專(zhuān)利名稱(chēng)：膽汁酸衍生物及其醫(yī)藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及膽汁酸硝酸酯衍生物，其藥學(xué)上可接受的鹽，含有這些化合物作為活性成分的藥物組合物，及所述化合物用于制備治療肝炎等疾病的藥物的用途。本發(fā)明還涉及膽汁酸硝酸酯衍生物及其藥學(xué)上可接受鹽的制備方法。
背景技術(shù)：
病毒性肝炎、肝纖維化、肝硬化等肝臟疾病發(fā)病率高，治療難度大。全球5億多乙肝和丙肝患者中，25％將發(fā)展成為肝硬化；各種原因(酒精性、肥胖、糖尿病等)引起的脂肪肝的發(fā)展也會(huì)導(dǎo)致肝硬化。門(mén)靜脈高壓為肝硬化的主要并發(fā)癥之一，患者會(huì)出現(xiàn)食管和胃底靜脈曲張破裂出血、腹水等癥狀，是導(dǎo)致肝硬化病人死亡的重要原因。
肝臟疾病的發(fā)展是一個(gè)由量變到質(zhì)變的過(guò)程。首先，肝臟受到病毒或炎癥介質(zhì)等多種致病因素的作用引起肝損傷，造成以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)各成分的合成增多，降解減少，沉積在肝內(nèi)導(dǎo)致肝纖維化；隨著肝損傷進(jìn)一步的發(fā)展及膠原組織增生的加劇，凋亡及壞死的肝細(xì)胞數(shù)量增多，肝臟結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致肝細(xì)胞再生，假小葉形成，最終形成肝硬化；肝硬化形成后，出現(xiàn)肝內(nèi)代謝及免疫等多種功能失常，常伴隨出現(xiàn)門(mén)靜脈高壓及肝腹水等并發(fā)癥，并可能會(huì)引起肝癌的發(fā)生。
肝纖維化是一切慢性肝病的共同病理學(xué)基礎(chǔ)，是肝硬化的必經(jīng)階段。通過(guò)合理的治療，肝纖維化在進(jìn)入肝硬化階段之前尚有逆轉(zhuǎn)的可能；因此，對(duì)肝纖維化的治療非常重要。目前對(duì)肝纖維化的治療主要使用γ-干擾素(IFN-γ)、秋水仙堿、青霉胺等抑制膠原合成的抗纖維化藥物，但其治療效果并不理想。
由肝纖維化進(jìn)入肝硬化階段后，肝組織病變不斷發(fā)展，壞死性病變?cè)黾樱谓M織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致肝臟多種功能失常，并常會(huì)出現(xiàn)門(mén)靜脈高壓、肝腹水等并發(fā)癥。目前對(duì)肝硬化的主要治療方法是糾正其并發(fā)癥，并通過(guò)增加肝臟對(duì)葡萄糖、維生素及氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的補(bǔ)充，維持肝臟的功能，防止病情進(jìn)一步的惡化，對(duì)于病情嚴(yán)重的患者需要進(jìn)行肝移植。現(xiàn)有藥物對(duì)肝硬化及其并發(fā)癥門(mén)靜脈高壓、腹水等無(wú)確切的療效。
研究表明適量的一氧化氮能夠保護(hù)肝細(xì)胞，防止肝細(xì)胞凋亡，抑制肝內(nèi)炎癥的形成與發(fā)展、修復(fù)肝損傷、并具有改善肝內(nèi)血液循環(huán)、降低肝內(nèi)壓及改善肝纖維化等多種作用，對(duì)肝臟疾病發(fā)展的各個(gè)階段均有治療作用。
一氧化氮在肝內(nèi)可抑制白細(xì)胞介素(IL-1，IL-6，IL-18，IL-1β)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等多種前炎性因子的釋放，具有抑制與炎癥及細(xì)胞凋亡相關(guān)的caspase活性的作用。研究證明，一氧化氮能夠改善多種因素所致的肝損傷，減少肝細(xì)胞的壞死，抑制肝內(nèi)炎癥的形成與發(fā)展，降低肝內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶的濃度，從而可以防止肝病向纖維化方向發(fā)展。
一氧化氮還能夠抑制白細(xì)胞、血小板、噬中性粒細(xì)胞的聚集及其對(duì)血管壁粘附，具有抑制肝內(nèi)血栓形成及改善微循環(huán)等作用。同時(shí)一氧化氮能夠舒張肝內(nèi)的星形細(xì)胞，增加肝靜脈竇處的血流；并可以擴(kuò)張包括小動(dòng)脈、小靜脈在內(nèi)的多種血管的管壁，減小血流阻力，從而保證或增加血液對(duì)肝臟的灌注，進(jìn)而產(chǎn)生抗門(mén)靜脈高壓的作用。
研究表明，一氧化氮釋放藥物可通過(guò)釋放一氧化氮分子抑制肝臟炎癥的發(fā)展及肝纖維化的形成、降低門(mén)靜脈高壓，進(jìn)而產(chǎn)生治療肝硬化和門(mén)靜脈高壓的療效。但是目前臨床用于治療肝硬化的有機(jī)硝酸酯類(lèi)的一氧化氮釋放藥物，由于其體內(nèi)分布的非特異性，從而產(chǎn)生比較廣泛的全身副作用。通過(guò)肝靶向給藥的途徑能夠減少或避免常規(guī)硝酸酯類(lèi)藥物的副作用。
