專利名稱：胰腺癌的治療的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及癌癥治療領域。更具體地，本發(fā)明是關于使用通過在N4位?；圆皇馨彰摪被缸饔玫陌疹愃莆飦碇委熞认侔?。
背景技術：
胰管腺癌是最致命的人惡性腫瘤之一，只在美國每年就有超過30,000人因其死亡。在診斷上，由于局部重病或遠端轉(zhuǎn)移的存在，只有10％～15％的這些癌癥被典型地發(fā)現(xiàn)是可以切除的。當前，在治療重癥胰腺癌中最常用的策略是用吉西他賓治療，它是誘導人胰腺癌細胞的凋亡并且能夠抑制腫瘤生長和進展的靜脈內(nèi)給藥2’-脫氧胞苷核苷類似物。盡管最大限度的藥物或外科手術治療，然而胰管腺癌病人的治療結果很不好；一組該病病人的半數(shù)存活期小于21個月。很清楚需要有新的有效的治療策略來與這一致命的疾病作斗爭。
最近，一種新的核苷類似物CS-682被說明并且在幾個皮下植入的實體瘤異種移植物中顯示出具有有效的抗腫瘤活性(Kaneko，M.，等，Proc.Amer.AIssoc.Cancer Res.(1997)38679)。CS-682是口服給藥的(1-(2-C-氰基-2-脫氧-β-D-阿拉伯-呋喃戊糖基)胞嘧啶)(CNDAC)的N4-棕櫚酰基衍生物，一種2’-脫氧胞苷類似物，其抗腫瘤作用被認為是由于其抑制DNA聚合酶和通過在DNA鏈上引入活性代謝物而誘導DNA自身-鏈斷裂的能力(Hanaoka，K.，等，Int.J.Cancer(1999)82226-236)?？诜﨏S-682已被表明在包括胃、肺、結腸和乳腺的幾種腫瘤細胞株上顯示出比它的母體化合物更有效的細胞毒活性。
CS-682效果的先前研究主要表明了該藥物在體外細胞培養(yǎng)中和非轉(zhuǎn)移皮下異種移植物模型中的有效性。只有一個現(xiàn)有研究說明了CS-682對肝轉(zhuǎn)移的效果(Wu，M.，等，Cancer Res.(2003)63(10)2477-82)。CS-682對胰腺癌的效果還未知。

發(fā)明內(nèi)容
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CS-682和同樣被保護的CNDAC類似物在長期控制和抑制胰腺癌中是有效的。這作為一種輔助治療是尤其重要的，即作為一種長期慢性治療來補充外科手術、化學治療或放射治療對腫瘤的原發(fā)去除。
因此，在一方面，本發(fā)明涉及治療患者胰腺癌的方法，該方法包括對需要這種治療的患者給予抑制或預防所述癌癥增殖的有效量的1-(2-C-氰基-2-脫氧-β-D-阿拉伯-呋喃戊糖基)胞嘧啶)(CNDAC)的N4被取代的衍生物。
在其他方面，本發(fā)明涉及將這種治療與給予其他治療劑進行聯(lián)合，和當該患者之前已經(jīng)被治療例如通過外科手術除去原發(fā)腫瘤時實施該治療。在另外一個方面，本發(fā)明涉及對于胰腺腫瘤的輔助治療有效的單位劑量的這些胞苷類似物的藥物組合物。
本公開發(fā)明的另一個方面是涉及為胰腺癌輔助治療設計的藥物組合物，其包括與至少一種藥學上可接受的賦形劑混合的單位劑量的N4被取代的CNDAC衍生物。
在另一方面，本公開的發(fā)明是涉及誘導胰腺癌細胞中的DNA自身鏈斷裂的方法，該方法包括對需要其的患者給予抑制一種或多種胰腺癌細胞增殖的有效量的含有1-(2-C-氰基-2-脫氧-β-D-阿拉伯-呋喃戊糖基)胞嘧啶)(CNDAC)的N4被取代的衍生物的藥物組合物，由此誘導該胰腺癌細胞中的DNA自身鏈斷裂。
本發(fā)明的另一方面是涉及抑制胰腺癌轉(zhuǎn)移的方法，該方法包括對需要其的患者給予抑制一種或多種胰腺癌細胞轉(zhuǎn)移的有效量的含有1-(2-C-氰基-2-脫氧-β-D-阿拉伯-呋喃戊糖基)胞嘧啶)(CNDAC)的N4被取代的衍生物的藥物組合物。
附圖簡述

圖1A和圖1B是顯示每天給予顯著量的CS-682對體重幾乎沒有影響并因此是無毒的圖。
圖2是顯示通過給予CS-682而延長的MIA-PaCa胰腺癌小鼠的存活期。
圖3A和3B顯示給予CS-682在腫瘤生長方面的結果。圖3A顯示了用紅熒光蛋白(RFP)標記的腫瘤對時間的函數(shù)的圖片。如在圖3A中顯示的，盡管對照小鼠在第16天表現(xiàn)出腫瘤的嚴重增大，但這樣的增大在給予了CS-682的小鼠中直到第33天才出現(xiàn)。圖3B是腫瘤面積對時間函數(shù)定量測量的圖。
圖4A-4C顯示對照小鼠(4A)、每天給予了40mg/kg的CS-682(4B)的小鼠和每天給予了60mg/kg的CS-682(4C)的小鼠的尸檢結果。
圖5顯示給予CS-682在原發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移方面的效果。
