專利名稱：Nkg2d受體的配體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及NKG2D受體的配體及其應(yīng)用，特別是涉及能與NKG2D受體特異結(jié)合的小分子多肽配體，以及這些小分子多肽的醫(yī)藥用途。
背景技術(shù)：
自然殺傷細(xì)胞(Natural Killer，NK細(xì)胞)是天然免疫系統(tǒng)的一個重要成員，通過細(xì)胞毒作用、釋放細(xì)胞因子和趨化因子來實現(xiàn)其免疫調(diào)節(jié)作用，其活性由細(xì)胞膜上一系列的激活和抑制性受體與靶細(xì)胞上的相應(yīng)配體的相互作用所產(chǎn)生的信號來介導(dǎo)。正常機體內(nèi)的NK細(xì)胞由于抑制性受體所介導(dǎo)的負(fù)調(diào)節(jié)信號占主導(dǎo)地位，處于殺傷抑制狀態(tài)，抑制性受體通過區(qū)分正常細(xì)胞和疾病狀態(tài)細(xì)胞的MHC-I類分子的變化來行使其免疫監(jiān)視功能缺失MHC-I類分子的靶細(xì)胞可以被NK細(xì)胞清除，而正常表達(dá)MHC-I類分子的靶細(xì)胞不被NK細(xì)胞殺傷。
然而，有證據(jù)表明，NK細(xì)胞的活化性受體也在NK細(xì)胞的活化和調(diào)節(jié)中扮演重要角色。NKG2D受體是NK細(xì)胞上的一個活化性受體，它和靶細(xì)胞上表達(dá)的NKG2D的配體MICA結(jié)合時，NK細(xì)胞就可以被激活，也就是說由NKG2D所介導(dǎo)的激活信號導(dǎo)致NK細(xì)胞對抑制性受體所介導(dǎo)的負(fù)調(diào)節(jié)信號不敏感，這是一些可以正常表達(dá)MHC-I類分子的靶細(xì)胞也可以被NK細(xì)胞清除的原因。CD8+T、γδT和巨噬細(xì)胞等都是行使人體正常免疫監(jiān)視功能的重要成員，NKG2D在這些細(xì)胞上都有表達(dá)，也是這些細(xì)胞的活化性受體。但是，這些細(xì)胞(NK細(xì)胞、CD8+T、γδT和巨噬細(xì)胞等)的過度激活會使它們對正常細(xì)胞產(chǎn)生攻擊，從而導(dǎo)致病理狀態(tài)，產(chǎn)生如習(xí)慣性流產(chǎn)、SLE與炎癥性腸病等自身免疫病、異體移植器官的排斥反應(yīng)。應(yīng)用免疫抑制劑是一種比較常見的治療手段，但目前應(yīng)用較多的免疫抑制劑主要具有如下缺點這些免疫抑制劑的針對性差，其抑制效應(yīng)是全方位的，長期大量應(yīng)用后會造成機體免疫能力的全面低下；易于發(fā)生繼發(fā)性感染等。也有采用下面兩種方法來進行治療使游離的MICA分子和NKG2D結(jié)合，由于能阻斷NKG2D與其配體MICA的結(jié)合位點，會降低NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞的殺傷活性(Groh V，Wu J，Yee C，Spies T.Tumour-derived soluble MICligands impair expression of NKG2D and T-cell activation.Nature 2002；419734-738)；或者使用NKG2D單抗阻斷NKG2D其配體MICA的結(jié)合，同樣會降低NK細(xì)胞的激活(LiP，Willie ST，Bauer S，Morris DL，Spies T，Strong RK.Crystal structure of the MHCclass I homolog MIC-A，a gammadelta T cell ligand.Immunity 1999；10577-584；Bauer S，Groh V，Wu J，Steinle A，Phillips JH，Lanier LL，Spies T.Activation of NK cells and Tcells by NKG2D，a receptor for stress-inducible MICA.Science 1999；285727-729)。雖然這兩種方法特異性好，均具有非常顯著的特點與明顯的優(yōu)勢，但由于MICA分子和NKG2D單抗的分子量大，氨基酸殘基數(shù)量較多，通透性低，單位體積內(nèi)的藥物有效濃度不是很高；且長期應(yīng)用后在體內(nèi)易于產(chǎn)生抗體，降低療效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供能與NKG2D受體特異結(jié)合的配體。
