專利名稱：含精－甘－天冬氨酸序列環(huán)肽及其主動靶向脂質(zhì)體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬制藥和臨床藥學(xué)領(lǐng)域，涉及一種含有精-甘-天冬氨酸(RGD)序列的整合素受體配體的多肽序列及其環(huán)合形式，以及構(gòu)建整合素受體介導(dǎo)的、針對肝星狀細(xì)胞的主動靶向脂質(zhì)體和醫(yī)藥用途。具體涉及含有精-甘-天冬氨酸(RGD)序列的環(huán)肽及其主動靶向脂質(zhì)體，制備方法和治療肝纖維化的用途。
背景技術(shù)：
肝纖維化是一切慢性肝病共同病理學(xué)基礎(chǔ)，是形成肝硬化的早期和必經(jīng)階段，據(jù)統(tǒng)計，其中25％～40％最終發(fā)展為肝硬化。其病理學(xué)變化可由不同病因所致，如病毒、乙醇、寄生蟲等引起慢性肝損害后，激活肝星狀細(xì)胞(hepaticstellate cell，HSC)，促進(jìn)以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成增多、降解減少或代償不足，從而使細(xì)胞外基質(zhì)在肝臟內(nèi)異常沉積引起肝纖維化。研究表明，HSC的增生和激活是肝纖維化發(fā)生的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，是各種病因肝纖維化形成的共同中心環(huán)節(jié)(Frieman S.L.Semin Liver Dis.1990，10(1)20-29)。因此針對HSC的靶向治療有可能逆轉(zhuǎn)肝纖維化。由于HSC位于肝臟竇周隙內(nèi)，在整個肝臟細(xì)胞群中所占比例少(約5％)，設(shè)計靶向到HSC的特異性治療存在困難。
靶向制劑可利用載體將藥物選擇性地積集于作用部位而發(fā)揮藥效，以達(dá)到高效而降低毒副作用的目的，尤其是細(xì)胞毒性藥物。成功的靶向制劑應(yīng)具備定位蓄積、控制釋藥以及無毒、可生物降解三個要素。脂質(zhì)體的靶向依其表面是否帶有活性基團(tuán)分為被動靶向、主動靶向。被動靶向脂質(zhì)體不帶有活性基團(tuán)，是利用人體各器官的生理特性和差異而使脂質(zhì)體選擇性地富集于某些器官或病灶。而主動靶向是通過在脂質(zhì)體表面引入活性介導(dǎo)基團(tuán)(如配體、單克隆抗體等)，依靠其與細(xì)胞之間的親和力，使得脂質(zhì)體能夠靶向到特異性的細(xì)胞。相對于被動靶向，主動靶向的選擇特異性強(qiáng)，能將脂質(zhì)體的病灶和器官靶向提高到細(xì)胞水平的靶向。理論上可以實(shí)現(xiàn)體內(nèi)控釋，是提高藥效、降低毒性的最佳藥劑學(xué)研究方向。
1990年Klibanov等(Klibanov AL，et al.FEBS Lett，1990，268(2)235；Bume G，Biochim Biophys Acta，1990，1029(1)91)，研制出一種能在循環(huán)中存在更長時間的脂質(zhì)體，其膜中含有棕櫚酰葡萄糖苷酸或聚乙二醇(PEG)的類脂衍生物(如PEG-DSPE)，這類脂質(zhì)體常稱之為空間穩(wěn)定脂質(zhì)體(sterically stabilized liposome，SSL)或長循環(huán)脂質(zhì)體(long circulating liposome，LCL)。由于它的表面含有的親水基團(tuán)高度水合，能有效地阻止血液中許多不同組分(Lasic DD，Martin FJ，Gabizon A，et al.Biochim Biophys Acta，1991，1070(1)187)，特別是調(diào)理素與之結(jié)合，從而抑制單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)(MPS)對其的吞噬作用。由于SSL能延緩釋藥并提高對特定靶組織的選擇性，使其在許多方面更適于應(yīng)用。研究表明(LasicDD，et al.Biochim Biophys Acta，1991，1070(1)187)，SSL優(yōu)于普通脂質(zhì)體(CL)之處在于延長了在循環(huán)中的滯留時間、可減少被MPS攝取的速度與程度、能增加靶部位如腫瘤組織及感染部位的吸收、在體內(nèi)具有穿透生物屏障的能力以及具有在動物及人體內(nèi)的非劑量依賴性，即具有線性藥動學(xué)特性。