圖6顯示給予CS-682在原發(fā)腫瘤重量方面的效果。
本發(fā)明的實施方式根據(jù)本發(fā)明的方法，胞苷類似物的衍生物，尤其是在N4位被保護不受脫氨作用的CNDAC衍生物，在胰腺癌的無毒、可耐受的治療中是有用的，尤其是作為外科手術或其他去除原發(fā)腫瘤的輔助藥。
本發(fā)明的化合物是胞苷類似物CNDAC的衍生物。這些衍生物通過?；蚱渌m合的保護基團在胞嘧啶基團的N4位氮被保護，保護基團比如烷基或鏈烯基或炔基。也可以使用多不飽和的鏈烯基和炔基。然而優(yōu)選N4位氮被?；Ｗo，優(yōu)選被長鏈脂肪酸保護。因此，適合的保護基團包括烷基(1-20C)；鏈烯基(2-20C)；炔基(2-20C)；?；筒伙柡王；?1-24C)。這些基團可以還被生理學上可容許的取代基比如鹵素優(yōu)選氟，氨基、烷基氨基、羥基、烷氧基和任何其他生理學上可容許的取代基所取代，該取代基是不損傷N4取代基的保護效果或者不干擾該類似物的抗腫瘤效果的取代基。優(yōu)選的取代基是天然存在脂肪酸的殘基，(包括不飽和脂肪酸)比如肉豆蔻酸、硬脂酸、棕櫚酸和油酸。尤其優(yōu)選的是已經(jīng)被公認為抗腫瘤劑的化合物CS-682；在該衍生物中，取代基是來自棕櫚酸的?；?。因此，本發(fā)明優(yōu)選化合物包括但不限于1-(2-C-氰基-2-脫氧-β-D-阿拉伯-呋喃戊糖基)-N4-肉豆蔻?；奏?；1-(2-C-氰基-2-脫氧-β-D-阿拉伯-呋喃戊糖基)-N4-硬脂?；奏?；1-(2-C-氰基-2-脫氧-β-D-阿拉伯-呋喃戊糖基)-N4-棕櫚酰基胞嘧啶和1-(2-C-氰基-2-脫氧-β-D-阿拉伯-呋喃戊糖基)-N4-油?；奏?。
合成這些化合物的方法是本領域普通技術人員所熟知的，例如見美國專利5,691,319號，其全部內(nèi)容在此引入作為參考。
由于這些化合物沒有毒性，因此能長期給予這些化合物用于牽制胰腺腫瘤細胞的增殖及它們的轉(zhuǎn)移的慢性治療。此外，這些衍生物可以口服給藥這利于它們長期的使用。因此，本發(fā)明化合物能夠持續(xù)給藥幾天、幾周，典型的是1～2周，幾個月，典型的是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或更多個月，直到2年或更多年。給藥能夠按日或采用任何長期重復的其他方案進行以產(chǎn)生期望的治療效果。
術語“治療”是指在已知含有胰腺癌細胞的患者中產(chǎn)生積極結果。該積極效果可以是腫瘤消退、腫瘤生長抑制、預防或抑制轉(zhuǎn)移的形成、延長生存時間、提高生命質(zhì)量、或通過給予本發(fā)明藥物所產(chǎn)生的其他積極結果。
“輔助”治療是指在通過化學治療、放射治療和/或外科手術已經(jīng)將大部分腫瘤去除和抑制后的治療。因此，本發(fā)明方法中當治療是“輔助”治療時，該治療與其他抗腫瘤措施協(xié)同進行。
多種化療劑可以用來治療胰腺癌。這些治療劑的實例包括但不限于吉西他賓、伊立替康、紫杉醇、flavopiridol、多柔比星、伊達比星、長春新堿、依沙替康(exatecan)等。這些以及其他治療劑能夠與本發(fā)明的化合物聯(lián)合應用來治療胰腺癌。
放射治療也經(jīng)常用于治療胰腺癌。本發(fā)明的化合物能夠用作放射治療的輔助劑來增加兩種治療方案的效果。
本文說明的衍生化合物的劑量水平依賴于選擇的衍生物本身、患者病情的嚴重性、給藥的方式、患者整體的健康和主治醫(yī)師的判斷。打算劑量范圍在每天0.1～500mg/kg，優(yōu)選每天1～200mg/kg，盡管在任何具體病例中也可能超出該劑量范圍。任何給藥途徑都可以采用，包括注射遞送、經(jīng)膜途徑給藥、經(jīng)皮途徑給藥，包括皮膚貼劑、栓劑、鼻噴霧劑等，口服給藥由于對患者的方便性和可接受性而是優(yōu)選的?？诜o藥采用本領域通常已知的適合吞咽的制劑，比如膠囊、片劑、糖漿劑、散劑和調(diào)味了的組合物。適合于本發(fā)明化合物所代表的分子類型的制劑在Remington’s Pharmaceutical Sciences，最新版，Mack Publishing Co.，Easton，PA中可以找到，該文獻在本文中引入作為參考。
本發(fā)明化合物由于它們的低毒性而可以以每天為基礎長期給藥。具體地要求每天給藥或每天給藥1～5次，優(yōu)選1～2次，更優(yōu)選1次的方案是有利的。例如在一個適合方案中，該化合物以咀嚼調(diào)味片的形式每天給藥1～2次，每片中含有該化合物的量基于患者的體重是20mg/kg。因此，設計給70kg人的單個片應含有大約1.4g的活性成分。給藥更頻繁例如在飯前和飯后給藥的較低劑量，代表了又一個優(yōu)選方案。
