專利名稱：親水親脂自封閉小體液相核心空化形成囊泡的方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使親水親脂兩性分子自封閉小體液相核心空化形成囊氣泡的方法。本發(fā)明微小囊氣泡應(yīng)用在醫(yī)療診斷上用于超聲造影成像，在臨床治療上用于靜脈輸氧治療缺氧性疾病。
背景技術(shù)：
微小囊氣泡或稱殼包裹的微氣泡(囊氣泡)，在醫(yī)療領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。近幾年發(fā)現(xiàn)經(jīng)靜脈注射微氣泡或殼包裹的微氣泡，能顯著提高超聲成像對比性。超聲造影是用超聲造影劑使超聲反射或散射增強的一種技術(shù)，超聲造影中使用的造影劑所含有的或產(chǎn)生的微泡內(nèi)氣體與周圍液體和組織相比，在超聲聲場中與周圍組織、血液成分相比具有指數(shù)級的壓縮性差異，產(chǎn)生強烈的反射界面，微泡呈顆粒狀回聲增強或云霧狀回聲，造影劑的回聲增強作用能更清楚地顯示心腔或血管內(nèi)的血液，這就是超聲造影成像的原理。
早期的超聲造影劑微小氣泡直徑均大于10微米，不能通過肺循環(huán)的毛細血管，即右心造影劑，且為自由氣泡，如雙氧水超聲造影，是經(jīng)靜脈注射雙氧水，在紅細胞內(nèi)過氧化氫酶的作用，分解釋放出氧氣，其中部分與血紅蛋白結(jié)合，其余呈游離狀態(tài)彌散于血液中，造成超聲界面反射；如二氧化碳超聲造影，是碳酸氫鈉溶液與各種酸性溶液(醋酸、鹽酸、維生素C等)混合，經(jīng)靜脈注射后釋放二氧化碳氣體形成超聲界面反射。
由于自由氣泡的不穩(wěn)定性和氣泡直徑的限制，研究者注意力邏輯上自然集中在可自發(fā)封閉形成微小球形液相小體的親水親脂兩性分子上。目前，能在液相環(huán)境里，能自發(fā)封閉形成微球樣小體總體上稱為親水親脂兩性分子自封閉小體，主要有兩類一類稱為脂質(zhì)體(Liposome)，另一類稱為基于非離子表面活性劑的液相小體(Non-ionic Surfactant based Vesicles，Niosome，參見文獻UchegbuIF，Vyas S Non-ionic surfactant based vesicles(niosomes)in drugdelivery，International Journal of Pharmaceutics 172(1998)33-70)簡稱為非離子表面活性小體。另外還有制備時兩者混合形成的非離子表面活性磷脂質(zhì)混合小體。實際上形成這種的親水親脂兩性分子自封閉小體的兩性分子都屬于表面活性劑范疇。大量的表面活性劑，包括很多非離子表面活性劑分子、各種類脂質(zhì)分子特別是磷脂均為親水親脂兩性雙分子層樣結(jié)構(gòu)。這些表面活性劑分子，在加入一定的膜添加劑后，其親水親脂兩性分子在水性介質(zhì)中，導(dǎo)入一定的機械能量攪動，可自發(fā)封閉形成具有液相核心的親水親脂雙分子層微球體樣結(jié)構(gòu)。這些物理化學(xué)性質(zhì)，決定了它們具有非常合適的膜包裹氣體的應(yīng)用前景。問題的關(guān)鍵是如何使其液相核心空化而形成微小囊氣泡。
非離子表面活性小體最先于70年代為化妝工業(yè)的研究者發(fā)現(xiàn)。這類非離子表面活性小體和脂質(zhì)體類似，由非離子表面活性劑親水親脂兩性分子在水性介質(zhì)中，導(dǎo)入一定的機械能量攪動，可自發(fā)封閉形成雙分子層微球體樣結(jié)構(gòu)。由于非離子表面活性小體的形成與親水親脂平衡值(HLB，hydrophilic-lipophilicbalance value)有密切關(guān)系，一般認為HLB值在4-10之間適合于非離子表面活性小體的形成。因此對于高HLB值的表面活性劑，往往與低HLB值的其他類型表面活性劑混合調(diào)配出合適的HLB值，如將卵磷脂加入非離子表面活性劑調(diào)配合適的HLB，這種情況下形成的小體嚴格意義上應(yīng)為磷脂質(zhì)-非離子表面活性混合小體。同樣，在制備脂質(zhì)體時，往往也需要添加某些非離子型表面活性劑作為膜修飾。此也可認為是前述的混合小體。親水親脂兩性分子自發(fā)封閉小體(非離子表面活性小體和脂質(zhì)體)制備方法都類似，如旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、聲振處理等。常規(guī)的非離子表面活性小體和脂質(zhì)體的制備分兩步驟進行1)成膜將調(diào)配好HLB值的非離子表面活性劑成膜材料和/或脂質(zhì)體成膜材料溶于有機溶液內(nèi)，并置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，成膜于容器底部；2)成體將已被膜的容器內(nèi)注入水性介質(zhì)，機械攪動1小時以上，形成具有親水親脂雙分子層的液相核心小體。應(yīng)強調(diào)的是無論非離子表面活性小體還是脂質(zhì)體，無論成膜過程還是成小體過程，均是在凝膠態(tài)向液晶態(tài)相轉(zhuǎn)變溫度上進行，這樣才能形成液相核心的小體結(jié)構(gòu)。從科學(xué)嚴格的概念上，一般意義的脂質(zhì)體(Liposome)、非離子表面活性小體(Niosome)或兩者混合形成的磷脂質(zhì)-非離子表面活性混合小體是液相概念，其親水親脂兩性分子層內(nèi)外均為液相環(huán)境。這類小體的直徑約可達到3-5微米范圍。因此要使親水親脂兩性分子自封閉小體液相核心空化形成微小囊氣泡，必須采用與一般制備脂質(zhì)體(Liposome)、非離子表面活性小體(Niosome)或兩者混合形成的磷脂質(zhì)-非離子表面活性混合小體不同的方法。
