專利名稱：胸腺素β4衍生物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)藥物衍生物的產(chǎn)生領(lǐng)域。通過(guò)對(duì)天然蛋白胸腺素β4(Tβ4)的改造，得到了Tβ4的衍生物Gly-Tβ4。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，該衍生物在受損組織的修復(fù)過(guò)程中起到非常重要的作用，進(jìn)而有望被開(kāi)發(fā)為一種造福于人類的新藥。
二.
背景技術(shù)：
免疫系統(tǒng)是人體的防御系統(tǒng)。參與免疫反應(yīng)的主要細(xì)胞有T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。而胸腺是T淋巴細(xì)胞發(fā)育、分化的免疫中樞器官。胸腺分泌的胸腺因子(或激素)是T淋巴細(xì)胞發(fā)育分化所需的一系列必需物質(zhì)，其中胸腺素β4(Tβ4)是現(xiàn)已結(jié)構(gòu)和功能較為明確的一種主要的胸腺因子。正如用Tβ4(一種涉及正在發(fā)育的胚胎中細(xì)胞遷移和存活的蛋白)的活性所做的一項(xiàng)研究所表明的那樣，“胸腺素—貝塔4”增強(qiáng)組織培養(yǎng)物中胚胎及出生后心肌細(xì)胞的存活能力，在大鼠冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后腹膜內(nèi)注射該蛋白，能成功刺激心臟修復(fù)和激活A(yù)kt“存活激酶”。這些結(jié)果說(shuō)明，“胸腺素—貝塔4”對(duì)于急性冠狀動(dòng)脈閉塞是一個(gè)可能的治療目標(biāo)。德克薩斯州大學(xué)的研究人員發(fā)現(xiàn)一種在心臟發(fā)育過(guò)程中制造的蛋白質(zhì)(胸腺素β-4)在心臟病發(fā)作后能夠幫助心臟器官的自我修復(fù)。這些在大鼠實(shí)驗(yàn)中獲得的發(fā)現(xiàn)最終可能導(dǎo)致新的心臟病療法的出現(xiàn)并且可能改變醫(yī)護(hù)人員對(duì)心臟病的處理方式。
胸腺素β-4是一種胚胎在心臟發(fā)育過(guò)程中表達(dá)的蛋白，它能促進(jìn)心臟細(xì)胞的遷移并影響這些細(xì)胞的生死存亡。新研究表明這種蛋白能夠在實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的心臟病發(fā)作后防止細(xì)胞的死亡并限制疤痕組織形成的程度。胸腺素β-4已經(jīng)被用于臨床試驗(yàn)，以促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷的痊愈。研究人員相信不久的將來(lái)這種蛋白將會(huì)進(jìn)入心臟病治療的臨床試驗(yàn)階段。
Tβ4是Goldstein等最早從小牛胸腺中提取的胸腺素組分5(TF5)中分離出來(lái)的一種多肽，含43個(gè)氨基酸，分子量4.963KD，無(wú)二硫鍵與糖基化。經(jīng)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)分析，在Tβ4的N末端加上一個(gè)甘氨酸，有利于Tβ4生物功能的發(fā)揮。
三.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明中Gly-Tβ4的制備方法為先以Tβ4氨基酸序列為模板選用大腸桿菌偏好密碼子全基因合成Tβ4 DNA序列且在N、C末端加上限制性酶切位點(diǎn)，以GST氨基酸序列為模板選用大腸桿菌偏好密碼子全基因合成先導(dǎo)肽DNA序列且在N、C末端加上限制性酶切位點(diǎn)，再將先導(dǎo)肽、Tβ4以及篩選質(zhì)粒pBSK用限制性內(nèi)切酶處理好，經(jīng)計(jì)算各樣品濃度后按一定摩爾比加入T4連接體系。經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選出一成功重組子命為PSK-Tβ4。