膽汁酸是目前唯一口服有效的小分子肝靶向載體。膽汁酸在肝細(xì)胞中由膽固醇生物合成而來(lái)，然后與甘氨酸或?；撬峤Y(jié)合，隨食物糜進(jìn)入消化道，超過(guò)95％的膽汁酸在終端回腸被重吸收，然后通過(guò)下腔靜脈再回到肝臟，如此不斷地進(jìn)行肝腸循環(huán)；成人體內(nèi)肝腸循環(huán)每天重復(fù)6至15次，參與循環(huán)的膽汁酸總量達(dá)到17-40g，因此膽汁酸具有較高的轉(zhuǎn)運(yùn)能力；膽汁酸是通過(guò)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的途徑被吸收，以膽汁酸為靶向載體能夠提高藥物的生物利用度；作為內(nèi)源性的天然配基，膽汁酸具有良好的生物兼容性，因而適合于作為靶向藥物的載體。體內(nèi)的膽汁酸由膽酸、熊去氧膽酸、鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸及石膽酸組成，其中膽酸(Cholic acid，CA)與熊去氧膽酸(Ursodeoxycholicacid，UDCA)無(wú)其它類(lèi)型膽汁酸的溶膜作用，體內(nèi)安全性好，轉(zhuǎn)運(yùn)能力強(qiáng)，因而常被選擇作為肝靶向藥物載體。熊去氧膽酸本身還具有保肝利膽等廣泛的藥理作用，可降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)，降低血脂，明顯緩解脂肪肝癥狀，對(duì)慢性肝炎也有一定的治療作用。因而，熊去氧膽酸不僅可作為藥物載體，還可與藥物產(chǎn)生協(xié)同作用。
國(guó)際專(zhuān)利WO 03095471公開(kāi)了含有硝酸酯的熊去氧膽酸的偶合物；在這些偶合物的結(jié)構(gòu)中，作為一氧化氮釋放組分的硝酸酯是通過(guò)酯鍵與載體膽汁酸連接的。其代表性化合物NCX1000的結(jié)構(gòu)如下 研究表明，NCX1000能夠有效抑制白介素、腫瘤壞死因子等多種炎性因子，對(duì)各種原因引起的肝損傷及炎癥、門(mén)靜脈高壓、肝硬化及肝纖維化均具有較好的治療作用。
但是，在NCX1000的分子中，靶向載體通過(guò)兩個(gè)酯鍵與硝酸酯成分偶聯(lián)；由于酯鍵易水解，載體部分與活性部分解離而失去靶向作用。藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明，通過(guò)酯鍵偶聯(lián)的硝酸酯類(lèi)釋放藥物，口服給藥血液中檢測(cè)不到完整的原性藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過(guò)提供具有以下式Ia和Ib所示的膽酸或熊去氧膽酸的硝酸酯衍生物解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的因載體膽汁酸與藥物之間的酯鍵易水解導(dǎo)致藥物喪失靶向作用的缺點(diǎn)因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及分別由結(jié)構(gòu)式Ia和/或Ib所示的膽酸或熊去氧膽酸的硝酸酯衍生物及其藥學(xué)上可接受的鹽 膽酸衍生物 R2＝OH熊去氧膽酸衍生物 R2＝H其中，A代表L-或D-型的絲氨酸、蘇氨酸或半胱氨酸殘基，順式或反式的3-羥脯氨酸或4-羥脯氨酸殘基；X為氧或硫。
本發(fā)明的另一方面涉及式Ia或Ib所示的膽酸或熊去氧膽酸的硝酸酯衍生物及其藥學(xué)上可接受鹽的制備方法。
本發(fā)明的另一方面涉及含有式Ia和/或Ib所示的膽酸或熊去氧膽酸的硝酸酯衍生物及其藥學(xué)上可接受鹽作為活性成分以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦型劑的藥物組合物。
本發(fā)明的另一方面涉及式Ia和/或Ib所示的膽酸或熊去氧膽酸的硝酸酯衍生物及其藥學(xué)上可接受的鹽用于制備治療肝炎、肝纖維化及肝硬化等肝臟疾病的藥物的用途。
本發(fā)明的再一方面涉及治療肝炎、肝纖維化及肝硬化等肝臟疾病的方法，所述方法包括給予有此需要的患者治療有效量的式Ia和/或Ib所示的膽酸或熊去氧膽酸的硝酸酯衍生物及其藥學(xué)上可接受的鹽。
具體地，本發(fā)明涉及式Ia和Ib所示的膽汁酸硝酸酯衍生物及其藥學(xué)上可接受的鹽 其中，R1代表反式或順式的OH；R2代表H或OH；A代表L-或D-型的絲氨酸、蘇氨酸或半胱氨酸殘基，順式或反式的3-羥脯氨酸或4-羥脯氨酸殘基；X為氧或硫。
根據(jù)本發(fā)明，上述式Ia為膽酸或熊去氧膽酸24-位羧基通過(guò)酰胺鍵與O-硝基化或S-硝基化的氨基酸的α氨基連接形成的偶合物；上述Ib為膽酸或熊去氧膽酸24-位羧基通過(guò)賴(lài)氨酸與硝基化的氨基酸連接形成的偶合物，賴(lài)氨酸的引入可能更好的控制藥物的釋放速率。
在Ia或Ib中，硝酸酯成分通過(guò)酰胺鍵連接于膽酸的載體上，保證了其在血漿中的穩(wěn)定性；而進(jìn)入肝細(xì)胞后，硝酸酯與細(xì)胞中的巰基組分形成不穩(wěn)定的S-亞硝基硫化物，進(jìn)一步分解釋放出NO分子，發(fā)揮藥理作用。同時(shí)，以氨基酸的α羧基模擬膽酸或熊去氧膽酸分子24位的羧基的負(fù)電性，最大限度的保持了膽酸或熊去氧膽酸的結(jié)構(gòu)特征，以保證其肝靶向性；連接子為天然氨基酸，具有良好的生物兼容性。