目前國內(nèi)外制備膜包裹微氣泡的方法主要有三類1)聲振利用聲振儀探頭直接插入含某種成膜表面活性劑的液體內(nèi)，引入高強度超聲振動，利用超聲空化效應(yīng)達到膜包裹微小氣泡的目的，如由中國發(fā)明專利公開說明書，申請?zhí)?2133720.9、發(fā)明專利申請?zhí)?6106566.4和發(fā)明專利申請?zhí)?1103726.1、發(fā)明專利申請?zhí)?8105120.0等涉及的超聲造影劑，均采用聲振儀進行聲振空化形成微小氣泡；2)冷凍干燥如意大利超聲造影劑Sonovue以及如發(fā)明專利申請?zhí)?8105120.0，利用冷凍干燥的方法，使磷脂質(zhì)體或聲振白蛋白微氣泡維持空泡化的空間結(jié)構(gòu)狀態(tài)；3)采用特制設(shè)備進行脂質(zhì)體空化，如發(fā)明專利申請?zhí)?4192405.X所涉及的填充氣體脂質(zhì)體的發(fā)明。
此三類方法，以聲振儀制備最為常用，但超聲探頭在極高能量振動下，易在振動液體內(nèi)殘留鈦金屬殘粒，而且制備過程較繁瑣，不易方便制備和分裝。而且已經(jīng)制備出的微小囊氣泡，在分裝和存儲過程中，不可避免的要丟失和破裂部分，沒有即刻準備的氣泡豐富。因此在使用時只用手動震蕩的能量就能產(chǎn)生微米級的氣泡是最為理想的途徑。另外，國內(nèi)發(fā)明專利申請?zhí)?2133720.9和Sonovue所用磷脂成膜材料與國內(nèi)發(fā)明申請?zhí)?2133720.9一致，造價昂貴。冷凍干燥方法，雖然利于分裝，但工藝要求高，且批量生產(chǎn)的冷凍干燥設(shè)備投入也昂貴，如Sonovue，一支Sonovue的價格國內(nèi)約為730元。發(fā)明專利申請?zhí)?4192405.X所涉及的填充氣體脂質(zhì)體的發(fā)明，需要特制的設(shè)備和特殊的工藝，制備也更繁瑣，投入大。
另外在生命活動即新陳代謝的過程，機體需要不斷地消耗氧氣，如出在臨床上急性、慢性心腦血管病變、呼吸肌麻痹、窒息性病變，往往造成全身或局部組織氧含量明顯降低，處于缺氧狀態(tài)。缺氧會導(dǎo)致機體組織種種損害，如細胞變性、壞死、血管內(nèi)皮損傷、血栓形成、全身炎癥反應(yīng)等，甚至導(dǎo)致機體死亡。如人腦灰質(zhì)的毛細血管半徑25微米，毛細血管間平均距離60微米，正常情況下，溶解氧的有效彌散半徑30微米，氧分壓為2Kpa，不存在缺氧區(qū)。若發(fā)生供氧不足、氧彌散能力下降，當(dāng)氧分壓降為1.33Kpa時即出現(xiàn)臨床癥狀，氧分壓降至0.53Kpa以下時發(fā)生意識喪失。多年來有許多人構(gòu)思過靜脈通路給氧，輸血就是一種重要的輔助療法。在19世紀70年代有人用雙氧水、紫外線照射血液治療缺氧性疾病。人工血的研制如氟碳化合物、動物血紅蛋白以及人工合成的攜帶氧的絡(luò)合物(卟啉化合物)等，能溶解高濃度氧的物質(zhì)，但由于存在種種缺點和造價昂貴等原因終未推廣。近年有研究者采用，溶氧罐或高氧液的靜脈輸氧裝置，是通過往復(fù)式透光血袋經(jīng)多光譜等光照作用后產(chǎn)生一定濃度的活性氧，但溶解氧的濃度有限，往體內(nèi)輸注時，壓力降低，往往溶解率更為下降；因此，現(xiàn)在并無較好的方式實現(xiàn)靜脈輸氧。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述背景技術(shù)中制備微氣囊或微氣泡的不足之處而提供一種簡易的使親水親脂兩性分子自封閉小體液相核心空化形成微小囊氣泡的方法；本發(fā)明的另一個目的涉及所述微小囊氣泡在臨床上的應(yīng)用，如用于超聲造影和經(jīng)靜脈輸氧。
用上述方法制備的微小囊氣泡用料便宜、無毒性、可生物代謝的、易于保存和分裝，不存在金屬物污染、直徑在10微米以下。
本發(fā)明的目的是通過如下措施來達到的一種使親水親脂兩性分子自封閉小體液相核心空化形成囊氣泡的方法，所述親水親脂兩性分子自封閉小體是指由非離子表面活性劑、膽固醇和/或磷脂類成膜材料組成；