整合素(integrin)是一類細(xì)胞膜表面糖蛋白受體家族，主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的粘附，與整合素結(jié)合的配體是ECM。整合素有α、β兩個亞單位，不同組合以不同的ECM為配基，實(shí)現(xiàn)不同的功能。精-甘-天門冬氨酸(RGD)三肽序列為整合素識別的共同結(jié)合位點(diǎn)。HSC表面可以表達(dá)整合素受體，靜止態(tài)的HSC僅表達(dá)α1，其余亞單位表達(dá)較少或不表達(dá)；而激活態(tài)的HSC可以表達(dá)多種整合素受體。
目前尚無關(guān)于針對HSC、整合素受體介導(dǎo)的主動靶向脂質(zhì)體治療肝纖維化的報導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種含有精-甘-天冬氨酸(RGD)序列的環(huán)肽及其主動靶向脂質(zhì)體，本發(fā)明將環(huán)肽與脂質(zhì)體進(jìn)行連接，并可進(jìn)一步包裹藥物如干擾素，能針對肝星狀細(xì)胞表面上整合素受體，實(shí)現(xiàn)主動靶向治療肝纖維化。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供所述環(huán)肽及其主動靶向脂質(zhì)體的制備方法。
本發(fā)明所述的RGD環(huán)肽為含有八個氨基酸殘基的寡肽，氨基酸序列為為*半胱-甘-精-甘-天冬-色-脯-賴氨酸*(C*GRGDSPK*)，其中*為成環(huán)位置。其中RGD序列是肝星狀細(xì)胞表面整合素受體的結(jié)合位點(diǎn)。
上述RGD環(huán)肽通過半胱氨酸殘基與賴氨酸殘基以酰胺鍵(-CO-NH-)成環(huán)，使半胱氨酸一端含有游離巰基。
所述的RGD環(huán)肽氨基酸序列或為X*GRGDSPZ*，*表示成環(huán)位置，X代表半胱氨酸殘基，含有一個游離的巰基，Z代表任意一個能與半胱氨酸殘基成環(huán)的氨基酸。
所述的RGD環(huán)肽氨基酸序列或為X*YRGDYZ*，其中，*表示成環(huán)位置，X代表半胱氨酸殘基，其含有一個游離的巰基，Y代表丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸中至少一個氨基酸或者任意長度的氨基酸序列，不影響與靶向受體結(jié)合，Z代表任意一個能與半胱氨酸殘基成環(huán)的氨基酸。
RGD環(huán)肽上的游離巰基可以與脂質(zhì)體膜材料中的馬來酰胺-聚乙二醇類脂衍生物(MAL-PEG-DOPE)相連，將RGD環(huán)肽連接于脂質(zhì)體的表面上，反應(yīng)方程式如下述。所述的MAL-PEG-DOPE屬于生物可降解材料，主要通過腎臟排泄。
本發(fā)明所述的人工合成的含有RGD序列環(huán)肽具有以下的優(yōu)點(diǎn)1.RGD環(huán)肽中含有的精-甘-天冬氨酸(RGD)序列的是與HSC表面整合素受體特異性的結(jié)合位點(diǎn)，符合作為外源性配基的要求，即與HSC的結(jié)合具有特異性、時間和濃度的依賴性、飽和性以及競爭性抑制作用。2.RGD環(huán)肽中由酰胺鍵(-CO-NH-)成環(huán)，空間構(gòu)象穩(wěn)定，不易降解。3.RGD環(huán)肽中半胱氨酸的殘基含有活性巰基(-SH)，便于進(jìn)行修飾。4.RGD環(huán)肽屬于人工合成的功能肽，分子量小，不易引起免疫反應(yīng)。