本發(fā)明還提供式Ia和Ib所示的膽酸或熊去氧膽酸的硝酸酯衍生物藥學(xué)上可接受的鹽，這些鹽可以由Ia或Ib分子中的羧基與各種陽(yáng)離子如鈉離子、鉀離子、氨離子、鈣離子、鋅離子、鎂離子或氨離子等形成。
根據(jù)本發(fā)明，目標(biāo)化合物Ia的合成路線主要有三條。
第一條合成路線為在氯化氫的醇溶液中，通過(guò)酯化先對(duì)氨基酸的羧基進(jìn)行保護(hù)，羧基保護(hù)的氨基酸分子中的羥基與五氯化磷反應(yīng)，制備鹵代的氨基酸；在DCC等縮合劑的作用下，游離的氨基再與膽酸或熊去氧膽酸分子中的羧基縮合，將縮合產(chǎn)物皂化脫去保護(hù)基，最后與硝酸銀反應(yīng)，得到目標(biāo)化合物。
以熊去氧膽酸-O-硝基絲氨酸的偶合物為例，具體合成反應(yīng)如下 第二條合成路線為羧基酯化保護(hù)的氨基酸分子中的羥基與硝酸反應(yīng)，制備硝酸酯；在DCC等縮合劑的作用下，游離的氨基再與膽酸或熊去氧膽酸分子中的羧基縮合，將縮合產(chǎn)物皂化脫去保護(hù)基，得到目標(biāo)化合物。
以熊去氧膽酸-O-硝基絲氨酸的偶合物為例，具體合成反應(yīng)如下 第三條合成路線為將羧基未經(jīng)保護(hù)的氨基酸分子中的羥基直接硝化制成硝酸酯，游離的氨基再與膽酸或熊去氧膽酸分子中的羧基縮合，得到目標(biāo)化合物。
仍以熊去氧膽酸-O-硝基絲氨酸的偶合物為例，具體合成反應(yīng)如下
根據(jù)本發(fā)明，目標(biāo)化合物Ib的合成路線為先將膽酸或熊去氧膽酸分子中的羧基與末端氨基保護(hù)的賴(lài)氨酸分子中的α-氨基縮合，脫保護(hù)，制備膽酸-賴(lài)氨酸偶合物。用BOC將O-硝基化氨基酸的氨基保護(hù)，再與膽酸-賴(lài)氨酸偶合物分子中賴(lài)氨酸的末端氨基縮合，最后將保護(hù)基BOC脫去，得到目標(biāo)分子。
以Nα-熊去氧膽酰-[Nω-(3-O-硝基-L-絲氨?；?-賴(lài)氨酸]為例，具體合成反應(yīng)如下
本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的鹽”可以是藥用無(wú)機(jī)或有機(jī)鹽。本發(fā)明式Ia和式Ib中具有堿性基團(tuán)的化合物可以與無(wú)機(jī)酸形成藥用鹽，例如硫酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽；也可與有機(jī)酸形成藥用鹽，例如乙酸鹽、草酸鹽、檸檬酸鹽、葡萄糖酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、馬來(lái)酸鹽等。本發(fā)明式Ia和式Ib中具有酸性基團(tuán)的化合物可以與堿金屬或堿土金屬形成藥用鹽，優(yōu)選但不限于鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽或鈣鹽。
本發(fā)明化合物可以單獨(dú)或以藥物組合物的形式給藥。給藥途徑可以是口服、非腸道或局部給藥，優(yōu)選口服和注射形式給藥。藥物組合物可根據(jù)給藥途徑配成各種適宜的劑型。
當(dāng)口服用藥時(shí)，本發(fā)明化合物可制成任意口服可接受的制劑形式，包括但不限于片劑、膠囊、水溶液或水懸浮液。其中，片劑使用的載體一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂。膠囊制劑使用的稀釋劑一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。水懸浮液制劑則通常是將活性成分與適宜的乳化劑和懸浮劑混合使用。任選地，以上口服制劑形式中還可加入一些甜味劑、芳香劑或著色劑。
當(dāng)皮膚局部施用時(shí)，本發(fā)明化合物可制成適當(dāng)?shù)能浉?、洗劑或霜?jiǎng)┲苿┬问?，其中將活性成分懸浮或溶解于一種或多種載體中。軟膏制劑可使用的載體包括但不限于礦物油、液體凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯、乳化蠟和水；洗劑或霜?jiǎng)┛墒褂玫妮d體包括但不限于礦物油、脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、吐溫60、十六烷酯蠟、十六碳烯芳醇、2-辛基十二烷醇、芐醇和水。
本發(fā)明化合物還可以無(wú)菌注射制劑形式用藥，包括無(wú)菌注射水或油懸浮液或無(wú)菌注射溶液。其中，可使用的載體和溶劑包括水、林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。另外，滅菌的非揮發(fā)油也可用作溶劑或懸浮介質(zhì)，如單甘油酯或二甘油酯。