所述形成微小囊氣泡的方法包括如下步驟(1)將成膜材料溶解于氯仿和甲醇等有機溶液中，在抽真空狀態(tài)下，在凝膠態(tài)向液晶態(tài)相轉(zhuǎn)變溫度上，利用噴霧干燥成膜于可生物降解水溶性微小粉狀顆粒載體上，所述成膜材料水溶性載體質(zhì)量比是1∶50-500000；(2)將上述可生物降解水溶性微小粉狀顆粒，裝入一定容積的容器內(nèi)，置真空，并封口，在低于凝膠態(tài)向液晶態(tài)相轉(zhuǎn)變溫度下，先后注入特定氣體和水性介質(zhì)，常溫下手動震蕩，在水溶性的微細顆粒溶解后，包裹膜塌陷，液氣界面的強烈震蕩使氣體進入親水親脂兩性分子自封閉小體，進而形成液相核心空化的親水親脂兩性分子自封閉小體。
在上述技術(shù)方案中所述液相核心空化的親水親脂兩性分子自封閉小體是指非離子表面活性小體(Niosome)或脂質(zhì)體(Liposome)或兩者混合形成的磷脂質(zhì)非離子表面活性混合小體。
在上述技術(shù)方案中所述非離子表面活性小體(Niosome)，所用非離子表面活性劑選以下類型中的一種或幾種調(diào)配并與膽固醇類膜表面添加劑組成；(1)司班(Span)系列非離子型表面活性劑，如司班20、司班40、司班60、司班80、司班85等；(2)吐溫(Tween)系列非離子型表面活性劑，如吐溫20，吐溫40、吐溫60、吐溫80、吐溫81、吐溫85等；(3)Brij系列非離子型表面活性劑，如Brij 30，Brij 40，Brij 60、Brij 76、Brij78、Brij93等；(4)其他CremophorEL，Pluronic F68、白蛋白。
在上述技術(shù)方案中所述脂質(zhì)體，包括以下諸種磷脂和其他膜添加劑構(gòu)成，諸如包括以下諸種磷脂或類脂，諸如卵磷脂、磷脂酰二醇胺、膽固醇、膽固醇乙酰脂、β-谷甾醇、牛膽酸鈉、蛋磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇、神經(jīng)鞘磷脂、鞘髓磷脂、二鯨醋磷脂、肉豆蔻酰卵磷脂、硬脂酰胺，油酸單磷脂、維生素E及其他人工合成磷脂如1，2-棕櫚酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸甘油基-鈉鹽(DPPGNa)、1，2-二硬脂?；?sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿(DSPC)、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷脂酸甘油酸鈉鹽(DPPANa)、1，2-棕櫚?；?sn-甘油基-3-3-磷脂酰膽堿(DPPC)，或上述部分化合物的混合物。
在上述技術(shù)方案中所述磷脂質(zhì)-非離子表面活性混合小體中磷脂類親水-親脂兩性分子和非離子表面活性劑親水親脂兩性分子調(diào)配比率為1-500∶1。
在上述技術(shù)方案中所述可生物降解水溶性粉狀微小顆粒載體為以下任一一種或幾種的混合物聚乳酸(PLA)、聚丙交酯、聚己內(nèi)酯(PCL)、聚乙醇酸(PGA)、聚羥丁酸(PHB)、聚羥戊酸(PVAC)、聚癸酸(PDA)，聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物PLGA、聚乳酸和聚羥丁酸的共聚物PH-BV、聚氰基丙烯酸異己酯(PIHCA)、聚丙交酯乙交酯(PLCG)等、聚酸酐、半固態(tài)聚原酸酯(POE)、聚乙二醇(如聚乙二醇1000，聚乙二醇2000，聚乙二醇3000，聚乙二醇4000，聚乙二醇5000，聚乙二醇6000，聚乙二醇8000)、聚乙烯吡咯酮、二丁基羥基甲苯、山梨醇、羧甲基纖維素鈉、羥乙基淀粉、人羧甲淀粉鈉、海藻酸鹽；葡萄糖、半乳糖、果糖、麥牙糖、蔗糖、麥芽糖糊精，葡聚糖、水溶性殼聚糖及其衍生物；山梨醇；氯化鈉。
在上述技術(shù)方案中所述可生物降解水溶性粉狀微小顆粒載體和膜包裹可生物降解水溶性粉狀微小顆粒載體的粒徑分布在微米級和/或納米級。
在上述技術(shù)方案中所述注入氣體為氟代烷烴類氣體(如全氟甲烷氣體、全氟乙烷氣體、全氟丙烷)、空氣、氧氣、氮氣、二氧化碳氣、一氧化氮氣、氫氣、丙烷、丁烷中的一種任一一種或幾種，所述微小囊氣泡直徑分布在微米和/或納米級。
在上述技術(shù)方案中所述囊氣泡醫(yī)療診斷上作為超聲造影劑應(yīng)用于超聲造影成像。
在上述技術(shù)方案中所述包裹氧氣的囊氣泡，在臨床治療上應(yīng)用于靜脈輸氧。
考慮到臨床應(yīng)用的安全性和成本，優(yōu)選方案主要選擇以下四種已經(jīng)經(jīng)美國食品和藥物管理局批準可安全的作為胃腸外營養(yǎng)的經(jīng)靜脈注射的親水親脂兩性分子表面活性劑作為成膜材料卵磷脂、吐溫20、吐溫80、Cremophor EL。以膽固醇作為膜表面修飾添加劑進行調(diào)配。由作為超聲造影應(yīng)用，采用穩(wěn)定性好的全氟丙烷氣體。作為靜脈輸氧的臨床應(yīng)用，則采用氧氣包裹?？缮锝到馑苄苑蹱钗⑿☆w粒載體采用葡萄糖晶體，水性介質(zhì)采用生理鹽水。
