專利名稱：核苷類似物膽固醇衍生物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及化學和生物醫(yī)藥領域，特別涉及一種核苷類似物膽固醇衍生物，由該化合物可以制備高度分散的傳遞系統(tǒng)，包括脂質(zhì)體、非離子表面活性劑泡囊、納米粒、微乳和自組裝傳遞系統(tǒng)。
背景技術：
核苷(Nucleosides)是生物體內(nèi)的重要化學成分，由它衍生得到的核苷酸以及核酸是遺傳信息的攜帶者。最重要的遺傳物質(zhì)DNA和RNA就是由核苷酸組裝而成。核苷和核苷酸也參與生物體內(nèi)許多重要的反應。自然界中的核苷由一個嘌呤或嘧啶堿基與一個五碳糖結合而成。堿基包括腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶，五碳糖為核糖和脫氧核糖，并由它們分別組成腺苷、鳥苷、胞苷和尿苷，以及脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胞苷和脫氧胸苷。
核苷類似物(Nucleoside analogues，Nu)是一類重要的化學物質(zhì)。它的結構特征與核苷類似。人們已經(jīng)合成了多種核苷類似物，發(fā)現(xiàn)其中有許多具有藥理活性，例如抗病毒作用、細胞毒作用、免疫抑制作用等。目前對核苷類似物活性的考查主要集中在抗病毒和抗癌方面?？共《镜暮塑疹愃莆镌隗w內(nèi)經(jīng)過病毒和人體細胞的激酶磷酸化作用后形成磷酸化核苷類似物，后者可通過各種途徑抑制病毒。根據(jù)不同作用功能部位，它們可以分為DNA聚合酶抑制劑、DNA還原酶抑制劑、胸苷激酶抑制劑、RNA酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑等，臨床上用于治療皰疹病毒、巨細胞病毒、水痘病毒、流感病毒、肝炎病毒、SARS病毒、艾滋病毒(HIV)、腦炎病毒等感染。因為病毒的復制在細胞內(nèi)完成，所以大多數(shù)抑制病毒復制增值過程的抗病毒藥物需要進入細胞內(nèi)才能發(fā)揮抗病毒作用。核苷類似物的水溶性一般較強，使得細胞內(nèi)的核苷類物質(zhì)不易滲出，這是由細胞維持生命本能決定的。同時外界的核苷類似物也較難進入細胞內(nèi)部，即許多核苷類似物的細胞膜滲透性不好。因此許多核苷類似物藥物口服生物利用度差，細胞內(nèi)濃度小，影響了抗病毒作用的發(fā)揮，并且藥物長期在細胞內(nèi)保持低濃度還有可能使病毒產(chǎn)生耐藥性(楊道鋒，等.抗病毒核苷類似物簡介.醫(yī)藥導報，2001，20(2)122；李子成，等.核苷類抗病毒藥物的研究進展.化學研究與應用，2002，14(1)15)。艾滋病毒(HIV)在感染人體的初期，就往往已經(jīng)進入淋巴系統(tǒng)和腦中，并進一步感染其它部位。而核苷類似物通常為水溶性，進入淋巴和腦都較困難，這也是艾滋病難治的原因之一(Yazdanlan M，et al.Blood-brain barrier properties of humanimmunodeficiency virus antiretrovirals.J Pharm Sci，1999，88950)?？拱┑暮塑疹愃莆镆话闶且环N抗代謝物，通過抑制核酸的合成發(fā)揮細胞毒作用(Galmarini，et al.Nucleoside analogues and nucleobase in cancer treatment.Lancet，2002，3415)。同樣它們也需要進入細胞內(nèi)才能發(fā)揮作用。因此抗癌核苷類似物也存在生物利用度較低、穿越細胞膜和血腦屏障較難等問題。
人們設計了很多方法來解決核苷類似物的生物利用度和細胞攝取問題，例如合成前藥和設計特殊的藥物傳遞系統(tǒng)，其中脂溶性前藥和脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)比較引人注目。
藥物的生物膜滲透性除了和生物膜本身性質(zhì)及藥物分子量有關外，藥物的物理化學性質(zhì)是主要影響因素。一般認為，適當增加藥物的脂溶性可以增強生物膜滲透性。人們已經(jīng)嘗試合成核苷類似物脂溶性前藥的方法來增加其生物利用度和細胞攝取。因為核苷類似物通常在非芳香環(huán)的脂肪鏈或環(huán)上連有羥基或氨基，人們往往利用這些羥基或氨基與脂肪鏈基團相連而獲得脂溶性前藥。許多研究證明脂溶性增強的核苷類似物的生物利用度和細胞攝取增加，在淋巴系統(tǒng)和腦中的濃度一般也會提高。這些前藥可以在細胞內(nèi)經(jīng)過水解酶或磷脂酶的作用釋放出原藥而發(fā)揮抗病毒或抗癌作用(Yatvin MB，et al.Improved uptake and retention of lipophilic prodrug to improve treatment of HIV.Adv Drug Del Rev，1999，39165；Tan X，et al.Development and optimization ofanti-HIV nucleoside analogs and prodrugsa review of their cellular pharmacology，structure-activity relationships and pharmacokinetics.Adv Drug Del Rev，1999，39117；Wiebe LI，et al.Concepts for the design of anti-HIV nucleoside prodrugsfor treating cephalic HIV infection.Adv Drug Del Rev，1999，3963；Hostetler KY，et al. Synthesis and antiretroviral activity of phospholipid analogs ofazidothymidine and other antiviral nucleosides.J Biol Chem，1990，2656112)。