另外需要指出，本發(fā)明化合物使用劑量和使用方法取決于諸多因素，包括患者的年齡、體重、性別、自然健康狀況、營(yíng)養(yǎng)狀況、化合物的活性強(qiáng)度、服用時(shí)間、代謝速率、病癥的嚴(yán)重程度以及診治醫(yī)師的主觀判斷。優(yōu)選的使用劑量介于0.01-100mg/kg體重/天。
具體實(shí)施例方式
通過(guò)下面的實(shí)施例可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述，然而，本發(fā)明的范圍并不限于下述實(shí)施例。本領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人員能夠理解，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種變化和修飾。
本發(fā)明所用的所有起始原料均市售可得。
實(shí)施例1.Nα-熊去氧膽酰-(3-O-硝基-L-絲氨酸)(Ia-1)的制備1.1 3-O-硝基-L-絲氨酸硝酸鹽的合成取發(fā)煙硝酸25毫升投入三口瓶中，冰鹽浴冷卻至-10℃；將5克絲氨酸分批加入至反應(yīng)液中，控制反應(yīng)液溫度低于0℃，攪拌下反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)畢，將反應(yīng)液滴入到100毫升乙醚中，析出沉淀，濾取沉淀，乙醚充分洗滌，干燥后得7.9克白色固體，熔點(diǎn)85-88℃，收率78％。IR(film，cm-1)3398，3005，1648，1570，1384，1285，985，845，757，643。1H-NMR(DMSO-d6)8.53(br s，3H)；4.98(q，1H)；4.85(q，1H)；4.50(br s，1H)。MS(FAB m/e)211.9(M+HNO3-1)，299.1(2M-1)。
1.2Nα-熊去氧膽酰-(3-O-硝基-L-絲氨酸)(Ia-1)的合成將1.9克(8.9毫摩爾)3-O-硝基-L-絲氨酸硝酸鹽在冰浴下溶解于17.8毫升1N氫氧化鈉溶液中，并將混合液泠卻至0℃。取熊去氧膽酸3.5克(8.9毫摩爾)溶解于45毫升四氫呋喃中，在冰鹽浴下冷卻至-15℃；依次加入1.06毫升N-甲基嗎啡啉、1.29毫升氯甲酸異丁酯，在冰鹽浴下反應(yīng)8-10分鐘。將絲氨酸硝酸酯混合液加入到反應(yīng)液中，冰浴下攪拌1.5小時(shí)。反應(yīng)畢，用5％的檸檬酸調(diào)節(jié)PH值至3-4，用乙酸乙酯提取3次，合并乙酸乙酯層，依次用5％檸檬酸、飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鎂干燥過(guò)夜。過(guò)濾，減壓除去溶劑，柱層析分離(石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇＝4∶4∶1)，得白色固體3.8克，熔點(diǎn)130-134℃，收率81％。TLC∶Rf＝0.4-0.5，石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶冰醋酸＝4∶4∶1∶2.1H-NMR(DMSO-d6)12.09(br m，1H)；8.08(br s，1H)；5.58(m，1H)；4.57(m，2H)；2.24(br m，2H)；1.99(s，3H)；1.95-0.84(brm，甾環(huán)CH2和CH)；0.89(d，3H，J＝8.1Hz)；0.61(s，3H)。MS(FABm/e)523.6(M-1)1047.9(2M-1)。
實(shí)施例2.Nα-熊去氧膽酰-(3-O-硝基-D-絲氨酸)(Ia-2)的制備以D-絲氨酸代替L-絲氨酸，參照實(shí)施例1.1的方法，得到3-O-硝基-D-絲氨酸硝酸鹽，收率72％，熔點(diǎn)87-91℃。1H-NMR(DMSO-d6)8.49(brs，3H)5.01(br m，2H)4.68(br m，1H)。MS(FAB m/e)151.1(M+1)301.0.1(2M+1)。
用3-O-硝基-D-絲氨酸硝酸鹽代替3-O-硝基-L-絲氨酸硝酸鹽，參照實(shí)施例1.2的方法得到目標(biāo)化合物Ia-2。收率74％，熔點(diǎn)133-136℃。1H-NMR(DMSO-d6)13.16(br m，1H)；8.38(d，1H，J＝7.0Hz)；4.84(m，1H)；4.68(m，2H)；2.16(br m，2H)；1.99(s，3H)；1.95-0.84(brm，甾環(huán)CH2和CH)；0.89(d，3H，J＝8.1Hz)；0.61(s，3H)。
實(shí)施例3.Nα-膽酰-(3-O-硝基-L-絲氨酸)(Ia-3)的制備以膽酸代替熊去氧膽酸，參照實(shí)施例1.2的方法，得到目標(biāo)化合物Ia-3。收率71％，熔點(diǎn)133-136℃。1H-NMR(DMSO-d6)13.11(br m，1H)；8.38(d，1H，J＝7.2Hz)；4.81(brd，1H)；4.69(m，2H)；3.78(s，1H)；3.61(s，1H)；3.39(q，2H)；3.18(br m，1H)；2.23-1.07(br m，甾環(huán)CH2和CH)；0.93(d，3H，J＝5.9Hz)；0.81(s，3H)；0.58(s，3H)。