只要是必要的，治療可以持續(xù)以防止和抑制腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移。
下列實施例用來說明本發(fā)明，但不限制本發(fā)明。
實施例1CS-682在胰腺癌小鼠模型中的效果模型采用來源于MIA-PaCa-2胰腺癌細胞株的胰腺腫瘤。
A.模型的制備MIA-PaCa-2胰腺癌細胞株從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，ND)獲得的，保存在補充有10％熱滅活胎牛血清和1％青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基(Gibco-BRL，Life Technologies，Inc.，Grand Island，NY)中，并在37℃于5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
pDsRed-2載體(Clontech Laboratories Inc.，Palo Alto，CA)用來制備穩(wěn)定表達RFP的MIA-PaCa-2克隆。該載體在相同雙順反子信息上表達RFP和新霉素的抗性基因。pDsRed-2在PT67包裝細胞中產(chǎn)生。通過用包裝細胞的反轉(zhuǎn)錄病毒上清液和DMEM對20％的融合MIA-PaCa-2細胞培養(yǎng)24小時來引發(fā)RFP轉(zhuǎn)導。此時重新補充新鮮培養(yǎng)基并讓細胞在沒有反轉(zhuǎn)錄病毒的條件下生長12小時。該操作重復進行一直到達到如使用熒光顯微鏡檢查法確定的RFP的高水平表達。然后用胰蛋白酶/EDTA收集細胞并將細胞用含有200μg/mlG418的選擇性培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)。G418的水平逐步增加到2000μg/ml。根據(jù)需要用克隆環(huán)(cylinders)分離表達了高水平RFP的克隆，并使用常規(guī)培養(yǎng)方法進行擴大培養(yǎng)和轉(zhuǎn)移。高RFP-表達克隆在沒有G418的條件下分離10代以選擇出在體內(nèi)RFP的穩(wěn)定表達。
將4～6周齡的雄性裸小鼠(NCr-nu)保持在HEPA-濾過架的屏障裝置中。用高壓縮實驗室嚙齒動物飼料(TecklandLM-485；Western Research Products，Orange，CA)喂養(yǎng)這些動物。按照實驗室動物飼養(yǎng)和使用指南(the Guidelinesfor the Care and Use of Laboratory Animals)(NIH出版號85-23)進行動物實驗，許可號為A3873-01。
以外科原位植入術(SOI)在裸小鼠內(nèi)植入紅-熒光人胰腺癌異種移植物。簡要地，將生長在裸小鼠皮下的在指數(shù)生長期的MIA-PaCa-2-RFP腫瘤進行無菌切除。在RPMI1640培養(yǎng)基中切除壞死組織，并用剪刀將保留的健康腫瘤組織剪下切成1mm3的小段。然后將小鼠麻醉并用酒精將它們的腹部滅菌。然后切開一個切口穿過左上腹部直腸旁線和腹膜。小心地暴露出胰腺并用單個8～0外科縫線(Davis-Geck，Inc.，Manati，Puerto-Rico)將兩個腫瘤段移植到該腺體中央。然后將胰腺放回到腹腔，用6～0外科縫線將腹壁和皮膚縫合。所有的操作都采用7倍顯微鏡(Olympus)和標準外科放大鏡來進行。
B.藥物劑量、給藥途徑和時間表將CS-682(1-(2-C-氰基-2-脫氧-β-D-阿拉伯-呋喃戊糖基)-N4-棕櫚酰基胞嘧啶，Sankyo Pharmaceuticals，Tokyo)以灌胃法給藥。在第一次給藥之前，將小鼠隨機分成每組10只的8組用于治療。
第1組用作陰性對照不接受治療。
第2、3和4組在安排治療的每天分別接受40、60和80mg/kg/劑量的CS-682。
第4、5、6和7組在治療的每天分別接受20、30、40和50mg/kg/劑量的CS-682兩次。
在外科原位植入后5天開始給藥，并且每周進行5次直到死亡。
C.評價方法外部、體內(nèi)整體成像至少一周一次，將小鼠稱重并且進行外部、體內(nèi)成像。這是在用纖維光學燈在470nm處照亮的熒光燈箱(Lightools Research，Encinitas，CA)中進行的。通過安裝在Hamamatsu C5810 3-片冷卻彩色CCD相機(Hamamatsu Photonics Systems，Bridgewater，NJ)上的長通濾片GG475(Chroma Technology，Battleboro，VT)來收集發(fā)射熒光。在IBM PC上直接地，或通過高分辨Sony VCRmodel SLV-R1000(Sony Corp.，Tokyo，Japan)視頻輸出連續(xù)地捕獲1024×724像素的高分辨圖象。將圖象對比度和亮度進行處理并采用Image Pro Plus 3.1軟件(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)進行分析。通過按照前述說明的定量熒光表面積來進行負荷的腫瘤實時測定(Bouvet，M，等，Cancer Res.(2002)621534-1540)。