這些研究較多采用磷脂類似物的磷脂?；?WO9413324)與核苷類似物的羥基相連。雖然增加了核苷類似物的脂溶性，前藥水解后可以得到單磷酸化物，但磷脂類似物(主要是磷脂酸)不易得，反應較復雜。另外脂溶性較強的藥物給藥有一定困難。因為脂溶性藥物不溶或難溶于水，使其一般制劑，如片劑和注射劑無法解決其在水溶液中的分散和溶解問題。藥物一般需要以分子或高度分散狀態(tài)的分子聚集體形式才能吸收和進入細胞。人體內(nèi)的環(huán)境是水溶液形式，生物膜呈脂溶性，藥物或藥物傳遞系統(tǒng)需要在體內(nèi)可以傳輸，并且多次穿越生物膜，才能達到細胞等作用靶部位。如果不溶性的脂溶性藥物無法溶解或高度分散，那就無法有效地傳遞藥物。
脂質(zhì)體(Liposomes)是一種由磷脂雙分子層構成的泡囊(Vesicles)，是一種可以在水溶液中高度分散的傳遞系統(tǒng)，可以作為很多種藥物的載體。它的高度分散性使其在體內(nèi)具有靶向、緩釋等效果，口服具有淋巴趨向性，較易攜帶藥物穿越血腦屏障，容易通過融合、內(nèi)吞等途徑進入細胞內(nèi)(Lasic DDand Papahadjopoulos D.Liposomes revisited.Science，1995，2671275)。修飾后的磷脂組成的脂質(zhì)體還可以有體內(nèi)長循環(huán)、溫度靶向、pH靶向、磁靶向、主動靶向等功能。脂質(zhì)體的局部(眼、鼻、皮膚)給藥有生物相容性好、促進藥物滲透的作用。脂質(zhì)體還是生物化學和分子生物學研究領域中經(jīng)常使用的一種轉(zhuǎn)染試劑，現(xiàn)在還是基因治療的一種重要載體(Kikuchi H，et al.Genedelivery using liposome technology.J Control Release，1999，62269)。
脂質(zhì)體泡囊的磷脂雙分子層膜將內(nèi)部包裹的水相和外部水相隔開，雙分子層內(nèi)呈疏水性。藥物根據(jù)其物理化學性質(zhì)的不同分別包裹在內(nèi)水相或膜中。一般地，水溶性藥物在內(nèi)水相中；脂溶性藥物在膜層中。脂質(zhì)體的制備是磷脂分子在水中自組裝的過程，內(nèi)外水相的體積比例不能很大。這些因素決定了大部分水溶性藥物的包裹率較低(＜50％)，有時還會很低(5％)，并且包裹的藥物有滲漏到外水相的可能。如果有合適的脂溶性基團(如脂肪鏈)，脂溶性藥物分子就可插入到磷脂雙分子層中，結合比較牢固，藥物分子不容易脫掉，所以藥物的包裹率較高。因此為了增加某些水溶性藥物在脂質(zhì)體中的包裹率，人們往往采用了制備成帶有長脂肪鏈的脂溶性前體藥物的方式(Gulati M，et al.Lipophilic drug derivatives in liposomes.Int J Pharm，1998，165129)。
目前合成的核苷類似物水溶性普遍較強，脂溶性較差，有的藥物甚至水溶性和脂溶性都不好。因此它們的脂質(zhì)體包裹率較低，往往無法達到給藥濃度。如果在制備得到核苷類似物脂溶性前藥的基礎上，再制備成脂質(zhì)體，可以增加包裹率，也同時具有了脂質(zhì)體水溶液中高度分散性和脂溶性前藥易滲透進入細胞的特點(Tong P，et al.Preparation and in viro antiviral activity ofliposomes of lipophilic esters of acyclovir.藥學學報，1991，2715)。
非離子表面活性劑泡囊(Niosomes)是指某些非離子表面活性劑(如司盤60)在一定條件下在水中自組裝成泡囊結構，類似脂質(zhì)體。它同樣可以作為藥物載體，具有類似脂質(zhì)體的一些體內(nèi)外特征。納米粒(Nanoparticles)一般指是納米級分散的固體粒子，由于其高度分散性，它作為藥物載體有提高藥物生物利用度、增強靶向性等特點。固體脂質(zhì)納米粒(SLN)采用人體相容的脂質(zhì)材料作為主要輔料形成納米粒，具有普通納米粒的特點和生物相容性好的特點，近年來研究較多。微乳(Microemulsions)是指粒徑在100納米以下的乳滴組成的體系，可以將脂溶性藥物包裹在乳滴中。由于其高度分散性，它作為藥物載體同樣有提高藥物生物利用度、增強靶向性等特點。