實(shí)施例4.Nα-膽酰-(3-O-硝基-D-絲氨酸)(Ia-4)的制備以D-絲氨酸代替L-絲氨酸，膽酸代替熊去氧膽酸，參照實(shí)施例1的方法，得到目標(biāo)化合物Ia-4。收率79％，熔點(diǎn)134-136℃。MS(FABm/e)542.7(M-1).1H-NMR(DMSO-d6)13.19(br m，1H)；8.39(d，1H，J＝7.6Hz)；4.84(m，1H)；4.68(m，2H)；3.78(s，1H)；3.62(s，1H)；3.39(q，2H)；3.19(br m，1H)；2.23-1.08(br m，甾環(huán)CH2和CH)；0.94(d，3H，J＝6.4Hz)；0.81(s，3H)；0.58(s，3H)。
實(shí)施例5.Nα-熊去氧膽酰-(3-O-硝基-L-蘇氨酸)(Ia-5)的制備以L-蘇氨酸代替L-絲氨酸，參照實(shí)施例1.1的方法，得到3-O-硝基-L-蘇氨酸硝酸鹽，收率81％，熔點(diǎn)125-127℃。1H-NMR(DMSO-d6)8.91(br s，3H)5.59(m，1H，)4.33(br s，1H，)1.46(d，1H，J＝6.7)。
用3-O-硝基-L-蘇氨酸硝酸鹽代替3-O-硝基-L-絲氨酸硝酸鹽，參照實(shí)施例1.2的方法得到目標(biāo)化合物Ia-5。收率83％，熔點(diǎn)138-142℃。1H-NMR(DMSO-d6)13.16(br m，1H)；8.38(d，1H，J＝9.0Hz)；5.59(br m，1H，J＝3.9和6.7Hz)；4.74(dd，1H，J＝9.0和3.9Hz)；4.02(q，2H)；2.21(br m，2H)；1.99(s，3H)；1.95-0.82(br m，甾環(huán)CH2和CH)；1.27(d，3H，J＝6.7Hz)；0.89(d，3H，J＝6.7Hz)；0.61(s，3H)。
實(shí)施例6.Nα-熊去氧膽酰-(3-O-硝基-D-蘇氨酸)(Ia-6)的制備以D-蘇氨酸代替L-絲氨酸，參照實(shí)施例1.1的方法，得到3-O-硝基-D-蘇氨酸硝酸鹽，收率71％，熔點(diǎn)126-128℃。1H-NMR(DMSO-d6)δ8.89(br s，3H)5.56(m，1H，)4.31(br s，1H，)1.42(d，1H，J＝6.7)。
用3-O-硝基-D-蘇氨酸硝酸鹽代替3-O-硝基-L-絲氨酸硝酸鹽，參照實(shí)施例1.2的方法得到目標(biāo)化合物Ia-6。收率85％，熔點(diǎn)135-139℃。1H-NMR(DMSO-d6)13.16(br m，1H)；8.37(d，1H，J＝9.0Hz)；5.60(br m，1H，J＝3.9和6.4Hz)；4.78(dd，1H，J＝9.0和3.9Hz)；4.02(q，1H)；2.21(br s，2H)；1.99(s，3H)；1.95-0.84(br m，甾環(huán)CH2和CH)；1.28(d，3H，J＝6.4Hz)；0.89(d，3H，J＝6.4Hz)；0.60(s，3H)。
實(shí)施例7.Nα-膽酰-(3-O-硝基-L-蘇氨酸)(Ia-7)的制備以膽酸代替熊去氧膽酸，3-O-硝基-L-蘇氨酸硝酸鹽代替3-O-硝基-L-絲氨酸硝酸鹽，參照實(shí)施例1.2的方法得到目標(biāo)化合物Ia-7。收率75％，熔點(diǎn)140-142℃。1H-NMR(DMSO-d6)13.17(br m，1H)；8.41(d，1H，J＝9.0Hz)；5.60(br m，1H)；4.76(dd，1H，J＝9.0和3.9Hz)；4.34(br s，1H)；4.12(br s，1H)；4.04(br s，1H)；3.79(br s，1H)；3.61(br s，1H)；3.39(q，2H)；3.18(br m，1H)；2.26-1.11(br m，甾環(huán)CH2和CH)；0.95(d，3H，J＝6.2Hz)；0.81(s，3H)0.58(s，3H)。
實(shí)施例8.Nα-膽酰-(3-O-硝基-D-蘇氨酸)(Ia-8)的制備以膽酸代替熊去氧膽酸，3-O-硝基-D-蘇氨酸硝酸鹽代替3-O-硝基-L-絲氨酸硝酸鹽，參照實(shí)施例1.2的方法，得到目標(biāo)化合物Ia-8。收率81％，熔點(diǎn)139-143℃。1H-NMR(DMSO-d6)13.09br m，1H)；8.34(d，1H，J＝9.0Hz)；5.56(br m，1H)；4.74(dd，1H，J＝9.0和3.9Hz)；4.26(br s，1H)；4.04(br s，1H)；3.94(br s，1H)；3.75(br s，1H)；3.57(br s，1H)；3.35(q，2H)；3.14(br m，1H)；2.16-1.05(br m，甾環(huán)CH2和CH)；0.91(d，3H，J＝6.1Hz)；0.77(s，3H)；0.53(s，3H)。
實(shí)施例9.Nα-熊去氧膽酰-(反式-4-O-硝基-羥基-L-脯氨酸)(Ia-9)的制備以反式-4-羥基-L-脯氨酸代替L-絲氨酸，參照實(shí)施例1.1的方法，得到反式-4-O-硝基-羥基-L-脯氨酸硝酸鹽。收率76％，熔點(diǎn)129-131℃。
