專利名稱：一種蘆薈雙氫香豆素及分離方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從蘆薈中分離出的化合物。
本發(fā)明還涉及從蘆薈中分離化合物的方法。
本發(fā)明還涉及該化合物在藥理學方面的用途。
背景技術(shù)：
蘆薈是百合科(Liliaceae)蘆薈屬(Aloe)多年長綠肉質(zhì)草本植物，蘆薈屬植物在民間用于治療創(chuàng)傷、哮喘、胃潰瘍和便秘等癥?，F(xiàn)代藥理實驗證明該屬植物中的有效部位或有效成分具有抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、殺蟲解熱、保肝及免疫增強等功效。目前，蘆薈屬植物及其制品廣泛應(yīng)用于日用化工、保健食品等多個領(lǐng)域。應(yīng)用先進的提取技術(shù)對中草藥中有效成分進行提取和純化是中醫(yī)藥現(xiàn)代化的重要發(fā)展方向之一。某些中草藥的單方或復方的粗提液經(jīng)粗分后已經(jīng)用于臨床并取得了較好的治療效果，這些成分中并不是每一個都在起作用。因此，從天然藥物中探尋毒副作用低和療效顯著的化合物并將其應(yīng)用于臨床具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從蘆薈中分離提取的化合物-蘆薈雙氫香豆素。
本發(fā)明的又一目的是提供分離上述化合物的方法。
本發(fā)明提供的化合物，其結(jié)構(gòu)如下式
式中a、b標示3位上兩個不等性氫原子；i、j標示4’和7位上兩個不同酚羥基。
迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)該化合物的專利或文獻報道。
本發(fā)明提供的從蘆薈中提取分離雙氫香豆素的方法，其主要步驟是A.所用原料為庫拉索蘆薈浸膏；B.首先以酸性氯仿進行回流提取(氯仿5000ml，20％H2SO4100ml)，庫拉索蘆薈浸膏質(zhì)量與溶劑體積之比為1∶3-5，浸取10次以上，每次2-5小時，濃縮每次抽提液；C.抽提液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮，溫度控制在28-35℃，并回收氯仿以反復使用，得到濃縮抽提液；D.以溫熱(T＝35-45℃)乙醇-水的混合液(體積比為1∶1-3)對上述抽提液進行重新溶解。依次以正己烷、氯仿、水對其進行萃取，并分別對萃取液進行濃縮；F.將氯仿萃取液濃縮后進行柱層析分離，所用的柱層析填料為聚酰胺粉末顆粒，粒徑40-80目。聚酰胺粉使用前首先進行預處理，以二氯甲烷二甲基甲酰胺(體積比100∶10-20)充分浸泡，時間不少于24小時，然后依次用環(huán)己烷、丙酮、氯仿、乙醇進行淋洗，以除其中的蠟質(zhì)及其他雜質(zhì)。層析柱為普通玻璃柱(直徑柱高為1∶20)。對氯仿提取物依次以環(huán)己烷、苯、氯仿、丙酮、甲醇進行洗脫。在氯仿∶丙酮為2∶1.5的洗脫部位出現(xiàn)一個混合的蘭色熒光物質(zhì)。合并此類物質(zhì)，濃縮。以硅膠作為分離材料，以環(huán)己烷和丙酮(體積比為1∶1-3)作為洗脫劑對此化合物分離純化，分別接收，得到一個純凈的化合物。經(jīng)過光譜解析證實此化合物為自然界首次發(fā)現(xiàn)的一個化合物，本申請將其命名為蘆薈雙氫香豆素。
蘆薈雙氫香豆素，淡黃色粉末。m.p.284-286℃，加熱溶于乙酸乙酯，微溶于甲醇、丙酮。EI-MS394，366，351，335，323，296，278，267，186，141，119105，94，60。高分辨質(zhì)譜393.0982(負離子峰)，分子組成為C22H18O7。
紫外光譜λ287.5(0.4156)，252.0(0.2634)，224.0(0.0581)。