本發(fā)明為達到液相核心空化的目的，采用了三點不同于常規(guī)的方法1)首先于凝膠態(tài)向液晶態(tài)相轉(zhuǎn)變溫度上成膜于可生物降解的水溶性的粉狀微小顆粒載體上，由于水溶性的粉狀顆粒的粒徑分布在微米級和/或納米級，實際上是將脂質(zhì)體(Liposome)或非離子表面活性小體(Niosome)或兩者混合形成的磷脂質(zhì)-非離子表面活性混合小體的液相核心首先固態(tài)化，這樣同時有利于保存和分裝；2)在使用時注入水性介質(zhì)，在凝膠態(tài)向液晶態(tài)相轉(zhuǎn)變溫度下短時手動強力震蕩，是避免高溫下膜相變過程包裹液體成分。在手動震蕩下，固性可溶性顆粒核心溶解，膜在支撐顆粒溶解時塌陷，同時震蕩形成頻繁的液、膜、氣接觸界面，氣體進入膜內(nèi)并自發(fā)封閉從而達到液相核心空化的目的，且形成的囊氣泡也最為豐富。3)本發(fā)明采用真空-氣體置換方法，可使液相空化達到特定氣體空化的目的，有利于根據(jù)特定的用途選定特定的氣體。
通過本發(fā)明，將液相核心氟代烷烴類氣體空化的微小囊氣泡經(jīng)靜脈注射，由于直徑小于10微米，可順利通過肺循環(huán)，可形成穩(wěn)定的超聲造影介面而達到左心、右心以及腹部實質(zhì)性臟器造影的目的。
通過本發(fā)明，將液相核心氧氣空化的微小囊氣泡經(jīng)靜脈輸注，同時結(jié)合血紅蛋白以及人工合成的攜帶氧的絡(luò)合物(卟啉化合物)一起輸注。由于核心空化的脂質(zhì)體或稱膜包裹的微氣泡，在超聲聲波振動下，可發(fā)生空化作用而破裂。因此在輸入液相核心氧氣空化的微小囊氣泡的同時，在體外，利用超聲探頭在局部探照，局部微小囊氣泡的破裂，一方面可使局部毛細血管動脈血中氧分壓遠高于組織中氧分壓，另一方面可使缺氧組織明顯提高氧氣的彌散，從而改善缺氧組織的供氧。含有一定濃度的活性氧可抑制自由基的大量產(chǎn)生，調(diào)節(jié)細胞鈣離子濃度，提高機體免疫能力，增加機體對缺氧的耐受力，并可緩解由缺血再灌注造成的組織損傷?？裳杆偬岣哐醴謮汉脱躏柡投龋纳平M織缺血缺氧狀態(tài)，提高紅細胞的變形能力，降低血小板的凝聚力，增加纖維蛋白溶解度，調(diào)節(jié)細胞Ca++離子濃度，有效保護損傷組織，并提高機體的免疫力和抗感染能力，適用于諸如腦血管病變，心肌缺血性病變，急性窒息等心腦血管疾病病人的搶救和治療。
本發(fā)明最終制劑形態(tài)包括三部分1)一支一定容積的真空狀態(tài)的容器，其內(nèi)含一定質(zhì)量的膜包裹的可生物降解水溶性粉狀微小顆粒；和2)一包含特定氣體容積的氣袋或注射器，其容積與上述容器相等；和3)一支含一定容量的水性介質(zhì)的注射器或容器。最終制劑形態(tài)也可簡化為兩部分1)一支一定容積的已經(jīng)經(jīng)過真空-氣相轉(zhuǎn)換的容器，其內(nèi)含一定質(zhì)量的膜包裹的可生物降解水溶性粉狀微小顆粒和特定氣體的容器；和2)一支含一定容量的水性介質(zhì)的注射器或容器。
綜上所述，本發(fā)明制備的液相核心空化的親水親脂兩性分子自封閉形成的微小囊氣泡與現(xiàn)有其他微氣泡性超聲造影劑相比具有以下明顯的優(yōu)點1)成本低廉。本發(fā)明優(yōu)選方案所用的卵磷脂是磷脂類表面活性劑中最為常用也最為便宜的膜材料；吐溫80、吐溫20、葡萄糖晶體以及膽固醇國內(nèi)外已經(jīng)有大量廠家生產(chǎn)，產(chǎn)品價格便宜，且易于采購；2)安全無毒，本發(fā)明所采用所有材料均為人體可生物代謝或已經(jīng)經(jīng)美國食品和藥物管理局批準可作為胃腸外營養(yǎng)的可靜脈注射親水親脂兩性分子表面活性劑作為成膜材料，因此具有極高的安全性；3)由于采用干粉劑型易于制備和分裝；且在使用時再經(jīng)手動震蕩溶解，形成的囊氣泡最為豐富，使用效果最好；3)囊氣泡粒徑分布在3-5微米范圍，可順利通過肺循環(huán)，可經(jīng)靜脈或動脈注射達到實質(zhì)臟器和心臟造影的目的；4)易于存儲，常溫下就可保持所有物理化學(xué)特性；5)作為臨床超聲影像診斷應(yīng)用其造影效果顯著，造影維持時間長，可維持半小時以上；6)無金屬顆粒污染的危險；7)作為臨床治療用途，可用于靜脈輸氧。


圖1為實施例3的液相核心全氟丙烷氣體空化的非離子表面活性小體20倍顯微鏡圖。
圖2為實施例3的計算機圖像分析核心全氟丙烷氣體空化的非離子表面活性小體直徑大小的正態(tài)分布曲線圖。
圖3為實施例4的液相核心一般空氣空化的脂質(zhì)體20倍顯微鏡圖。(圖中箭頭表示破裂氣泡)圖4為實施例5的核心全氟丙烷氣體空化的脂質(zhì)體。
圖5為實施例6的液相核心空化的非離子-磷脂混合小體的顯微鏡圖。(圖中未見破裂的囊氣泡)圖6為實施例7的液相核心全氟丙烷氣體空化的非離子-磷脂混合小體的20倍顯微鏡圖。
圖7為實施例7的計算機圖像分析核心全氟丙烷氣體空化的磷脂質(zhì)-非離子表面活性混合小體直徑大小的正態(tài)分布曲線圖。
圖8A為動物實驗造影前腎臟能量像，8B造影后腎臟能量像。
圖9為液相核心氣體空化的非離子-磷脂混合小體20倍顯微鏡圖。
具體實施例方式