用反式-4-O-硝基-羥基-L-脯氨酸硝酸鹽代替3-O-硝基-L-絲氨酸硝酸鹽，參照實(shí)施例1.2的方法得到目標(biāo)化合物Ia-9。收率77％，熔點(diǎn)133-136℃。1H-NMR(DMSO-d6)12.69(br m，1H)；5.65(s，1H)；5.57(br s，0.5H)；4.65(t，0.5H)；4.46(t，1H)；4.04(q，1H)；3.93(brm，4H)；2.36(br m，1H)；2.26(br m，1H)；2.15(br m，1H)；1.99(s，3H)；1.95-0.84(br m，甾環(huán)CH2和CH)；0.90(d，3H，J＝6.4Hz)；0.62(s，3H)。
實(shí)施例10.Nα-膽酰-(反式-4-O-硝基-羥基-L-脯氨酸)(Ia-10)的制備用膽酸代替熊去氧膽酸，反式-4-O-硝基-羥基-L-脯氨酸硝酸鹽代替3-O-硝基-L-絲氨酸硝酸鹽，參照實(shí)施例1.2的方法得到目標(biāo)化合物Ia-10。收率83％，熔點(diǎn)131-134℃。1H-NMR(DMSO-d6)δ12.83(brm，1H)；5.65(s，1H)；5.57(br s，0.5H)；4.64(t，0.5H)；4.24(t，1H)；4.11(br s，1H)；4.03(q，1H)；3.93(br m，2H)；3.79(br s，1H)；3.39(q，1H)；3.21(br m，1H)；2.65-0.81(br m，甾環(huán)CH2和CH)；0.95(d，3H，J＝6.2Hz)；0.81(s，3H)；0.59(s，3H)。
實(shí)施例11.Nα-熊去氧膽酰-[Nω-(3-O-硝基-L-絲氨?；?-賴(lài)氨酸](Ib-1)的制備11.1Nα-叔丁氧羰基-3-O-硝基-L-絲氨酸的合成取5.8克(22.6毫摩爾，1.2倍量)BOC酸酐溶解于20毫升的二氧六環(huán)中，制成BOC溶液。將44毫升1N的氫氧化鈉與20毫升二氧六環(huán)的混合溶液用冰浴冷卻至0℃，加入4.7克(22.1毫摩爾)3-O-硝基-L-絲氨酸；冰浴下交替加入BOC酸酐溶液與22毫升1N氫氧化鈉溶液，冰浴下攪拌1小時(shí)。反應(yīng)畢，將反應(yīng)液加至100毫升冰水中，用30毫升乙醚提取三次，水層中加入50毫升乙酸乙酯，攪拌下以5％檸檬酸酸化PH值至3，分出乙酸乙酯層，水層用50毫升乙酸乙酯提取二次；合并乙酸乙酯層，飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鎂干燥，減壓除去溶劑，得無(wú)色粘稠液體4.8克。收率87％。TLC∶Rf＝0.7，展開(kāi)劑＝石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶冰醋酸＝4∶4∶1∶0.03。
11.2Nα-熊去氧膽酰-(Nω-芐氧羰基賴(lài)氨酸)的合成將11.8克(42.1毫摩爾)Nω-芐氧羰基賴(lài)氨酸溶于160毫升1N氫氧化鈉溶液中，并將混合液泠卻至0℃。取熊去氧膽酸15克(38.2毫摩爾)溶解于110毫升四氫呋喃中，在冰鹽浴下冷卻至-15℃；依次加入4.20毫升N-甲基嗎啡啉、5.02毫升氯甲酸異丁酯，在冰鹽浴下反應(yīng)8-10分鐘。將Nω-芐氧羰基賴(lài)氨酸的溶液加入到反應(yīng)液中，冰浴下攪拌1.5小時(shí)，除去冰浴，在室溫下攪拌2小時(shí)。反應(yīng)畢，以5％的檸檬酸酸化PH值至3，用乙酸乙酯提取3次，合并乙酸乙酯層，依次用5％檸檬酸、飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鎂干燥。減壓除去溶劑，柱層析分離(展開(kāi)劑＝石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇＝4∶4∶0.3)，得白色固體18.1克，收率91％。TLC∶Rf＝0.3-0.4，展開(kāi)劑＝石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶冰醋酸＝4∶4∶1∶2。
11.3 2.2.3Nα-熊去氧膽酰-賴(lài)氨酸的合成取Nα-熊去氧膽酰-(Nω-芐氧羰基賴(lài)氨酸)4.1克(6.26毫摩爾)溶于40毫升甲醇，加入1克10％Pd-C，室溫下通入氫氣，攪拌下反應(yīng)36小時(shí)。反應(yīng)畢，將反應(yīng)液過(guò)濾，回收催化劑；濾液減壓除去溶劑，得白色固體3.3克，熔點(diǎn)215-220℃，收率99％。
11.4Nα-熊去氧膽酰-[Nω-(Nα-叔丁氧羰基-3-O-硝基-L-絲氨?；?-賴(lài)氨酸]的合成將2.4克(4.6毫摩爾)Nα-熊去氧膽酰-賴(lài)氨酸溶于含4.6毫摩爾氫氧化鈉的25毫升水溶液中，并將混合液泠卻至5℃。取2.1克(8.4毫摩爾)Nα-叔丁氧羰基-3-O-硝基-L-絲氨酸溶解于40毫升四氫呋喃中，在冰鹽浴下冷卻至-15℃；依次加入0.92毫升(8.4毫摩爾)N-甲基嗎啡啉、1.10毫升(8.4毫摩爾)氯甲酸異丁酯，在冰鹽浴下反應(yīng)8-10分鐘。將Nα-熊去氧膽酰-賴(lài)氨酸溶液加入到反應(yīng)液中，冰浴下攪拌1.5小時(shí)。反應(yīng)畢，以5％的檸檬酸酸化至PH 3，用乙酸乙酯提取3次，合并乙酸乙酯層，依次用5％檸檬酸、飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鎂干燥。減壓除去溶劑，柱層析分離(石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇＝4∶4∶1)，得白色固體2.53克，產(chǎn)物144-151℃分解，收率73％。TLC∶Rf＝0.7-0.8，展開(kāi)劑＝石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶冰醋酸＝4∶4∶1∶2。