用限制性酶切下融合蛋白基因，再將該基因與用限制性酶處理好的本公司質(zhì)粒PGM(該質(zhì)粒為卡那霉素抗性篩選標(biāo)記，能大量表達(dá)GST類融合蛋白，為本公司構(gòu)建)連接，經(jīng)篩選得到正確重組子命名為PGM2Tβ4。將PGM2Tβ4轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌BL21中，經(jīng)表達(dá)篩選出高表達(dá)工程菌PGM2Tβ4/BL21，然后在30升發(fā)酵罐中對(duì)PGM2Tβ4/BL21進(jìn)行高密度發(fā)酵，經(jīng)12小時(shí)發(fā)酵，最終得到目的蛋白表達(dá)量占菌體總蛋白量60％的工程菌體，，濕重約100g/L，再經(jīng)離心收集菌體，高壓均質(zhì)機(jī)破碎細(xì)菌并離心得到含目的前體蛋白上清液，將上清液上樣到GST親和柱上，洗脫目的前體蛋白并用凝血酶酶切后，再將樣品通過(guò)陰離子柱進(jìn)一步純化，使得最終蛋白純度大于98％。
在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，發(fā)現(xiàn)胸腺素Gly-Tβ4與其它兩種蛋白一起，通過(guò)激活A(yù)kt/蛋白激酶B來(lái)促進(jìn)心肌細(xì)胞的遷移和存活。在研究了培養(yǎng)的細(xì)胞活性后，首先研究了Gly-Tβ4對(duì)受損心臟組織的作用，研究人員將60只成年大鼠的冠狀動(dòng)脈結(jié)扎模擬心臟病發(fā)作，從而創(chuàng)造出大鼠模型。接著給20只大鼠局部注射胸腺素Gly-Tβ4 2ug/只，給20只大鼠局部注射胸腺素Tβ4 2ug/只，而另20只大鼠只注射鹽水200uL作為空白對(duì)照。連續(xù)注射胸腺素Gly-Tβ4與Tβ4一月的大鼠的受損心臟中的細(xì)胞很少死亡，并在心臟病發(fā)后數(shù)周改善了心臟功能，而且Gly-Tβ4治療效果比Tβ4明顯。研究人員相信胸腺素Gly-Tβ4能夠改變細(xì)胞的代謝并創(chuàng)造出更強(qiáng)大的心肌細(xì)胞，這些細(xì)胞能夠抵抗心臟病發(fā)后的低氧狀況。
接下來(lái)研究了Gly-Tβ4對(duì)受損表皮組織的作用，研究人員將30只成年大鼠的表皮劃傷，從而創(chuàng)造出大鼠表皮損傷模型。接著給10只大鼠局部涂抹胸腺素Gly-Tβ4 5ug/50ul/只/天，給10只大鼠局部涂抹胸腺素Tβ4 5ug/50ul/只/天，而另10只大鼠只涂抹生理鹽水50uL/天作為空白對(duì)照。連續(xù)涂抹胸腺素Gly-Tβ4與Tβ4 5天的大鼠的傷口長(zhǎng)度比空白對(duì)照小50％，而且Gly-Tβ4治療效果比Tβ4明顯。
隨后還研究了Gly-Tβ4對(duì)受損角膜組織的作用，研究人員將30只成年大鼠的角膜用1N燒堿燒傷，從而創(chuàng)造出大鼠角膜損傷模型。接著給10只大鼠眼部滴胸腺素Gly-Tβ4 5ug/5ul只，2次/天；給10只大鼠眼部滴胸腺素Tβ4 5ug/5ul只，2次/天；而另10只大鼠眼部只滴注射鹽水5ul/只，2次/天。連續(xù)眼部滴胸腺素Gly-Tβ4與Tβ4 4天的大鼠的受損角膜完全恢復(fù)，而用生理鹽水組的動(dòng)物角膜不但沒(méi)恢復(fù)，還出現(xiàn)了嚴(yán)重的炎癥和充血。研究人員將會(huì)確定這種蛋白的最有效劑量、用藥的最佳時(shí)間。這項(xiàng)研究將會(huì)為心臟病、角膜損傷、表皮損傷的治療開(kāi)辟出新的途徑。如果這種蛋白對(duì)人類同樣有效，那么這種蛋白將會(huì)成為一種強(qiáng)有力的治療藥物。
經(jīng)測(cè)試，本發(fā)明的Gly-Tβ4衍生物活性高于天然Tβ4。
四.


圖1是對(duì)大鼠模型注射Tβ4和Gly-Tβ4后對(duì)大鼠心臟壁厚度的影響結(jié)果。
圖2是對(duì)大鼠模型注射Tβ4和Gly-Tβ4后對(duì)大鼠心臟壁纖維化程度的影響結(jié)果。
圖3是對(duì)大鼠模型使用Tβ4和Gly-Tβ4后對(duì)大鼠表皮傷口愈合程度的影響結(jié)果。
圖4是對(duì)大鼠模型使用Tβ4和Gly-Tβ4后對(duì)大鼠的損傷角膜表皮形成程度的影響結(jié)果。
五.
