專利名稱：新西蘭牡荊甙－1在制備抗病毒藥物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新西蘭牡荊甙-1在制備抗病毒藥物的用途。
背景技術(shù)：
Yasukawa K等在Yakugaku Zasshi 1986，106(6)第517-519頁和蘇亞倫、王玉蘭、楊俊山在《中草藥》1993，24(7)在第343-344，378頁中報道了新西蘭牡荊甙-1為6-C-木糖-8-C-葡萄糖-芹黃素苷及其理化常數(shù)和波譜數(shù)據(jù)，它的結(jié)構(gòu)式為 本發(fā)明人在研究繁縷中從中分離出了一種黃酮，經(jīng)過鑒定發(fā)現(xiàn)它就是新西蘭牡荊甙-1，進而進一步對新西蘭牡荊甙-1的活性加以研究，意外發(fā)現(xiàn)它具有抗病毒的作用，從而完成本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供新西蘭牡荊甙-1在制備抗病毒藥物的用途。
本發(fā)明所述的病毒是指艾滋病病毒、皰疹病毒、呼吸道病毒、腸道病毒、尖銳濕疣病毒、感冒病毒和腺病毒。其中皰疹病毒包括單純皰疹病毒-1和單純皰疹病毒-2和帶狀皰疹病毒。
由于新西蘭牡荊甙具有抗上述病毒的活性，所以它可以制備成治療上述病毒引起的疾病的藥物。這些病毒引起的疾病包括艾滋病、病毒性呼吸道疾病、病毒性腸道疾病、病毒性感冒、尖銳濕疣、皮膚皰疹、性皰疹、眼角膜皰疹或水痘-帶狀皰疹。
本發(fā)明所述的新西蘭牡荊甙-1可以通過化學(xué)合成獲得，也可以從繁縷屬植物或其它屬植物中提取獲得的。這些植物包括繁縷屬植物薄葉繁縷Stellaria leptohylla Hance、長瓣繁縷Stellaria hungeanaFenzl.、褐瓣雀舌草Stellaria alsine var.PhaeuspetalaHand.-Mazz.、安徽繁縷Stellaria anhwiensis Migo.、細尖繁縷Stellaria apiculata Wils.4987Stellaria(L)Scop.、薄葉阿里山繁縷Stellaria arisanensis var.Leptophylla Hayata.、北繁縷Stellaria borealis Bigel.、小茸毛繁縷Stellaria tomentallaOhwi.、大衛(wèi)繁縷Stellaria davidii Hemsl.、沙生繁縷Stellariaarenaria Maxim.、短瓣繁縷Stellaria brachypetala Bge.、華繁縷Stellaria chinensis Regel.、阿里山繁縷Stellaria arisanensisHayata.、東北繁縷Stellaria cherleriae(Fisch.)Will.、厚葉繁縷Stellaria crassifolia、皺葉繁縷Stellaria crispate Wall.、雀舌草Stellaria alsine Grimm.、偃臥繁縷Stellaria decumbensEdgew.、二歧聚傘花繁縷Stellaria dichasioides Williams.、窄葉雙歧繁縷Stellaria dichotoma var.Lanceolata Bge.、西南繁縷Stellaria delavayi Franch.、石竹葉繁縷Stellaria dianthifoliaWilliams.、針狀偃臥繁縷Stellaria decunbens var.AciculariaEdgew.Et Hook.f.、雙歧繁縷Stellaria dichotoma L.、線葉雙歧繁縷Stellaria dichotoma var.Stephenjiana Willd.、澤繁縷Stellaria diversiflora Maxim.、凹脈繁縷Stellaria depressaSchnid.、翻白繁縷Stellaria discolor Turcz.、禾葉繁縷Stellariagraminea L.、鋪散繁縷Stellaria diffusa Wills.、杜氏繁縷Stellaria duthiei Gandoger.、線莖繁縷Stellaria filicaulisMak.、裸蕊異花繁縷Stellaria diversiflora var.GymnandraFranch.、多花繁縷Stellaria florida Fisch.、長毛繁縷Stellariapilosa Franch.