對于直接成像和RFP熒光顯微鏡檢查法來說，當小鼠表現(xiàn)為發(fā)病前時將它們處死并使用。安樂死后，每只小鼠進行了剖腹術和胸骨切開術。通過熒光顯像如上述說明的燈箱中的RFP激發(fā)促進了原發(fā)和轉(zhuǎn)移疾病的鑒別。在進行完全身開放成像后，將實體器官去除并將它們的表面進行關于任何轉(zhuǎn)移證據(jù)的徹底檢查。然后將器官冷凍并切片成寬度為大約2mm的橫斷層面樣品，并通過裝備有50-W汞燈光源的Leica熒光體視顯微鏡模型LZ12(LeicaMicrosystems，Inc.，Bannockburn，IL)進行觀察。通過D25/60帶通濾波器和470DCXR分色鏡進行RFP的選擇激發(fā)。用上述說明的Hamatatsu照相機系統(tǒng)收集發(fā)射熒光。
D.統(tǒng)計分析采用ANOVA和用了Statistica(Statsoft，Inc.，Tulsa，OK)的Student’s t檢驗來評價給藥組之間的差別。采用時序檢驗的Kaplan-Meier分析確定存活期和治療組之間的差別。p＜0.05被認為有統(tǒng)計學意義。
采用上述技術得到了如下結果體重減少和毒性每天一次給予40mg/kg劑量的CS-682，如圖1A和1B所示的在體重上沒有觀察到減少。圖1A顯示采用40mg/kg(閉合圓形)、60mg/kg(鉆石形)、或80mg/kg(四方形)的結果。圖1B顯示采用20mg/kg(四方形)、30mg/kg(三角形)和50mg/kg(圓)的結果，每個劑量每天給藥2次。在每天給予60mg/kg時出現(xiàn)體重減少，但小于這個劑量時毒性是不顯著的。在更高的劑量時體重下降到少于基線的80％。在這些劑量，有顯著量的小鼠觀察到了毒性相關的死亡。值得注意的，40mg/kg和60mg/kg的劑量每天給藥一次比相同劑量每天給藥兩次帶來較少的體重減少和毒性。
存活期具有MIA-PaCa-2-RFP胰腺癌的沒有治療的小鼠的半數(shù)存活期是17天。口服給予CS-682在幾個劑量上顯著延長了存活期。這些結果在圖2中顯示。CS-682劑量為20mg/kg每天給藥兩次、40mg/kg每天和60mg/kg每天的半數(shù)存活期從對照組的17天分別增加到27天(p＝0.003)、35天(p＝0.0008)和36天(p＝0.002)。◆＝對照，●＝CS-682 20mg/kg每天兩次，▲＝CS-682 60mg/kg每天，■＝CS-682 40mg/kg每天。盡管在60mg/kg每天和20mg/kg每天兩次的治療組中有幾只小鼠由于毒性致死，但在存活期上還是出現(xiàn)了顯著的增長，因為尸檢中它們的原發(fā)和轉(zhuǎn)移負荷不足以解釋它們的死亡。這三個治療組的存活期延長并沒有顯著的差別(p＝0.19)。在更高的劑量時，給予CS-682并沒有使存活期延長，50mg/kg每天兩次的劑量的半數(shù)存活期為18天，30mg/kg和40mg/kg每天兩次以及80mg/kg每天的劑量的半數(shù)存活期為19天。
腫瘤生長和轉(zhuǎn)移腫瘤RFP自發(fā)熒光可以實現(xiàn)腫瘤負荷的實時、連續(xù)整體成像和定量。在對照小鼠中，在腫瘤外科原位植入后最初兩周內(nèi)發(fā)現(xiàn)了顯著的原發(fā)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移擴散(圖3A)。在SOI之后第16天，通過RFP熒光進行外部觀察鑒定這些小鼠的每只在腹腔的所有四個部分中都散布了轉(zhuǎn)移性疾病。此外，在植入后的首個16天內(nèi)在100％的對照小鼠中發(fā)現(xiàn)了惡性腹水的發(fā)生。
相反的，用CS-682治療過的小鼠直到植入后的第三和第四周才表現(xiàn)出顯著的腫瘤擴散(圖3A)。面板描述了在腫瘤植入后第8、16、和33天三個治療組中的每組一只代表性小鼠。植入后首個兩周內(nèi)對照組中在所有四個腹腔部分內(nèi)都可見腫瘤擴散。在以40mg/kg和60mg/kg每天劑量的CS-682治療的小鼠中，直到植入后的第三周和第四周才可見廣泛分布的腫瘤轉(zhuǎn)移。到第16天，發(fā)現(xiàn)對照動物具有大塊的腹腔內(nèi)腫瘤擴散，發(fā)現(xiàn)用40mg/kg每天劑量的CS-682治療過的小鼠90％具有限制于局部的疾病。在治療過的動物中腹水蓄積的頻率也較少，在檢測時40mg/kg和60mg/kg劑量每天治療了的分別是50％和10％的小鼠具有明顯的腹腔內(nèi)流體。