11.5Nα-熊去氧膽酰-[Nω-(3-O-硝基-L-絲氨?；?-賴(lài)氨酸](Ib-1)的制備取0.5克(0.66毫摩爾)Nα-熊去氧膽酰-[Nω-(Nα-叔丁氧羰基-3-O-硝基-L-絲氨酰基)-賴(lài)氨酸]溶于25毫升二氧六環(huán)中，室溫下加入干燥4N鹽酸二氧六環(huán)10毫升，攪拌下反應(yīng)30分鐘，濾取沉淀，乙醚充分洗滌，充分干燥，得白色固體0.53克，熔點(diǎn)162-167℃，收率77％。TLC∶Rf＝0.5，展開(kāi)劑異丙醇∶甲醇∶氨水＝8∶2∶0.1。1H-NMR(DMSO-d6)7.46(br s，1H)4.12(br m，2H)3.90(m，1H)3.72(m，1H)3.71(br s，1H)3.65(br m，2H)1.83-0.25(br m，甾環(huán)CH2和CH)。
實(shí)施例12.Nα-熊去氧膽酰-[Nω-(3-O-硝基-L-蘇氨?；?-賴(lài)氨酸](Ib-2)的制備以3-O-硝基-L-蘇氨酸代替3-O-硝基-L-絲氨酸，參照實(shí)施例11.1的方法，得到Nα-叔丁氧羰基-3-O-硝基-L-蘇氨酸。
用Nα-叔丁氧羰基-3-O-硝基-L-蘇氨酸代替Nα-叔丁氧羰基-3-O-硝基-L-絲氨酸，參照實(shí)施例11.4的方法，得到Nα-熊去氧膽酰-[Nω-(Nα-叔丁氧羰基-3-O-硝基-L-蘇氨?；?-賴(lài)氨酸]。
用Nα-熊去氧膽酰-[Nω-(Nα-叔丁氧羰基-3-O-硝基-L-蘇氨?；?-賴(lài)氨酸]代替Nα-熊去氧膽酰-[Nω-(Nα-叔丁氧羰基-3-O-硝基-L-絲氨酰基)-賴(lài)氨酸]，參照實(shí)施例11.5的方法，得到Nα-熊去氧膽酰-[Nω-(3-O-硝基-L-蘇氨?；?-賴(lài)氨酸](Ib-2)，熔點(diǎn)172-178℃。MS(FABm/e)667.6(M+1)；。1H-NMR(DMSO-d6)8.13(d，1H，J＝5.9Hz)；7.20(br d，1H)；5.32(m，2H)；4.42(d，1H，J＝3.9Hz)；3.87(d，1H，J＝6.7)；3.71(br s，1H)；3.03(br m，2H)；2.02-0.84(br m，甾環(huán)CH2和CH)；1.24(s，3H)；0.89(d，3H，J＝7.6Hz)；0.61(s，3H)。
實(shí)施例13.Nα-熊去氧膽酰-[Nω-(3-O-硝基羥脯?；?-賴(lài)氨酸](Ib-3)的合成以3-O-硝基-羥脯氨酸代替3-O-硝基-L-絲氨酸，參照實(shí)施例11.1的方法，得到Nα-叔丁氧羰基-3-O-硝基-羥脯氨酸。
用Nα-叔丁氧羰基-3-O-硝基-羥脯氨酸代替Nα-叔丁氧羰基-3-O-硝基-L-絲氨酸，參照實(shí)施例11.4的方法，得到Nα-熊去氧膽酰-[Nω-(Nα-叔丁氧羰基-3-O-硝基-L-羥脯?；?-賴(lài)氨酸]。
用Nα-熊去氧膽酰-[Nω-(Nα-叔丁氧羰基-3-O-硝基-L-羥脯?；?-賴(lài)氨酸]代替Nα-熊去氧膽酰-[Nω-(Nα-叔丁氧羰基-3-O-硝基-L-絲氨?；?-賴(lài)氨酸]，參照實(shí)施例11.5的方法，得到Nα-熊去氧膽酰-[Nω-(3-O-硝基-羥脯?；?-賴(lài)氨酸](Ib-3)，熔點(diǎn)164-168℃。MS(FABm/e)677.9(M-1)713.9(M+HCl-1)；1H-NMR(DMSO-d6)10.16(br m，1H)；8.99(br s，1H)；8.58(br s，1H)；8.07(m，1H)；5.71(t，1H)；4.15-3.57(m，6H)；3.41(q，1H)；3.37(br m，2H)；3.12(br m，2H)；2.25-0.90(br m，甾環(huán)CH2和CH)；1.09(s，3H)；0.88(d，3H，J＝6.5Hz)；0.61(s，3H)。
實(shí)施例14.抗CCl4中毒所致小鼠肝損傷的藥效學(xué)評(píng)價(jià)取質(zhì)量大約20-25g的Baclb/c小鼠，隨機(jī)分組，每組5只小鼠。通過(guò)口服給予不同劑量的待測(cè)化合物；1h后，按照10mL/kg的劑量，皮下注射100mL/L％的CCl4，制備肝損傷模型；皮下注射生理鹽水作為正常對(duì)照組。造模后12小時(shí)后，再次口服給予不同劑量的待測(cè)化合物。第二次給藥后24小時(shí)，處死動(dòng)物，留取血清標(biāo)本，統(tǒng)一用全自動(dòng)生化儀對(duì)于血清中的ALT，AST水平進(jìn)行檢測(cè)。評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表1。