紅外光譜γcm-1(KBr壓片)3363.44，1619.21，1639.84，1595.01，1563.67，1514.15，1458.36，1406.69，1372.86，1251.37，1136.11，1013.75，826.40，551.14。
核磁共振氫譜(DMSO)δppm10.26(-OH，OH-i)；9.38(-OH，OH-j)；6.86d，J＝8.53，(2H，H-2′，H-6′)；6.70d，J＝8.45，(2H，H-3′，H-5′)；6.60s，(1H，H-8)；6.22d，J＝2.15，(1H，H-5″)；5.66d，J＝2.15，(1H，H-3″)；4.41d，J＝5.86，(1H，H-4)；3.84s，(3H，H-7″)；3.21m，(1H，H-3a)；2.83t，(1H，H-3b)；1.97s，(3H，H-9)。
核磁共振碳譜(DMSO)δppm170.71(C-5″)；167.26(C-2)；163.82(C-2)；157.99(C-6″)；156.39(C-4′)；170.71(C-4″)；155.67(C-7)；153.13(C-8a)；136.82(C-5)；131.01(C-1′)；127.75(2C，C-2′，C-6′)；117.33(C-6)；115.64(2C，C-3′，C-5′)；115.19(C-4a)；104.41(C-5″)；101.54(C-8)；88.27(C-3″)；56.37(C-7″)；37.74(C-3)；36.01(C-4)；15.78(C-9)。
只依靠H1-NMR，C13-NMR(見附圖1、2)對該化合物結(jié)構(gòu)的鑒定是不夠全面的，本申請還作了相關(guān)的二維核磁譜H-H COSY、HMBC、HMQC以及DEPT-135對其結(jié)構(gòu)進行進一步全面的確定。
經(jīng)藥理學研究，該化合物還具有抗氧化性，較強的免疫調(diào)節(jié)作用和抗腫瘤活性。


圖1化合物的1H-NMR譜；圖2化合物的13C-NMR譜；
圖3化合物的抗氧化性實驗結(jié)果示意圖；圖4巨噬細胞吞噬活性的測試結(jié)果示意圖；圖5巨噬細胞呼吸爆發(fā)結(jié)果示意圖；圖6誘導KB細胞凋亡TUNEL實驗(a)與Hoechst 33258染色照片(b)。
具體實施例方式
以庫拉索蘆薈浸膏為原料，用酸性氯仿進行回流提取(氯仿5000ml，100ml 20％H2SO4)，庫拉索蘆薈浸膏質(zhì)量與溶劑體積之比為1∶5，浸取10次，每次3小時，濃縮每次抽提液；抽提液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮，溫度控制在30℃，并回收氯仿以反復使用，得到濃縮抽提液；以40℃乙醇-水的混合液(體積比為1∶1)對上述抽提液進行重新溶解。依次以正己烷、氯仿、水對其進行萃取，并分別對萃取液進行濃縮；將氯仿萃取液濃縮后進行柱層析分離，所用的柱層析填料為聚酰胺粉末顆粒，60目。聚酰胺粉首先進行預處理。以二氯甲烷二甲基甲酰胺(體積比100∶10)充分浸泡，時間不少于24小時，然后依次用環(huán)己烷、丙酮、氯仿、乙醇進行淋洗，以除其中的蠟質(zhì)及其他雜質(zhì)。層析柱為普通玻璃柱(直徑柱高為1∶20)。對氯仿提取物依次以環(huán)己烷、苯、氯仿、丙酮、甲醇進行洗脫。在氯仿∶丙酮為2∶1.5的洗脫部位出現(xiàn)一個混合的蘭色熒光物質(zhì)。合并此類物質(zhì)，濃縮。以硅膠作為分離材料，以環(huán)己烷和丙酮(體積比為1∶1)作為洗脫劑對此化合物分離純化，分別接收，得到一個純凈的化合物。