本發(fā)明所提供的NKG2D受體的配體，為具有下述氨基酸序列之一的多肽1)MICA-P1DGSVQ；2)MICA-P2KDLRMTLAHIK；3)MICA-P3THYHAMHADCLQ；4)MICA-P2LKTWDRETRDLTGKDLRMTLAHIKDQ；5)MICA-P3LEDAMKTKTHYHAMHADCLQELRRYLKS。
上述多肽中MICA-P1、MICA-P2和MICA-P3較短，為短肽；另外兩種MICA-P2L、MICA-P3L較長，為長肽。本發(fā)明多肽可以用人工合成方法直接合成，也可以將這些多肽的編碼基因融合或分別插入到表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，用基因工程方法生產(chǎn)。
本發(fā)明的另一個目的是提供本發(fā)明多肽的醫(yī)藥用途。
NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞等是以細(xì)胞免疫為主的自身免疫性疾病及異體移植排斥反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞上表達(dá)的NKG2D和靶細(xì)胞上表達(dá)的配體分子MICA結(jié)合后造成異常激活，導(dǎo)致病理損傷，本發(fā)明發(fā)明人通過實驗證實，本發(fā)明短肽能與NKG2D相結(jié)合，可起封閉NKG2D與MICA分子結(jié)合位點的作用，能抑制NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的異常激活，可作為NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的特異性免疫抑制劑，用于治療自身免疫疾病和異體移植的排斥反應(yīng)。
可以一種或幾種本發(fā)明多肽為活性成分，制備為治療自身免疫疾病和/或異體移植排斥的藥物。
其中，所述藥物的活性成分優(yōu)選為所述MICA-P1、所述MICA-P2和所述MICA-P3的組合物；組合物中MICA-P1、MICA-P2和MICA-P3的重量份數(shù)比優(yōu)選為為1∶2-3∶2-3。
所述藥物的活性成分另一種優(yōu)選方案為所述MICA-P1、所述MICA-P2L和所述MICA-P3L的組合物；組合物中所述MICA-P1、所述MICA-P2L和所述MICA-P3L的重量份數(shù)比優(yōu)選為1∶6-7∶6-7。
在應(yīng)用時，上述藥物需要的時候還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等，必要時還可以加入香味劑、甜味劑等。常用劑型有片劑、膠囊、軟膠囊、滴丸、注射液、凍干粉針、口服液、分散片等，均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。有效使用劑量為0.05-0.5mg/Kg/日。
本發(fā)明根據(jù)MICA分子與NKG2D的相互作用區(qū)域，以MICA分子為參考模板，設(shè)計、合成一組能與NKG2D特異結(jié)合的小分子多肽，能選擇性地降低由NK、CD8+T和巨噬細(xì)胞等異常激活所造成的細(xì)胞免疫反應(yīng)，而非全面降低機體的免疫反應(yīng)，有利于避免長期使用后所造成的易于繼發(fā)性感染的傾向；所合成的多肽分子量小，極少引起機體的免疫反應(yīng)，且溶解性好、通透性強，易于到達(dá)作用部位發(fā)揮作用，能實現(xiàn)和NKG2D單抗及可溶性的全分子MICA相同的作用，同時還避免了其副作用；本發(fā)明多肽可采用現(xiàn)有常規(guī)方法制備得到，技術(shù)成熟，可廣泛用于治療自身免疫疾病和異體移植的排斥反應(yīng)。


