)明的低分子量HAF配制并局部施加的制劑2和3顯著增加無毛SKH1鼠中的表皮厚度和真皮細胞含量(表2)。與制劑1和4相比，制劑3也明顯增加無毛SKH1鼠中表皮和真皮增殖細胞的數(shù)目(表3)。
制劑2和3的局部施加誘導表面和深真皮中增加的細胞性。數(shù)目增加的細胞主要是成纖維細胞，它們具有活化表型與非常發(fā)達的內質網(wǎng)。
2.2.真皮中HA水平的效應結果見表4。
表4根據(jù)本發(fā)明的HAFS對HA在真皮中的存在的影響

針對制劑2和3檢測真皮中HA的存在(制劑3＞制劑2)。在施加制劑1和4之后不可檢測HA水平。
因此，本發(fā)明人已經證明低分子量HAF的局部施加具有兩個主要結果1-伴隨細胞增殖增加的顯著的表皮增生。
2-表面真皮中HA的局灶性累積與成纖維細胞數(shù)目的顯著增加，這一結果在采用高和非常低分子量HAF時是觀察不到的。
實施例2類維生素A與低分子量HAF的組合的效應1.材料和方法表5的片段包括在前述例示的標準化妝品制劑中。
表5基于HAF和類維生素A的制劑

2.結果它們見表6和7及見圖1和2。制劑6和7的局部施加可增加變厚的表皮的位點數(shù)目。
表6對HAF和RAL對表皮厚度和真皮細胞含量的協(xié)同效應的研究

表7在施加HAF-RAL之后HA在真皮中的存在的檢測

單獨施加RAL(制劑5)的效應可比于將低分子量HAF與RAL結合的制劑8獲得的效應，這證明在RAL和非常低分子量片段之間沒有協(xié)同作用。
HAF-RAL結合的協(xié)同效應是特別可見針對制劑6和7的真皮細胞含量的水平(參照表5)。
制劑6和7的局部施加也增加真皮HA的染色(制劑7＞制劑6)(參照表7)。
HAF-RAL結合的協(xié)同效應也由HA在鼠真皮和表皮中存在的ELISA量揭示，采用以上提及的不同制劑治療該鼠。
結果顯示與僅采用RAL(制劑5)或僅采用HAF(制劑3)的治療相比，在采用HAF-RAL結合(制劑7)的治療之后，在真皮中(圖2)和在表皮中(圖1)HA產生的顯著增加。
權利要求
1.一種局部組合物，其特征在于它們包括作為活性成分的一種或多種透明質酸鹽片段，所述片段的分子量為50,000-750,000Da，并且特征還在于所述組合物進一步包含至少一種類維生素A。
2.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其特征在于所述透明質酸鹽片段的分子量為50,000-250,000Da或250,000-750,000Da。
3.根據(jù)權利要求2所述的組合物，其特征在于所述類維生素A選自視黃醇或它的異構體、視黃醛、視黃酸或它的異構體或視黃酸酯。
4.根據(jù)權利要求1-3所述的組合物在化妝中的用途。
5.根據(jù)權利要求1-3所述的組合物，其中所述組合物用作治療皮膚病的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及局部組合物，該組合物的特征在于其包括一種或幾種作為主要成分的、分子量為50000到750000的透明質酸片段，如果需要，該組合物還包括類維生素A。
文檔編號A61K31/74GK1913868SQ200580003661
公開日2007年2月14日 申請日期2005年1月27日 優(yōu)先權日2004年1月29日
發(fā)明者J-H·索拉特, G·卡亞, P·博爾達 申請人:皮埃爾·法布爾皮膚化妝品公司