上述化合物具有抗氧化性、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤活性1、抗氧化特性分別借助Fenton反應(yīng)和黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系，檢驗蘆薈雙氫香豆素在體外對羥基自由基與超氧陰離子自由基的抑制作用Fenton反應(yīng)體系H2O2(30％)60μl，5×10-5Fe2+-EDTA溶液80μl，0.2mmol-1DEPMPO 30μl，高純水80μl，1.4mg/ml蘆薈雙氫香豆素的DMSO溶液70μl混合均勻，終體積為240μl，反應(yīng)混合液轉(zhuǎn)移至一個石英扁平池中，置于ESR(Bruker ESP 300)標準諧振腔內(nèi)(TE102)，5min后檢測羥基自由基。
黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系0.8mmol-1Xan 60μl，0.2V/ml XOD 60μ，0.2mmol-1DEPMPO 30μl，高純水80μl，1.4mg/ml蘆薈雙氫香豆素的DMSO溶液70μl混合均勻，終體積為240μl，反應(yīng)混合液轉(zhuǎn)移至一個石英扁平池中，置于ESR(Bruker ESP 300)標準諧振腔內(nèi)(TE102)，5min后檢測超氧陰離子自由基。
如圖3所示，在0.4mg/ml條件下顯示出對上述體系中羥基與超氧陰離子自由基較可觀的抑制率。超氧陰離子的抑制率約為43％；羥基自由抑制率為44％。
2、免疫調(diào)節(jié)作用1)巨噬細胞吞噬活性的測試巨噬細胞吞噬活力以其吞噬中性紅的能力來表示。2×106cells巨噬細胞預先與FLZ 10-6，10-5，10-4mol.l-1和EGB76140，80，160mg.l-1溫孵1h，反應(yīng)體積1ml，然后再與ox-LDL(0.1mg protein)共培養(yǎng)4h.通過換上新鮮的培養(yǎng)液來終止反應(yīng)，每孔加入0.1ml 0.072％中性紅(溶于0.9％NaCl)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)30min，棄去上清，用Hanks溶液洗二次，加入0.2ml 50％乙酸(1∶1v/v)來提取巨噬細胞中的中性紅顏色，巨噬細胞的吞噬活力通過被吞噬的中性紅的吸光度來表示(如圖4)。
2)蘆薈雙氫香豆素對經(jīng)佛波脂(PMA)誘發(fā)小鼠腹腔巨噬細胞呼吸爆發(fā)的影響將分離好的細胞按每孔5×106個細胞加到24孔培養(yǎng)板中的三個孔，經(jīng)貼壁后向每孔中加入細胞培養(yǎng)平衡鹽溶液Hanks和相應(yīng)的蘆薈提取物，提取物終濃度為50μg/ml，細胞培養(yǎng)箱溫育2h，棄去上清，依次加Hanks液、絡(luò)合劑、捕捉劑和PMA，混勻，終體積為250μl，5min后檢測超氧陰離子自由基，ESR譜圖如圖5所示。
蘆薈雙氫香豆素在巨嗜細胞實驗中體現(xiàn)出對巨嗜細胞吞噬能力特有的激活作用。在濃度為200μg/ml時，它顯著增強巨嗜細胞的吞噬能力。同時，在PMA誘導的巨嗜細胞氧呼吸爆發(fā)過程中，蘆薈雙氫香豆素顯著增加了該過程中超氧陰離子自由基的產(chǎn)生。
3.對腫瘤細胞的凋亡作用1)TUNEL實驗在細胞發(fā)生凋亡過程中，細胞基因組的DNA會被切斷，產(chǎn)生雙鏈碎片(單核小體或者寡聚核小體)或者在大的DNA分子上出現(xiàn)單鏈斷裂的缺口。在末端脫氧核酸轉(zhuǎn)移酶的作用下，DNA3’-OH就會被標記。這種酶可以將經(jīng)過標記的核苷酸以不依賴模板的形式發(fā)生聚合到游離的3’-OH上面。這些DNA碎片可采用熒光顯微鏡或者流式細胞儀檢測。
經(jīng)100μg/ml蘆薈雙氫香豆素作用的人口腔癌上皮細胞(KB細胞)，1500rpm離心10min，去上清液，用PBS洗滌3次，將細胞濃度調(diào)整為107cell/ml。取100μl細胞懸浮液，加入100μl新配制的固定液，在15～25℃固定1h。離心，多次用PBS洗滌，用PBS將細胞調(diào)整在體積為250～500μl。在流式細胞儀上檢測，激發(fā)波長450～500nm，發(fā)射波長515～565nm。實驗結(jié)果如圖6-a所示，約有57.43％的KB細胞的DNA產(chǎn)生斷裂，發(fā)生凋亡。