圖1A為MICA-NKG2D復(fù)合分子的二級結(jié)構(gòu)示意圖；圖1B為本發(fā)明多肽的參考模板在MICA-NKG2D復(fù)合分子的位置示意圖；圖2A為本發(fā)明多肽對NK92細(xì)胞殺傷Hela細(xì)胞作用的抑制效應(yīng)；圖2B為不同濃度本發(fā)明多肽對NK92細(xì)胞殺傷Hela細(xì)胞作用的抑制效應(yīng)；圖2C為本發(fā)明多肽對NK92細(xì)胞殺傷K526細(xì)胞作用的抑制效應(yīng)；圖3A為不同短肽組合對NK92細(xì)胞殺傷Hela細(xì)胞作用的抑制效應(yīng)；圖3B為本發(fā)明多肽組合物對NK92細(xì)胞殺傷Hela細(xì)胞作用的抑制效應(yīng)；圖3C為本發(fā)明多肽兩種組合(P1+P2+P3、P1+P2L+P3L)與sMICA對NK92細(xì)胞殺傷Hela細(xì)胞作用的抑制效應(yīng)比較；圖4為本發(fā)明多肽對小鼠肝臟淋巴細(xì)胞殺傷YAC-1細(xì)胞的抑制效應(yīng)；圖5為本發(fā)明多肽對小鼠肝損傷模型的治療作用。
具體實施例方式
實施例1、NKG2D受體的多肽配體1、多肽序列的設(shè)計與合成如圖1A和圖1B所示，根據(jù)NCBI提供的蛋白數(shù)據(jù)庫PDB文件，NKG2D-MICA復(fù)合體的相互作用與β1和β2鏈之間的環(huán)狀連接區(qū)有關(guān)，因此MICA的β1和β2鏈之間的環(huán)狀連接區(qū)(13-21)可以作為肽段設(shè)計的第一個參考模板；MICA的α1結(jié)構(gòu)域包含和NKG2D-A相互作用的螺旋區(qū)(70-80)，可以作為肽段設(shè)計的第二個參考模板；MICA的α2結(jié)構(gòu)域有一個由10個氨基酸殘基(152-161)構(gòu)成的螺旋區(qū)，包含和NKG2D-B相互作用的殘基，可作為肽段設(shè)計的第三個參考模板。
為便于合成，本發(fā)明多肽的氨基酸序列和其參考模板之間稍有不同，而且稍長的兩個肽段能模擬模板α1和α2的整個結(jié)構(gòu)域，共獲得5個短肽，分別命名為MICA-P1、MICA-P2、MICA-P3、MICA-P2L和MICA-P3LMICA-P1，以MICA的β1和β2鏈之間的環(huán)狀連接區(qū)(16-20)為參考模板，由5個氨基酸殘基組成，序列為DGSVQ；MICA-P2，以MICA的α1結(jié)構(gòu)域和NKG2D-A相互作用的螺旋區(qū)(72-82)為參考模板，由11個氨基酸殘基組成，序列為KDLRMTLAHIK；MICA-P3，以MICA的α2結(jié)構(gòu)域和NKG2D-B相互作用的螺旋區(qū)(156-167)為參考模板，曲12個氨基酸殘基組成，序列為THYHAMHADCLQ；MICA-P2L，以MICA的α1結(jié)構(gòu)域和NKG2D-A相互作用的螺旋區(qū)(58-84)為參考模板，由25個氨基酸殘基組成，序列為KTWDRETRDLTGKDLRMTLAHIKDQ；MICA-P3L，以MICA的α2結(jié)構(gòu)域和NKG2D-B相互作用的螺旋區(qū)(147-173)為參考模板，由27個氨基酸殘基組成，序列為EDAMKTKTHYHAMHADCLQELRRYLKS。三個短肽(MICA-P1、MICA-P2及MICA-P3)的疏水性氨基酸不超過各自氨基酸總數(shù)的50％，而且位于肽段內(nèi)部；MICA-P2與MICA-P2L、MICA-P3與MICA-P3L的參考模板在MICA蛋白中的位置相同，但長短不同。
另外，設(shè)計HLA-E功能區(qū)的無關(guān)肽(Px的序列RDTAQIFRVNLRT)作為陰性對照。