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)例僅是對(duì)本發(fā)明的說(shuō)明，而不會(huì)對(duì)本發(fā)明產(chǎn)生任何限制。
一)胸腺素β4衍生物的獲得首先通過(guò)全基因合成擴(kuò)增出胸腺素β4前體蛋白的全基因序列GGA TCC GAC AAA CCC GAT ATG GCT GAG ATC GAG AAA TTC GAT AAG TCG AAACTG AAG AAG ACA GAG ACG CAA GAG AAA AAT CCA CTG CCT TCC AAA GAA ACGATT GAA CAG GAG AAG CAA GCA GGC GAA TCG TAA GTC GAC以GST基因?yàn)槟０?，PCR擴(kuò)增獲得500bp左右的產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序質(zhì)粒克隆、基因測(cè)序，得到設(shè)計(jì)序列備用。
目的片段經(jīng)BamH I、EcoR I、XhoI雙酶切后分別回收小片段，質(zhì)粒PGM經(jīng)XhoI和EcoRI雙酶切后回收大片段，18℃在T4連接酶體系中三段目的基因片斷進(jìn)行連接，經(jīng)篩選得到的重組質(zhì)粒命名為PGM2Tβ4。然后用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，涂布在含有50ug/ml卡那霉素的LB平板，挑選陽(yáng)性菌落在LK中培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8時(shí)加入IPTG 0.1mM誘導(dǎo)3-4小時(shí)離心收集菌體，8M尿素破菌后15％SDS-PAGE電泳時(shí)出現(xiàn)一條30KD左右的蛋白帶，表達(dá)量為40％。經(jīng)胸腺素β4的單克隆抗體免疫印跡檢定，顯示陽(yáng)性反應(yīng)。所獲得的高效表達(dá)胸腺素Gly-Tβ4前體蛋白的工程菌命名為PGM2Tβ4/BL21。
1.發(fā)酵1)搖瓶表達(dá)含胸腺素β4前體蛋白基因的PGM2Tβ4/BL21，在含50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中搖瓶過(guò)夜(37℃，200rpm)，再按1∶30接種含有50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)3小時(shí)后，加入0.1mM IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)。收集菌體經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，發(fā)現(xiàn)含胸腺素β4前體蛋白(30KD)以可溶性表達(dá)為主，表達(dá)量占菌體總蛋白的60％。
2)發(fā)酵工藝a.培養(yǎng)基a)種子液培養(yǎng)基(LK)胰蛋白胨10克/升、酵母粉5克/升、氯化鈉10克/升、卡那霉素50微克/毫升。
b)種養(yǎng)基(15升)磷酸氫二鈉315克、磷酸二氫鉀100克、 氯化鈉10.05克、氯化銨50克、 胰蛋白胨90克。
以上成分一起在罐中滅菌；下面的成分單獨(dú)滅菌后加入發(fā)酵罐。
硫酸鎂15克、 葡萄糖450克、 補(bǔ)料(500克/升)葡萄糖b.發(fā)酵過(guò)程1.種子培養(yǎng)從已鑒定的平皿上劃取菌種，接種到50毫升(250毫升的三角瓶)LC中，36度、200轉(zhuǎn)/分、8小時(shí)后將這50毫升種子液轉(zhuǎn)接到700毫升LC中，36度、200轉(zhuǎn)/分，過(guò)夜。
2.發(fā)酵過(guò)程將培養(yǎng)好的種子液(OD600＝3-4)加入罐中，調(diào)好各參數(shù)，36度、150轉(zhuǎn)、溶氧100％，開(kāi)始發(fā)酵；5小時(shí)后開(kāi)始以2.5速流加2小時(shí)，約加入800毫升補(bǔ)料，加入1克IPTG誘導(dǎo)(三小時(shí))。