綜上所述，將核苷類似物制備成脂溶性前藥，并進一步制備成脂質(zhì)體、非離子表面活性劑泡囊、納米粒、微乳等水溶液中高度分散的制劑，有利于發(fā)揮藥效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人發(fā)明了一種核苷類似物膽固醇衍生物，其特征在于核苷類似物和膽固醇分子通過連接基連接，并且本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)由上述核苷類似物膽固醇衍生物可以方便地制備得到高度分散的傳遞系統(tǒng)。根據(jù)前面所述，具有高度分散狀態(tài)并且脂溶性較強的藥物容易在體內(nèi)進行傳遞，并且生物膜滲透性好，具有靶向性。本發(fā)明因此首次設計并制備了具備上述功能的核苷類似物膽固醇衍生物，并制備了其高度分散的傳遞系統(tǒng)。
本發(fā)明涉及的膽固醇(Cholesterol，Ch)分子可以來源于提取和合成途徑。
膽固醇分子中含有一個游離的羥基，需要一個連接基(Linker，L)才能與核苷類似物中的活潑基團如羥基結合，一般采用適當?shù)哪撤N反應將膽固醇、連接基分子、核苷類似物三者結合，得到核苷類似物膽固醇衍生物。一般情況下，可以先將連接基與核苷類似物結合，再與膽固醇結合，當然也可以將順序顛倒。本發(fā)明中的連接基是一種脂肪鏈連接基，其碳數(shù)在2～7之間，它的原型分子優(yōu)選自2～7個碳數(shù)的雙羧基脂肪酸，如草酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、2-甲基-2-丁烯二酸、甲基丁二酸、羥基丁二酸、草乙酸(氧化琥珀酸)、酒石酸、天冬氨酸、谷氨酸、戊二酸、己二酸、2，2-二甲基戊二酸、庚二酸，更優(yōu)選的是碳數(shù)為4的雙羧基脂肪酸，如琥珀酸、馬來酸、富馬酸。
本發(fā)明中所述的用于制備核苷類似物膽固醇衍生物的核苷類似物原型分子，在分子結構特征方面一般含有活潑基團，如游離的羥基或氨基，優(yōu)選的是核苷類似物分子中的非芳香環(huán)的脂肪鏈(或環(huán))上有一個以上的羥基，更優(yōu)選的是非芳香環(huán)的脂肪鏈(或環(huán))上有一個羥基。本發(fā)明所述的核苷類似物沒有要求其具有特殊作用，但優(yōu)選的是在作用方面具有藥理活性的藥物，更優(yōu)選的是具有抗病毒或抗癌作用的藥物。抗病毒的藥物可以選自阿昔洛韋(ACV)、更昔洛韋(GCV)、泛昔洛韋(FCV)、噴昔洛韋(PCV)、萬乃洛韋、病毒唑、索利夫定、利巴韋林、阿糖腺苷、齊多夫定(AZT)、拉米夫定(3TC)、去羥肌苷(ddI)、扎西他賓(ddC)、司他夫定(d4T)、阿糖腺苷、西多福韋，優(yōu)選的是阿昔洛韋、更昔洛韋、泛昔洛韋、噴昔洛韋、利巴韋林、齊多夫定、拉米夫定、去羥肌苷、扎西他賓、司他夫定，更優(yōu)選的是阿昔洛韋、齊多夫定、拉米夫定、去羥肌苷、扎西他賓、司他夫定?？拱┑乃幬锟梢赃x自去氧氟尿苷、阿糖胞苷、阿扎胞苷。
本發(fā)明中的核苷類似物膽固醇衍生物的合成步驟一般分為兩個階段。首先雙羧基脂肪酸與膽固醇或與核苷類似物發(fā)生酰化反應得到脂肪酸單酯或單酰胺，然后再與另一個反應物反應，得到最終產(chǎn)物。在上述酰化反應中，可以采用酸酐與羥基或氨基?；?；或酰氯與羥基或氨基?；姆绞?；或羧酸先形成活化的中間體，然后與羥基或氨基酰化；或由羧酸直接與羥基或氨基?；?。通過參考相關文獻方法和利用一般專業(yè)技術就可以得到高純度的核苷類似物膽固醇衍生物。
得到本發(fā)明中的核苷類似物膽固醇衍生物后，還可以根據(jù)使用要求將其制備成堿鹽或酸鹽。成鹽部位一般是在核苷基團上。堿鹽可以選自鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽。酸鹽中的酸可以選自馬來酸、富馬酸、琥珀酸、苯甲酸、苯磺酸、甲酸、乙酸、丙酸、草酸、氨基酸、檸檬酸、酒石酸、硝酸、磷酸、鹽酸、硫酸，優(yōu)選的是乙酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、苯甲酸。制備核苷類似物膽固醇衍生物的鹽的方法一般可以先將核苷類似物膽固醇衍生物和相應的酸或堿分別溶于相同或不同的有機溶劑，再將它們的有機溶劑溶液按照它們分子摩爾相等或幾乎相等的比例混合，經(jīng)過適當處理，最后將混合溶液揮干，進行適當?shù)募兓头蛛x，得到核苷類似物膽固醇衍生物的鹽。
本發(fā)明中的核苷類似物膽固醇衍生物或其鹽帶有脂溶性較強的膽固醇基團，可以將它們制備成脂質(zhì)體、非離子表面活性劑泡囊、納米粒、微乳等高度分散的制劑，后者可以以水性混懸液的形式存在并給藥。這些含有核苷類似物膽固醇衍生物的高度分散傳遞系統(tǒng)的粒子直徑一般小于1微米，優(yōu)選的是小于0.5微米，更優(yōu)選的是小于0.2微米。制備方法可以參考相關文獻方法和專業(yè)技術(New RRC ed.Liposomea practical approach.OxfordOxfordUniversity Press，1990；Uchegbu IF and Vyas SP.Non-ionic surfactant basedvesicles(niosomes)in drug delivery.Int J Pharm，1998，17233，Cavalli R，et al.Sterilization and freeze-drying of drug-free and drug-loaded solid lipidnanoparticles.Int J Pharm，1997，14847；陸彬，張正全.用三角相圖法研究藥用微乳的形成條件.藥學學報，2001，3658)。