這些肽段可以采用常規(guī)的固相合成方法合成，經(jīng)HPLC純化，純度大于95％以上(王良友，陳正英，潘和平.降鈣素基因相關(guān)肽的合成.中國藥物化學(xué)雜志，1997，7(4)287-290)。
表1.合成短肽的序列及性質(zhì)

2、多肽二維結(jié)構(gòu)分析采用兩種方法(ANTHEPROT 4.3-Garnier和ANTHEPROT 4.3-Gibrat)對本發(fā)明的5個肽段進行二維結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果如表2所示，分析表明所合成的短肽的二維結(jié)構(gòu)以穩(wěn)定的α螺旋形式存在，近似于其設(shè)計參考模板的二維結(jié)構(gòu)。
表2 合成短肽的二維結(jié)構(gòu)

A.通過ANTHEPROT 4.3-Garnier方法分析的短肽的二維結(jié)構(gòu)；B.通過ANTHEPROT4.3-Gibrat方法分析的短肽的二維結(jié)構(gòu)；H代表螺旋；E代表折疊；T代表轉(zhuǎn)角；C代表無規(guī)卷曲。
實施例2、本發(fā)明多肽的抑制實驗1、短肽P1、P2、P3對NK細(xì)胞系殺傷表達(dá)MICA表面分子的細(xì)胞的抑制效應(yīng)(在實施例中P1即為MICA-P1，其他實施例表示與此相同)采用51Cr同位素細(xì)胞殺傷試驗，觀察短肽對NK細(xì)胞系殺傷表達(dá)MICA表面分子的細(xì)胞的抑制效應(yīng)。
NK細(xì)胞系-NK92細(xì)胞表達(dá)NKG2D，Hela細(xì)胞表達(dá)MICA表面分子，本實驗分別采用NK92細(xì)胞和Hela細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞，加入各條肽的不同組合、不同濃度的溶液進行實驗，實驗用51Cr同位素釋放法測定NK92細(xì)胞的殺傷效率(在實施例中每實驗組平行對照不少于3個，其他實施例與此相同)。
效靶比為10∶1，在細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入105個(100μl)NK92細(xì)胞和濃度為20nM的短肽溶液(以PBS溶液作為溶劑)5μl，使其終濃度為1nM。陰性對照加入濃度為200nM的的無關(guān)肽Px溶液(以PBS溶液作為溶劑)5μl，使其終濃度為10nM。并以同體積的PBS溶液作為空白對照，37℃、5％CO2溫育0.5小時，然后再加入51Cr(購自中國同位素總公司)標(biāo)記的Hela細(xì)胞104個(100μl)，實驗中設(shè)定最大釋放組(104個靶細(xì)胞加1％TritonX-100溶液，總體積為200μl)和自然釋放組(只加104個靶細(xì)胞，總體積為200μl)，完成后將培養(yǎng)板稍作離心，37℃、5％CO2溫育4小時，取100μl上清液，r-計數(shù)，按以下公式計算殺傷率＝(試驗組cpm值-自然釋放組cpm值)/(最大釋放組cpm值-自然釋放組cpm值)×100％。
如圖2A所示，肽段P1、P2和P3對NK92細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞Hela的作用均有抑制效果；而無關(guān)肽濃度為10nM時，也未表現(xiàn)出抑制效果。
短肽在1-1×10-6nM的濃度范圍內(nèi)對NKG2D/MICA的相互作用抑制效應(yīng)如圖2B所示，呈劑量依賴關(guān)系。
2、短肽P1、P2、P3對NK92細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞K526的作用以K526細(xì)胞(該細(xì)胞不表達(dá)MICA分子)作為靶細(xì)胞，采用與上述相同的方法測試短肽P1、P2、P3對NK92細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞K526的作用，結(jié)果如圖2C所示，結(jié)果表明短肽P1、P2、P3對NK92細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞K526的作用無影響。