下面通過實施例和相關(guān)實驗來詳細說明本發(fā)明的實施情況實施例1制備液相核心空化的非離子表面活性小體首先將1克麥芽糖糊精研磨至微米級的粉狀顆粒，將100mg司班60與20mg膽固醇混溶于氯仿有機溶液中，并裝入噴霧器中。引入50毫升圓底磨口燒瓶，噴霧于麥芽糖糊精上，接入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，在60度水浴下抽真空，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30分鐘，成膜于麥芽糖糊精粉狀顆粒上。取出膜覆蓋的麥芽糖糊精，常溫下風(fēng)干12小時。將上述膜包裹麥芽糖糊精迅速溶于10毫升生理鹽水中，手動振蕩30秒，取混懸液于顯微鏡下觀察，核心空化非離子表面活性小體直徑約在7-8微米，一個高倍視野分布約90％。在常溫，不密封的情況下，微小囊氣泡于燒瓶內(nèi)可保持3天不消失和破裂；密封狀態(tài)下，微小囊氣泡可保持至少1周。
實施例2調(diào)配HLB值制備液相核心空化的非離子表面活性小體將1克麥芽糖糊精研磨至微米級的粉狀顆粒。將司班80和吐溫80的HLB值按各自HLB值重量加權(quán)平均計算調(diào)配出HLB值為6復(fù)合乳化劑，其中司班80(166mg)重量占83％，吐溫80(34mg)重量占17％，將上述復(fù)合乳化劑與20mg膽固醇混溶于氯仿有機溶液中，并裝入噴霧器中。引入50毫升圓底磨口燒瓶，噴霧于麥芽糖糊精上，接入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，在60度水浴下抽真空，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30分鐘，成膜于麥芽糖糊精粉狀顆粒上。取出膜覆蓋的麥芽糖糊精，常溫下風(fēng)干12小時。將上述膜包裹麥芽糖糊精迅速溶于10毫升生理鹽水中，取混懸液于顯微鏡下觀察，核心空化非離子表面活性小體直徑約在7-8微米，一個高倍視野分布約90％。在常溫，不密封的情況下，微小囊氣泡于燒瓶內(nèi)可保持1天不消失和破裂。密封狀態(tài)下，微小囊氣泡可保持至少1周。
實施例3調(diào)配HLB值制備液相核心全氟丙烷氣體空化的非離子表面活性小體將1克麥芽糖糊精研磨至微米級的粉狀顆粒。將司班80和吐溫80的HLB值按各自HLB值重量加權(quán)平均計算調(diào)配出HLB值為6復(fù)合乳化劑，其中司班80(166mg)重量占83％，吐溫80(34mg)重量占17％，將上述復(fù)合乳化劑與20mg膽固醇混溶于氯仿有機溶液中，并裝入噴霧器中。引入50毫升圓底磨口燒瓶，噴霧于麥芽糖糊精上，接入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，在60度水浴下抽真空，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30分鐘，成膜于麥芽糖糊精粉狀顆粒上。取出膜覆蓋的麥芽糖糊精，常溫下風(fēng)干12小時。將上述膜包裹麥芽糖糊精分裝于小玻璃瓶內(nèi)，抽取真空，并密封。以先后次序分別注入全氟丙烷的氣體(氣體容積和前述容器容積一致)和10毫升生理鹽水，手動震蕩30秒后，取混懸液于顯微鏡下觀察，核心全氟丙烷氣體空化的非離子表面活性小體直徑約在3-8微米，一個高倍視野分布約95％，見圖1，為20倍鏡下所見，95％的微小囊泡直徑在7-8微米左右，僅少量囊氣泡直徑稍大于10微米。圖2為實施例3的計算機圖像分析核心全氟丙烷氣體空化的非離子表面活性小體直徑大小的正態(tài)分布曲線圖。由正態(tài)曲線分布圖可見，65％的囊氣泡的直徑在2-6微米范圍分布，99％的囊氣泡小于10微米。平均囊氣泡直徑為4微米。采用全氟丙烷氣體空化的囊氣泡穩(wěn)定性大大提高，在不密封狀態(tài)，微小囊氣泡可維持3-4天，密封狀態(tài)下包裹全氟丙烷的微小囊氣泡至少保持1月。
實施例4制備液相核心空化的脂質(zhì)體100毫克卵磷脂和40毫克膽固醇混溶于5毫升氯仿有機溶液，并裝入噴霧器中噴霧于1克葡萄糖微細晶體，并置入50毫升圓底磨口燒瓶，接入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，60度水浴下抽真空，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜于燒瓶底部。30分鐘后，取出膜覆蓋葡萄糖微細晶體，常溫下風(fēng)干12小時。將上述膜包裹麥芽糖糊精迅速溶于10毫升生理鹽水中，手動強烈振蕩，取混懸液于顯微鏡下觀察，核心空化的脂質(zhì)體直徑約在3-8微米，一個高倍視野分布約90％。常溫下，保持不封口，微小囊氣泡維持時間約6小時。但單純卵磷脂雙分子層的核心空化的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)顯示不夠穩(wěn)定，易于破裂。圖3為實施例4的液相核心一般空氣空化的脂質(zhì)體20倍顯微鏡下所見，此為20倍鏡下所見，90％的微小囊泡直徑在5微米左右，僅少量囊氣泡直徑稍大于10微米，但單純卵磷脂雙分子層的核心空化的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)顯示不夠穩(wěn)定，易于破裂，見圖3中箭頭所指。