2.層析(1)親和層析采用GSH-Agrose層析介質(zhì)(Sigma公司)，平衡液采用25mM Tris-HCl，pH8，上樣平衡后，裂菌的離心上清上Glutathione Sepharose層析柱，平衡后用含10mM還原型谷胱甘肽(GSH)的洗脫液洗下融合蛋白。
(2)酶解上一步的洗脫液加入凝血酶(5NIHU/mL)37℃酶切2小時(shí)。
(2)陰離子交換層析采用Source30Q層析介質(zhì)，平衡液為20mM PB，pH7，上一步得到的樣品用水稀釋1倍進(jìn)行上樣，平衡后采用20mM PB，pH7，0-1MNaCl的梯度洗脫，收集目的蛋白洗脫峰。
3.檢測(cè)得到的胸腺素β4通過(guò)SDS-PAGE純度檢測(cè)和反相HPLC檢測(cè)，純度大于98％。
二)Gly-Tβ4體內(nèi)生物學(xué)評(píng)價(jià)1.Gly-Tβ4與Tβ4對(duì)大鼠心臟缺血模型的治療效果評(píng)價(jià)1)、病態(tài)動(dòng)物模型的制作與試驗(yàn)方法為了評(píng)價(jià)Gly-Tβ4與Tβ4的藥物有效性，建立了急性心肌梗塞的病態(tài)動(dòng)物模型——大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支再灌流模型。
肌肉注射甲苯噻嗪5mg/kg；氯胺酮50mg/kg麻醉，用碘酒、酒精消毒大鼠前胸壁；完全干燥后鋪無(wú)菌手術(shù)巾，暴露手術(shù)部位，在完全無(wú)菌狀態(tài)下進(jìn)行手術(shù)。切開(kāi)大鼠前胸壁皮膚，切斷第3到第6肋骨，露出胸腔，將肺推向一側(cè)，打開(kāi)心囊，露出心臟。從冠狀動(dòng)脈左前降支起點(diǎn)到3mm處，用6-0聚丙烯(polypropylene)結(jié)扎絲與NELATON結(jié)扎血管，1小時(shí)后再灌注。確認(rèn)無(wú)出血后，將切斷的肋骨與胸骨縫合，再縫合皮膚。手術(shù)后肌肉注射慶大霉素3mg/kg/天，共3天，防止感染。
2)、利用超聲心動(dòng)圖比較左心室前壁厚度建立大鼠心臟缺血模型后，注射陰性對(duì)照物(生理鹽水)，陽(yáng)性對(duì)照物(Tβ4)，試驗(yàn)物質(zhì)(Gly-Tβ4)。注藥后第14、28、56天利用心臟超聲心動(dòng)圖(Live 3D Echo 7500)與探針(probe15-16L)，測(cè)定各組左心室前壁厚度。
基礎(chǔ)值(第0天，給藥前)，生理鹽水組0.2682±0.01，Tβ4組0.2513±0.032，Gly-Tβ4組0.2499±0.0225，各組之間無(wú)顯著性差異。
給藥14天，生理鹽水組0.1365±0.0125，Tβ4組0.1919±0.0128，Gly-Tβ4組0.2162±0.0078，Gly-Tβ4組心臟左心室前壁厚度增加(p＜0.05)。
這些結(jié)果顯示，Gly-Tβ4能有效恢復(fù)心肌梗塞引起的左心室壁厚度的減少(見(jiàn)圖1)。
4)、利用組織學(xué)圖片比較在心室纖維化程度試驗(yàn)第56天，取心臟，以乳頭狀肌肉為準(zhǔn)，橫切心臟，做成切片。用1％福爾馬林浸泡24小時(shí)，制造石臘組織切片及玻片，進(jìn)行Masson’trichrom染色。各組之間比較采用了Image-pro PLUS ver.4.1(Media Cybernetics)方法。
心肌纖維化部分占全左心室心肌的比率為，生理鹽水組30.02±5.1％，Tβ4組23.15±2.9％(P＜0.05＝，Gly-Tβ4組15.36±2.7％(P＜0.0005＝；生理鹽水組與Tβ4組、Gly-Tβ4組之間有顯著性差異，尤其Gly-Tβ4組有非常顯著性差異。這些結(jié)果表明Gly-Tβ4能有效減少心肌梗塞引起的心肌損傷和心肌纖維化(見(jiàn)圖2)。
2.Gly-Tβ4與Tβ4對(duì)大鼠表皮損傷模型的治療效果評(píng)價(jià)1)、病態(tài)動(dòng)物模型的制作與試驗(yàn)方法為了評(píng)價(jià)Gly-Tβ4與Tβ4的藥物有效性，建立了表皮損傷的病態(tài)動(dòng)物模型——大鼠表皮損傷模型。