上述兩個實驗結(jié)果證實，短肽P1、P2、P3能夠特異抑制NKG2D/MICA的相互作用。
3、本發(fā)明多肽的不同組合物的抑制效果以PBS配制P1、P2、P3、P2L、P3L以及P1+P2(P1∶P2的重量份數(shù)比為1∶2.6)、P1+P3(P1∶P3的重量份數(shù)比為1∶2.8)、P2+P3(P2∶P3的重量份數(shù)比為1∶1.1)、P1+P2L(P1∶P2L的重量份數(shù)比為1∶6)、P1+P3L(P1∶P3L的重量份數(shù)比為1∶6.5)、P2L+P3(P2L∶P3的重量份數(shù)比為2.1∶1)以及P1+P2+P3(P1∶P2∶P3的重量份數(shù)比為1∶2.6∶2.8)、P1+P2L+P3L(P1∶P2L∶P3L的重量份數(shù)比為1∶6∶6.5)組合物的溶液，其濃度均為20nM。
以上述溶液進行NK92細(xì)胞殺傷HeLa細(xì)胞的抑制效應(yīng)實驗，并與可溶性MICA分子(反應(yīng)體系的終濃度為1nM)進行對比，結(jié)果分別如圖3A、圖3B和圖3C所示。結(jié)果表明，每兩個短肽的結(jié)合(P1+P2，P1+P3，P2+P3，反應(yīng)體系的終濃度均為1nM)比單一短肽具有更強的抑制作用(圖3A)，抑制效率從18％(P3)增長到32％(P2+P3)；當(dāng)三個短肽聯(lián)合作用時，抑制效率達(dá)到38％，已接近于可溶性的MICA分子(圖3C)。同時，用P2L和P3L代替P2和P3時，不管單獨或是聯(lián)合作用時均表現(xiàn)出更強的抑制效應(yīng)(圖3B)，這說明較長的肽能封閉較多位點，具有更強的抑制效應(yīng)；P1+P2L+P3L的抑制效應(yīng)已達(dá)到可溶性MICA分子的同等水平(圖3C)。
實施例3、本發(fā)明多肽對小鼠淋巴細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的抑制作用將P1+P2+P3組合物的PBS溶液(濃度為2mM，P1∶P2∶P3的重量份數(shù)比為1∶2.6∶2.8)以50μg多肽組合物/g體重的劑量注射C56BL/6小鼠(購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心)，4小時后，收獲小鼠肝臟淋巴細(xì)胞，用這些細(xì)胞作效應(yīng)細(xì)胞，以YAC-1細(xì)胞為靶細(xì)胞，進行細(xì)胞殺傷實驗；并以同劑量的Px溶液處理的小鼠肝臟淋巴細(xì)胞為陰性對照，同體積的PBS溶液處理的小鼠肝臟淋巴細(xì)胞為空白對照，其結(jié)果如圖4所示，短肽處理過的小鼠肝臟淋巴細(xì)胞對YAC-1細(xì)胞的殺傷作用比PBS組(Px組和PBS組經(jīng)統(tǒng)計分析無差別)下降36.67％，表明小鼠肝臟淋巴細(xì)胞的殺傷作用可部分被短肽抑制。
小鼠的肝臟淋巴細(xì)胞包括NK細(xì)胞和T細(xì)胞，這些細(xì)胞均表達(dá)NKG2D分子，小鼠的NKG2D分子與人的NKG2D分子具有相似的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)；YAC-1細(xì)胞表面表達(dá)RAE-1分子，小鼠的RAE-1、H-60等分子行使與MICA分子類似的功能，即作為NKG2D的配體。本實施例的結(jié)果表明，本發(fā)明多肽也能夠封閉小鼠的NKG2D分子。
實施例4、本發(fā)明短肽對NKG2D介導(dǎo)的自身免疫性損傷的阻斷作用為了進一步證明本發(fā)明短肽對NKG2D介導(dǎo)的自身免疫性損傷的阻斷作用，將本發(fā)明短肽應(yīng)用于刀豆A(Con-A)誘導(dǎo)的小鼠肝炎模型，這是一種典型的T細(xì)胞介導(dǎo)的肝損傷模型。