、線柄繁縷Stellaria filipes Komar.、鈍萼繁縷Stellaria amblyosepala Schrenk.、疏柔毛禾葉繁縷Stellariagraminea var.Pilosula Maxim.、變綠禾葉繁縷Stellaria graminea、東繁縷Stellaria maximowixziana Franch var.ViridescensMaxim.、江孜繁縷Stellaria gyantsensis Williams.、湖北繁縷Stellaria henryi Williams.、興安繁縷Stellaria hsinganensisKitagawa.、霞草繁縷Stellaria gypsophiloides Fenzl.、繁縷Stellaria media(L.)Cyr.、小花繁縷Stellaria micrantha Hayata.、內(nèi)曲繁縷Stellaria infracta Maxim.、柔繁縷Stellaria mitansWilliams.、鵝腸繁縷Stellaria neglecta Weihe.、新沼生繁縷Stellaria neo-alustris Kitagawa.、八蕊繁縷Stellaria octandraFobedim.、紅莓繁縷Stellaria oxycoccoides Komar.、石生繁縷Stellaria saxatilis Buch-Ham.、柄花繁縷Stellaria peduncularisBge.、臺灣繁縷Stellaria cicrantha Hayata.、沼生繁縷Stellariapalustria L.、土耳其斯坦繁縷Stellaria turkestanica Schischk.、展葉繁縷Stellaria patentifolia Kitagawa.、假石生繁縷Stellariapseudosaxatilis Hand.-Mass.、五臺繁縷Stellaria wutaicaHand.-Mazz.、網(wǎng)脈繁縷Stellaria reticulivena.Hayata.、巖繁縷Stellaria rupestris Hemsl.、抱莖石生繁縷Stellaria saxatilisvar.Amplexicaulis Hand.-mazz.、三型繁縷Stellaria trimorphaNakai.、小繁縷Stellaria pusilla Schmid.、燧瓣繁縷Stellariaradians L.、準葛爾繁縷Stellaria soongorica Roshev.、蘇氏繁縷Stellaria souliei Williams.、星毛繁縷Stellariastellato-pilosa Hayata.、園萼繁縷Stellaria stronglosepalaHand.-Mazz.、擬傘花繁縷Stellaria subumbellata Edgew.、濕地繁縷Stellaria uda Williams.、綠花繁縷Stellaria virdiflora Paxet O.Hoffm.、巫山繁縷Stellaria wushanensis Williams.、傘花繁縷Stellaria umbellate Turcz.、云南繁縷Stellaria yunnanensisfranch.j、牛繁縷屬植物牛繁縷Malachium aquaticum(L.)Fries、松葉蕨科植物松葉蕨Psilotum nudum(L.)Griseb.[Lycopodium nudumL.]、鐵角蕨科植物虎尾鐵角蕨Asplenium incisum Thunb.、石竹科植物凄枯草Sagina japonica(SW.)Ohwi.[Spergula japonica SW.]、鼠李科植物酸棗的種子Zoziplus jujuba Mill.Var.Spinosa(Bunge)Hu ex H.F.chow[Z.Vulgaris Lam.var.Spinosa Bunge.]、山茶科植物的嫩葉或嫩芽Camellia sinensis(L.)O.Kuntze[Theasinensis L.]、唇形科植物羅勒的全草Ocimum basilicum L.、唇形科植物野紫蘇Perilla frutescens(L.)Britt.Var.Purpurascens(Hayata)H.W.H.li[P.Frutescens(L.)Britt var.Acuta(Thumb)L.Kudo]、玄參科植物野甘草Scoparia dulcis L.