肌肉注射甲苯噻嗪5mg/kg；氯胺酮50mg/kg麻醉，用碘酒、酒精消毒大鼠前胸壁；完全干燥后鋪無(wú)菌手術(shù)巾，暴露手術(shù)部位，在完全無(wú)菌狀態(tài)下進(jìn)行手術(shù)。切開(kāi)大鼠后背皮膚3cm。
2)、利用電腦圖像分析系統(tǒng)測(cè)量傷口長(zhǎng)度建立大鼠心臟缺血模型后，注射陰性對(duì)照物(生理鹽水)，陽(yáng)性對(duì)照物(Tβ4)，試驗(yàn)物質(zhì)(Gly-Tβ4)。用藥后第5天利用電腦圖像分析系統(tǒng)測(cè)量傷口長(zhǎng)度。
基礎(chǔ)值(第0天，給藥前)，生理鹽水組3.15±0.21，Tβ4組3.07±0.18，Gly-Tβ4組3.13±0.11，各組之間無(wú)顯著性差異。
給藥第5天生理鹽水組2.37±0.18，Tβ4組1.62±0.13，Gly-Tβ4組1.14±0.12各組之間無(wú)顯著性差異。
這些結(jié)果顯示，Gly-Tβ4能有效促進(jìn)表皮傷口愈合(見(jiàn)圖3)。
3.Gly-Tβ4與Tβ4對(duì)大鼠角膜損傷模型的治療效果評(píng)價(jià)1)、病態(tài)動(dòng)物模型的制作與試驗(yàn)方法為了評(píng)價(jià)Gly-Tβ4與Tβ4的藥物有效性，建立了急性角膜損傷的病態(tài)動(dòng)物模型——大鼠角膜堿燒傷模型。
把直徑2毫米的濾紙片浸泡到1N的燒堿中，然后將浸泡好的濾紙片放到大鼠角膜正中央，30秒以后用PBS充分沖洗。立刻用Gly-Tβ4與Tβ4治療，4天后挖出眼球，10％甲醛固定后用石蠟包埋，沿著瞳孔視神經(jīng)平面連續(xù)切片，切好的片用圖像分析系統(tǒng)采集、分析角膜上皮恢復(fù)情況。
2)、利用利用電腦圖像分析系統(tǒng)測(cè)量角膜上皮恢復(fù)情況基礎(chǔ)值(第0天，給藥前)，生理鹽水組4.82±0.12，Tβ4組4.76±0.18，Gly-Tβ4組4.85±0.16，各組之間無(wú)顯著性差異。
給藥第4天生理鹽水組4.89±0.12，Tβ4組7.03±0.13，Gly-Tβ4組7.62±0.11，生理鹽水組與Tβ4組、Gly-Tβ4組之間有顯著性差異，尤其Gly-Tβ4組有非常顯著性差異。這些結(jié)果表明Gly-Tβ4能有效促進(jìn)角膜堿燒傷后的恢復(fù)(見(jiàn)圖4)。
權(quán)利要求
1.一種44肽胸腺素β4衍生物，該衍生物氨基酸序列為Gly-Ser-Asp-Lys-Pro-Asp-Met-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Phe-Asp-Lys-Ser-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-Glu-Lys-Asn-Pro-Leu-Pro-Ser-Lys-Glu-Thr-Ile-Glu-Gln-Glu-Lys-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser。
2.使用權(quán)利要求1中的44肽胸腺素β4衍生物作為藥物組合物主要成份，用于治療皮膚組織損傷的修復(fù)。
3.使用權(quán)利要求1中的44肽胸腺素β4衍生物作為藥物組合物主要成份，用于治療心臟組織損傷的修復(fù)。
4.使用權(quán)利要求1中的44肽胸腺素β4衍生物作為藥物組合物主要成份，用于冠心病的治療。
5.使用權(quán)利要求1中的44肽胸腺素β4衍生物作為藥物組合物主要成份，用于角膜損傷的修復(fù)。
6.權(quán)利要求1中所述的肽胸腺素β4衍生物是用基因重組方法得到。
7.權(quán)利要求1中所述的肽胸腺素β4衍生物是用化學(xué)合成方法得到。
全文摘要
本發(fā)明涉及一段具有高生物活性的胸腺素β4衍生物，本發(fā)明得到的胸腺素β4衍生物，可用于角膜、皮膚、心臟損傷的修復(fù)。
文檔編號(hào)A61P27/02GK1935838SQ20051010329
公開(kāi)日2007年3月28日 申請(qǐng)日期2005年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月23日
發(fā)明者聶李亞, 馬素永, 許松山, 文美玉 申請(qǐng)人:北京諾思蘭德生物技術(shù)有限責(zé)任公司