實施例5制備液相核心全氟丙烷氣體空化的脂質(zhì)體100毫克卵磷脂和40毫克膽固醇混溶于5毫升氯仿有機溶液，并裝入噴霧器中噴霧于1克葡萄糖微細晶體，并置入50毫升圓底磨口燒瓶，接入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，60度水浴下抽真空，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜于燒瓶底部。30分鐘后，取出膜覆蓋葡萄糖微細晶體，常溫下風(fēng)干12小時。將上述膜包裹葡萄糖微細晶體分裝于小玻璃瓶內(nèi)，抽取真空，并密封。以先后次序分別注入全氟丙烷的氣體(氣體容積和前述容器容積一致)和10毫升生理鹽水，強力震蕩30秒后，取混懸液于顯微鏡下觀察，核心全氟丙烷氣體空化的脂質(zhì)體直徑約在3-8微米，一個高倍(20×)視野分布約95％，穩(wěn)定性顯著提高，不密封狀態(tài)下，微小囊氣泡，可保持3-4天左右。密封狀態(tài)下包裹全氟丙烷的微小囊氣泡至少保持1月。圖4為實施例5的核心全氟丙烷氣體空化的脂質(zhì)體直徑約在3-8微米，一個高倍視野分布約95％，全視野內(nèi)未見破裂的囊氣泡穩(wěn)定性顯著提高。
實施例6制備液相核心空化的磷脂質(zhì)-非離子表面活性混合小體100毫克卵磷脂、50毫克吐溫80、30毫克膽固醇混溶于5毫升氯仿有機溶液，并裝入噴霧器中噴霧于1克葡萄糖微細晶體，并置入50毫升圓底磨口燒瓶，接入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，60度水浴下抽真空，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜于燒瓶底部。30分鐘后，取出膜覆蓋葡萄糖微細晶體，常溫下風(fēng)干12小時。將上述膜包裹葡萄糖微細晶體迅速置于10毫升生理鹽水中，手動強烈振蕩，取混懸液于顯微鏡下觀察，核心空化的磷脂質(zhì)-非離子表面活性混合小體直徑約在3-8微米，一個高倍視野分布約90％。僅包裹一般空氣的液相核心空化的非離子磷脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，明顯優(yōu)于實施例4單純卵磷脂雙分子層包裹的囊氣泡。常溫下，保持不封口，微小囊氣泡維持時間約2-3天，密封狀態(tài)可保持至少1周。見圖5。圖5為實施例6的液相核心空化的非離子-磷脂混合小體的顯微鏡下圖，核心空化的磷脂質(zhì)-非離子表面活性混合小體直徑約在3-8微米，一個高倍(20×)視野分布約90％。未見破裂的囊氣泡。
實施例7制備液相核心全氟丙烷氣體空化的磷脂質(zhì)-非離子表面活性混合小體100毫克卵磷脂、20毫克吐溫80、30毫克膽固醇混溶于5毫升氯仿有機溶液，并裝入噴霧器中噴霧于1克葡萄糖微細晶體，并置入50毫升圓底磨口燒瓶，接入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，60度水浴下抽真空，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜于燒瓶底部。30分鐘后，取出膜覆蓋葡萄糖微細晶體，常溫下風(fēng)干12小時。將上述膜包裹葡萄糖微細晶體分裝于小玻璃瓶內(nèi)，抽取真空，并密封。以先后次序分別注入全氟丙烷的氣體(氣體容積和前述容器容積一致)和10毫升生理鹽水，強力震蕩30秒后，取混懸液于顯微鏡下觀察，核心全氟丙烷氣體空化的磷脂質(zhì)-非離子表面活性混合小體直徑約在3-5微米，一個高倍視野分布約95％，穩(wěn)定性顯著提高，見圖6，圖7。穩(wěn)定性顯著提高，不密封狀態(tài)下，微小囊氣泡，可保持1周左右。密封狀態(tài)下包裹全氟丙烷的微小囊氣泡至少保持2月。圖6為實施例7的液相核心全氟丙烷氣體空化的非離子-磷脂混合小體的顯微鏡下圖，核心全氟丙烷氣體空化的磷脂質(zhì)-非離子表面活性混合小體直徑約在3-5微米，一個高倍視野分布約95％，穩(wěn)定性顯著提高。圖7為實施例7的計算機圖像分析核心全氟丙烷氣體空化的磷脂質(zhì)-非離子表面活性混合小體直徑大小的正態(tài)分布曲線圖。由正態(tài)曲線分布圖可見，70％的囊氣泡的直徑在2-6微米范圍分布，97％的囊氣泡小于10微米。平均囊氣泡直徑為4微米。
實施例8超聲造影動物實驗動物實驗，將實施7所制備的液相核心空化的混懸液1毫升經(jīng)兔耳緣靜脈團注入大白兔體內(nèi)，數(shù)秒內(nèi)，于在多普勒能量圖成像模式下，可見顯著的造影增強效果，見圖8A，8B。圖8A為造影前腎臟能量像，圖8B為造影后腎臟能量像，腎實質(zhì)顯像顯著增強。