、豆科植物田皂角Aesohy nomene india L.的葉、豆科植物金錢草Desmodium styracifolium(Osbeck)Merr.的枝葉、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、豆科植物鐵掃帚Lespedeza juncea(L.f.)Pers.Var.Seriacea(Thunb)Maxim[Hedysarum junceum L.f.；Lespedeza sericea(Thunb)Miq.；L.Cuneafa(Dum.-cours)G.Don]的全草或根、豆科植物胡盧巴Trigonella foenum-graecum L.、亞麻科植物亞麻Linum usitatissimum L.、蕓香科植物金橘Fortunellamargarita(Lour.)swingle[Crtrus margarita Lour.]。
新西蘭牡荊甙-1從繁縷屬植物中提取的方法如下用8倍量的50％乙醇在80℃下提取，每次1-3小時，合并提取液，減壓回收乙醇，濃縮至40℃測密度1.05-1.1，向濃縮液中加入95％乙醇，使醇濃度達到40-70％，醇沉(沉淀物另用)，過濾，濾液通過正相硅膠柱層析，以不同比例的乙酸乙酯和甲醇(或不同比例的氯仿和甲醇)進行洗脫，1/4個柱體積接收一瓶，以薄層鑒別監(jiān)控，取含量最多一段，再上一次制備柱，以12.5∶87.5比例的乙腈-0.3％H3PO4作流動相，接取所得成分，即新西蘭牡荊甙-1。
本發(fā)明所述的新西蘭牡荊甙-1可以與藥學(xué)上可接受的載體或賦型劑按照常規(guī)制劑方法制備成各種藥物劑型，這些藥物劑型包括片劑、膠囊、噴霧劑、膏劑、乳劑、霜劑、顆粒劑等。
具體實施例方式
以下通過試驗來證實新西蘭牡荊甙-1的抗病毒功效。
試驗例1新西蘭牡荊甙-1體外抗皰疹病毒的活性試驗
1試驗材料和方法細胞As49/20S細胞(用于單純皰疹病毒I型，HSV-1的培養(yǎng))，A-549細胞(用于單純皰疹病毒II型，HSV-II的培養(yǎng))購自美國ATCC；HELF(人胚肺成纖維細胞，用于帶狀皰疹病毒，VZV的培養(yǎng))由美國科州醫(yī)學(xué)中心兒科傳染病系提供。
培養(yǎng)基最小基礎(chǔ)培養(yǎng)基Eagle(Sigma，St Louis，MO，美國)，加上10％胎牛血清。
病毒毒株HSV-I 690，HSV-II SKB-1，CAVZV均由美國科州醫(yī)學(xué)中心兒科傳染病系提供。
樣品新西蘭牡荊甙-1由海南制藥集團藥物研究所提供。對照藥物磷甲酸(PFA)和阿昔洛韋由美國科州醫(yī)學(xué)中心傳染病系提供?？笻SV-1和抗VZV活性根據(jù)保護細胞病變作用的程度決定?？笻SV-II的活性根據(jù)病毒形成的空斑數(shù)目變化決定。
樣品毒性測定用苔玢藍染色方法判斷細胞成活數(shù)目，藍染細胞為死細胞，無色細胞為活細胞。
數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用Chou Dose Effect的軟件處理數(shù)據(jù)。
2試驗設(shè)計樣品在細胞培養(yǎng)中對HSV-1復(fù)制的抑制作用樣品和陽性對照藥物阿昔洛韋和磷甲酸在96-孔培養(yǎng)板內(nèi)連續(xù)1∶4稀釋，每孔藥物的體積為100微升。As49/20S細胞100微升(106細胞/毫升)和50微升HSV-1-690(MOI＝0.005)加入每一孔中。在37℃，5％CO2的孵箱中培養(yǎng)48小時，顯微鏡下觀察細胞病變(CPE)程度。無病變和CPE在＜25％、＜50％、＜75％和＞75％分別給予-，+，++，+++，++++的記錄。毒性測定的設(shè)計相同于上述敘述，只是用50微升的培養(yǎng)液代替病毒懸液，并在48小時后用Typan Blue染色決定細胞死活數(shù)目，最后用Chou Dose Effect軟件處理數(shù)據(jù)，算出藥物50％抑制濃度IC50。
樣品在細胞培養(yǎng)中對HSV-II復(fù)制的抑制作用樣品和陽性對照藥物阿昔洛韋在96-孔培養(yǎng)板內(nèi)連續(xù)1∶4稀釋，每孔藥物的體積為100微升。A-549細胞100微升(106細胞/毫升)和50微升HSV-IISKB-1(MOI＝0.005)加入每一孔中。在37℃，5％CO2的孵箱中培養(yǎng)72小時，用Giemsa染細胞，計數(shù)空斑數(shù)目。毒性測定與數(shù)據(jù)處理同前述，算出藥物50％抑制濃度IC50。