一般地，如果采用薄膜分散法制備脂質(zhì)體，可以將核苷類似物膽固醇衍生物與磷脂等膜材共同溶于有機溶劑，盛入燒瓶中，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到一層薄膜，然后加入水或適當緩沖液，進行振蕩和超聲，直至形成均勻的混懸液。如果超聲時間延長，還可能得到納米級分散系統(tǒng)。如果采用反相蒸發(fā)法制備脂質(zhì)體，可以將核苷類似物膽固醇衍生物與磷脂等膜材共同溶于有機溶劑，加入水或緩沖液，高速攪拌或超聲制備成乳劑，然后減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到凝膠態(tài)物質(zhì)，然后加入水或適當緩沖液或不加，繼續(xù)減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，直至形成均勻的脂質(zhì)體混懸液。脂質(zhì)體混懸液還可以選擇適當處方并在適當條件下進行冷凍干燥或噴霧干燥，形成固體粉末狀，這樣可以保證制劑的穩(wěn)定性，臨用前加入水溶液振搖即可得到脂質(zhì)體混懸液。運用同樣的技術可以獲得核苷類似物膽固醇衍生物的非離子表面活性劑泡囊。
納米粒制劑中的固體脂質(zhì)納米粒較適合于本發(fā)明中的核苷類似物膽固醇衍生物。一般地，將核苷類似物膽固醇衍生物與常溫下為固態(tài)的脂質(zhì)，如磷脂、脂肪酸、甘油酯，共同加熱熔融，然后加入水或適當緩沖液，在加熱情況下在高壓乳勻機上循環(huán)乳化多次，形成納米分散的乳滴，迅速冷卻，使之固化，即得到核苷類似物膽固醇衍生物固體脂質(zhì)納米粒。用微乳法也可制得核苷類似物膽固醇衍生物固體脂質(zhì)納米粒。核苷類似物膽固醇衍生物納米粒混懸液還可以選擇適當處方并在適當條件下進行冷凍干燥或噴霧干燥，形成固體粉末狀，這樣可以保證制劑的穩(wěn)定性，臨用前加入水溶液振搖即可得到納米?；鞈乙骸?br> 核苷類似物膽固醇衍生物微乳的制備可以參考常見的處方，一般包括乳化劑、助乳化劑、助溶劑、油相、水相。一般在選擇合適的處方后，即可容易地形成微乳。如果選擇合適的處方，一般包括乳化劑、助乳化劑、助溶劑、油相，還可以組成自微乳化系統(tǒng)，在加入適量水溶液后，系統(tǒng)可以自行分散成微乳。
除了上述可以方便地得到的核苷類似物膽固醇衍生物的高度分散的傳遞系統(tǒng)外，本發(fā)明人還出乎意料地發(fā)現(xiàn)由于本發(fā)明中的核苷類似物膽固醇衍生物具有特殊的物理化學性質(zhì)，特別是兩親性，由它自身或加入適量添加劑后在水溶液中可以自組裝，形成高度分散的傳遞系統(tǒng)。核苷類似物膽固醇衍生物分子中含有脂溶性強的膽固醇基團和極性較大的核苷基團，因此具有兩親性，這種物理化學性質(zhì)類似于磷脂和某些表面活性劑。如果兩親性分子的分子結構滿足一定條件，由它本身可以在水中自組裝成高度分散的有序聚集體，例如雙分子層、雙分子層彎曲得到的泡囊和雙分子層疊加得到的長形納米粒(Schreier S，et al.Surface active drugsself-association and interaction withmembranes and surfactants.Physicochemical and biological aspects.BiochimBiophys Acta，2000，1508210)。本發(fā)明中的核苷類似物膽固醇衍生物具有較長的并且脂溶性較強的膽固醇基團和親水性核苷基團，較容易形成雙分子層，并進一步得到泡囊或長形納米粒，不過某些條件下需加入一定量的添加劑。因此本發(fā)明首次設計并制備了由本發(fā)明中的核苷類似物膽固醇衍生物組成或加入適量添加劑的高度分散的自組裝傳遞系統(tǒng)。
本發(fā)明中的由核苷類似物膽固醇衍生物組成的高度分散的自組裝傳遞系統(tǒng)的制備方法和脂質(zhì)體等高度分散系統(tǒng)的制備方法類似。通常是將核苷類似物膽固醇衍生物溶于某種有機溶劑，根據(jù)需要可以加入適當添加劑，然后進行分散。方法包括薄膜分散法、反相蒸發(fā)法、注入法、復乳法等。在某些情況下，添加劑不是必需的，此時傳遞系統(tǒng)全部由核苷類似物膽固醇衍生物組成。在某些情況下，單獨用核苷類似物膽固醇衍生物不能形成很好的高度分散粒子，此時需要加入適當添加劑，幫助其形成有序結構。是否需要加入添加劑根據(jù)核苷類似物膽固醇衍生物的物理化學性質(zhì)決定，一般可以通過預實驗來推斷。
本發(fā)明中的高度分散自組裝傳遞系統(tǒng)中添加劑的量占全部組成成分的分子摩爾比例在0～50％之間，優(yōu)選的是0～30％，更優(yōu)選的是0～15％，其余成分即為核苷類似物膽固醇衍生物。添加劑可以選自磷脂、多元醇酯類表面活性劑、聚氧乙烯類表面活性劑、雙十六烷基磷脂酸、膽固醇及其衍生物、硬脂胺。磷脂包括合成磷脂、半合成磷脂、天然磷脂。其中合成磷脂又包括修飾的磷脂如聚乙二醇衍生化的磷脂、連接單克隆抗體的磷脂。多元醇酯類表面活性劑優(yōu)選的是失水山梨醇脂肪酸酯，具體如司盤60、司盤40、司盤20。聚氧乙烯類表面活性劑優(yōu)選的是聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物(也稱泊洛沙姆)，聚山梨酯和聚氧乙烯脂肪醇醚，具體如泊洛沙姆P188、吐溫80、吐溫60、吐溫40、吐溫20、芐澤35。膽固醇及其衍生物包括膽固醇、膽固醇的脂肪酸酯、聚乙二醇衍生化的膽固醇。