RFP自發(fā)熒光的定量促進每個治療劑量的實時比較(圖3B)，表明CS-682在20mg/kg每天兩次、40mg/kg每天和60mg/kg每天(在每個時間點p＜0.05)劑量時抑制胰腺癌生長的能力。值代表每個治療組中活的完整動物的外部RFP自發(fā)熒光+/-S.E.的平均面積(在每個時間點p＜0.05)?！簦綄φ?，●＝CS-68220mg/kg每天兩次，▲＝CS-682 60mg/kg每天，■＝CS-682 40mg/kg每天。
這些動物死亡后進行尸檢結果顯示于圖4A～4C。A是對照，B是CS-68240mg/kg每天，C是CS-682 60mg/kg每天。在對照組中在幾乎所有的小鼠中廣泛的原發(fā)腫瘤生長和到膈、肝、以及腸系膜的和肝門淋巴結的轉(zhuǎn)移都很明顯。在用CS-682治療的小鼠中遠端轉(zhuǎn)移的頻率較低。
沒有治療過的動物在尸檢時，在脾(100％)、腸結(100％)、肝門結(90％)、肝(80％)、腹膜后腔(60％)、膈膜(50％)、腎(30％)和肺(10％)中發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)移(圖5)。相反，以40mg/kg每天的CS-682治療抑制了在膈膜、肝門結、肝、腸結和腎中轉(zhuǎn)移的進展。在尸檢時還發(fā)現(xiàn)每天40mg/kg以上的劑量還減少轉(zhuǎn)移數(shù)量，但毒性增加。
盡管CS-682對原發(fā)胰腺腫瘤確實顯示出生長抑制效果，但該效果在每天40mg/kg時不顯著(圖6)。在尸檢時，對照小鼠中的原發(fā)腫瘤平均重量為5.163g，這與用40mg/kg劑量的CS-682治療的那些小鼠的原發(fā)重量在統(tǒng)計學上相似(3.935g，p＝0.16)。用更高的毒性劑量的CS-682進行治療確實在原發(fā)腫瘤生長上具有顯著效果(60mg/kg每天p＝0.0004，20mg/kg每天兩次p＝0.003)，但這些劑量表現(xiàn)出喪失腫瘤選擇性并且伴隨有顯著的毒性。
實施例2CS-682輔助治療對轉(zhuǎn)移胰腺癌小鼠模型中存活期率的效果對口服CS-682在轉(zhuǎn)移胰腺癌中的效果進行了研究。與沒有接受治療的、只接受化學療法的、或只接受外科手術切除的動物相比，CS-682作為外科手術切除輔助劑的給予表現(xiàn)出了延長存活期。下面討論的該研究采用了如上述討論改造了的人胰腺癌細胞株MIA-PaCa-2胰腺癌細胞株的高度攻擊性克隆，來選擇性地表達高水平的Discosoma紅色熒光蛋白。該明亮的熒光模型促進整個治療過程中腫瘤負荷的無創(chuàng)性定量。
實驗A.模型的制備在本研究中使用的MIA-PaCa-2胰腺癌細胞株和動物是按照實施例1的討論制備的，同時有下類不同之處。在原位植入MIA-PaCa-2-RFP腫瘤后，將要求外科切除原發(fā)胰腺腫瘤的治療組中的每只小鼠進行麻醉并準備用于外科手術。隨后將腹膜穿過最初的切口重開并進行鄰近結構的檢查以確保肉眼可見的疾病位于胰腺上。采用鋒利的解剖刀將所有顯著可見的腫瘤去除。使用6～0縫線達到止血。然后將腹腔以兩層縫合。
SOI之后7天，依據(jù)小鼠是否用外科手術切除、化學治療或這兩者來治療而將小鼠隨即分成每組10只的8組。第1～4組的小鼠不用外科手術治療。組1中的小鼠不接受化學療法并且用作陰性對照。組2～4中的小鼠用主要的CS-682根據(jù)下面列出的治療時間表分別以每個治療天40、50或60mg/kg的劑量進行治療。
第5～8組中的小鼠，在原位植入后7天以單盲法被外科醫(yī)生將它們的原發(fā)腫瘤進行外科切除。組5的小鼠沒有接受其他的化學療法；組6～8中的小鼠在每個治療天分別接受了40、50或60mg/kg劑量的輔助劑CS-682。
CS-682通過灌胃法給藥。在原位腫瘤植入后9天(當可以應用時在外科手術切除后2天)主要或輔助地用CS-682開始治療，并且在每個治療周給藥5次總共給5周或直到死。如下面詳述的，接受60mg/kg的組中的小鼠不耐受長期治療并且需要修改治療時間表。在這些組中，在SOI后的第1周和第2周給予9次CS-682，然后在第4周和第5周給予10次，在第3周不作治療。