表1.本發(fā)明化合物抗CCl4中毒所致小鼠肝損傷的治療作用

實(shí)施例15.抗對(duì)乙酰氨基酚所致小鼠肝損傷的藥效學(xué)評(píng)價(jià)取質(zhì)量大約20-25g的Baclb/c小鼠，隨機(jī)分組，每組5只小鼠。通過(guò)口服給予不同劑量的待測(cè)化合物；1h后，用100mL/kg的對(duì)乙酰氨基酚皮下注射制備肝損傷模型，皮下注射生理鹽水作為正常對(duì)照組。造模1h后，通過(guò)口服再次給予不同劑量的待測(cè)化合物。第二次給藥后24小時(shí)，處死動(dòng)物，留取血清標(biāo)本，統(tǒng)一用全自動(dòng)生化儀對(duì)于血清中的ALT，AST水平進(jìn)行檢測(cè)。評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表2。
表2.本發(fā)明化合物抗對(duì)乙酰氨基酚所致小鼠肝損傷的治療作用

由表1和表2所列四氯化碳和對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的小鼠急性損傷的藥效學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，化合物Ia1-4、Ib1-3對(duì)血清ALT、AST水平有明顯的降低作用。
權(quán)利要求
1.式Ia和Ib所示的膽汁酸硝酸酯衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽 其中，R1代表反式或順式的OH；R2代表H或OH；A代表L-或D-型的絲氨酸、蘇氨酸或半胱氨酸殘基，順式或反式的3-羥脯氨酸或4-羥脯氨酸殘基；X為氧或硫。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中的膽汁酸為膽酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中的膽汁酸為熊去氧膽酸。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的式Ia化合物的制備方法，所述方法包括(a)在氯化氫的醇溶液中，通過(guò)酯化先對(duì)氨基酸的羧基進(jìn)行保護(hù)，羧基保護(hù)的氨基酸分子中的羥基與五氯化磷反應(yīng)，制備鹵代的氨基酸；在DCC等縮合劑的作用下，游離的氨基再與膽酸或熊去氧膽酸分子中的羧基縮合，將縮合產(chǎn)物皂化脫去保護(hù)基，最后與硝酸銀反應(yīng)；或者(b)將羧基酯化保護(hù)的氨基酸分子中的羥基與硝酸反應(yīng)，制備硝酸酯；游離的氨基再與膽酸或熊去氧膽酸分子中的羧基縮合，將縮合產(chǎn)物皂化脫去保護(hù)基；或者(c)將羧基未經(jīng)保護(hù)的氨基酸分子中的羥基直接硝化制成硝酸酯，游離的氨基再與膽酸或熊去氧膽酸分子中的羧基縮合。
5.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的式Ib化合物的制備方法，所述方法包括將膽酸或熊去氧膽酸分子中的羧基與末端氨基保護(hù)的賴(lài)氨酸分子中的α-氨基縮合并脫保護(hù)，制備膽酸-賴(lài)氨酸偶合物，然后用BOC將O-硝基化氨基酸的氨基保護(hù)，再與膽酸-賴(lài)氨酸偶合物分子中賴(lài)氨酸的末端氨基縮合，最后脫去保護(hù)基BOC。
6.含有式Ia和/或Ib所示的化合物或其藥學(xué)上可接受鹽作為活性成分以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦型劑的藥物組合物。
7.權(quán)利要求6的藥物組合物，其以溶液劑、片劑、膠囊或注射劑的形式存在。
8.式Ia和/或Ib所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽用于制備治療肝炎、肝纖維化及肝硬化等肝臟疾病的藥物的用途。
9.治療肝炎、肝纖維化及肝硬化等肝臟疾病的方法，所述方法包括給予有此需要的患者治療有效量的式Ia和/或Ib所示的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽。
全文摘要
本發(fā)明涉及式Ia和Ib所示的膽汁酸硝酸酯衍生物，其藥學(xué)上可接受的鹽，含有這些化合物作為活性成分的藥物組合物，所述化合物的制備方法及其用于制備治療肝炎等疾病的藥物的用途，其中，R1代表反式或順式的OH；R2代表H或OH；A代表L－或D－型的絲氨酸、蘇氨酸或半胱氨酸殘基，順式或反式的3－羥脯氨酸或4－羥脯氨酸殘基；X為氧或硫。
文檔編號(hào)A61K9/08GK1908001SQ200510089019
公開(kāi)日2007年2月7日 申請(qǐng)日期2005年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月3日
發(fā)明者仲伯華, 李宏武, 劉河, 陳蘭福, 吳波 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所