高度分散的傳遞系統(tǒng)包括自組裝傳遞系統(tǒng)，如果其組成或表面吸附有高度親水的分子或分子片斷，由于在體外環(huán)境或體內(nèi)環(huán)境可以形成親水性保護層，可以阻滯粒子間的聚合或在體內(nèi)阻滯調(diào)理化作用而獲得長循環(huán)效果(Barenholz Y.Liposome applicationproblems and prospects.Curr Opin ColloidInterface Sci，2001，666)。常用的親水性分子或分子片斷是聚乙二醇(PEG)。在本發(fā)明中，可以采用添加聚乙二醇衍生化的磷脂或聚乙二醇衍生化的膽固醇的方法制備得到表面親水的核苷類似物膽固醇衍生物的高度分散的傳遞系統(tǒng)包括其自組裝傳遞系統(tǒng)。
上述制備核苷類似物膽固醇衍生物的高度分散的傳遞系統(tǒng)的方法不經(jīng)改變或經(jīng)過稍微調(diào)整后，都可適用于核苷類似物膽固醇衍生物的鹽。
具體實施例方式
實施例1.阿昔洛韋膽固醇琥珀酸酯的制備本品是琥珀酸分子兩端分別與阿昔洛韋脂肪鏈羥基和膽固醇羥基酰化的產(chǎn)物，英文化學名Succinic acid 2-(2-amino-6-oxo-1，6-dihydro-purin-9-ylmethoxy)-ethyl ester 17-(1，5-dimethyl-hexyl)-10，13-dimethyl-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[α]phenanthren-3-yl ester，分子式C39H59N5O6，分子量693.93。首先合成琥珀酰阿昔洛韋(C12H15N5O6)，具體步驟如下。取阿昔洛韋(4.5g，0.02mol)、琥珀酸酐(10g，0.1mol)、4-二甲基氨基吡啶(DMAP，0.244g，2mmol)，加入100ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，充入氮氣，密閉，室溫反應2天，反應物減壓蒸發(fā)除去大部分溶劑，剩余液體倒入冰水中，得白色混懸液，再用1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至2，抽濾，水洗滌，干燥，得到琥珀酰阿昔洛韋白色粉末6g。產(chǎn)物薄層層析顯示一個斑點。熔點195-196℃。1H NMR顯示，化學位移2.61(4H，OCCH2CH2CO)，3.75(2H，CH2OCO)，4.22(2H，OCH2)，5.40(2H，NCH2O)，6.86(3H，NH2，COOH)，7.76(1H，NCHN)，10.59(1H，OCNHC)。元素分析值C(44.22％)H(4.68％)N(21.69％)，與理論值C(44.31％)H(4.65％)N(21.53％)相近。
其它雙羧基脂肪酰阿昔洛韋如馬來酰阿昔洛韋、富馬酰阿昔洛韋、戊二酰阿昔洛韋的合成步驟與琥珀酰阿昔洛韋相近。
取琥珀酰阿昔洛韋(16.25g，0.05mol)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC，11.33g，0.055mol)、膽固醇(58g，0.15mol)，加入500ml DMF和四氫呋喃(THF)混合溶劑(1∶1)，密閉，室溫攪拌3天，過濾除去雜質(zhì)，濾液減壓蒸干，加入500ml氯仿溶解，順序用NaCO3溶液、水洗滌，氯仿液用無水硫酸鎂干燥，過濾，蒸干溶劑，用異丙醇重結晶，晾干，得到阿昔洛韋膽固醇琥珀酸酯白色粉末25g。薄層層析顯示一個斑點。熔點180-183℃。1H NMR(CDCl3)顯示，化學位移0.85-1.90(40H，Cholesterol)，2.20(2H，CH2，Cholesterol-α-cycle)，2.63(4H，OCCH2CH2CO)，2.65(H，OCCH(CH2)2-Cholesterol)，5.35(H，CCHCH2，Cholesterol-β-cycle)，7.75(1H，NCHN)，10.65(1H，OCNHC)。元素分析值C(67.56％)H(8.52％)N(10.28％)，與理論值C(67.50％)H(8.57％)N(10.09％)相近。
其它不同連接基的阿昔洛韋膽固醇衍生物分子如阿昔洛韋膽固醇馬來酸酯、阿昔洛韋膽固醇富馬酸酯、阿昔洛韋膽固醇戊二酸酯的合成步驟與上面描述的阿昔洛韋膽固醇琥珀酸酯合成步驟相近。