本發(fā)明所述的脂質(zhì)體采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)-薄膜水化-擠壓法制備。所述的脂質(zhì)體包括普通脂質(zhì)體(CL)、長循環(huán)脂質(zhì)體(SSL)、RGD環(huán)肽修飾的CL(RGD-CL)、RGD環(huán)肽修飾的SSL(RGD-SSL)以及分別包裹干擾素的CL(CL-IFN)、SSL(SSL-IFN)、RGD環(huán)肽修飾的CL(RGD-CL-IFN)、RGD環(huán)肽修飾的SSL(RGD-SSL-IFN)。
所述的CL的膜材料由卵磷脂(EPC)、膽固醇(Chol)、馬來酰胺-聚乙二醇類脂衍生物(MAL-PEG33-10-DOPE)組成，其摩爾比為2∶1∶0.02。
所述的SSL的膜材料由EPC、Chol、單甲氧基聚乙二醇類脂衍生物(mPEG2000-DOPE)、MAL-PEG3310-DOPE組成，其摩爾比為2∶1∶0.1∶0.02。PEG占3.2mol％。
按照MAL-PEG-DOPE與RGD環(huán)肽摩爾比為10∶1將RGD環(huán)肽加入到制備CL或SSL的膜材料中，通過RGD環(huán)肽半胱氨酸的巰基與MAL-PEG-DOPE共價連接，即可將RGD環(huán)肽連接到脂質(zhì)體表面。通過凝膠柱層析法去除未結(jié)合的RGD環(huán)肽，即可得到RGD-CL或RGD-SSL。
本發(fā)明進(jìn)一步將待包封的干擾素(IFN)溶液分別加入到CL、SSL、RGD-CL或RGD-SSL中，冰浴下旋渦振蕩30min，通過凝膠柱層析法除去未包入的IFN。干擾素的包封率為35.6％，載藥率為104U IFN/μmol磷脂。
CL、SSL、RGD-CL、RGD-SSL、CL-IFN、SSL-IFN、RGD-CL-IFN和RGD-SSL-IFN通過擠壓法粒子均勻一致，粒徑范圍為50～200nm，優(yōu)選100nm。
本發(fā)明構(gòu)建的針對肝星狀細(xì)胞表面上整合素受體的主動靶向脂質(zhì)體，通過受體介導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)了對實(shí)驗性肝纖維化的靶向治療作用。即借助HSC表面受體與人工合成的RGD環(huán)肽的特異性相互作用，將RGD環(huán)肽標(biāo)記的、載有干擾素的主動靶向脂質(zhì)體靶向到纖維化肝臟，取得了良好的抗纖維化療效。
經(jīng)體外實(shí)驗，分離大鼠HSC，熒光示蹤法證實(shí)，所述的主動靶向脂質(zhì)體能夠特異性地與HSC結(jié)合。
體內(nèi)實(shí)驗，SPET顯像顯示RGD-SSL主要分布于肝臟，持續(xù)達(dá)24小時，主要經(jīng)腎臟和膽道排泄。通過膽總管結(jié)扎制備大鼠肝纖維化模型，采用尾靜脈注射給藥的方法，觀察RGD-SSL-IFN對肝纖維化大鼠的治療作用。結(jié)果顯示治療組肝功能指標(biāo)、血清肝纖維化指標(biāo)、肝組織羥脯氨酸含量和肝臟病理學(xué)改變均較SSL-IFN組有明顯改善；肝臟I型膠原mRNA和肝星狀細(xì)胞的α-激動蛋白表達(dá)量明顯下降，顯示了主動靶向脂質(zhì)體對大鼠肝纖維化具有良好的治療作用。


圖1是各組大鼠肝臟組織學(xué)染色，其中，HE染色(×100)肝纖維化組(A)；干擾素-脂質(zhì)體組(C)；RGD環(huán)肽-脂質(zhì)體-干擾素組(E)；Desmin染色(×400)肝纖維化組(B)；干擾素-脂質(zhì)體組(D)；RGD環(huán)肽-脂質(zhì)體-干擾素組(F)。
圖2是各組大鼠肝功能指標(biāo)，其中，1假手術(shù)組；2肝纖維化組；3干擾素-脂質(zhì)體組；4RGD環(huán)肽-脂質(zhì)體-干擾素組。與假手術(shù)組相比，△P＜0.05；與BDL組相比，*P＜0.05；與BDL+IFN-SSL相比，▲P＜0.05。(ALT丙氨基氨基轉(zhuǎn)移酶；AST天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；ALP堿性磷酸酶；TBIL總膽紅素；γ-GTγ谷氨酰轉(zhuǎn)移酶)。
圖3是各組大鼠血清肝纖維化指標(biāo)，