B.外部體內(nèi)整體成像兩次/周，將小鼠稱重并進行外部體內(nèi)整體成像。這是在用纖維光學燈在470nm處照亮的熒光燈箱(Lightools Research，Encinitas，CA)中進行的。通過安裝在Hamamatsu C58103-片冷卻彩色CCD相機(Hamamatsu PhotonicsSystems，Bridgewater，NJ)上的長通濾片GG475(Chroma Technology，Battleboro，VT)來收集發(fā)射熒光。在IBM PC上直接地，或通過高分辨SonyVCRmodel SLV-R1000(Sony Corp.，Tokyo，Japan)視頻輸出連續(xù)地捕獲1024×724像素的高分辨圖象。將圖象對比度和亮度進行處理并采用Image Pro Plus3.1軟件(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)進行分析。通過按照前述說明的定量熒光表面積來進行腫瘤負荷的實時測定(Bouvet，M，等，CancerRes.(2002)621534-1540)。
C.直接開放成像和RFP熒光顯微鏡檢查法當小鼠表現(xiàn)為發(fā)病前時將它們處死并使用。安樂死后，每只小鼠進行了剖腹術和胸骨切開術。通過熒光顯像如上述說明的燈箱中的RFP激發(fā)促進了原發(fā)和轉(zhuǎn)移疾病的鑒別。在進行完全身開放成像后，將實體器官去除并將它們的表面進行關于任何轉(zhuǎn)移證據(jù)的徹底檢查。使用裝備有50-W汞燈光源的Leica熒光體視顯微鏡模型LZ12(Leica Microsystems，Inc.，Bannockburn，IL)來實現(xiàn)熒光顯微鏡檢查法。通過D25/60帶通濾片和470DCXR分色鏡進行RFP的選擇性激發(fā)。用上述說明的Hamatatsu照相機系統(tǒng)收集發(fā)射熒光。
D.組織學分析在尸檢時將代表性的原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移物去除固定在10％福爾馬林中，在石蠟中包埋并切片。然后將樣品用標準H&E染色法處理以備明場顯微鏡檢查。
E.統(tǒng)計學分析采用ANOVA和用了Statistica(Statsoft，Inc.，Tulsa，OK)的Student’s t檢驗來評價給藥組之間的差別。采用時序檢驗的Kaplan-Meier分析確定存活期和治療組之間的差別。p＜0.05被認為有統(tǒng)計學意義。
結果A.MIA-PaCa-2-RFP的體外形態(tài)學和生長特征表達RFP的MIA-PaCa-2細胞在光學顯微鏡下表現(xiàn)出與它們的母MIA-PaCa-2細胞株是相同的形態(tài)學。MIA-PaCa-2和MIA-PaCa-2-RFP細胞的生長比率在先前就表明是統(tǒng)計學上相等的。原發(fā)和轉(zhuǎn)移的MIA-PaCa-2-RFP胰腺腫瘤顯示用H&E染色難以區(qū)分的胰管腺癌的特征。
B.毒性分析對每只小鼠的體重和一般狀態(tài)進行了監(jiān)測并每周記錄兩次作為全身毒性的證據(jù)。沒有接受CS-682的小鼠的體重或者直到死保持恒定或者由于腹腔內(nèi)腹水蓄積而逐漸增加。主要在背部的肩胛間區(qū)產(chǎn)生的身體脂肪消耗是與擴散疾病關聯(lián)發(fā)生的通常后續(xù)發(fā)現(xiàn)。
以40mg/kg的劑量用CS-682治療沒有伴隨出現(xiàn)體重上的顯著減少。在對照組中，肩胛間身體脂肪的消耗是后續(xù)發(fā)現(xiàn)并且在沒有擴散疾病時沒有觀察到。所有小鼠即使是接受了長期治療的那些小鼠的死亡，很清楚地是由于擴散的胰腺癌所致，而不是藥物毒性。
在用50mg/kg CS-682治療的組中，長期給藥的效果不足以要求改變最初的治療方案。雖然如此，在連續(xù)CS-682治療2周以后，伴隨肩胛間消耗的身體脂肪中度下降在沒有擴散胰腺疾病時經(jīng)?？梢宰⒁獾剑@表明了給藥經(jīng)過時間的蓄積作用。該作用并不嚴重并且不會導致體重的顯著減少。即使這樣，在每個輔助治療組和主要治療組中有一只小鼠由于長期藥物毒性而致死，都是在化學治療的2個完整周以后。
盡管用60mg/kg CS-682治療的小鼠中沒有發(fā)現(xiàn)急性藥物毒性，但是在治療的最初2周內(nèi)在所有小鼠中都出現(xiàn)了蓄積副作用，要求在最初的九個劑量后終止給藥。此時，在所有動物中都發(fā)現(xiàn)嚴重的肩胛間脂肪消耗，導致在第20天體重減少了15％。由于這一點，CS-682給藥直到第4周結束，讓所有動物恢復并伴隨身體脂肪和體重增加，在這之后再重新治療2周。采用該策略，只有1只動物在第41天死于毒性。在所有其他動物中在沒有擴散胰腺疾病時沒有出現(xiàn)死亡。