實施例2.去羥肌苷膽固醇草酸酯的制備本品是草酸分子兩端分別與去羥肌苷脂肪環(huán)側(cè)鏈羥基和膽固醇羥基?；漠a(chǎn)物，化學名Oxalic acid 17-(1，5-dimethyl-hexyl)-10，13-dimethyl-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[α]phenanthren-3-yl ester 5-(6-oxo-1，6-dihydro-purin-9-yl)-tetrahydro-furan-2-ylmethyl ester，分子式C39H56N4O6，分子量676.89。具體合成步驟如下取膽固醇(3.86g，10mmol)、草酰氯(5ml)加100ml二氯甲烷，室溫攪拌5h，減壓揮發(fā)大部分溶劑，加入去羥肌苷(1.18g，5mmol)和50ml DMF∶THF(1∶1，v/v)，密閉，室溫攪拌10h，減壓蒸發(fā)濃縮，剩余溶液攪拌下倒入飽和NaHCO3冰水溶液中，過濾，水洗至中性，濾渣經(jīng)硅膠柱以氯仿∶甲醇(97∶3，v/v)洗脫得到粗產(chǎn)品，以甲醇重結晶得去羥肌苷膽固醇草酸酯白色粉末2.3g。薄層層析顯示一個斑點。熔點157-160℃。1H NMR(CDCl3)顯示，化學位移0.85-1.85(40H，Cholesterol)，2.20(2H，34-CH2)，2.30(2H，3-CH2)，4.00(H，23-CH)，4.34(H，5-CH)，4.29(2H，15-CH2)，5.37(H，36-CH)，7.97(H，CHN)，8.12(H，NCHN)，12.70(H，NH)。元素分析值C(69.06％)H(8.78％)N(8.91％)，與理論值C(69.20％)H(8.34％)N(8.28％)相近。
實施例3.去羥肌苷膽固醇琥珀酸酯的制備本品是琥珀酸分子兩端分別與去羥肌苷脂肪環(huán)側(cè)鏈羥基和膽固醇羥基?；漠a(chǎn)物，化學名Succinic acid 17-(1，5-dimethyl-hexyl)-10，13-dimethyl-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[α]phenanthren-3-yl ester 5-(6-oxo-1，6-dihydro-purin-9-yl)-tetrahydro-furan-2-ylmethyl ester，分子式C41H60N4O6，分子量704.9。首先合成中間體膽固醇半琥珀酸酯，再與去羥肌苷(ddI)酰化得到目標產(chǎn)物。具體合成步驟如下取膽固醇(3.86g，10mmol)、琥珀酸酐(3g，30mmol)、DMAP(0.122g，1mmol)加100ml二氯甲烷，55℃攪拌3天，減壓蒸干溶劑得類白色固體，加乙醇25ml加熱至溶解，攪拌下倒入15％NaCl冰水溶液中，以1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0，過濾，用水洗滌，濾渣以無水乙醇∶乙酸乙酯(10∶1)重結晶，即得到純的膽固醇半琥珀酸酯白色粉末約4.8g。取去羥肌苷(1.18g，5mmol)、膽固醇半琥珀酸酯(4.86g，10mmol)、DCC(1.236g，6mmol)、DMAP(610mg，5mmol)加入50ml DMF∶THF(1∶1)，密閉，50℃攪拌2天，減壓蒸發(fā)濃縮，剩余溶液攪拌下倒入飽和NaHCO3冰水溶液中，過濾，水洗至中性，濾渣經(jīng)硅膠柱以氯仿∶甲醇(97∶3)洗脫得到粗產(chǎn)品，以甲醇重結晶得去羥肌苷膽固醇琥珀酸酯白色粉末2.3g。薄層層析顯示一個斑點。熔點188-190℃。1H NMR(CDCl3)顯示，化學位移0.85-1.85(40H，Cholesterol)，2.30(m，4H，CHCH2CH)，2.62(m，2H，CHCH2CH)，2.64，2.65(m，4H，OCH2CH2O)，4.35(m，1H，CHO)，4.37(m，2H，C2O)，4.60(m，1H，CHO)，5.35(d，1H，CCHCH2)，6.29(t，1H，CHN)，8.11，8.14(s，1H，NCHN)，12.71(s，1H，NH)。元素分析值C(69.86％)H(8.58％)N(7.95％)，與理論值C(69.77％)H(8.54％)N(7.84％)相近。
其它不同連接基的去羥肌苷膽固醇衍生物分子如去羥肌苷膽固醇馬來酸酯、去羥肌苷膽固醇富馬酸酯的合成步驟與上面描述的步驟相近。
實施例4.去羥肌苷膽固醇琥珀酸酯鈉鹽的制備分子式C41H60N4O6Na。取去羥肌苷膽固醇琥珀酸酯(7.05g，0.01mol)溶于20ml氯仿，加入含0.01mol NaOH的甲醇溶液，振搖超聲，減壓揮干溶劑，甲醇重結晶，得到去羥肌苷膽固醇琥珀酸酯鈉鹽白色晶體。該晶體在甲醇中溶解度大于氯仿。薄層層析顯示一個斑點。元素分析值C(67.30％)H(8.21％)N(7.42％)，與理論值C(67.65％)H(8.31％)N(7.70％)相近。其它堿鹽如鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽制備方法相近。
實施例5.去羥肌苷膽固醇琥珀酸酯醋酸鹽的制備分子式C43H65N4O8。取去羥肌苷膽固醇琥珀酸酯(7.05g，0.01mol)溶于20ml氯仿，加入含0.01mol醋酸的丙酮溶液，振搖超聲，減壓揮干溶劑，異丙醇重結晶，得到去羥肌苷膽固醇琥珀酸酯醋酸鹽白色固體。該固體較易溶于氯仿。薄層層析顯示一個斑點。元素分析值C(67.56％)H(8.52％)N(7.56％)，與理論值C(67.42％)H(8.55％)N(7.31％)相近。其它有機酸鹽如甲酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽制備方法相近。