其中，1假手術(shù)組；2肝纖維化組；3干擾素-脂質(zhì)體組；4RGD環(huán)肽-脂質(zhì)體-干擾素組。與假手術(shù)組相比，△P＜0.05；與BDL組相比，*P＜0.05；與BDL+IFN-SSL相比，▲P＜0.05。(HA透明質(zhì)酸；PCIIIIII型前膠原；LN層粘蛋白；CIVIV型膠原)。
圖4是各組大鼠肝組織羥脯氨酸(HYP)含量(mg/g肝組織)，其中，1假手術(shù)組；2肝纖維化組；3干擾素-脂質(zhì)體組；4RGD環(huán)肽-脂質(zhì)體-干擾素組。與假手術(shù)組相比，△P＜0.05；與BDL組相比，*P＜0.05；與BDL+IFN-SSL相比，▲P＜0.05。
圖5是各組大鼠肝組織I型膠原mRNA表達(dá)，其中，1假手術(shù)組；2肝纖維化組；3干擾素-脂質(zhì)體組；4RGD環(huán)肽-脂質(zhì)體-干擾素組。AI型膠原mRNA電泳條帶；BI型膠原mRNA/GAPDHmRNA相對灰度值。與假手術(shù)組相比，△P＜0.05；與BDL組相比，*P＜0.05；與BDL+IFN-SSL相比，▲P＜0.05。
圖6是各組大鼠肝組織α肌動蛋白(α-SMA)的表達(dá)，其中，1空白對照；2假手術(shù)組；3肝纖維化組；4干擾素-脂質(zhì)體組；5RGD環(huán)肽-脂質(zhì)體-干擾素組。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 制備RGD多肽利用文獻(xiàn)報道的方法(Schnolzer M，Alewood P，Jones A，Alewood D，KentSB.Int J Pept Protein Res.1992，40(3-4)180-93)，在蛋白合成儀上固相合成半胱-甘-精-甘-天冬-色-脯-賴硫脂PAM(CysGlyArgGlyAspSerProLys-SCH2CO-Leu-PAM)樹脂。與文獻(xiàn)不同的是，Boc-氨基酸(2.2mmol)在含縮合劑(HBTU 2.0mmol)與N，N-二異丙基乙胺(DIEA20％，v/v)的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中活化3min，然后依次加入到樹脂(0.25mmol)中反應(yīng)10min。N-Boc保護(hù)基團(tuán)用三氟乙酸(TFA)去除；合成的整個過程中，DMF與二氯甲烷(DCM)用來清洗樹脂。所用氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基為Arg(Tosyl)，Asp(OcHxl)，Cys(4MeBzl)，Lys(2ClZ)，Ser(Bzl)。樹脂合成完成后，將其在0℃于含5％對甲酚(p-cresol)的無水氟化氫中攪拌1h，冷乙醚沉淀得粗品，高壓制備液相純化。將純化的樣品溶于含6M鹽酸呱啶(GuHCl)的0.25M磷酸鹽緩沖液(pH7.5)。然后加入2％(v/v)苯硫酚(thiophenol)。將溶液純化、冷凍干燥得RGD環(huán)肽。將制得的RGD環(huán)肽與異硫氰熒光素(FITC)在pH9.0的磷酸鹽緩沖液中反應(yīng)，純化、冷凍干燥得FITC-RGD環(huán)肽。經(jīng)HPLC鑒定純度＞95％。
實(shí)施例2 制備脂質(zhì)體采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)-薄膜水化-擠壓法，通過如下步驟制備脂質(zhì)體。
1.按2∶1∶0.1∶0.02(摩爾比)精密稱取蛋磷脂(EPC)、膽固醇(Chol)、單甲氧基聚乙二醇-(mPEG2000-DOPE)、馬來酰亞胺-聚乙二醇-二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(MAL-PEG3450-DOPE)，溶于氯仿，40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成透明薄膜，蒸干有機(jī)溶劑。加入磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4，22℃)充分水化。用Mini Extruder反復(fù)擠壓15次過100nm濾膜，得到均一的長循環(huán)脂質(zhì)體(SSL)。PEG占3.2mol％。