C.MIA-PaCa-2-RFP腫瘤生長的體內(nèi)特征人MIA-PaCa-2-RFP胰腺腫瘤碎片SOI后，在所有沒有治療的動物中實時熒光整體光學成像顯示在原位區(qū)域生長和轉(zhuǎn)移生長方面累進的增加。早在植入后5天熒光原發(fā)腫瘤透過皮膚可見，并且在第10天在70％的動物中可見，在第14天在100％的動物中可見。遠端實體腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)展和腹腔內(nèi)腹水兩者都是早期發(fā)現(xiàn)，在第16天分別在60％和100％的動物中被鑒定。對外部可見熒光區(qū)域的無創(chuàng)性定量測量使得能夠建立體內(nèi)腫瘤生長曲線，該曲線表明在沒有治療的動物中有顯著線性的腫瘤生長率，它導致在30天所有小鼠死于疾病以及26天的半數(shù)存活期。在尸檢方面，在多個位置確認了轉(zhuǎn)移，包括膈膜、腸內(nèi)和肝門淋巴系統(tǒng)、腹膜后腔、腎和肝。
D.外科手術切除原發(fā)疾病的早期外科手術切除導致在存活期方面的微小或顯著增加(半數(shù)存活期，28天，P0.03)。在所有病例中，在任何遠端轉(zhuǎn)移沉著物的蓄積之前進行切除并且確認去除了所有肉眼能見的胰腺疾病，在第10天外部可見的熒光腫瘤區(qū)域一致地顯著降低(P0.009)。雖然如此，外科手術的益處很清楚是暫時的。在第10天后復發(fā)性腫瘤負荷逐步增加，在第14天達到了手術前水平。在這一點上，腫瘤擴大和擴散被加速了，平均腫瘤生長率與在沒有治療的組中所見的相似。如期望的那樣，外科手術切除也延緩了腹水的發(fā)展，只有20％的動物在第16天產(chǎn)生這一臨床發(fā)現(xiàn)。
E.主要用CS-682治療與我們先前的結果(13)一致的，主要用CS-682治療的給藥的受試的每個劑量都顯著提高了原位植入MIA-PaCa-2-RFP腫瘤小鼠的存活期(每個劑量P0.05)。由CS-682引起的存活期優(yōu)勢在所用的每個受試劑量中是相似的(P0.4)。以50和60mg/kg的劑量主要給予CS-682相比于單獨外科手術切除在總存活期方面產(chǎn)生顯著的增加(分別為P0.045和0.03)。
早期腫瘤生長的實時整體成像證實CS-682化學療法在存活期方面的良好效果是由于該制劑顯著降低腫瘤生長率。盡管在植入后主要用CS-682治療的小鼠比在植入后2～3周內(nèi)外科手術治療的小鼠具有更多腫瘤，CS-682的生長抑制效果比外科手術腫瘤切除的暫時效果持久，生長曲線上的交點在21天。
F.切除和輔助CS-682治療在存活期方面的最大增加是在外科手術切除后術后給予CS-682取得的。在所有的受試劑量，以這種方式治療的小鼠相比于治療對照組在存活期方面具有顯著的增加(P0.05)。在50和60mg/kg用藥法中，與只切除的相比也在存活期方面由顯著的提高(分別為P0.004和0.03)。存活期的提高在50mg/kg劑量時最顯著。在該用藥法中，小鼠具有48天的半數(shù)存活期并且30％存活了直到60天。使用熒光顯像法，這種聯(lián)合治療的生長抑制效果是很明顯的在第23天，在40％的未治療動物已經(jīng)患有擴散的疾病之后，70％的輔助50mg/kg組的動物具有大部分限制于腹部四分之一的局部疾病。在30％的用該用藥法經(jīng)歷了相當長期存活期(60天)的小鼠中，直到化學療法完成的10天才見到遠端轉(zhuǎn)移，在這時，轉(zhuǎn)移發(fā)展加速并且小鼠最終患有擴散的胰腺疾病。體內(nèi)腫瘤生長曲線的建立表明了外科手術切除和輔助劑CS-682的應用之間在抑制腫瘤生長方面有表觀協(xié)同作用。如所期望的，腹水的發(fā)展也被輔助劑治療所抑制，只有20％的動物在它們死亡時顯示出液體潴留征兆。
這些公開實施例單獨地提供以例證限于權利要求語言的公開的本發(fā)明。
權利要求
1.一種治療胰腺癌的方法，包括對需要這種治療的患者給予抑制一種或多種胰腺癌細胞增殖的有效量的包括1-(2-C-氰基-2-脫氧-β-D-阿拉伯-呋喃戊糖基)胞嘧啶(CNDAC)的N4被取代的衍生物的藥物組合物。
2.權利要求1的方法，其中給予的藥物組合物適合口服給藥。
3.權利要求1的方法，其中給予的藥物組合物中的N4被取代的衍生物包括通過N4位與取代基偶聯(lián)的CNDAC，取代基是任選取代的烷基(1-20C)；鏈烯基(2-20C)；炔基(2-20C)；?；筒伙柡王；?1-24C)。
4.權利要求3的方法，其中所述取代基是?；虿伙柡王；?。
5.權利要求4的方法，其中所述酰基是棕櫚酸、肉豆蔻酸、硬脂酸或油酸的殘基。
6.權利要求5的方法，其中所述衍生的CNDAC是CS-682(1-(2-C-氰基-2-脫氧-β-D-阿拉伯-呋喃戊糖基)-N4-棕櫚?；奏?。
7.權利要求1的方法，其中所述患者已經(jīng)用化學治療、放射治療和/或外科手術治療切除了所述一種或多種胰腺癌細胞。
8.權利要求1的方法，其還包括給予抗腫瘤劑。