實施例9制備液相核心全氟丙烷氣體空化的磷脂質(zhì)-非離子表面活性混合小體100毫克卵磷脂、5毫克Cremophor EL、30毫克膽固醇混溶于5毫升氯仿有機溶液，并裝入噴霧器中噴霧于1克葡萄糖微細晶體，并置入50毫升圓底磨口燒瓶，接入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，60度水浴下抽真空，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜于燒瓶底部。30分鐘后，取出膜覆蓋葡萄糖微細晶體，常溫下風(fēng)干12小時。將上述膜包裹葡萄糖微細晶體分裝于小玻璃瓶內(nèi)，抽取真空，并密封。以先后次序分別注入全氟丙烷的氣體(氣體容積和前述容器容積一致)和10毫升生理鹽水，強力震蕩30秒后，取混懸液于顯微鏡下觀察，核心全氟丙烷氣體空化的磷脂質(zhì)-非離子表面活性混合小體直徑約在7-8微米，一個高倍視野(20×)分布約85％。
實施例10制備液相核心氧氣氣體空化的磷脂質(zhì)-非離子表面活性混合小體100毫克卵磷脂、20毫克吐溫80、30毫克膽固醇混溶于5毫升氯仿有機溶液，并裝入噴霧器中噴霧于1克葡萄糖微細晶體，并置入50毫升圓底磨口燒瓶，接入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，60度水浴下抽真空，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜于燒瓶底部。30分鐘后，取出膜覆蓋葡萄糖微細晶體，常溫下風(fēng)干12小時。將上述膜包裹葡萄糖微細晶體分裝于小玻璃瓶內(nèi)，抽取真空，并密封。以先后次序分別注入全氟丙烷的氣體(氣體容積和前述容器容積一致)和10毫升生理鹽水，強力震蕩30秒后，取混懸液于顯微鏡下觀察，核心氧氣氣體空化的磷脂質(zhì)-非離子表面活性混合小體直徑約在3-5微米，一個高倍視野分布約95％，不密封狀態(tài)下，微小囊氣泡，可保持1周左右。密封狀態(tài)下包裹氧氣的微小囊氣泡至少保持2月。
實施例11調(diào)配HLB值制備液相核心氣體空化的磷脂質(zhì)-非離子表面活性混合小體將1克葡萄糖的粉狀顆粒。將卵磷脂和吐溫20的HLB值按各自HLB值重量加權(quán)平均計算調(diào)配出HLB值為9的復(fù)合乳化劑，其中吐溫20(22mg)重量占11％，卵磷脂(178mg)重量占89％，將上述復(fù)合乳化劑與20mg膽固醇混溶于氯仿有機溶液中，并裝入噴霧器中。引入50毫升圓底磨口燒瓶，噴霧于葡萄糖上，接入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，在60度水浴下抽真空，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30分鐘，成膜于葡萄糖粉狀顆粒上。取出膜覆蓋的葡萄糖，常溫下風(fēng)干12小時。將上述膜包裹葡萄糖迅速溶于10毫升生理鹽水中，手動強力震蕩10秒后，取混懸液于顯微鏡下觀察，核心空化磷脂質(zhì)-非離子表面活性混合小體直徑約在5-6微米，但氣泡含量明顯少于與吐溫80調(diào)配所得。如圖9，所示，微小囊氣泡直徑都在5-6微米，但與實施例6，7相比氣泡含量明顯減少。
實施例12經(jīng)靜脈輸氧動物實驗取實施例10制備的氧氣核心空化的磷脂質(zhì)-非離子表面活性混合小體的混懸液5毫升，采用經(jīng)大白兔耳緣靜脈輸注的方式，以每分鐘0.05毫升的速度輸注。在20分鐘的輸注過程中，未見任何氣體栓塞征象，明顯提高了兔血氧含量。
需要說明的是對于所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，在不改變本發(fā)明原理的前提下還可以對本發(fā)明作出若干的改變或變形，例如在成膜材料上標(biāo)記某些特異性的抗體或包裹特殊的藥物成分，以達到靶向釋放、靶向造影、靶向治療的目的。這同樣屬于本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1.親水親脂兩性分子自封閉小體液相核心空化形成囊氣泡的方法，所述親水親脂兩性分子自封閉小體是由非離子表面活性劑、膽固醇和/或磷脂類成膜材料組成；其特征在于所述方法包括如下步驟(1)將成膜材料溶解于氯仿和/或甲醇中，在抽真空狀態(tài)下，在凝膠態(tài)向液晶態(tài)相轉(zhuǎn)變溫度上噴霧干燥成膜于可生物降解水溶性的微小粉狀顆粒載體上，所述成膜材料水溶性載體質(zhì)量比是1∶50-500000；(2)將上述已包裹膜的水溶性微小粉狀顆粒，裝入一定容積的容器內(nèi)，置真空，并封口，在低于凝膠態(tài)向液晶態(tài)相轉(zhuǎn)變溫度下，以先后次序注入一定容積的氣體和水性介質(zhì)，手動震蕩至水溶性的微小粉狀顆粒溶解，包裹膜塌陷使氣體進入親水親脂兩性分子自封閉小體，進而形成液相核心空化的親水親脂兩性分子自封閉小體囊氣泡。