按2∶1∶0.02(摩爾比)精密稱取EPC、Chol、MAL-PEG3450-DOPE，溶于氯仿，40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成透明薄膜，蒸干有機(jī)溶劑。加入磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4，22℃)充分水化。用Mini Extruder反復(fù)擠壓15次過100nm濾膜，得到均一的普通脂質(zhì)體(CL)。
將RGD環(huán)肽按照與MAL-PEG-DOPE摩爾比10∶1加入CL或SSL的PBS溶液中，室溫(25℃)振蕩過夜，通過凝膠柱(CL-4B)層析法去除未結(jié)合的RGD環(huán)肽，即可得到RGD-CL或RGD-SSL。
將待包封的干擾素(IFN-α1b)溶液分別加入到CL、SSL、RGD-CL、RGD-SSL中，冰浴下旋渦振蕩30min，通過凝膠柱(CL-4B)層析法除去未包入的IFN，即可制得CL-IFN、SSL-IFN、RGD-CL-IFN或RGD-SSL-IFN。
在制備CL、SSL、RGD-CL或RGD-SSL的過程中，以鈣黃綠素(calcein，CF)溶液(50mmol/L)代替PBS作為水化液，其余步驟同前，即可制得CF脂質(zhì)體。以熒光分光光度計測得CF的包封率為10％(λex＝492nm，λem＝512nm)。
2.形態(tài)和粒徑研究取少量SSL和RGD-SSL稀釋后，用1％磷鎢酸負(fù)染，透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察。可見脂質(zhì)體經(jīng)RGD環(huán)肽修飾以及包裹干擾素后形態(tài)未改變，且分布均勻，呈典型的指紋結(jié)構(gòu)。用激光粒度散射儀測定脂質(zhì)體平均粒徑為98.1±23.1nm。
包封率的測定采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定干擾素包封率為35.6％，載藥率為104U IFN/μmol磷脂。采用病毒抑制法測定脂質(zhì)體包裹干擾素后活性不變。
3.其他特性選擇測定5批RGD-SSL-IFN進(jìn)行檢測。pH計測定的pH值為7.21±0.08。采用醋酸纖維素膜電泳法測定RGD-SSL-IFN帶負(fù)電荷(測定條件上下電極液0.01mol/L，pH7.4磷酸鹽緩沖液，電壓200V)。按照細(xì)管法原理用烏氏粘度計測定相對粘度，為(1.0323×10-3±3.7460×10-5)Pa.s-1。用比重瓶法測定相對密度為1.0025±1.37×10-4。
實(shí)施例3 采用熒光素和放射性同位素示蹤法考察人工合成的含有RGD序列環(huán)肽作為整合素受體配基可行性根據(jù)受體-配體結(jié)合的特性，即特異性、濃度和時間依賴性、競爭性抑制作用，將異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的RGD環(huán)肽與HSC共同孵育。結(jié)果顯示RGD環(huán)肽與HSC結(jié)合性質(zhì)符合作為受體配基的基本特征。采用3H標(biāo)記RGD環(huán)肽進(jìn)行放射性配基Scatchard分析，平衡解離常數(shù)(Kd)和每個細(xì)胞上的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(Bmax)分別為7.05×10-9mmol/L和6.79×105。
步驟如下1.分離大鼠HSC2.熒光示蹤法考察激活態(tài)HSC與環(huán)肽的結(jié)合將HSC接種于6孔板上，貼壁后，以0.25％FBS-DMEM培養(yǎng)過夜。實(shí)驗前用1％BSA-DMEM預(yù)封閉。以流式細(xì)胞儀檢測HSC結(jié)合的相對熒光強(qiáng)度。