9.權利要求1的方法，其中給藥持續(xù)至少兩個月的時間。
10.權利要求9的方法，其中所述給藥持續(xù)至少兩周的時間。
11.權利要求2的方法，其中所述給藥是每天進行的。
12.一種為胰腺癌輔助治療設計的藥物組合物，其包括與至少一種藥學上可接受的賦形劑混合的單位劑量的N4被取代的CNDAC衍生物。
13.權利要求12的組合物，其中所述衍生物是CS-682。
14.權利要求12的組合物，其適合口服給藥。
15.權利要求13的組合物，其適合口服給藥。
16.有效量的1-(2-C-氰基-2-脫氧-β-D-阿拉伯-呋喃戊糖基)胞嘧啶)(CNDAC)的N4被取代的衍生物在制備用于在需要其的患者中抑制一種或多種胰腺癌細胞增殖的藥物中的用途。
17.權利要求16的用途，其中該藥物適合于口服給藥。
18.權利要求16的用途，其中該N4被取代的衍生物包括在N4位取代，其中該取代基是任選取代的烷基(1-20C)；鏈烯基(2-20C)；炔基(2-20C)；酰基和不飽和?；?1-24C)。
19.權利要求18的用途，其中所述取代基是?；虿伙柡王；?。
20.權利要求19的用途，其中所述?；亲貦八?、肉豆蔻酸、硬脂酸或油酸的殘基。
21.權利要求20的用途，其中所述衍生的CNDAC是CS-682(1-(2-C-氰基-2-脫氧-β-D-阿拉伯-呋喃戊糖基)-N4-棕櫚?；奏?。
22.權利要求16的用途，其中所述患者已經(jīng)用化學治療、放射治療和/或外科手術治療去除了所述一種或多種胰腺癌細胞。
23.權利要求16的用途，其中所述藥物還包括抗腫瘤劑。
24.權利要求16的用途，其中所述藥物適合于給藥至少兩個月的時間。
25.權利要求24的用途，其中所述藥物適合于給藥至少兩周的時間。
26.權利要求25的用途，其中所述藥物適合于每天給藥。
27.一種誘導胰腺癌細胞中的DNA自身鏈斷裂的方法，該方法包括對需要其的患者給予抑制一種或多種胰腺癌細胞增殖的有效量的包括1-(2-C-氰基-2-脫氧-β-D-阿拉伯-呋喃戊糖基)胞嘧啶)(CNDAC)的N4被取代的衍生物的藥物組合物，由此誘導該胰腺癌細胞中的DNA自身鏈斷裂。
28.權利要求27的方法，其中給予的藥物組合物適合口服給藥。
29.權利要求27的方法，其中給予的藥物組合物中的N4被取代的衍生物包括通過N4位與取代基偶聯(lián)的CNDAC，取代基是任選取代的烷基(1-20C)；鏈烯基(2-20C)；炔基(2-20C)；酰基和不飽和酰基(1-24C)。
30.權利要求29的方法，其中所述取代基是?；虿伙柡王；?。
31.權利要求30的方法，其中所述酰基是棕櫚酸、肉豆蔻酸、硬脂酸或油酸的殘基。
32.權利要求31的方法，其中所述衍生的CNDAC是CS-682(1-(2-C-氰基-2-脫氧-β-D-阿拉伯-呋喃戊糖基)-N4-棕櫚?；奏?。
33.權利要求27的方法，其中所述患者已經(jīng)用化學治療、放射治療和/或外科手術治療去除了所述一種或多種胰腺癌細胞。
34.權利要求27的方法，其還包括給予抗腫瘤劑。
35.權利要求27的方法，其中給藥持續(xù)至少兩個月的時間。
36.權利要求35的方法，其中所述給藥持續(xù)至少兩周的時間。
37.權利要求28的方法，其中所述給藥是每天進行的。
38.一種抑制胰腺癌轉(zhuǎn)移的方法，該方法包括對需要其的患者給予抑制一種或多種胰腺癌細胞轉(zhuǎn)移的有效量的包括1-(2-C-氰基-2-脫氧-β-D-阿拉伯-呋喃戊糖基)胞嘧啶)(CNDAC)的N4被取代的衍生物的藥物組合物。
39.權利要求38的方法，其中所述給藥是發(fā)生在外科手術切除一種或多種胰腺癌細胞之前、之中或之后。
40.權利要求38的方法，其中所述給藥是發(fā)生在放射治療一種或多種胰腺癌細胞之前、之中或之后。
41.權利要求38的方法，其中給予的藥物組合物適合口服給藥。
42.權利要求38的方法，其中給予的藥物組合物中的N4被取代的衍生物包括通過N4位與取代基偶聯(lián)的CNDAC，取代基是任選取代的烷基(1-20C)；鏈烯基(2-20C)；炔基(2-20C)；?；筒伙柡王；?1-24C)。
43.權利要求42的方法，其中所述取代基是酰基或不飽和?；?br> 44.權利要求43的方法，其中所述酰基是棕櫚酸、肉豆蔻酸、硬脂酸或油酸的殘基。
45.權利要求44的方法，其中所述衍生的CNDAC是CS-682(1-(2-C-氰基-2-脫氧-β-D-阿拉伯-呋喃戊糖基)-N4-棕櫚?；奏?。
全文摘要
已知的抗腫瘤化合物CNDAC的N
文檔編號A61K31/7072GK1791415SQ200480013774
公開日2006年6月21日 申請日期2004年5月21日 優(yōu)先權日2003年5月21日
發(fā)明者王曉恩, 王勁偉 申請人:抗癌公司