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的親水親脂兩性分子自封閉小體液相核心空化形成囊氣泡的方法，其特征在于所述液相核心空化的親水親脂兩性分子自封閉小體是指非離子表面活性小體(Niosome)或脂質(zhì)體(Liposome)或兩者混合形成的脂質(zhì)非離子表面活性混合小體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種使親水親脂兩性分子自封閉小體液相核心空化形成囊氣泡的方法，其特征在于所述非離子表面活性小體(Niosome)，所用非離子表面活性劑選司班(Span)系列非離子型表面活性劑、吐溫(Tween)系列非離子型表面活性劑、Brij非離子型表面活性劑、Cremophor EL、PluronicF68、白蛋白中的一種或幾種調(diào)配并與膽固醇等膜表面添加劑組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種使親水親脂兩性分子自封閉小體液相核心空化形成囊氣泡的方法，其特征在于所述脂質(zhì)體所用磷脂類親水親脂兩性分子選下述類型中的一種或幾種調(diào)配并與膽固醇類膜表面添加劑組成；所述磷脂類親水親脂兩性分子為卵磷脂、磷脂酰二醇胺、膽固醇、膽固醇乙酰脂、β-谷甾醇、牛膽酸鈉、蛋磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇、神經(jīng)鞘磷脂、鞘髓磷脂、二鯨醋磷脂、肉豆蔻酰卵磷脂、硬脂酰胺，油酸單磷脂、維生素E、1，2-棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷脂酸甘油基-鈉鹽(DPPGNa)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿(DSPC)、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷脂酸甘油酸鈉鹽(DPPANa)、1，2-棕櫚?；?sn-甘油基-3-3-磷脂酰膽堿(DPPC)或上述化合物的混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種使親水親脂兩性分子自封閉小體液相核心空化形成囊氣泡的方法，其特征在于所述磷脂質(zhì)非離子表面活性混合小體，其磷脂類親水親脂兩性分子和非離子表面活性劑親水親脂兩性分子質(zhì)量調(diào)配比率為1-500∶1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種使親水親脂兩性分子自封閉小體液相核心空化形成囊氣泡的方法，其特征在于所述可生物降解水溶性粉狀微小顆粒載體為以下任一一種或幾種的混合物聚乳酸(PLA)、聚丙交酯、聚己內(nèi)酯(PCL)、聚乙醇酸(PGA)、聚羥丁酸(PHB)、聚羥戊酸(PVAC)、聚癸酸(PDA)，聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物PLGA、聚乳酸和聚羥丁酸的共聚物PH-BV、聚氰基丙烯酸異己酯(PIHCA)、聚丙交酯乙交酯(PLCG)、聚酸酐、半固態(tài)聚原酸酯(POE)、聚乙二醇、聚乙烯吡咯酮、二丁基羥基甲苯、山梨醇、羧甲基纖維素鈉、羥乙基淀粉、人羧甲淀粉鈉、海藻酸鹽、葡萄糖、半乳糖、果糖、麥牙糖、蔗糖、麥芽糖糊精，葡聚糖、水溶性殼聚糖及其衍生物、山梨醇、氯化鈉。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的一種使親水親脂兩性分子自封閉小體液相核心空化形成囊氣泡的方法，其特征在于所述可生物降解水溶性粉狀微小顆粒載體和膜包裹可生物降解水溶性粉狀微小顆粒載體的粒徑分布在微米級和/或納米級。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種使親水親脂兩性分子自封閉小體液相核心空化形成微小囊氣泡的方法，其特征在于所述注入氣體為氟代烷烴類氣體、空氣、氧氣、氮氣、二氧化碳氣、一氧化氮氣、氫氣、丙烷、丁烷中的任一一種或幾種，所述微小囊氣泡直徑分布在微米和/或納米級。
9.上述親水親脂兩性分子自封閉小體液相核心空化形成囊氣泡的應(yīng)用，其特征在于所述囊氣泡在醫(yī)療診斷上作為超聲造影劑用于超聲造影成像上的應(yīng)用。
10.上述親水親脂兩性分子自封閉小體液相核心空化形成包裹氧氣的囊氣泡的應(yīng)用，其特征在于所述囊氣泡在臨床治療用于靜脈輸氧上的應(yīng)用。
全文摘要
親水親脂兩性分子自封閉小體液相核心空化形成囊氣泡的方法，它是將成膜材料溶解于氯仿和/或甲醇中，在抽真空狀態(tài)下，在凝膠態(tài)向液晶態(tài)相轉(zhuǎn)變溫度上噴霧干燥成膜于可生物降解水溶性的微小粉狀顆粒載體上；將水溶性微小粉狀顆粒裝容器內(nèi)，置真空并封口，在低于凝膠態(tài)向液晶態(tài)相轉(zhuǎn)變溫度下，先后注入一定容積的氣體和水性介質(zhì)，手動震蕩至水溶性的微小粉狀顆粒溶解，形成液相核心空化的親水親脂兩性分子自封閉小體囊氣泡。本發(fā)明成本低廉、安全無毒、采用干粉劑型易于制備和分裝、使用效果最好；作為臨床治療用途，可用于靜脈輸氧。
文檔編號A61K49/18GK1613504SQ200410060609
公開日2005年5月11日 申請日期2004年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月22日
發(fā)明者周翔 申請人:周翔