2.1濃度-效應(yīng)關(guān)系每孔加入不同濃度的環(huán)肽，分別于4℃和37℃培養(yǎng)4h。
2.2時間-效應(yīng)關(guān)系每孔加入環(huán)肽200nmol/L，分別于4℃和37℃分別孵育0～8h。
2.3競爭抑制試驗每孔先加入不同濃度未標(biāo)記環(huán)肽，然后于反應(yīng)體系中加入200nmol/L FITC標(biāo)記的環(huán)肽，再結(jié)合4h。
3.放射性配基結(jié)合分析法測定RGD環(huán)肽與HSC結(jié)合的平衡解離常數(shù)(Kd)和每個細(xì)胞上的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(Bmax)采用氚標(biāo)記cRGD(3H-cRGD)。將0.5ml細(xì)胞懸液分別與不同濃度3H-cRGD0.1ml置于反應(yīng)管內(nèi)，補(bǔ)足體積至1ml，4℃孵育3h，冰Hank’s液中止反應(yīng)，離心棄上清，沉淀與甲酸水浴，測量沉淀放射性計數(shù)。各水平樣品均設(shè)3復(fù)管，設(shè)有總結(jié)合管(Total binding，TB)和非特異性結(jié)合管(Non-specific binding，NSB)。按Scatchard模型求出HSC與3H-cRGD結(jié)合的解離常數(shù)Kd和每個細(xì)胞表面最大結(jié)合位點(diǎn)(Bmax)。
實(shí)施例4 采用熒光素示蹤法表征表面修飾有RGD環(huán)肽脂質(zhì)體與HSC結(jié)合的特性按照實(shí)施例2制備RGD環(huán)肽修飾的包裹鈣黃綠素的脂質(zhì)體(RGD-SSL-CF)和包裹鈣黃綠素的脂質(zhì)體(SSL-CF)。將RGD-SSL-CF和SSL-CF分別與HSC共同孵育4h。結(jié)果顯示HSC攝取RGD-SSL-CF為SSL-CF的5.4倍；RGD-SSL-CF能夠特異性的與HSC結(jié)合。
步驟如下1.分離大鼠的HSC與培養(yǎng)2.熒光示蹤法考察激活態(tài)HSC與RGD環(huán)肽修飾的包裹鈣黃綠素的(RGD-SSL-CF)的結(jié)合將HSC接種于33cm2細(xì)胞培養(yǎng)皿上，以0.25％FBS-DMEM培養(yǎng)過夜。實(shí)驗前用1％BSA-DMEM預(yù)封閉。分別加入RGD-SSL-CF和SSL-CF共同孵育4h。刮除細(xì)胞，溶解于PBS(1％Triton X-100)。熒光分光光度計法檢測細(xì)胞結(jié)合的熒光強(qiáng)度(Ex＝492nm，Em＝512nm)。以熒光顯微鏡顯示RGD-SSL-CF與HSC結(jié)合情況。
實(shí)施例599m锝(99mTc)標(biāo)記脂質(zhì)體將DTPA-DOPE與磷脂按照1∶10(摩爾比)加入脂質(zhì)體膜材料中，按照實(shí)施2制備脂質(zhì)體。采用氯化亞錫(SnCl2)還原法進(jìn)行RGD環(huán)肽-脂質(zhì)體標(biāo)記99mTc。
可通過如下步驟將SnCl2溶解于0.15mol/L的鹽酸(HCl)溶液中，制備成10ug/ul的SnCl2-HCl溶液。按照0.5ml脂質(zhì)體加入SnCl2100ug，再加入99mTcO4洗脫液2mCi，混勻，室溫放置15分鐘即可備用。
實(shí)施例699mTc標(biāo)記RGD環(huán)肽修飾的脂質(zhì)體(99mTc-RGD-SSL)在正常和肝纖維化大鼠體內(nèi)分布及顯像研究采用尾靜脈注射法，考察99mTc-RGD-SSL在正常大鼠和肝纖維化大鼠體內(nèi)分布行為及SPET顯像研究。結(jié)果顯示RGD-SSL主要在肝臟濃集，持續(xù)達(dá)24小時，經(jīng)腎臟和膽道排泄。
通過如下步驟