樣品在細胞培養(yǎng)中對VZV復(fù)制的抑制第20代的HELF用0.5％胰酶/EDTA1消化制成105/毫升的細胞懸液。0.5毫升的HELF細胞懸液種到24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，在37℃，5％CO2的孵箱中培養(yǎng)48小時，細胞單層成長。被CAVZV感染的105HFLF細胞加到每一孔中攻擊正常的HELF細胞，2小時后加入不同濃度的樣品和陽性對照藥物阿昔洛韋并在37℃，5％CO2的孵箱中培養(yǎng)。在感染4天后于顯微鏡下觀察CPE，記錄病變的程度為-，+，++，+++，++++，代表無病變，CPE＜25％，＜50％，＜75％，＞75％。毒性測定與數(shù)據(jù)處理與前相同，算出藥物50％的抑制濃度。
3結(jié)果表1新西蘭牡荊甙-1抗HSV-1的活性感染2天后的As49/20S細胞系中的HSV-1(HSV-1 690)的細胞病理作用


表2新西蘭牡荊甙-1抗HSV-2的活性PEU的數(shù)量/0.1(105細胞)HSV-2(SKB-1)所產(chǎn)生的A-549細胞

表3新西蘭牡荊甙-1抗VZV體外活性試驗人胎肺成纖維細胞(HELF)的VZV的細胞病理作用


4結(jié)論新西蘭牡荊甙-1體外明顯抑制HSV-1、HSV-2、VZV在細胞內(nèi)的復(fù)制，50％抑制HSV-1濃度為30.9微克/毫升；50％抑制HSV-2的濃度為45.3微克/毫升；50％抑制VZV的濃度為200微克/毫升。根據(jù)IC50的數(shù)據(jù)，新西蘭牡荊甙-1抑制HSV-1＞HSV-2＞VZV。
試驗例2新西蘭牡荊甙-1體外抗艾滋病病毒的活性試驗1材料和方法病毒HIV-1018a是從AZT治療前的HIV-1感染的個體獲得。它由美國加州大學(xué)圣地亞哥分校的Douglas Richmen教授提供。
細胞外周血單核細胞(PBMC)使用Ficoll-Hypaque密度梯度離心方法，從未感染HIV的健康供血者的外周血分離得到的。
試驗設(shè)計抗病毒活性的測定將2×105PBMC/100微升的新西蘭牡荊甙-1暴露于用接種50微升的HIV-1的100TCID50。同時，給每個孔中加入各種濃度的新西蘭牡荊甙100微升。感染4天培后，取上清液測定p24抗原產(chǎn)生。按照操作說明通過完整病毒抗原捕獲ELISA(CoulterCorp.，Hialeah FL)復(fù)制來定量HIV-1p24抗原。
細胞毒性測定使用包括3H-胸腺嘧啶所測定的細胞增生描述可能的藥物細胞毒性作用。在含有各種濃度的新西蘭牡荊甙-1的96孔培養(yǎng)皿培養(yǎng)4天后，將1μCi胸腺嘧啶(DuPont NEN，Boston MA)加入到2×105細胞/200微升培養(yǎng)基。加入3H-胸腺嘧啶后，在37℃培養(yǎng)6小時并測定3H-TdR。用SigmaPlot Scirntific Graphing System計算50％抑制濃度(IC50)和50％毒性濃度(TC50)，計算治療指數(shù)TI值＝TC50/IC50。
試驗結(jié)果HIV-1018a p24抗原產(chǎn)生(pg/ml)(感染后4天，用病毒將細胞感染2小時)

結(jié)論新西蘭牡荊甙-1對相同時間病毒接種的細胞的IC50為1.3μg/ml，TC50為28.3μg/ml，治療指數(shù)為22。新西蘭牡荊甙-1對HIV-1018a預(yù)感染PBMCs3小時的IC50為6.1μg/ml，TC50為28.3μg/ml，治療指數(shù)為5。
權(quán)利要求
1.新西蘭牡荊甙-1在制備抗單純皰疹病毒的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了新西蘭牡荊甙－1用于制備抗單純皰疹病毒的藥物的用途。
文檔編號A61P31/00GK1636570SQ200410088710
公開日2005年7月13日 申請日期2003年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月30日
發(fā)明者樓金, 張龍清, 張興權(quán) 申請人:海南亞洲制藥有限公司