將Con-A以15μg/g體重靜脈注射C56BL/6小鼠后，小鼠就會發(fā)生肝損傷，6小時后血漿中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)上升到5433±692IU/ml；在注射Con-A的同時將P1+P2+P3組合物的PBS溶液(濃度為2mM，P1∶P2∶P3的重量份數(shù)比為1∶2.6∶2.8)以50μg多肽組合物/g體重的劑量注射(抑制組)，在注射Con-A的同時注射與抑制組多肽組合物溶液相同體積的PBS溶液作為空白對照組，6小時后抑制組小鼠的血漿中ALT為3195±461IU/L，抑制率為41.19％；在注射Con-A的同時注射無關(guān)肽Px 50μg/g體重，而無關(guān)肽Px則沒有作用(陰性對照組)；結(jié)果如圖5，表明本發(fā)明短肽能夠特異性地減輕Con-A誘導(dǎo)的、由NKG2D介導(dǎo)的肝損傷。
權(quán)利要求
1.NKG2D受體的配體，為具有下述氨基酸序列之一的多肽1)MICA-P1DGSVQ；2)MICA-P2KDLRMTLAHIK；3)MICA-P3THYHAMHADCLQ；4)MICA-P2LKTWDRETRDLTGKDLRMTLAHIKDQ；5)MICA-P3LEDAMKTKTHYHAMHADCLQELRRYLKS。
2.一種治療自身免疫疾病和/或異體移植排斥的藥物，其活性成分為下述多肽家族中的至少一個1)MICA-P1DGSVQ；2)MICA-P2KDLRMTLAHIK；3)MICA-P3THYHAMHADCLQ；4)MICA-P2LKTWDRETRDLTGKDLRMTLAHIKDQ；5)MICA-P3LEDAMKTKTHYHAMHADCLQELRRYLKS。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥物，其特征在于所述藥物的活性成分為所述MICA-P1、所述MICA-P2和所述MICA-P3的組合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物，其特征在于所述組合物中所述MICA-P1、所述MICA-P2和所述MICA-P3的重量份數(shù)比為1∶2-3∶2-3。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥物，其特征在于所述藥物的活性成分為所述MICA-P1、所述MICA-P2L和所述MICA-P3L的組合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物，其特征在于所述組合物中所述MICA-P1、所述MICA-P2L和所述MICA-P3L的重量份數(shù)比為1∶6-7∶6-7。
全文摘要
本發(fā)明公開了NKG2D受體的配體及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的NKG2D受體的配體，為具有下述氨基酸序列之一的多肽1)MICA－P1DGSVQ；2)MICA－P2KDLRMTLAHIK；3)MICA－P3THYHAMHADCLQ；4)MICA－P2LKTWDRETRDLTGKDLRMTLAHIKDQ；5)MICA－P3LEDAMKTKTHYHAMHADCLQELRRYLKS。本發(fā)明多肽分子量小，極少引起機體的免疫反應(yīng)，且溶解性好、通透性強，易于到達(dá)作用部位發(fā)揮作用，能實現(xiàn)和NKG2D單抗及可溶性的全分子MICA相同的作用，同時還避免了其副作用；本發(fā)明多肽可采用現(xiàn)有常規(guī)方法制備得到，技術(shù)成熟，可廣泛用于治療自身免疫疾病和異體移植的排斥反應(yīng)。
文檔編號A61P37/02GK1634979SQ20041009605
公開日2005年7月6日 申請日期2004年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月26日
發(fā)明者田志剛, 劉文濤, 張斌, 魏海明, 鄭曉東, 張建, 孫汭 申請人:中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)