實施例6.去羥肌苷膽固醇庚二酸酯的制備本品是庚二酸分子兩端分別與去羥肌苷脂肪環(huán)側(cè)鏈羥基和膽固醇羥基酰化的產(chǎn)物，化學名Pimelic acid 17-(1，5-dimethyl-hexyl)-10，13-dimethyl-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[α]phenanthren-3-yl ester 5-(6-oxo-1，6-dihydro-purin-9-yl)-tetrahydro-furan-2-ylmethyl ester，分子式C44H66N4O6，分子量747.02。去羥肌苷膽固醇庚二酸酯的合成步驟如下取庚二酸(16.02g，10mmol)溶于50ml二氯甲烷，加熱回流，逐滴加入二氯亞砜5ml，回流2h，中間可補充適量二氯亞砜，然后減壓揮去大部分溶劑，又加入50ml二氯甲烷和膽固醇(3.86g，10mmol)室溫攪拌5h，繼續(xù)加入去羥肌苷(1.18g，5mmol)，室溫攪拌5h，減壓蒸干溶劑得類白色固體，加THF適量加熱至溶解，攪拌下倒入飽和NaHCO3冰水溶液中，過濾，水洗至中性，濾渣經(jīng)硅膠柱以氯仿∶甲醇(95∶5)洗脫得到粗產(chǎn)品，以異丙醇重結晶得去羥肌苷膽固醇庚二酸酯白色粉末2.0g。薄層層析顯示一個斑點。熔點192-195℃。元素分析值C(70.68％)H(8.59％)N(7.85％)，與理論值C(70.74％)H(8.91％)N(7.50％)相近。
實施例7.齊多夫定膽固醇琥珀酸酯的制備本品是琥珀酸分子兩端分別與齊多夫定脂肪環(huán)側(cè)鏈羥基和膽固醇羥基酰化的產(chǎn)物，分子式C41H61N5O7，分子量735.96。齊多夫定膽固醇琥珀酸酯的合成步驟與實施例1中的阿昔洛韋膽固醇琥珀酸酯相類似，產(chǎn)物元素分析結果C(66.58％)H(8.59％)N(9.09％)，與理論值C(66.91％)H(8.35％)N(9.52％)相近，薄層層析結果顯示一個點。
實施例8.拉米夫定膽固醇琥珀酸酯的制備本品是琥珀酸分子兩端分別與拉米夫定脂肪環(huán)側(cè)鏈羥基和膽固醇羥基酰化的產(chǎn)物，英文化學名為Succinic acid 5-(4-amino-2-oxo-2H-pyrimidin-l-yl)-[1，3]oxathiolan-2-ylmethyl ester 17-(1，5-dimethyl-hexyl)-10，13-dimethyl-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[α]phenanthren-3-yl ester，分子式C39H59N3O6S，分子量697.97。拉米夫定膽固醇琥珀酸酯的合成步驟與實施例3中的去羥肌苷膽固醇琥珀酸酯相似，產(chǎn)物元素分析結果C(67.58％)H(8.46％)N(6.38％)，與理論值C(67.11％)H(8.52％)N(6.02％)相近，薄層層析結果顯示一個點。
實施例9.阿糖胞苷膽固醇馬來酸酯的制備本品是馬來酸分子兩端分別與阿糖胞苷4位芳胺和膽固醇羥基?；漠a(chǎn)物，英文化學名為3-[1-(3，4-Dihydroxy-5-hydroxymethyl-tetrahydro-furan-2-yl)-2-oxo-1，2-dihydro-pyrimidin-4-ylcarbamoyl]-acrylic acid 17-(1，5-dimethyl-hexyl)-10，13-dimethyl-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-tetradecahydro-1H-cyclo-penta[α]phenanthren-3-yl ester，分子式C40H59N3O8，分子量709.91。阿糖胞苷膽固醇馬來酸酯的合成步驟如下取阿糖胞苷(300mg，1.23mmol)溶于2ml水，加入15ml溶有馬來酸酐(287mg，2.47mmol)的二氧六環(huán)，室溫攪拌2天，減壓揮去溶劑，殘渣用正己烷洗滌，并用乙醇水(1∶1)重結晶，得到N4-馬來酸-阿糖胞苷單酯。此中間體(1.21g，5mmol)溶于20ml DMF，然后加入20ml溶有膽固醇(3.86g，10mmol)的THF溶液，室溫攪拌3天，攪拌下倒入飽和NaHCO3冰水溶液中，過濾，水洗至中性，濾渣經(jīng)硅膠柱以氯仿∶甲醇(90∶10)洗脫得到粗產(chǎn)品，以乙醇重結晶得阿糖胞苷膽固醇馬來酸酯白色粉末2.5g。薄層層析顯示一個斑點。熔點142-145℃。產(chǎn)物元素分析結果C(67.88％)H(8.76％)N(5.65％)，與理論值C(67.67％)H(8.38％)N(5.92％)相近。
實施例10.阿昔洛韋膽固醇琥珀酸酯脂質(zhì)體的制備取阿昔洛韋膽固醇琥珀酸酯(20mg)、大豆磷脂(0.1g)于250ml燒瓶中，用20ml二氯甲烷溶解，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到一層有機脂溶性膜，加入pH7.4的磷酸鹽緩沖液10ml，振蕩，大部分膜脫落，在50℃超聲，直至得到均勻混懸液，顯微鏡下觀察，大部分粒子直徑小于1微米，即為阿昔洛韋膽固醇琥珀酸酯脂質(zhì)體。
實施例11.阿昔洛韋膽固醇琥珀酸酯非離子表面活性劑泡囊的制備取阿昔洛韋膽固醇琥珀酸酯(30mg)、司盤60(0.08g)于250ml燒瓶中，用20ml二氯甲烷溶解，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到一層有機脂溶性膜，加入pH7.4的磷酸鹽緩沖液10ml，振蕩，大部分膜脫落，在50℃超聲，直至得到阿昔洛韋膽固醇琥珀酸酯非離子表面活性劑泡囊的均勻混懸液，激光散射粒度分析儀檢測，平均粒徑為325納米。