2)Hoechst 33258染色試驗Hoechst 33258是一種與核DNA結(jié)合的染料，可根據(jù)它的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜特征，在流式細胞儀上檢測細胞凋亡。因為該染料更易與凋亡細胞DNA結(jié)合，使之染色，可在熒光顯微鏡下直接觀察凋亡現(xiàn)象。
取處理好的潔凈蓋玻片，平放入六孔培養(yǎng)板內(nèi)，接種入KB細胞培養(yǎng)過夜，刺激細胞發(fā)生凋亡(50μg/ml)。吸盡培養(yǎng)液，加入0.5ml固定液，固定10min。去掉固定液，用PBS或0.9％NaCl洗滌兩遍，每次3min。加入Hoechst 33258染色液，染色5min。在熒光顯微鏡下鏡檢，激發(fā)波長361nm，發(fā)射波長460nm。染色結(jié)果如圖6-b所示，染色的KB細胞形態(tài)出現(xiàn)明顯皺縮現(xiàn)象，發(fā)生凋亡。
權(quán)利要求
1.一種蘆薈雙氫香豆素，其結(jié)構(gòu)如下式
2.一種分離權(quán)利要求1所述化合物的方法，其主要步驟是a)所用原料為庫拉索蘆薈浸膏；b)首先以酸性氯仿進行回流提取，該酸性氯仿為氯仿∶20％H2SO4＝5000ml∶80-100ml，庫拉索蘆薈浸膏質(zhì)量與溶劑體積之比為1∶3-5，浸取10次以上，每次2-5小時，濃縮每次抽提液；c)抽提液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮，溫度控制在28-35℃，并回收氯仿以反復使用，得到濃縮抽提液；d)以體積比為1∶1-3的乙醇-水混合液對上述抽提液進行重新溶解，依次以正己烷、氯仿、水對其進行萃取，并分別對萃取液進行濃縮；e)將氯仿萃取液濃縮后進行柱層析分離，所用的柱層析填料為聚酰胺粉末顆粒，粒徑40-80目，層析柱為普通玻璃柱，直徑∶柱高為1∶20；對氯仿提取物進行淋洗，淋洗液以體積比為氯仿∶丙酮＝2∶1.5，合并淋洗的物質(zhì)，濃縮；以硅膠作為分離材料，以體積比為1∶1-3的己烷和丙酮混合溶液為洗脫劑對化合物分離純化，分別接收，得到蘆薈雙氫香豆素。
3.權(quán)利要求2的方法，其特征在于，步驟d中的乙醇-水混合液溫度為35-45℃。
4.權(quán)利要求2的方法，其特征在于，步驟e中的聚酰胺粉末顆粒在使用前以體積比為100∶10-20的二氯甲烷和二甲基甲酰胺混合液浸泡24小時以上，然后依次用環(huán)己烷、丙酮、氯仿、乙醇進行淋洗，以除其中的蠟質(zhì)及其他雜質(zhì)。
5.權(quán)利要求1所述的化合物在制備具有抗氧化性、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
一種蘆薈雙氫香豆素及分離和應(yīng)用，其分離方法包括將中藥蘆薈浸膏以酸性氯仿進行抽提，將提取液濃縮后以乙醇水溶液溶解，然后依次以正己烷、氯仿、醇水進行溶劑分配。對氯仿部分濃縮后進行柱層析，多次洗脫后，得到一純凈化合物。藥理實驗證實它具有抗氧化性，免疫調(diào)節(jié)作用和抗腫瘤活性。整個提取工藝過程簡單，成本低。該提取物具有較大的應(yīng)用價值。
文檔編號A61K31/366GK1730479SQ20041007099
公開日2006年2月8日 申請日期2004年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月6日
發(fā)明者劉揚, 王紅梅, 張秀鳳, 田秋 申請人:中國科學院化學研究所