通過正常大鼠和肝纖維化大鼠尾靜脈分別注射99mTc-RGD-SSL和99mTc-SSL0.5ml(2mCi)，于不同時間點(diǎn)進(jìn)行SPECT(single photon emission computedtomography)掃描顯像，儀器為Philips-IRIX三探頭SPECT。探頭與大鼠保持2cm的距離，采集大鼠的正位相，采集矩陣為512×512，50秒/幀，繪制出各臟器感興趣區(qū)，測定某臟器總計數(shù)/臟器感興趣區(qū)大小(counts/pixel)，即每個臟器每象素的計數(shù)。
實(shí)施例7 RGD環(huán)肽修飾的干擾素脂質(zhì)體對肝纖維化大鼠的治療作用采用尾靜脈注射給藥法，觀察RGD環(huán)肽-脂質(zhì)體-干擾素(RGD-SSL-IFN)對肝纖維化大鼠的治療作用。結(jié)果顯示治療組肝功能指標(biāo)、血清肝纖維化指標(biāo)、肝組織羥脯氨酸含量和肝臟病理學(xué)改變均較干擾素-脂質(zhì)體(SSL-IFN)組有明顯改善；肝臟I型膠原mRNA和肝星狀細(xì)胞的α-激動蛋白表達(dá)量明顯下降(圖1～6)。
通如下過步驟1.動物模型的制備和實(shí)驗分組 大鼠隨機(jī)分成4組，假手術(shù)組、模型(BDL)組、IFN-SSL治療(BDL+IFN-SSL)組、干擾素-脂質(zhì)體治療(BDL+IFN-RGD-SSL)組各10只。除假手術(shù)組外，其余各組均行雙重結(jié)扎并剪斷膽總管。假手術(shù)組，剖腹后暴露、游離膽總管上段約1cm，隨即關(guān)腹。于結(jié)扎之日起B(yǎng)DL+IFN-SSL組每周尾靜脈注射1次0.2ml(相當(dāng)于5×104U IFN)的IFN-SSL，；BDL+IFN-RGD-SSL組每周尾靜脈注射1次0.2ml IFN-RGD-SSL(相當(dāng)于5×104U IFN)的IFN-RGD-SSL；BDL組和假手術(shù)組分別給予等量的生理鹽水處理。各組大鼠連續(xù)實(shí)驗4周后，最后1次給藥24h后處死動物，留取血清和肝組織。
2.觀察指標(biāo)及檢測的內(nèi)容和方法2.1觀察大鼠一般狀態(tài)以及黃疸情況。
2.2HE和α-SMA免疫組織化學(xué)染色觀察各組大鼠肝組織病理改變。
2.3采用自動生化分析儀測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽紅素(TBIL)、堿性磷酸酶(AKP)、γ-GT(γ-谷氨酰胺)。
2.4放免法測定血清透明質(zhì)酸(HA)、III型前膠原(PCIII)、層粘蛋白(LN)、IV型膠原(CIV)含量。
2.5采用比色法測定肝組織勻漿羥脯氨酸(Hyp)，以每g肝組織Hyp含量表示。
2.6RT-PCR法檢測肝組織I型膠原mRNA表達(dá)。
肝組織總RNA的提取、cDNA的合成、共擴(kuò)增定量PCR及擴(kuò)增產(chǎn)物定量分析，擴(kuò)增產(chǎn)物以凝膠系統(tǒng)分析，膠原mRNA相對含量用I型膠原吸光度×面積與GAPDH吸光度×面積的比值表示。
2.7Western blot檢測HSCα-SMA表達(dá)。
采用兩步膠原酶灌注、密度梯度離心法分離大鼠HSC。提取蛋白，測定蛋白濃度，進(jìn)行變性SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)在尼龍膜上，5％脫脂奶粉封閉，用一抗(兔抗鼠抗體)和辣根酶標(biāo)記的二抗(驢抗兔抗體)孵育，曝光顯影。采用Biomad公司圖形分析軟件對Western blot的特異性條帶進(jìn)行灰度掃描，以積分吸光度A×mm2表示特異性條帶信號的強(qiáng)弱，從而對目的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行半定量比較。
權(quán)利要求
1.一種含有精—甘—天冬氨酸序列的環(huán)肽，其特征是含有精—甘—天冬氨酸序列，由酰胺鍵(-CO-NH-)成環(huán)，其半胱氨酸一端含有活性巰基。
2.按權(quán)利要求1所述的含有精—甘—天冬氨酸序列的環(huán)肽，其特征是所述的環(huán)肽的氨基酸序列為X*YRGDYZ*，其中，*表示成環(huán)位置，X代表半胱氨酸殘基其含有一個游離的巰基，Y代表至少一個氨基酸或者足夠長度的氨基酸序列并且不影響與靶向受體結(jié)合，Z代表任意一個能與半胱氨酸殘基成環(huán)的氨基酸。