實施例12.去羥肌苷膽固醇琥珀酸酯長循環(huán)脂質(zhì)體的制備取去羥肌苷膽固醇琥珀酸酯(50mg)、大豆磷脂(0.1g)、PEG化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)(0.01g)于燒瓶中，用20ml氯仿∶異丙醚(1∶1，v/v)溶解，加入適量蒸餾水，超聲使其成為乳劑，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到凝膠態(tài)物質(zhì)，加入少量水，繼續(xù)減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，凝膠態(tài)物質(zhì)脫落并分散成均勻混懸液，顯微鏡下觀察，大部分粒子直徑小于1微米，即為去羥肌苷膽固醇琥珀酸酯長循環(huán)脂質(zhì)體。
實施例13.去羥肌苷膽固醇琥珀酸酯固體脂質(zhì)納米粒的制備取去羥肌苷膽固醇琥珀酸酯(60mg)、單硬脂酸甘油酯(0.8g)、吐溫80(0.02g)于燒杯中加熱至80℃，逐漸加入含十二烷基硫酸鈉(10mg)的80℃水(10ml)，保持溫度不變，呈透明液體。再將其用注射器注入到高速攪拌的0℃水中，呈透明液體。在原子力顯微鏡下觀察，多為100納米以下的粒子。該去羥肌苷膽固醇琥珀酸酯固體脂質(zhì)納米?；鞈乙嚎沙胤胖?天未見沉淀析出。該固體脂質(zhì)納米?；鞈乙禾砑舆m當保護劑后凍干成固體粉末，臨用前加入水，即成去羥肌苷膽固醇琥珀酸酯固體脂質(zhì)納米?；鞈乙骸?br> 實施例14.阿昔洛韋膽固醇琥珀酸酯自組裝傳遞系統(tǒng)的制備取阿昔洛韋膽固醇琥珀酸酯溶于四氫呋喃(5％，w/w)，用微量注射器注入到攪拌的水中，注入速度約100μl/min，至得到均勻微混懸液，減壓可揮去有機溶劑，并可在加熱條件下進一步濃縮產(chǎn)品，產(chǎn)品經(jīng)磷鎢酸負染后，粒子透射電鏡下觀察，為納米級的粒狀或棒狀結構，即為阿昔洛韋膽固醇琥珀酸酯自組裝傳遞系統(tǒng)。
實施例15.去羥肌苷膽固醇琥珀酸酯自組裝傳遞系統(tǒng)的制備將含有去羥肌苷膽固醇琥珀酸酯(5％，w/w)和泊洛沙姆P188(1％，w/w)的四氫呋喃溶液，用微量注射器注入到攪拌的水中，注入速度約100μl/min，至得到均勻微混懸液，減壓可揮去有機溶劑，并可在加熱條件下進一步濃縮產(chǎn)品。產(chǎn)品經(jīng)磷鎢酸負染后，用透射電鏡觀察，為納米級的粒狀或棒狀結構(見說明書附

圖1和附圖2)，粒徑在20-1000納米之間，即為去羥肌苷膽固醇琥珀酸酯自組裝傳遞系統(tǒng)。
圖1低濃度(0.47mg/ml)去羥肌苷膽固醇琥珀酸酯自組裝傳遞系統(tǒng)負染法透射電鏡照片。
圖2高濃度(11.88mg/ml)去羥肌苷膽固醇琥珀酸酯自組裝傳遞系統(tǒng)負染法透射電鏡照片。
權利要求
1.一種核苷類似物膽固醇衍生物，其特征是核苷類似物膽固醇衍生物的結構為Nu-L-Ch其中Nu是核苷類似物基團，L是脂肪鏈連接基，并且L中的碳數(shù)在2～7之間，Ch是膽固醇基團。
2.如權利要求1的核苷類似物膽固醇衍生物，Nu、L和Ch之間以酯鍵連接。
3.如權利要求1的核苷類似物膽固醇衍生物，其中L的原型分子是雙羧基脂肪酸。
4.如權利要求1的核苷類似物膽固醇衍生物，其中Nu的原型分子是核苷類似物，并且在其非芳香環(huán)的脂肪鏈或環(huán)上連有羥基。
5.如權利要求4的核苷類似物膽固醇衍生物，其中Nu的原型分子是具有抗病毒或抗癌作用的藥物。
6.如權利要求1的核苷類似物膽固醇衍生物，其中L的原型分子是雙羧基脂肪酸，Nu的原型分子是具有抗病毒或抗癌作用的核苷類似物藥物，并且在其非芳香環(huán)的脂肪鏈或環(huán)上連有羥基，Ch是膽固醇基團。
7.如權利要求1～6的任一核苷類似物膽固醇衍生物形成的高度分散的傳遞系統(tǒng)，包括脂質(zhì)體、非離子表面活性劑泡囊、納米粒、微乳。
8.如權利要求7的高度分散的傳遞系統(tǒng)，含核苷類似物膽固醇衍生物的粒子直徑小于1微米。
9.如權利要求1～6的任一核苷類似物膽固醇衍生物形成的高度分散的自組裝傳遞系統(tǒng)，其分散粒子組成中的核苷類似物膽固醇衍生物的分子摩爾比例大于50％，其余為添加劑。
10.如權利要求9的自組裝傳遞系統(tǒng)，其中添加劑選自磷脂、多元醇酯類表面活性劑、聚氧乙烯類表面活性劑、雙十六烷基磷脂酸、膽固醇及其衍生物、硬脂胺。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種核苷類似物膽固醇衍生物，特征是核苷類似物膽固醇衍生物的結構為Nu－L－Ch其中Nu是核苷類似物基團，L是脂肪鏈連接基，并且L中的碳數(shù)在2～7之間，Ch是膽固醇基團。由核苷類似物膽固醇衍生物可以形成高度分散的傳遞系統(tǒng)，包括脂質(zhì)體、非離子表面活性劑泡囊、納米粒和微乳，也可以形成自組裝傳遞系統(tǒng)。
文檔編號A61K47/28GK1634969SQ20041009065
公開日2005年7月6日 申請日期2004年11月11日 優(yōu)先權日2004年11月11日
發(fā)明者金義光, 艾萍 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所