3.按權(quán)利要求1或2所述的含有精—甘—天冬氨酸序列的環(huán)肽，其特征是所述的環(huán)肽的氨基酸序列為X*GRGDSPZ*，其中，*表示成環(huán)位置，X代表半胱氨酸殘基，其含有一個游離的巰基，Z代表至少一個氨基酸或足夠長的氨基酸序列。
4.按權(quán)利要求1或2或3所述的含有精—甘—天冬氨酸序列的環(huán)肽，其特征是所說的環(huán)肽的氨基酸序列為X*GRGDSPK*，其中，*表示成環(huán)位置，X代表半胱氨酸殘基，其含有一個游離的巰基。
5.按權(quán)利要求1或2或3或4所述的含有精—甘—天冬氨酸序列的環(huán)肽在制備與肝星狀細(xì)胞表面整合素受體結(jié)合的外源性配基中的用途。
6.一種主動靶向脂質(zhì)體，其特征是由權(quán)利要求1的RGD環(huán)肽與脂質(zhì)體組成，通過下述方法制備，將RGD環(huán)肽的半胱氨酸殘基上的游離巰基與脂質(zhì)體膜材料中的馬來酰亞胺通過共價鍵連接，反應(yīng)方程式為
7.按權(quán)利要求6所述主動靶向脂質(zhì)體，其中所述的脂質(zhì)體的膜材料由卵磷脂、膽固醇、單甲氧基聚乙二醇類脂衍生物和馬來酰胺-聚乙二醇類脂衍生物組成。
8.按權(quán)利要求7所述主動靶向脂質(zhì)體，其中所述的脂質(zhì)體的膜材料卵磷脂、膽固醇、單甲氧基聚乙二醇類脂衍生物和馬來酰胺-聚乙二醇類脂衍生物的摩爾比為2∶1∶0.1∶0.02。
9.按照權(quán)利要求7所述主動靶向脂質(zhì)體，其中所述的脂質(zhì)體的膜材料中聚乙二醇占3.2mol％。
10.按權(quán)利要求6所述主動靶向脂質(zhì)體，其特征是所述主動靶向脂質(zhì)體包裹干擾素制成載藥主動靶向脂質(zhì)體。
11.按權(quán)利要求6所述主動靶向脂質(zhì)體，其中所述的RGD環(huán)肽上的半胱氨酸殘基所含的游離巰基，是與脂質(zhì)體的結(jié)合位點(diǎn)。
12.按權(quán)利要求6所述主動靶向脂質(zhì)體，其中所述的脂質(zhì)體粒徑范圍為50～200nm。
13.按權(quán)利要求6所述主動靶向脂質(zhì)體，其中所述的脂質(zhì)體粒徑為100nm。
14.按權(quán)利要求10所述的主動靶向脂質(zhì)體在制備治療肝纖維化藥物中的用途。
15.按權(quán)利要求10所述的主動靶向脂質(zhì)體在制備靜脈注射治療肝纖維化藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬制藥和臨床藥學(xué)領(lǐng)域，涉及一種含有精—甘—天冬氨酸(RGD)序列的環(huán)肽及其主動靶向脂質(zhì)體，制備方法和用途。所述環(huán)肽結(jié)構(gòu)符合作為配基的要求，由酰胺鍵成環(huán)，空間構(gòu)象穩(wěn)定，不易降解，一端含有活性巰基，便于進(jìn)行修飾，人工合成的功能肽，分子量小，不易引起免疫反應(yīng)，作為配基與肝星狀細(xì)胞(HSC)表面整合素受體結(jié)合，構(gòu)建主動靶向脂質(zhì)體，通過受體介導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)對實(shí)驗性肝纖維化的細(xì)胞靶向治療。本發(fā)明將RGD環(huán)肽標(biāo)記的、載有干擾素的脂質(zhì)體靶向到纖維化肝臟，經(jīng)動物體內(nèi)、外證實(shí)，具有治療肝纖維化的用途，療效良好。
文檔編號A61K9/127GK1687118SQ20051002465
公開日2005年10月26日 申請日期2005年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月25日
發(fā)明者王吉耀, 杜施霖, 陸偉躍 申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院, 復(fù)旦大學(xué)